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CN113557228B - 位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶联物 - Google Patents

位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶联物 Download PDF

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CN113557228B
CN113557228B CN202080019814.3A CN202080019814A CN113557228B CN 113557228 B CN113557228 B CN 113557228B CN 202080019814 A CN202080019814 A CN 202080019814A CN 113557228 B CN113557228 B CN 113557228B
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Abstract

本申请涉及能够使特定数量的化学官能团或载荷部分被标记在抗体的特定位点的技术。本申请可以提供具有高度均一性的抗体产品。此外，本申请可以提供如下的抗体产品，其中抗体的功能不会下降。即，可以提供其亲合力和半衰期没有下降的抗体产品。本申请是无需任何复杂过程即可对抗体进行位点特异性标记的首个技术，因此是非常有意义的。

Description

位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶 联物
技术领域
本发明涉及用物质(低分子量化合物、合成聚合物、生物聚合物(即肽、碳水化合物、蛋白质等))选择性标记抗体的特定氨基酸残基或将待被递送至特定靶细胞或组织的分子(下文称为“载荷(cargo)”)连接至抗体的技术。此外，本发明涉及用期望数量的物质标记抗体的特定位点或将期望数量的载荷连接至抗体的特定氨基酸残基的技术。此外，本发明涵盖通过该方法或使用抗体片段复合物的方法制备的抗体复合物。
背景技术
抗体是具有识别特定分子的功能的生物分子，并且已被用于各种工业应用。例如，抗体可被用于检测或筛选特定物质，并检查特定物质通过其在体内或细胞中移动的途径。此外，抗体可通过诱导针对特定物质的免疫应答而用于治疗目的。
为了扩展此类抗体的功能，已经尝试提高抗体的能力。通常，尝试用外来物质标记抗体，以补充或扩展抗体的功能。通常，当抗体用荧光物质标记时，可将该抗体用于荧光测定，或者当抗体用治疗特定疾病的试剂标记时，该抗体可用于使抗体的治疗效果最大化。这些尝试和技术通常被称为“抗体标记”。本发明涉及标记抗体的新方法。
最初，抗体标记是通过将外来物质随机附着到抗体来实现的。然而，这种方法有很多问题。如此制备的抗体的问题在于它们的同质性差。这些抗体的问题在于它们的效果仍然不均一，因为附着至每种抗体的物质的数量不同，并且抗体的结合位点也不同。这个问题是开发需要高安全性和重现性的抗体-药物偶联物(ADC)技术的大的障碍。
此外，该方法具有抗体识别能力可能显著降低的问题。抗体由包括识别抗原的抗原结合结构域的Fab结构域和参与抗体结晶的Fc结构域组成。通过允许外来物质与抗体的抗原结合结构域或邻接于抗原结合结构域的位点结合，随机标记导致高度退化的抗体识别能力。
因此，相关领域中存在以位点特异性方式均匀标记抗体的技术的需求。尽管开发了一些技术，例如遗传学调节或修饰的抗体等，但其中大部分在技术和经济方面是无效的。因此，本发明被设计为解决这些问题，并因此针对能够将特定物质(或“部分”)与抗体的特定位点特异性连接的技术(该技术无需抗体的任何额外调节)，以及也使用抗体将特定物质(药物或经标记的物质)递送入细胞或组织中。
发明内容
[技术问题]
本发明提供了将化学官能团特异性转移到抗体的特定位点的技术。在一个具体实施方式中，本发明提供了将化学官能团特异性转移至抗体中的赖氨酸246的技术。在另一具体实施方式中，本发明提供了将化学官能团特异性转移至抗体中的赖氨酸248的技术。在又一具体的实施方式中，本发明提供了用于将化学官能团特异性转移至抗体中的赖氨酸246和赖氨酸248的技术。
本发明提供了能够将期望数量的化学官能团连接至抗体的技术。在一个具体的实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段具有与其结合的两个特定部分。在另一具体的实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段具有与其结合的四个特定部分。
本发明提供了用于将载荷部分与抗体的特定位点特异性连接的技术。在一个具体实施方式中，本发明提供了用于将载荷部分与抗体中的赖氨酸246特异性连接的技术。在另一具体的实施方式中，本发明提供了用于将载荷部分与抗体中的赖氨酸248特异性连接的技术。在又一具体的实施方式中，本发明提供了用于将载荷部分与抗体中的赖氨酸246和赖氨酸248特异性连接的技术。
本发明提供了将期望数量的载荷部分与抗体连接的技术。在一个具体实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段具有与其结合的两个载荷部分。在另一具体的实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段具有与其结合的四个载荷部分。
本发明提供了使用上述抗体或抗体片段的方法。在一个具体实施方式中，本发明提供了使用抗体-药物复合物治疗特定疾病的方法。
[技术方案]
本申请提供了式2的化合物：
[式2]
其中，H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，X2为O，R2′为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。
本申请还提供了其中H1选自端基炔、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪的化合物。此外，本申请提供了其中H1选自降冰片烯、四嗪、叠氮化物和二苯并环辛炔-胺的化合物。
此外，本申请提供了其中R2′为N-琥珀酰亚胺的化合物。
此外，本申请提供了其中式2为式2-1、式2-2或式2-3的化合物：
[式2-1]
[式2-2]
[式2-3]
本申请提供了具有式4-2结构的肽：
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，Xa3选自色氨酸残基、萘丙氨酸残基和苯丙氨酸残基，并且Xa1为其中D3为共价键或C1～3亚烷基，且X3为NH2，其中所述肽由13至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请还提供了其中D3为共价键、亚甲基或亚乙基的肽。
此外，本申请提供了其中式4-2为式4-6的肽：
[式4-6]
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T
其中，D为天冬氨酸残基，A为丙氨酸残基，E为谷氨酸残基，W为色氨酸残基，T为苏氨酸残基。
本申请提供了具有式6-2结构的肽-化合物偶联物：
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，Xa3选自色氨酸残基、萘丙氨酸残基和苯丙氨酸残基，并且
(Xa1)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，D3为共价键或C1～3亚烷基，并且X3为NH，其中所述肽由13个至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请还提供了肽-化合物偶联物，其中从(Xa1)′的β碳到(Xa1)′的第一羰基碳的距离小于约
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中D2是Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，D3是Cx亚烷基，其中y是大于或等于1的整数，且1≤x+y≤5。
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中从(Xa1)′的β碳到(Xa1)′的第一羰基碳的距离大于约
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中D2是Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且D3是Cx亚烷基，其中y是大于或等于1的整数，且9≤x+y≤12。此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中D2是Cy亚烯基或Cy亚炔基。
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中从(Xa1)′的β碳到(Xa1)′的第一羰基碳的距离为约至约
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且D3为Cx亚烷基，其中y为大于或等于1的整数，且6≤x+y≤8。
此外，本申请提供了其中式6-2为式6-3的肽-化合物偶联物：
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T
其中，D为天冬氨酸残基，A为丙氨酸残基，E为谷氨酸残基，W为色氨酸残基，T为苏氨酸残基。
此外，本申请提供了肽-化合物偶联物，其中D1为共价键并且D2为亚甲基。
本申请提供了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法，所述方法包括使式2的化合物与具有式4-2结构的肽反应：
[式2]
其中，H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，X2为O，R2′为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基；
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，Xa3选自色氨酸残基、萘丙氨酸残基和苯丙氨酸残基，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1～3亚烷基，并且X3为NH2，其中所述肽由13个至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请还提供了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法，其中D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且D3为Cx亚烷基，其中y为大于或等于1的整数，且1≤x+y≤5，其特征在于由该方法制备的用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以与抗体反应，以将所述第一点击化学官能团特异性地递送至该抗体的Fc结构域的赖氨酸248残基。
此外，本申请提供了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法，其中D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且D3为Cx亚烷基，其中y为大于或等于1的整数，且1≤x+y≤5，其特征在于由该方法制备的用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以与抗体反应，以将所述第一点击化学官能团特异性地递送至该抗体的Fc结构域的赖氨酸248残基。
此外，本申请提供了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法，其中D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且D3为Cx亚烷基，其中y为大于或等于1的整数，且9≤x+y≤12，其特征在于由该方法制备的用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以与抗体反应，以将所述第一点击化学官能团特异性地递送至该抗体的Fc结构域的赖氨酸246残基。
此外，本申请提供了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法，其中D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且D3为Cx亚烷基，其中y为大于或等于1的整数，且6≤x+y≤8，其特征在于由该方法制备的用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以与抗体反应，以将所述第一点击化学官能团选择性地递送至该抗体的Fc结构域的赖氨酸246残基或赖氨酸248残基。
本申请提供了用于制备转移至抗体的第一点击化学官能团的试剂盒，所述试剂盒包含式2的化合物和具有式4-2结构的肽：
[式2]
其中，H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，X2为O，R2′为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基；
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，Xa3选自色氨酸残基、萘丙氨酸残基和苯丙氨酸残基，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1～3亚烷基，并且X3为NH2，其中所述肽由13个至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自式8-1、式8-2和式8-3的一个或多个氨基酸序列：
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)′-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-(K)′-D-T-L-M-I
其中，G为甘氨酸残基，P为脯氨酸残基，S为丝氨酸残基，V为缬氨酸残基，F为苯丙氨酸残基，L为亮氨酸残基，K为赖氨酸残基，D为天冬氨酸残基，T为苏氨酸残基，M为甲硫氨酸残基，I为异亮氨酸残基，并且
(K)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基。
本申请还提供了其中D1为共价键的抗体或其片段。
此外，本申请提供了包含式8-1的氨基酸序列而不包含式8-2和式8-3的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中均包含式8-1的氨基酸序列的抗体或其片段。
此外，本申请提供了包含式8-2的氨基酸序列而不包含式8-1和式8-3的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中均包含式8-2的氨基酸序列的抗体或其片段。
此外，本申请提供了包含式8-3的氨基酸序列而不包含式8-1和式8-2的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中均包含式8-3的氨基酸序列的抗体或其片段。
本申请提供了用于制备包含第一点击化学官能团的抗体或其片段的方法，所述方法包括使具有式6-2结构的肽-化合物偶联物与抗体或其片段反应：
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，Xa3选自色氨酸残基、萘丙氨酸残基和苯丙氨酸残基，并且
(Xa1)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，D3为共价键或C1～3亚烷基，并且X3为NH，其中所述肽由13个至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请提供了用于制备包含第一点击化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包含具有式6-2结构的肽-化合物偶联物和抗体或其片段：
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3
其中，每个Xaa独立地为非半胱氨酸残基的任何氨基酸残基，C为半胱氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，Xa2为谷氨酸残基或天冬酰胺残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，W为色氨酸残基，并且
(Xa1)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，X1为S，D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基、C2～7亚炔基和C3～8亚环烷基，D3为共价键或C1～3亚烷基，并且X3为NH，其中所述肽由13个至17个氨基酸残基组成，其中所述肽表现出结合人免疫球蛋白G(IgG)的活性，并且其中，同N-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基与同C-端相距2至4个氨基酸的半胱氨酸残基任选地连接。
本申请提供了具有式9结构的化合物：
[式9]
Cm——————H2
其中，Cm为载荷部分，H2为第二点击化学官能团。
本申请提供制备抗体-药物偶联物的方法，所述方法包括使包含选自式8-1、式8-2和式8-3的一个或多个氨基酸序列的抗体或其片段与具有式9结构的化合物反应：
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)′-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-(K)′-D-T-L-M-I
其中，G为甘氨酸残基，P为脯氨酸残基，S为丝氨酸残基，V为缬氨酸残基，F为苯丙氨酸残基，L为亮氨酸残基，K为赖氨酸残基，D为天冬氨酸残基，T为苏氨酸残基，M为甲硫氨酸残基，I为异亮氨酸残基，并且
(K)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基；
[式9]
Cm——————H2
其中，Cm为载荷部分，H2为与所述第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团。
本申请提供了用于制备抗体-药物偶联物的试剂盒，所述试剂盒包含抗体或其片段和具有式9结构的化合物，所述抗体或其片段包含选自式8-1、式8-2和式8-3的一个或多个氨基酸序列：
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-K-D-T-L-M-I
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)′-D-T-L-M-I
[式8-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-(K)′-D-T-L-M-I
其中，G为甘氨酸残基，P为脯氨酸残基，S为丝氨酸残基，V为缬氨酸残基，F为苯丙氨酸残基，L为亮氨酸残基，K为赖氨酸残基，D为天冬氨酸残基，T为苏氨酸残基，M为甲硫氨酸残基，I为异亮氨酸残基，并且
(K)′为其中H1为第一点击化学官能团，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基；
[式9]
Cm—————H2
其中，Cm为载荷部分，H2为与所述第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团。
本申请提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自式10-1、式10-2和式10-3的一个或多个氨基酸序列：
[式10-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)″-P-K-D-T-L-M-I
[式10-2]
G-P-S-V-F-L-F-p-P-K-P-(K)″-D-T-L-M-I
[式10-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)″-P-(K)″-D-T-L-M-I
其中，G为甘氨酸残基，P为脯氨酸残基，S为丝氨酸残基，V为缬氨酸残基，F为苯丙氨酸残基，L为亮氨酸残基，K为赖氨酸残基，D为天冬氨酸残基，T为苏氨酸残基，M为甲硫氨酸残基，I为异亮氨酸残基，并且
(K)”为其中Cm为载荷部分，B选自
其中A1和A2连接至载荷部分或D1并且它们不会均连接至相同的部分，Rx选自H、卤素和C1～3烷基，D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基。
本申请还提供了包含式10-1的氨基酸序列而不包含式10-2和式10-3的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中均包含式10-1的氨基酸序列的抗体或其片段。
此外，本申请提供了包含式10-2的氨基酸序列而不包含式10-1和式10-3的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中都包含式10-2的氨基酸序列的抗体或其片段。
此外，本申请提供了包含式10-3的氨基酸序列而不包含式10-1和式10-2的氨基酸序列的抗体或其片段。此外，本申请提供了在两个Fc结构域中都包含式10-3的氨基酸序列的抗体或其片段。
此外，本申请提供了其中载荷部分包含药物部分的抗体或其片段。此外，本申请提供了其中载荷部分包含2个以上的药物部分的抗体或其片段。或者进一步地，本申请提供了其中药物部分为抗癌剂的抗体或其片段。此外，本申请提供了抗体或其片段，其中所述抗癌剂为选自以下中的至少一种：DM1、DM3、DM4、相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、凋亡剂、抗血管生成剂、淋巴因子、紫杉烷、DNA-烷化剂、蒽环、tubulysin类似物、倍癌霉素类似物、auristatin E、auristatin F、美登素类化合物(maytansinoid)、包含反应性聚乙二醇部分的细胞毒性剂、taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、t.秋水仙素(t.)、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-二氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺铂、更生霉素、博来霉素、氨茴霉素、卡奇霉素(calicheamicin)、阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、达沙替尼、多西他赛、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、奈达铂、尼洛替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙铂、索拉非尼、vemurafenib、舒尼替尼、替尼泊苷、triplatin和长春瑞滨。
本申请提供了用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含上述的抗体-药物偶联物。
本申请还提供了用于治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症选自膀胱癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结直肠癌、直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。
此外，本申请提供了用于治疗癌症的药物组合物，其中所述癌症为乳腺癌。
本申请提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者给予包含上述的抗体-药物偶联物的药物组合物。
本申请还提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症选自膀胱癌、骨癌、脑瘤、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结直肠癌、直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃肠癌、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。
此外，本申请提供了治疗癌症的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
[有益效果]
根据本发明的抗体产品可具有在其特定位点处标记的特定数量的化学官能团或载荷部分。因此，本发明可提供具有高均一性的抗体产品。本发明还可以提供其抗体功能不退化的抗体产品。即，本发明可以提供其抗体结合亲和力和半衰期没有降低的抗体产品。作为无需任何复杂过程即可对抗体进行位点特异性标记的首个技术，本发明具有重要意义。
附图说明
图1示出了Fc结构域的部分序列和根据EU编号系统编号的序列中的编号。
图2示出了包括赖氨酸246和赖氨酸248的Fc结构域中的赖氨酸残基的位置。
图3和图4示出了SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构。
图5示出了Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248以及SSFI的Xa1。
图6示出了赖氨酸246的胺基基团与SSFI的Xa1的β碳之间的距离。
图7示出了赖氨酸248的胺基基团与SSFI的Xa1的β碳之间的距离。
图8示出了R1′-L2-SSFI的结构和(Xa1)′的第一个羰基碳与β碳之间的距离(Lc)。
图9示出了R1′-L2-SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构，使得(Xa1)′的侧链具有平行于图中x轴的方向(虚线箭头)。
图10示出了用于允许所述第一个羰基碳与赖氨酸248良好反应的条件。
图11示出了用于允许所述第一个羰基碳与赖氨酸246良好反应的条件。
图12示出了用于允许所述第一羰基碳选择性地与赖氨酸246或赖氨酸248反应的条件。
图13示出了FcRn结合位点和Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248。
图14示出了与Fc和FcRn之间的结合位点相比，SSFI和Fc结构域之间的结合结构的分析。
图15示出了合成化合物I的方法。
图16示出了通过质谱法确认化合物I的结构的结果。
图17示出了合成化合物II的方法。
图18示出了通过质谱法确认化合物II的结构的结果。
图19示出了合成化合物III的方法。
图20示出了通过质谱法确认化合物III的结构的结果。
图21和图22示出了合成化合物IV的方法。
图23示出了通过质谱法确认化合物IV的结构的结果。
图24示出了通过质谱法确认SSFI(6Lys)的结构的结果。
图25示出了通过质谱法确认SSFI(6Orn)的结构的结果。
图26示出了通过质谱法确认SSFI(6Dab)的结构的结果。
图27示出了通过质谱法确认SSFI(6Dap)的结构的结果。
图28示出了通过质谱法确认DD2的结构的结果。
图29示出了通过质谱法确认DD3的结构的结果。
图30示出了通过质谱法确认DD4的结构的结果。
图31示出了通过质谱法确认DD5的结构的结果。
图32示出了通过质谱法确认DD6的结构的结果。
图33示出了通过质谱法确认化合物I-SSFI(6Lys)的结构的结果。
图34示出了通过质谱法确认化合物II-SSFI(6Lys)的结构的结果。
图35示出了通过质谱法确认化合物III-SSFI(6Lys)的结构的结果。
图36示出了通过质谱法确认化合物III-SSFI(6Orn)的结构的结果。
图37示出了通过质谱法确认化合物III-SSFI(6Dab)的结构的结果。
图38示出了通过质谱法确认化合物III-SSFI(6Dap)的结构的结果。
图39示出了通过质谱法确认化合物IV-SSFI(6Dap)的结构的结果。
图40示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物I-SSFI(6Lys)的结合反应的结果。
图41示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物II-SSFI(6Lys)的结合反应的结果。
图42示出了抗体与化合物III-SSFI(6Dap、Dab、Orn或Lys)的反应。
图43示出了作为最终产物的Ab(246/248)-降冰片烯的结构。
图44示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(6Dap)的结合反应的结果。
图45示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(6Dab)的结合反应的结果。
图46示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(6Orn)的结合反应的结果。
图47示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(6Lys)的结合反应的结果。
图48示出了通过HIC-HPLC观察使用曲妥珠单抗和化合物IV-SSFI(6Dap)的结合反应的结果。
图49和图50示出了抗体-降冰片烯结合引起的分子量谱的增加。
图51至图54示出了曲妥珠单抗和抗体-降冰片烯复合物的MS/MS色谱结果。
图55示出了借助于MS/MS谱的序列匹配结果。
图56示出了为确认曲妥珠单抗-叠氮化物结构而测量的曲妥珠单抗的质谱图。
图57示出了为确认曲妥珠单抗-叠氮化物结构而测量的曲妥珠单抗-叠氮化物复合物的质谱图。
图58示出了通过质谱法确认四嗪-DM1的结构的结果。
图59示出了基于化合物III-SSFI(6Dap)的曲妥珠单抗-DM1偶联物的结构。
图60示出了通过HIC-HPLC观察曲妥珠单抗-DM1偶联物的形成反应的结果。
图61和图62示出了通过降冰片烯-四嗪-DM1结合引起的分子量谱的增加。
图63示出了结合至降冰片烯标记的抗体的有效载荷的三种设计的结构。
图64示出分析抗体-药物偶联物的抗原结合亲和力的结果。
图65至图67示出了分析抗体-药物偶联物的血清稳定性的结果。
图68至图70示出了在细胞水平评价抗体-药物偶联物的药效的结果。
图71和图72示出在动物水平评价抗体-药物偶联物的药效的结果。
图73示出了针对抗体-药物偶联物的药代动力学测试的结果。
具体实施方式
定义
除非另有定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。提供以下参考文献以向相关领域中的技术人员给出本发明中使用的术语的许多常见定义：Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology(第2版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science andTechnology(Walker编著，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等(编著)，Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham，The Harper Collins Dictionary ofBiology(1991)。除非另外明确指明，本发明中使用的下列术语应具有针对其描述的如下含义。
在一些实施方式中，化学结构与相应的化学名称一同公开。当术语相互矛盾或冲突时，化学结构优先于化学名称，以通过化学结构理解化合物的含义。
本发明中使用的术语“杂”是指包含至少一个杂原子的化合物或一组化合物。术语“杂原子”是指除碳原子或氢原子以外的原子，并且例如包括B、Si、N、P、O、S和Se。优选地，其中，所述杂原子包括多价元素如N、O和S，或单价元素如F、Cl、Br和I，但本发明不限于此。
本发明中使用的术语“低级”用于修饰烃类，例如亚烷基等，并因此是指相应的烃类具有6个或更少的碳原子。例如，C1-6直链或支链烷基基团被称为另一个名称，例如“低级烷基”基团。
本发明中使用的术语“氧基”是指氧原子的仲自由基(-O-)。
术语“烷基”或“烷烃”是指完全饱和的直链或支链的非芳香烃。除非另有定义，直链或支链烷基基团通常具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子。直链和支链烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。
术语“烯基”或“烯烃”是指包含至少一个双键的直链或支链的非芳香烃。除非另有定义，直链或支链的烯基基团通常具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子。
术语“炔基”或“炔烃”是指含有至少一个三键的直链或支链的非芳香烃。除非另有定义，直链或支链的炔基通常具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子。
术语“环烷烃”或“环烷基”是指完全饱和的环状烃。“环烷基”包括单环和多环。除非另有定义，单环环烷基基团通常具有3至约10个碳原子，更通常具有3至8个碳原子。多环环烷基的第一个环以外的环可以选自饱和环、不饱和环和芳香环。所述环烷基包括含有在两个环之间共享的1个、2个或3个或更多个原子的双环分子。术语“稠合环烷基”是指其中一个环与另一环共享两个相邻原子的多环环烷基。稠合多环环烷基的第一个环以外的环可以选自饱和环、不饱和环和芳环。
术语“环炔烃”或“环炔基”是指含有至少一个三键的环烃，也称为“张力炔烃”。所述“环炔基”包括单环和多环。除非另有定义，单环环炔基通常具有3至约10个碳原子，更通常具有3至8个碳原子。多环环炔基的第一个环以外的环可以选自饱和环、不饱和环和芳香环。所述环炔基是双环分子，包含在两个环之间共享的1个、2个或3个或更多个原子。术语“稠合的环炔基”是指其中一个环与另一环共享两个相邻原子的多环环炔基。稠合的多环环炔基的第一个环以外的环可以选自饱和环、不饱和环和芳香环。
用作分子本身或用作另一分子的一部分的术语“亚烷基”是指衍生自烷烃的二价自由基。例如，该基团包括-CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2-，均含有10个或更少的碳原子，但本发明不限于此。术语“低级亚烷基”是指通常具有6个或更少碳原子的短的亚烷基基团。除非另有说明，术语“亚烷基”旨在涵盖本发明中由“杂亚烷基”表示的基团。
术语“杂亚烷基”是指衍生自杂烷基的二价自由基，并且例如包括-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-，但本发明不限于此。杂亚烷基基团可以在其链的每个末端或所有末端含有相同或不同的杂原子(包括亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨基氧基亚烷基等，但本发明不限于此)。此外，链两端的连接的指示与式的基团排列无关。例如，式-C(O)2R′-指的是-C(O)2R′-和-R′(O)2C-。
用作分子本身或用作另一分子的一部分的术语“亚烯基”是指衍生自烯烃的二价自由基。例如，该基团包括-CH＝CH-、-CH2CH＝CHCH2-和-CH＝CH-CH＝CH-，均具有10个或更少的碳原子，但本发明不限于此。除非另有说明，术语“亚烯基”旨在涵盖本发明中的杂亚烯基。
用作分子本身或用作另一分子的一部分的术语“亚炔基”是指衍生自炔烃的二价自由基。例如，该基团包括-C≡C-、-CH2C≡CCH2-和-C≡C-C≡C-，均具有10个或更少的碳原子，但本发明不限于此。除非另有说明，术语“亚炔基”旨在涵盖本发明中的杂亚炔基。
用作分子本身或用作另一分子的一部分的术语“亚环烷基”是指衍生自环烷烃的二价自由基。除非另有说明，“亚环烷基”旨在涵盖本发明中的杂亚环烷基。
本说明书、实施例和权利要求书中使用的术语“亚烷基”旨在涵盖“未取代的亚烷基”和“取代的亚烷基”。其中，后者是指具有取代烃的一个或多个碳原子上的氢原子的取代基的亚烷基基团。除非另有明确指出，所述取代基可包括例如卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸基团、膦酸酯基团、次膦酸酯基团、氨基基团、酰胺基团、脒基、亚胺基团、氰基基团、硝基基团、叠氮基基团、巯基基团、烷硫基基团、硫酸基团、磺酸基团、氨磺酰基团、亚磺酰氨基基团、磺酰基基团、杂环基基团、芳烷基基团或者芳族或杂芳族基团。当被适当取代时，相关领域技术人员可以理解，烃链上的取代残基本身可以被取代。例如，取代的亚烷基的取代基可以包括取代和未取代的氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基(包括膦酸盐/酯和次膦酸盐/酯)、磺酰基(包括硫酸盐/酯、亚磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸盐/酯)和甲硅烷基，并且还可包括醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸根以及酯)、-CF3、-CN及其等同物。示例性的取代烷基如下所述。亚环烷基可以进一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN及其等同物取代。该内容也同样适用于亚烯基和亚炔基。
当与诸如亚烷基、亚烯基或亚炔基的残基一起使用时，术语“Cx-y”旨在涵盖例如在其链中含有x至y个碳原子的残基。例如，术语“Cx-y亚烷基”是指在其链中含有x至y个碳原子的取代或未取代的、直链或支链的亚烷基。例如，其意在示例性地包括卤代亚烷基基团，例如二氟亚甲基、2,2,2-三氟亚乙基等。C0亚烷基是指共价键。术语“C2-y亚烯基”和“C2-y亚炔基”是指取代或未取代的不饱和的脂肪族残基，将如亚烷基的定义中所述的长度和可能的取代的定义应用至该残基。然而，这意味着每个都包含至少一个双键或三键。
术语“点击化学反应”被用作由Scripps研究所的K.Barry Sharpless引入的化学概念，以解释被设计以使两个分子能够快速且稳定地形成共价键的化学反应和互补的化学官能团。所述点击化学反应不是指某种反应，而是指这种快速稳定反应的概念。在任何实施方式中，所述点击化学反应必须是模块化的、范围广、产率高、仅产生微不足道的副产物、立体定向的、生理稳定的、由热力学驱动力驱动(例如，大于84kJ/mol)、和/或具有高的原子经济性。已知一些反应满足如下要求：
(1)Huisgen 1,3-偶极环加成(例如，包括Cu(I)催化的环加成反应，通常称为“点击反应”；参见Tornoe等，Journal of Organic Chemistry(2002)67:3057-3064)：通常将铜或钌用作催化剂；
[Huisgen 1,3-偶极环加成的示意图]
(2)Diels-Alder反应，例如环加成(例如张力促进的环加成(SPAAC))包括正常的电子需求Diels-Alder反应和反电子需求Diels-Alder反应，但本发明不限于此)；
[Diels-Alder反应的示意图]
[Diels-Alder反应的示例；TCO和四嗪]
[张力促进的环加成的示意图]
[张力促进的环加成的示例；叠氮化物和DBCO]
(3)对环氧化物和氮丙啶等的小张力环的亲核加成；
(4)对活化的羰基的亲核加成；
(5)对碳碳双键或三键的加成。
[硫醇和烯烃的加成]
本发明中使用的术语“点击化学官能团”是指参与点击化学反应的官能团。例如，张力炔烃(例如，环辛炔)对应于点击化学官能团。一般而言，所述点击化学反应需要至少两个分子，每个分子都包含彼此互补的点击化学官能团。这样，彼此具有反应性的成对的点击化学官能团在本发明中通常被称为“伴侣点击化学官能团”。例如，在环辛炔与叠氮化物的张力促进的环加成中，叠氮化物是环辛炔和其它炔烃的伴侣点击化学官能团。本发明中使用的示例性的点击化学官能团包括端基炔、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、反式环辛烯、烯烃、硫醇和四嗪，但本发明不仅限于此。其它点击化学官能团是相关领域技术人员已知的。
本发明中使用的术语“离去基团”与相关领域技术人员公知的概念相同(AdvancedOrganic Chemistry:reactions,mechanisms and structure，第四版，Jerry March，JohnWiley和Sons编著；1992，第351-357页)，是指与任何反应物相连的化学官能团，当使反应物经受取代反应(置换反应)、例如亲核取代反应时，该官能团移动。良好的离去基团是指在亲核取代反应过程中容易移动的离去基团。示例性的良好的离去基团包括卤素(F、Cl、Br和I)、甲苯磺酸盐/酯、甲磺酸盐/酯、三氟甲磺酸盐/酯、乙酸酯、三氟甲基乙酸酯、樟脑磺酸盐/酯、2-硫亚基苯并[d]噻唑-3(2H)-基、N-氢化琥珀酰亚胺、N-芳基氧化物和被一个或多个吸电子基团(EWG)取代的芳基氧化物，但本发明不限于此。例如，被一个或多个吸电子基团取代的芳基氧化物包括2-硝基苯氧化物、4-硝基苯氧化物、2,4-二硝基苯氧化物、五氟苯氧化物、2-氯-4-硝基苯氧化物、2,4-二氯苯氧化物和2,4,6-氯苯氧化物，并且吸电子基团例如包括卤素(F、Cl、Br或I)、-NO2、-CN、-C(O)(C1-6烷基)、-C(O)(芳基)、-C(O)O(C1-6烷基)、-C(O)O(芳基)等。
本发明中使用的术语“相互作用组”是指当蛋白质之间或肽之间存在蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)时，参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质或肽。例如，伴侣蛋白和它的乘客蛋白是相互的相互作用组。“蛋白质-蛋白质相互作用”是指两个或更多个蛋白质或肽分子相互作用，以高度特异性地彼此物理接触。在这种情况下，因果性的相互作用包括电磁力、氢键和疏水相互作用，但本发明不限于此。
本发明中使用的术语“抗体相互作用组”是指包括免疫球蛋白在内的抗体的相互作用组。示例性的抗体相互作用组列于表1中。其中，已知肽(如Fc-III等)对免疫球蛋白的Fc结构域具有结合活性。在这种情况下，这些肽也被称为“Fc相互作用组”。
根据本发明，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白通常是众所周知的，并且具有与特定抗原特异性结合的能力。然而，因为根据本发明的抗体是还涵盖其片段的概念，所以该抗体不必像在Fc片段的情况下那样显示与特定抗原的结合能力。除了天然存在的免疫球蛋白外，所述抗体还旨在涵盖具有相同或相似结构的所有重组蛋白、融合蛋白、嵌合蛋白、人免疫球蛋白、非人动物免疫球蛋白等。
根据本发明，术语“偶联物”是指当偶联物伴侣在一起以形成共价键时制成的异质分子。共价键可以优选地通过点击化学反应形成。术语“偶联物伴侣”是指旨在形成偶联物的每个分子。在这种情况下，为方便起见，当希望进行缀合的人打算将某个分子连接到任何其它分子时，该特定分子通常可以称为“靶分子”或“靶蛋白”，而任何其它分子通常可以称为“载荷分子”或“载荷部分”。
根据本发明，术语“载体(carrier)部分”是指构成偶联物的分子的一部分，即起到增强与其连接的分子的血清稳定性或延长分子的半衰期的作用的分子。可用作载体部分的分子在相关领域中是众所周知的。载体部分的代表性实例包括白蛋白、明胶、弹性蛋白(包括原弹性蛋白)、源自弹性蛋白的多肽(α-弹性蛋白和弹性蛋白样多肽(ELP))、麦醇溶蛋白、豆球蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆蛋白(例如，大豆分离蛋白(SPI))、乳蛋白、乳清蛋白、胆红素等，但本发明不限于此。
根据本发明，术语“荧光部分”旨在涵盖用于荧光的染料或染料试剂。可用作染料和染料试剂的分子在相关领域中是众所周知的。荧光部分的代表性实例列于表2中，但本发明不限于此(Immunotech-Coulter Corp.目录，“Cytometry Monoclonal Reagent Guide”，8/95，p.3)。
<表2>荧光部分的列表
根据本发明，术语“药物部分”是指对任何疾病具有治疗作用的分子。根据本发明的药物部分包括本领域普通技术人员已知的对任何疾病有效的药物部分。通常，具有抗癌作用的药物部分包括DM1、DM3、DM4、相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、凋亡诱导剂、抗血管生成剂、淋巴因子、紫杉烷、DNA-烷化剂、蒽环、Tubulysin类似物、倍癌霉素类似物、auristatin E、auristatin F、美登素类化合物(maytansinoid)、包含反应性聚乙二醇残留部分的细胞毒性剂、taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、t.秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-二氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺铂、更生霉素、博来霉素、氨茴霉素、卡奇霉素、阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、达沙替尼、多西他赛、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、奈达铂、尼洛替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙铂、索拉非尼、vemurafenib、舒尼替尼、替尼泊苷、triplatin和长春瑞滨，但本发明不限于此。
根据本发明，术语“放射性部分”是指包括放射性同位素的部分。放射性同位素标记可用于诊断成像和放射治疗。代表性的放射性部分包括18F、11C、125I、123I、124I、131I和99mTc，但本发明不限于此。
术语“药学上可接受的载体”可以在包括赋形剂、稀释剂或佐剂的意义上使用。所述载体例如可选自于由以下组成的组：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐/酯、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、生理盐水、PBS等缓冲液、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。所述载体可包括填充剂、抗凝聚剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂或它们的组合。
术语“药学上可接受的盐”是指在其中保留了蛋白质组和根据本发明化合物的生物学有效性和性质并且在生物学或其它方面并非是不期望的盐。在许多情况下，本发明的蛋白质组和化合物可以在带电基团例如带电氨基和/或羧基等存在下形成酸性和/或碱性盐。药学上可接受的酸加成盐可从无机酸和有机酸制备，而药学上可接受的碱加成盐可从无机碱和有机碱制备。
术语“治疗”是指获得有益或期望的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果的非限制性实例包括症状的缓解、疾病范围的减小、疾病状态的稳定(即，不恶化)、进展的延迟或疾病的进展率的降低，(部分或全部)改善或暂时缓解和减轻疾病状况，以及是否可检测到。所述治疗表示所有治疗性治疗以及防病性或预防性方法。所述治疗包括待预防的紊乱和已经发生的紊乱所需的治疗。“缓解”疾病是指与未治疗疾病时相比，一系列的疾病状况和/或不期望的临床征象降低和/或疾病进展的时间进程被延迟或延长。
“治疗有效量”(或“有效量”)是指当给予受试者或患者时足以实现治疗的活性成分、例如根据本发明的试剂的量。因此，相关领域的技术人员可以容易地确定构成根据本发明的组合物的治疗有效量的内容。在视力治疗的背景下，“治疗有效量”是引起与眼部疾病或病症的治疗相关的一个或多个参数的客观上测量的变化的量，其包括与眼部疾病或病症相关的一个或多个基因表达的增加或减少、细胞凋亡或其它细胞死亡途径的诱导、症状的临床改善、异常的新血管形成或炎症的减少等。当然，所述治疗有效量可以根据待治疗的病症和特定受试者、受试者的体重和年龄、疾病病症的严重程度、待选择的特定化合物、随后的给药方案、给药时间调整、给药模式等而变化，相关领域的技术人员可以很容易地确定所有这些。在组合疗法的上下文中，应当理解，构成某种活性成分的治疗有效量可能不同于构成被用于单一疗法而给予的活性成分的治疗有效量(即，使用一种化学实体作为活性成分的治疗方案)。
“受试者”或“患者”是指需要可通过本发明的分子实现的治疗的动物。待根据本发明进行治疗的动物包括脊椎动物。动物的特别优选的实例包括哺乳动物，例如，牛、犬、马、猫、羊、猪和灵长类动物(包括人和非人灵长类动物)。
术语“大约或约(about或approximately)”是指相对于参考的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、分量、重量或长度，变化30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、分量、重量或长度。
1.抗体
应当理解，本发明的描述旨在提供对所提供的抗体的结构、学术体系和生理作用的描述以帮助理解本发明，并且落入本发明的权利范围内的抗体并不旨在限制本发明的描述。
抗体由本领域已知的两条重链和两条轻链组成。当将抗体在功能方面简单地划分时，抗体被划分为包含轻链的抗原结合可变区的片段(Fab)和作为重链的一部分构成的可结晶区的片段。Fab包括与抗原结合的互补位，并且是指如本领域已知的允许抗体对抗原具有特异性结合活性的区域。由于Fc结构域是细胞中的Fc受体(FcR)的配体，因此它在诱导免疫应答中起着重要作用。Fc结构域通过与新生儿Fc受体结合，也在延长抗体的半衰期方面发挥重要作用，从而使抗体可以反复地内化到细胞中。
从这些事实可以推断出标记抗体的一些期望的方向性：(1)，首先，期望在与抗体的互补位间隔开的位置处标记抗体。当在互补位上或在与互补位相邻的位置处进行标记时，抗体对抗原的结合亲和力可能显著降低。(2)其次，期望在与包括FcRn的FcR识别位点间隔开的位置处标记抗体。当在受体的识别位点或与识别位点相邻的位置处进行标记时，可能会降低抗体的免疫反应诱导功能，或者会缩短抗体的半衰期。关于Fc结构域结合活性基序的信息可见于DeLano,W.L.(2000):Convergent Solutions to Binding at a Protein-Protein Interface；Science,287(5456),1279-1283和W.Lance Martin等,(2001)，Molecular Cell，第7卷，867-877，2001年4月。
在本发明中，当提及抗体的Fc结构域的氨基酸序列时，除非另有说明，否则序列中的编号均按照EU编号系统编号。在研究了IgG的序列后，EU编号系统已被广泛用作Fc结构域的测序系统，如Edelman GM等，The covalent structure of an entire gammaGimmunoglobulin molecule；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1969年5月；63(1):78-85中所述。
1.1.搜索期望的标记位点
可以鉴于标记位点的标准来设计抗体的标记位点，即(1)与互补位间隔开的位点；以及(2)与包括FcRn的FcR识别位点间隔开的位点。用于生物偶联反应中的氨基酸的实例通常包括赖氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。存在于抗体Fc结构域中的赖氨酸246(Lys246)和赖氨酸248(Lys248)是满足所有要求的残基，并因此都是期望的标记位点。包含Lys246和Lys248残基的Fc结构域的序列为GPSVFLFPPKPKDTLMI，并且在图1中示出了在按照EU编号系统编号的序列中的序列和编号(图1，SEQ ID NO:1)。
在具体的实施方式中，根据本发明的抗体可包括SEQ ID NO:1或其衍生物的序列。根据本发明的抗体还可以包括其中赖氨酸246被取代的SEQ ID NO:1的衍生物。此外，根据本发明的抗体可以包括其中赖氨酸248被取代的SEQ ID NO:1的衍生物。此外，根据本发明的抗体可以包括其中赖氨酸246和赖氨酸248被取代的SEQ ID NO:1的衍生物。
SEQ ID NO:1或其衍生物的序列包括在可接受范围内突变的序列。在具体的实施方式中，突变的序列可以相对于SEQ ID NO:1或其衍生物具有大于或等于约90％、约85％、约80％、约75％或约70％的同源性。在以下指明的具体的实施方式中，应理解，式7-1至式7-3、式8-1至式8-3和式10-1至式10-3表示的SEQ ID NO:1的衍生物还包括在可接受的范围内突变的序列。
图2示出了包括赖氨酸246和赖氨酸248的Fc结构域中的赖氨酸残基的位置。
2.接头(R1′-L1)
本发明公开了能够用于标记抗体的新型化合物。为方便起见，此类化合物在本文中称为接头，由符号“R1′-L1”表示。
本发明提供具有下述式1的结构的化合物：
[式1]
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X2为比碳更具电负性的元素，并且
R2′为第二化学官能团。
在式1中，与D1连接的羰基基团被称为第一羰基基团。此外，与D2连接的羰基基团被称为第二羰基基团。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。当D1为共价键时，R1′与所述第一羰基的碳彼此直接相连。在下文中，当描述化合物的结构时，所有的亚烷基、亚烯基、亚炔基和亚环烷基分别旨在包括杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基和杂亚环烷基，它们的内涵也在“定义”部分中指明。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。X1还可以为S。X1可以从所述第一羰基基团的碳吸引电子以活化所述第一羰基基团。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任何一种。D2还可以是C1-2亚烷基。此外，D2可以是亚甲基。
在具体的实施方式中，X2可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。X2还可以是O。X2可以从所述第二羰基基团的碳吸引电子以活化所述第二羰基基团。
在具体的实施方式中，R2′可以为卤素、N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。
在具体的实施方式中，R2′和X2一起可形成离去基团。例如，X2可以为O，并且R2′可以为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。R2′还可以为N-琥珀酰亚胺。当良好的离去基团连接至所述第二羰基基团时，可以增强所述第二羰基基团的反应性。例如，已知N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)显示出非常高的反应性。
本发明提供具有下述式1-2的结构的化合物：
[式1-2]
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，并且
R2′为第二化学官能团。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为C1-2亚烷基。此外，D1可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，R2′和O一起可形成离去基团。在这种情况下，R2′可以为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。此外，R2′可以为N-琥珀酰亚胺。
在具体的实施方式中，式1-2表示的化合物可以具有下述式1-3的结构：
[式1-3]
2.1.包括第一点击化学官能团(H1-L1)的接头
本发明提供具有下述式2的结构的化合物：
[式2]
其中，H1为第一点击化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X2为比碳更具电负性的元素，并且
R2′为第二化学官能团。具有式2结构的接头在本文中被称为“包含第一点击化学官能团的接头”，其由符号“H1-L1”示出。
在式2中，连接到D1的羰基基团被称为第一羰基基团。此外，与D2连接的羰基基团被称为第二羰基基团。
在具体的实施方式中，H1可以包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任何一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D1可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。此外，X1可以为S。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D2还可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，X2可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。此外，X2可以为O。
在具体的实施方式中，R2′可以为卤素、N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。
在具体的实施方式中，R2′和X2一起可形成离去基团。例如，X2可以为O，并且R2′可以为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。R2′还可以为N-琥珀酰亚胺。
在具体的实施方式中，式2表示的化合物可以具有选自下述式2-1至2-3中的任一种的结构：
[式2-1]
[式2-2]
[式2-3]
2.2.由于所述第一羰基基团和所述第二羰基基团之间的反应性的不同，可以具体确定发生取代反应的位置
当设计式1和式2的接头及其子实例时，可以基于X1、X2和R2′的设计来指明取代反应的位点。
本发明中公开的接头的作用是通过活化的第一和/或第二羰基基团之间发生的取代反应将R1′转移至靶标分子。这样的取代反应示意性地显示在下述的方案1中。
[方案1]
在方案1中，为了方便起见，靶标分子被指定为“Nu：”。Nu：用作亲核试剂，因为它具有非共享电子对，引起与所述第一羰基基团和/或第二羰基基团的亲核酰基取代反应以与接头形成键。在亲核酰基取代反应中，羰基基团的反应性可由离去基团的碱性决定。因此，已知羰基基团的反应性按羧酸盐/酯、酰胺、羧酸、酯、硫酯和酰基磷酸盐/酯的顺序增加。还已知羰基基团如NHS酯等具有高反应性，因为羰基基团形成非常稳定的离去基团。
在具体的实施方式中，X1和X2可以为比碳更具电负性的元素。X1和X2还可以为NR1、S或O，其中R1可以为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。因为X1和X2与它们所连接的残基一起可形成离去基团，所以羰基可被活化。
在这种情况下，羰基基团的活化可以任选地允许Nu：i)优先与所述第一羰基基团反应或ii)优先与所述第二羰基基团反应。这种反应趋势可以根据所述第一羰基基团和所述第二羰基基团之间的反应性的差异来确定。例如，当包括X1的离去基团的碱性低于包括X2的离去基团的碱性时，所述第一羰基基团可以先反应。在另一实施方式中，当包括X2的离去基团的碱性低于包括X1的离去基团的碱性时，所述第二羰基基团可以先反应。
在优选的实施方式中，根据本发明的接头中所述第二羰基基团的反应性优选高于所述第一羰基基团的反应性。根据本发明，通过如下来实现选择性反应：允许X2-R2′连接至所述第二羰基基团以形成良好的离去基团，并将所述第一羰基基团设计成显示出温和的反应性的酰胺、硫酯、酯等(显示出中等的反应性)。例如，在式1-3的接头的情况下，所述第二羰基基团可以是NHS酯，从而使其比所述第一羰基基团(硫酯)反应更快。
公开号US 2018/0141976 A1和WO 2018/199337 A1中公开的现有技术在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂形成方面与本发明相似(参见下文第4节)，但与本发明的不同之处在于交联剂包括两种NHS酯。所述交联剂的两个羰基基团具有相同的反应性，并且其难以以高产率制备用于化学官能团的转移的期望试剂。由于NHS酯的高反应性，所述交联剂还具有与两个SSFI反应的高可能性。根据本发明，通过将所述第一羰基基团设计为具有温和反应性的硫酯等，已经解决了这些问题。
3.位点特异性抗体相互作用组(SSAI)
根据本发明，公开了用于使待标记的分子与抗体的特定位点紧密接触的新型肽。为方便起见，此类肽在本文中称为位点特异性抗体相互作用组，由符号“SSAI”示出。
根据本发明提供的所述SSAI可以对抗体的特定位点具有结合活性。
在具体的实施方式中，所述SSAI可以对所述抗体的Fab结构域具有结合活性。在这种情况下，所述SSAI可以优选地对与所述抗体的互补位间隔开的位点具有结合活性。
在具体的实施方式中，所述SSAI可以对所述抗体的Fc结构域具有结合活性。在这种情况下，所述SSAI可以优选对所述抗体的FcRn结合位点或与影响抗体的FcRn结合位点的抗体残基间隔开的位点具有结合活性。
3.1.位点特异性Fc相互作用组(SSFI)
在所述SSAI中，对所述Fc结构域具有特异性结合活性的肽在本文中被称为“位点特异性Fc相互作用组”，其由符号“SSFI”表示。
在具体的实施方式中，所述SSFI可以包括由下述的式3表示的氨基酸序列：
[式3]
(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3(SEQ ID NO:3)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1-3亚烷基，并且X3为NH2、OH或SH。作为序列AWHLGELVW(SEQ ID NO:2)的类似物，该序列是在文章“Dias,R.L.A等(2006),Protein Ligand Design:From Phage Display to Synthetic Protein EpitopeMimetics in Human Antibody Fc-Binding Peptidomimetics；Journal of the AmericanChemical Society,128(8),2726-2732和DeLano,W.L.等，Convergent solutions tobinding at a protein-protein interface；Science 2000,287,1279-1283”中被发现对Fc结构域具有结合活性的序列。根据本发明的Fc结合活性基序具有如下特征：1)首先，指明具有Fc结合活性的关键残基。2)该基序还被设计为通过将SEQ ID NO:2的第4个亮氨酸改变为具有自由电子对的Xa1来允许与接头的亲核取代反应。(X)n表示其由n个X组成，并且(X)n-m表示由n个以上且m个以下的X组成。以下，与D3连接的碳称为“β碳(β-碳)”。
式3的氨基酸序列还可具有由下述式3-1表示的结构：
[式3-1]
A-W-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3(SEQ ID NO:4)
其中，A为丙氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1-3亚烷基，并且X3为NH2、OH或SH。在式3和式3-1中，X3可以为NH2。或者，Xa2可以为谷氨酸。或者，Xa3可以为色氨酸。
当包含式3及其子实例的每个氨基酸序列的肽处于其中的内部残基彼此连接的环肽形式时，已知该肽具有更好的结合活性。本发明提供了包含式3的氨基酸序列的环肽。
本发明提供了具有下述式4-1的结构的环肽：
[式4-1]
LP-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-DP(SEQ ID NO:5)
其中，N-端LP和DP形成D-脯氨酸-L-脯氨酸模板，
每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1-3亚烷基，X3为NH2、OH或SH。
在具体的实施方式中，X3可以为NH2。在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
本发明提供了具有下述式4-2的结构的环肽：
[式4-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(SEQ ID NO:6)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
C为半胱氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1-3亚烷基，X3为NH2、OH或SH。
在具体的实施方式中，所述肽可由13个以上且17个以下的氨基酸残基组成。
在具体的实施方式中，位于N-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸和位于C-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸可任选地彼此连接。
在具体的实施方式中，X3可以为NH2。在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
在具体的实施方式中，构成N-端(X)1-3的残基中的一个和构成C-端(X)1-3的残基中的一个可以彼此结合。在一个示例性实施方式中，式4-2的肽可具有下述式4-3的结构：
[式4-3]
LP-D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T-DP(SEQ ID NO:7)
其中，N-端LP和DP可以形成D-脯氨酸-L-脯氨酸模板。
在另一示例性实施方式中，式4-2的肽可以具有下述式4-4的结构：
[式4-4]
C-D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T-C(SEQ ID NO:8)
其中，N-端半胱氨酸和C-端半胱氨酸可以彼此连接。
本发明提供了具有下述式4-5的结构的环肽：
[式4-5]
D-C-(Xaa)2-H-Xa1-G-Xa2-L-V-Xa3-C-T(SEQ ID NO:9)
其中，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，
每个Xaa独立地为除半胱氨酸以外的任何氨基酸，
C为半胱氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
Xa1为其中D3为共价键或C1-3亚烷基，并且X3为NH2、OH或SH。
在具体的实施方式中，所述肽可由13个以上且17个以下的氨基酸残基组成。
在具体的实施方式中，位于N-端起2个氨基酸处的半胱氨酸和位于C-端起2个氨基酸处的半胱氨酸可以任选地彼此连接。在具体的实施方式中，X3可以为NH2。在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
在具体的实施方式中，式4-5可以与下述式4-6相同：
[式4-6](SEQ ID NO:10)
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T(SEQ ID NO:10)
其中，A为丙氨酸，E为谷氨酸。
具有式4-1至式4-6的结构的肽可具有对抗体的结合活性。此外，所述肽可能对免疫球蛋白G(IgG)具有结合活性。此外，所述肽可能对抗体的Fc结构域具有结合活性。
在具体的实施方式中，根据本发明的SSFI的N-端可以被琥珀酰化。在具体的实施方式中，根据本发明的SSFI可以在其N-端(X)1-3处包括极性氨基酸残基。在其它的具体实施方式中，根据本发明的SSFI可以在其C-端(X)1-3处包括极性氨基酸残基。在这种情况下，所述极性氨基酸残基包括酸性氨基酸和碱性氨基酸。所述极性氨基酸残基还可包括谷氨酸或天冬氨酸。
3.2.根据本发明的位点特异性Fc相互作用组可与具有特定的拓扑结构的抗体的Fc结构域一同排列。
在本文中，提供式4-6的化合物作为一个实例以帮助理解本发明，但本发明的范围不限于此。应注意，以下描述也适用于式3、式3-1和式4-1至式4-6的化合物，并且为方便起见，式4-6的化合物仅作为一个实例提供。
如上所述，根据本发明的SSFI对所述抗体的Fc结构域具有结合活性。在这种情况下，由于氨基酸残基之间的相互作用，SSFI可以与具有特定拓扑结构的Fc结构域一同排列。根据本发明的SSFI序列与所述Fc结构域之间的代表性的相互作用包括：(1)SSFI与Fc结构域中的组氨酸433的盐键，(2)SSFI与天冬酰胺434的氢键，(3)SSFI与谷氨酸380的盐键，(4)SSFI与精氨酸255的盐键等。由此形成的这些相互作用和特定拓扑结构可以从本领域已知的研究结果确定(参见DeLano,W.L.等，Convergent solutions to binding at aprotein-protein interface；Science 2000,287,1279-1283)。
当设计根据本发明的SSFI时，所述SSFI与所述Fc结构域形成稳定的拓扑结构是重要的。这是因为用于将第一化学官能团转移至根据本发明的所述抗体的试剂以及使用该试剂的标记过程是基于研究中发现的SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构设计的(参见以下的第5.2节、第5.3节和第5.4节)。当所述SSFI和所述Fc结构域之间的相互作用在SSFI的设计过程中变得不稳定以干扰其分子之间的拓扑结构时，这是不利的，因为相互作用可能会对标记过程产生负面影响。
将参考示例性化合物描述设计原理的一个实施方式。由式4-6表示的SSFI具有如下结构：
[式4-6]
D-C-A-W-H-Xa1-G-E-L-V-W-C-T(SEQ ID NO:10)。
基于文献中的数据模拟SEQ ID NO:10所示的SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构的结果等在图3和图4中示出(参见DeLano,W.L.等,Convergent solutions to binding at aprotein-protein interface；Science 2000,287,1279-1283)。在这种情况下，所述SSFI中第5位的组氨酸残基与所述Fc结构域中的谷氨酸380形成盐键，表明该盐键对SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构有显著影响(参见图4中的虚线)。因此，期望在SSFI的设计过程中组氨酸残基及其位置不改变(参见式3、式3-1和式4-1至式4-6中的残基Xa1紧接着的“H”)。此外，证实谷氨酸8是显示电负性的残基，并因此与Fc结构域中的显示电正性的精氨酸255形成盐键，从而对SSFI和Fc结构域之间的拓扑结构产生显著影响(参见图4中的虚线)。因此，相应的残基优选为可以对应于谷氨酸的酸性氨基酸，并且可以被天冬酰胺替换(参见式3、式3-1和式4-1至式4-6中的残基Xa2)。当氨基酸残基被其它氨基酸残基取代或被任何官能团取代时，这可能对分子间相互作用产生影响，从而对所述SSFI和所述Fc结构域之间的拓扑结构产生影响。
此外，SEQ ID NO:10序列中的第7位的甘氨酸是形成所述SSFI弯曲(bent)结构所需的小氨基酸。因此，期望在设计SSFI期间不改变甘氨酸残基及其位置(参见式3、式3-1和式4-1至式4-6中残基Xa1和Xa2之间的“G”)。
图5显示了所述Fc结构域的赖氨酸残基和所述SSFI之间的拓扑结构。基于所述拓扑结构，可以看出最靠近残基Xa1的Fc结构域的赖氨酸残基是赖氨酸246和赖氨酸248(图5)。
测量赖氨酸246的胺基与Xa1的β碳之间的距离。结果证实，在构成赖氨酸支链的键旋转时，测量的最小距离约为(以下称为“D246,min”)，并且测量的最大距离约为(以下称为“D248,max”)(图6)。
测量赖氨酸248的胺基与Xa1的β碳之间的距离。结果证实，在构成赖氨酸支链的键旋转时，测得的最小距离约为(以下称为“D248,min”)，并且测得的最大距离约为(以下称为“D248,max”)(图7)。
如以下第5.3节所述，距离关系可能是设计所述接头和所述SSFI以及将第一个化学官能团转移到抗体的试剂中的重要考虑因素。
4.将第一化学官能团转移至抗体的试剂；R1′-L1和SSAI的偶联物(R1′-L2-SSAI)
根据本发明，公开了用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂。这种化合物在本文中由符号“R1′-L2-SSAI”示出。根据其结构，该化合物也被称为R1′-L1和SSAI的偶联物(R1′-L2-SSAI偶联物)。
本发明提供具有下述式5的结构的R1′-L2-SSAI：
[式5]
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
D3为共价键或C1-3亚烷基，
X3为NH、O或S，并且
SSAI为位点特异性抗体相互作用组。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。此外，所述点击化学官能团可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。X1还可以为S。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任何一种。D2还可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，X3可以为NH。
在具体的实施方式中，所述SSAI可以为对Fab具有结合活性的肽序列。在其它的具体实施方式中，所述SSAI可以为对Fc结构域具有结合活性的肽序列。
当式5中的SSAI为SSFI时，由符号“R1′-L2-SSFI”示出。根据本发明的R1′-L2-SSFI通过根据本发明的SSFI的Xa1与R1′-L1的第二羰基基团的亲核取代反应产生(参见以下的第4-2节和方案2)。因此，根据本发明的R1′-L2-SSFI包括其中式3、式3-1和式4-1至式4-6中的SSFI的Xa1被(Xa1)′取代的那些，但本发明不限于它们的以下的示例性实施方式。
本发明提供包含下述式5-1的氨基酸序列的R1′-L2-SSFI：
[式5-1]
(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3(SEQ ID NO:11)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
(Xa1)′为
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
D3为共价键或C1-3亚烷基，以及
X3为NH、O或S。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分或药物部分。R1′还可包含VC接头。此外，R1′可包括放射性部分。R1′还可以包括药物部分。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D1可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任何一种。D2还可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，X3可以为NH。
在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
本发明提供具有下述式5-2的结构的R1′-L2-SSFI：
[式5-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(SEQ ID NO:12)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
C为半胱氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且(Xa1)′为
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
D3为共价键或C1-3亚烷基，以及
X3为NH、O或S。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以是-CH2OCH2-。此外，D1可以是共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D2还可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，式5-2可由13个以上且17个以下的氨基酸残基(包括(Xa1)′)组成。
在具体的实施方式中，位于N-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸和位于C-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸可以任选地彼此连接。
在具体的实施方式中，X3可以为NH。在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
在具体的实施方式中，构成N-端(X)1-3的残基中的一个和构成C-端(X)1-3的残基中的一个可以彼此结合。
在具体的实施方式中，式5-2可以与式5-3相同：
[式5-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T(SEQ ID NO:13)
其中，A为丙氨酸，并且E为谷氨酸。
具有式5和式5-1至式5-3的结构的R1′-L2-SSAI或R1′-L2-SSFI可具有对抗体的结合活性。R1′-L2-SSAI或R1′-L2-SSFI还可能对免疫球蛋白G(IgG)具有结合活性。此外，R1′-L2-SSAI或R1′-L2-SSFI可能对所述抗体的Fc结构域具有结合活性。
4.1.将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂；H1-L1和SSAI的偶联物(H1-L2-SSAI)
根据本发明，公开了用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂。这种化合物在本文中由符号“H1-L2-SSAI”示出。根据其结构，该化合物也被称为H1-L1和SSAI的偶联物(H1-L2-SSAI偶联物)。在这种情况下，当所述SSAI是SSFI时，由符号“H1-L2-SSFI”示出。
根据本发明的H1-L2-SSAI或H1-L2-SSFI包括其中R1′包含第“4.将第一化学官能团转移至抗体的试剂”节中的点击化学官能团的那些，但本发明不限于其以下的示例性实施方式。
本发明提供了包含下述式6-1的氨基酸序列的H1-L2-SSFI：
[式6-1]
(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3(SEQ ID NO:14)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且
(Xa1)′为
其中H1为第一点击化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
D3为共价键或C1-3亚烷基，以及
X3为NH、O或S。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任何一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D2可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，X3可以为NH。
在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
本发明提供具有下述式6-2的结构的H1-L2-SSFI：
[式6-2]
(Xaa)1-3-C-(Xaa)2-H-(Xa1)′-G-Xa2-L-V-Xa3-C-(Xaa)1-3(SEQ ID NO:15)
其中，每个Xaa独立地为除半胱氨酸之外的任何氨基酸，
C为半胱氨酸，H为组氨酸，G为甘氨酸，Xa2为谷氨酸或天冬酰胺，L为亮氨酸，V为缬氨酸，Xa3选自色氨酸、萘丙氨酸和苯丙氨酸，并且(Xa1)′为
其中，H1为第一点击化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X1为比碳更具电负性的元素，
D2为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
D3为共价键或C1-3亚烷基，以及
X3为NH、O或S。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任何一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D1可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，X1可为NR1、S或O，其中R1可为H、卤素或者取代或未取代的C1-3亚烷基。
在具体的实施方式中，D2可包括选自C1-7亚烷基、C2-7亚烯基、C2-7亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D2可以为C1-2亚烷基。此外，D2可以为亚甲基。
在具体的实施方式中，式6-2可由13个以上且17个以下的氨基酸残基(包括(Xa1)′)组成。
在具体的实施方式中，位于N-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸和位于C-端起2至4个氨基酸处的半胱氨酸可以任选地彼此连接。
在具体的实施方式中，X3可以为NH。在具体的实施方式中，(X)2可以为AW。在具体的实施方式中，Xa2可以为谷氨酸。在具体的实施方式中，Xa3可以为色氨酸。
在具体的实施方式中，构成N-端(X)1-3的残基中的一个和构成C-端(X)1-3的残基中的一个可以彼此结合。
在具体的实施方式中，式6-2可以与式6-3相同：
[式6-3](SEQ ID NO:16)
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T(SEQ ID NO:16)
其中，A为丙氨酸，并且E为谷氨酸。
具有式6-1至式6-3的结构的H1-L2-SSAI或H1-L2-SSFI可对抗体具有结合活性。H1-L2-SSAI或H1-L2-SSFI还可能对免疫球蛋白G(IgG)具有结合活性。此外，H1-L2-SSAI或H1-L2-SSFI可能对所述抗体的Fc结构域具有结合活性。
4.2.制备将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法
根据本发明，公开了制备R1′-L2-SSAI、R1′-L2-SSFI、H1-L2-SSAI和H1-L2-SSFI(以下通常称为“R1′-L2-SSAI”)的方法。应注意提供以下制备方法的描述以帮助理解本发明。
例如，将描述制备式5化合物的方法。在具体的实施方式中，式5的化合物可以通过以下的方案2的反应来制备。
[方案2]
根据本发明的R1′-L2-SSAI可以通过使位点特异性抗体相互作用组(SSAI)与根据本发明的接头(R1′-L1)反应来制备。根据本发明的SSAI被设计为包括亲核体X3。X3可以攻击接头中包含的活化羰基基团以引起亲核取代反应。在这种情况下，由于X3攻击所述第二羰基的碳，因此制备了根据本发明的R1′-L2-SSAI。
作为更具体的实例，将描述制备式6-3的化合物的方法。在具体的实施方式中，式6-3的化合物可以通过以下的方案3的反应来制备。
[方案3]
包含根据本发明的式3或式3-1的氨基酸序列并具有式4-1至式4-6的结构中的每一个的SSAI包括包含亲核体X3的Xa1残基。由于X3攻击接头中包含的所述第二羰基，因此制备了根据本发明的R1′-L2-SSAI。
在具体的实施方式中，在根据本发明的接头中，包括X2的离去基团的碱性可以低于包括X1的离去基团的碱性。在具体的实施方式中，根据本发明的接头可以允许连接到所述第二羰基基团的X2-R2′形成良好的离去基团。X2还可以为O，并且R2′可以为N-琥珀酰亚胺、对硝基苯基或五氟苯基。在这种情况下，所述第二羰基基团的反应性高于所述第一羰基基团的反应性。因此，SSAI的X3可以特异性攻击所述接头的所述第二羰基基团。
根据本发明，公开了制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法。
本发明提供了制备R1′-L2-SSAI的方法，所述方法包括：使根据本发明的接头与根据本发明的位点特异性抗体相互作用组反应。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式1、式2和式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述位点特异性抗体相互作用组可以包括或具有选自式3、式3-1和式4-1至式4-6的任意一种结构。
所述接头还可以具有式2的结构，并且所述位点特异性抗体相互作用组可以具有选自式4-2至式4-6的任意一种结构。此外，所述位点特异性抗体相互作用组可以具有式4-6的结构。
根据本发明，公开了制备用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的方法。
本发明提供了制备H1-L2-SSAI的方法，所述方法包括：使根据本发明的接头与根据本发明的位点特异性抗体相互作用组反应。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式2、式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，位点特异性抗体相互作用组可以包括或具有选自式3、式3-1和式4-1至式4-6的任意一种结构。
接头还可以具有式2的结构，并且位点特异性抗体相互作用组可以具有选自式4-2至式4-6的任意一种结构。此外，位点特异性抗体相互作用组可以具有式4-6的结构。
根据本发明，公开了用于制备将第一化学官能团转移至抗体的试剂的试剂盒。
本发明提供了用于制备将第一化学官能团转移至抗体的试剂的试剂盒，所述试剂盒包含根据本发明的接头和根据本发明的位点特异性抗体相互作用组。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式1、式2和式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述位点特异性抗体相互作用组可以包括或具有选自式3、式3-1和式4-1至式4-6的任意一种结构。
所述接头还可以具有式2的结构，并且所述位点特异性抗体相互作用组可以具有选自式4-2至式4-6的任意一种结构。此外，所述位点特异性抗体相互作用组可以具有式4-6的结构。
根据本发明，公开了用于制备将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的试剂盒。
本发明提供了用于制备将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的试剂盒，该试剂盒包括含有根据本发明的第一点击化学官能团的接头和位点特异性抗体相互作用组。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式2、式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述位点特异性抗体相互作用组可以包括或具有选自式3、式3-1和式4-1至式4-6的任意一种结构。
所述接头还可以具有式2的结构，并且所述位点特异性抗体相互作用组可以具有选自式4-2至式4-6的任意一种结构。此外，所述位点特异性抗体相互作用组可以具有式4-6的结构。
5.含有第一化学官能团(R1′-Ab)的抗体
根据本发明，公开了含有第一化学官能团的抗体。这种化合物在本文中由符号“R1′-Ab”示出。
本发明提供了由式7表示的R1′-Ab：
[式7]
其中，R1′为第一化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X4为NH、O或S，并且
Ab为抗体。
在具体的实施方式中，R1′可以为点击化学官能团。R1′还可以包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任意一种。此外，R1′可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，R1′可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，R1′可以为二烯或亲二烯体。此外，R1′可以为四嗪或降冰片烯。或者，R1′可以为四嗪或反式环辛烯。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D1可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在一个具体实施方式中，X4可为NH。
在具体的实施方式中，Ab可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，Ab可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，Ab可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fab结构域连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域连接。X4和Ab还可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸248连接。或者，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248连接。在具体的实施方式中，X4和Ab可以仅通过Ab的两个Fc结构域中的一个连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的两个Fc结构域连接。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式7-1的氨基酸序列：
[式7-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-K-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:17)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，R1′为第一化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。该抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸246或对应于赖氨酸246的位点连接的R1′。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。此外，R1′可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-1的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式7-1的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式7-2的氨基酸序列：
[式7-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)′-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:18)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，R1′为第一化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。该抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸248或对应于赖氨酸248的位点连接的R1′。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。此外，D1可以是-CH2OCH2-。此外，D1可以是共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-2的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式7-2的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式7-3的氨基酸序列：
[式7-3](SEQ ID NO:19)
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-(K)′-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:19)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，R1′为第一化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。该抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248或对应于赖氨酸246和赖氨酸248的位点连接的R1′。
在具体的实施方式中，R1′可包括点击化学官能团。所述点击化学官能团还可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的一种或多种。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或张力炔烃。此外，所述点击化学官能团可以选自叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，所述点击化学官能团可以选自二烯或亲二烯体。此外，所述点击化学官能团可以选自四嗪或降冰片烯。或者，所述点击化学官能团可选自四嗪或反式环辛烯。此外，R1′可以包含两个或更多个点击化学官能团。
在其它的具体实施方式中，R1′可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包含VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-3的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式7-3的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自式7-1、式7-2和式7-3的一个或多个氨基酸序列。在这种情况下，式7-1至式7-3的序列的内容如上所述。
在具体的实施方式中，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式7-1的氨基酸序列，而可以不包括式7-2和式7-3的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-1的氨基酸序列。此外，所述抗体可以在其两个Fc结构域中均包含式7-1的氨基酸序列。
在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式7-2的氨基酸序列，而可以不包括式7-1和式7-3的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-2的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式7-2的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式7-3的氨基酸序列，而可以不包括式7-1和式7-2的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式7-3的氨基酸序列。此外，所述抗体可以在其两个Fc结构域中均包含式7-3的氨基酸序列。
5.1.含有第一点击化学官能团的抗体
根据本发明，公开了含有第一点击化学官能团的抗体。这种化合物在本文中由符号“H1-Ab”示出。
本发明提供了由式8表示的H1-Ab：
[式8]
其中，H1为第一点击化学官能团，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X4为NH、O或S，并且
Ab为抗体。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任意一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在一个具体的实施方式中，X4可为NH。
在具体的实施方式中，Ab可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，Ab可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，Ab可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，Ab可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fab结构域连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域连接。X4和Ab还可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸248连接。或者，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248连接。在具体的实施方式中，X4和Ab可以仅通过Ab的两个Fc结构域之一连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的两个Fc结构域连接。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式8-1的氨基酸序列：
[式8-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-K-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:20)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，H1为第一点击化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。该抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸246或对应于赖氨酸246的位点连接的H1。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任意一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-1的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-1的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式8-2的氨基酸序列：
[式8-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)′-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:21)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，H1为第一点击化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸248或对应于赖氨酸248的位点连接的H1。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任意一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-1的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-2的氨基酸序列。
本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含下述式8-3的氨基酸序列：
[式8-3](SEQ ID NO:22)
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(K)′-P-(K)′-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:22)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)′为
其中，H1为第一点击化学官能团，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。该抗体或其片段具有通过其Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248或对应于赖氨酸246和赖氨酸248的位点连接的H1。
在具体的实施方式中，H1可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任何一种。此外，H1可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H1可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H1可以为二烯或亲二烯体。此外，H1可以为四嗪或降冰片烯。或者，H1可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-3的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-3的氨基酸序列。
本发明提供抗体或其片段，所述抗体或其片段包含选自式8-1、式8-2和式8-3的一个或多个氨基酸序列。在这种情况下，式8-1至式8-3的序列的内容如上所述。
在具体的实施方式中，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式8-1的氨基酸序列而可以不包括式8-2和式8-3的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-1的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-1的氨基酸序列。
在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式8-2的氨基酸序列，而可以不包括式8-1和式8-3的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-2的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-2的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式8-3的氨基酸序列，而可以不包括式8-1和式8-2的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式8-3的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式8-3的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体发实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为经操纵的抗体。
5.2.制备含有第一化学官能团的抗体的方法
根据本发明，公开了制备R1′-Ab和H1-Ab(以下通常称为“R1′-Ab”)的方法。应注意提供以下制备方法的描述以帮助理解本发明。
例如，将描述制备式7化合物的方法。在具体的实施方式中，式7的化合物可以通过以下方案4的反应来制备。
[方案4]
由于根据本发明的所述接头的第一羰基基团具有温和的反应性，当所述接头的所述第一羰基基团与抗体的胺基具有紧密的位置关系时，可以实现交联。首先，使式5表示的R1′-L2-SSAI与所述抗体的特定部位紧密接触，以产生可能发生反应的环境。因为根据本发明的R1′-L2-SSAI具有对应于所述接头的第一羰基基团的活化羰基基团(即连接到X1的羰基基团)，所以本发明的R1′-L2-SSAI可以引发亲核取代反应。在这种情况下，由于所述抗体中存在的具有自由电子对的原子(X4)充当亲核体来攻击羰基基团，因此可以制备式7的化合物。在这种情况下，通过所述接头的设计，位点特异性抗体相互作用组(SSAI)在被包含在离去基团中时离开，并且所述SSAI从最终的产品移除。这些特性对抗体产品的物理特性具有积极影响，如下面的第5.8节所示。
在具体的实施方式中，X4可以为NH2。X4还可以为赖氨酸残基的NH2。在其它的具体实施方式中，X4可以为SH。X4还可以为半胱氨酸残基的SH。在其它的具体实施方式中，X4可以为OH。
作为更具体的实例，将描述制备包括式8-3的氨基酸序列的抗体或其片段的方法。在具体的实施方式中，包括式8-3的氨基酸序列的化合物可以通过以下的方案5的反应来制备。
[方案5]
具有式6-3的结构(其中两个半胱氨酸残基任选地连接的结构)的化合物针对抗体的Fc结构域，因为该化合物具有SSFI序列(参见第3.2节)。在这种情况下，包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列的抗体在其Fc结构域中包括赖氨酸残基，并且这样的赖氨酸残基可以充当亲核体。示例性的实施方式显示了Fc结构域中的赖氨酸246或对应于赖氨酸246的残基(下文称为“赖氨酸246”)充当亲核体的情况。在这种情况下，赖氨酸246的胺基攻击式6-3的第一羰基基团以产生式8-1的化合物。这样，H1或R1可以被转移到抗体的Fc结构域的赖氨酸残基。在这种情况下，所述化学官能团转移到哪个赖氨酸残基可能取决于接头、SSAI和R1′-L2-SSAI的设计，如下面第5.3节和第5.4节所述。
根据本发明，公开了制备含有第一化学官能团的抗体的方法。
本发明提供了制备R1′-Ab的方法，所述方法包括：用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂与抗体或其片段进行反应。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂可以为选自式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3中的任一种。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，本发明提供了制备抗体的方法，该抗体具有转移至其Fc结构域的特定赖氨酸残基的第一化学官能团。在这种情况下，以下第5.4节中描述的那些方面可以用作将第一化学官能团转移到抗体的试剂。
根据本发明，公开了制备含有第一点击化学官能团的抗体的方法。
本发明提供了制备H1-Ab的方法，包括：用于将第一点击化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂与抗体或其片段进行反应。
在具体的实施方式中，用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以为选自式6-1至式6-3中的任一种。用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂还可具有式6-3的结构。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
在具体的实施方式中，本发明提供了制备抗体的方法，该抗体具有转移至其Fc结构域的特定赖氨酸残基的第一点击化学官能团。在这种情况下，下面第5.4节中描述的那些方面可以用作将第一点击化学官能团转移到抗体的试剂。
根据本发明，公开了用于制备含有第一化学官能团的抗体或其片段的试剂盒。
本发明提供了用于制备含有第一化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包括用于将第一化学官能团转移到根据本发明的抗体的试剂，以及抗体或其片段。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂可以为选自式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3中的任一种。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
另外，本发明提供了制备含有第一化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包括：
根据本发明的接头(R1′-L1)；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
抗体或其片段。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式1、式2和式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述位点特异性抗体相互作用组可以为选自式3、式3-1和式4-1至式4-6中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
本发明提供了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有转移至其Fc结构域的特定赖氨酸残基的第一化学官能团。在这种情况下，以下第5.4节中描述的方面可以用作将第一化学官能团转移到抗体、接头和位点特异性抗体相互作用组的试剂。
根据本发明，公开了用于制备含有第一点击化学官能团的抗体或其片段的试剂盒。
本发明提供了用于制备含有第一点击化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包括将第一点击化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂，以及抗体或其片段。
在具体的实施方式中，用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以为选自式6-1至式6-3中的任一种。用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂还可具有式6-3的结构。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
本发明还提供了用于制备含有第一点击化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包括：
根据本发明的接头(H1-L1)；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
抗体或其片段。
在具体的实施方式中，所述接头可以为选自式2、式2-1至式2-3中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述位点特异性抗体相互作用组可以为选自式3、式3-1和式4-1至式4-6中的任意一种。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为抗体的片段。在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以为野生型抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以为经操纵的抗体。
本发明提供了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有转移到其Fc结构域的特定赖氨酸残基的第一化学官能团。在这种情况下，以下的第5.4节中描述的方面可以用作将第一化学官能团转移到抗体、接头和位点特异性抗体相互作用组的试剂。
5.3.(Xa1)′的作用和(Xa1)′在R1′-L2-SSFI上的位置的设计原理
在本文中，提供式6-3的化合物作为一个实例，以帮助理解本发明，但本发明的范围不限于此。需要注意的是，以下描述也适用于式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3的化合物，并且为了方便起见，式6-3的化合物仅作为所述化合物的一个实例提供。
如第5.2节所讨论的，R1′-L2-SSFI的(Xa1)′的作用为通过亲核取代反应将R1′转移到抗体。根据本发明，认为促进亲核取代反应的条件满足以下要求：(1)(Xa1)′与Fc结构域的赖氨酸残基相邻，以及(2)R1′所结合的指向赖氨酸残基的侧链。预期随着(Xa1)′的位置和侧链的方向变得与Fc结构域的赖氨酸残基更加远离，过程的产量和均匀性会下降。(3)还将优选的是，(Xa1)′的取代位置对SSFI和Fc结构域之间的相互作用没有太大影响(参见第3.2节)。
如图3和图5间接所见，基于下式6-3，确认了关于Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248，满足(1)要求的SSFI中的位置为位置5、位置6、位置7和位置8。
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T
在这种情况下，由于对应位置5的组氨酸与所述Fc结构域中的谷氨酸380形成盐键，组氨酸的替换可能会影响所述SSFI和所述Fc结构域之间的相互作用。因此，这不满足(3)的要求。由于该侧链的方向不靠近赖氨酸246和赖氨酸248，因此这也不满足(2)的要求。由于对应位置7的甘氨酸有助于形成所述SSFI的弯曲结构，因此不期望用大的(Xa1)′残基替换甘氨酸残基。由于对应位置8的谷氨酸与所述Fc结构域中的精氨酸255形成盐键，因此谷氨酸的替换可能会影响所述SSFI和所述Fc结构域之间的相互作用。因此，这不满足(3)的要求(参见第3.2节)。判断出位置6最适合(Xa1)′的位置，因为位置6满足(1)、(2)和(3)的所有要求。因此，基于这些事实完成了根据本发明的R1′-L2-SSFI。
5.4.转移至抗体的R1′的位置可取决于R1′-L1中D2和SSFI中D3的长度而变化。
本文旨在解释根据本发明的R1′-L2-SSFI的优选设计原理。根据R1′-L2-SSFI的设计，可以将R1′特异性地转移至所述Fc结构域的特定赖氨酸残基。另外，本文旨在解释R1′-L1和SSFI的设计原理，以制备优选的R1′-L2-SSFI。
阅读上述第5.2节的本领域普通技术人员可以认识到，当R1′-L2-SSFI的(Xa1)′的所述第一羰基碳与所述Fc结构域的赖氨酸的胺基相邻定位时，可能发生亲核取代反应。基于上述第3.2节的描述，本领域普通技术人员也可以认识到，R1′-L2-SSFI与具有特定拓扑结构的Fc结构域一起排列，其中Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248的胺基与(Xa1)′的β碳间隔一定距离(图5)。通过使用这种组合来设计R1′-L2-SSFI，预期当(1)(Xa1)′的β碳和所述第一羰基碳之间的距离(以下通常称为“Lc”)与(2)(Xa1)′的β碳和特定拓扑结构的所述Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248的胺基之间的距离相同或相像时，其可以特异性地标记期望的赖氨酸残基。
根据本发明的R1′-L2-SSFI的结构和所述Lc在图8中示出。如图8所示，D3、X3、碳原子、D2和X1位于(Xa1)′的β碳和所述第一羰基碳之间。其中，D3和X3与SSFI的设计相关，并且D2和X1与L1-R1′的设计相关。
为方便起见，本发明以如下假定来体现：D3为Cx亚烷基，X3为N，D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且X1为S，其中y为大于或等于1的整数。在这种情况下，假定亚烷基、亚烯基和亚炔基具有相同的长度。如图8所示的所述接头的结构使用Discovery Studio软件建模以计算Lc值。结果，相对于x+y值确定的Lc值列于表3中。在计算过程中，当所述链具有最长的长度时对其进行建模。
<表3>相对于x+y值的Lc值
x+y Lc(A)
1(x＝O，y＝1) 6.616
2 7.784
3 9.102
4 10.299
5 11.599
6 12.816
7 14.100
8 15.334
9 16.601
10 17.848
11 19.099
12 20.357
13 21.592
14 22.857
在下文中，基于图9提供了用于显示所述R1′-L2-SSFI与所述Fc结构域的赖氨酸残基之间的拓扑结构的附图。图9显示了R1′-L2-SSFI与Fc结构域之间的拓扑结构，使得(Xa1)′的侧链的方向(虚线箭头)与图中的x轴平行。如图9所示，可以看出(Xa1)′的侧链指向赖氨酸246和赖氨酸248的胺基(参见第5.3节)。还可从图中看出，取决于Lc的长度，(Xa1)′的侧链可能与赖氨酸246或赖氨酸248特异性地发生反应。图10-图12是沿着示例性的Lc的长度以与图中y轴平行的方向(粗的实线箭头)观察图9的图表的图解。
(Xa1)′的β碳与所述Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248的胺基之间的距离(D246,min、D246,max、D248,min和D248,max)在第3.2节中描述。(Xa1)′的β碳比246位的赖氨酸残基更靠近所述Fc结构域中的赖氨酸248。因此，预期当Lc值短于D246,min(图10)时所述第一羰基碳与赖氨酸248反应良好，当Lc值长于D248,max(图11)时所述第一羰基碳与赖氨酸246反应良好，以及当Lc值长于或等于D246,min且短于或等于D248,max(图12)时所述第一羰基碳将与赖氨酸246和赖氨酸248选择性地反应。
根据本发明，公开了用于将第一化学官能团特异性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸248的R1′-L2-SSFI(参见图11)。
本发明提供用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂，其特征在于(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)短于D246,min(约)。在这种情况下，Lc可以具有约约约约约约或约的值。
在具体的实施方式中，当所述R1′-L2-SSFI具有选自式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3中的任一种结构时，D3为Cx亚烷基，X3为N，D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，X1为S，其中y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为1≤x+y≤5。x和y的和还可以为1、2、3、4或5。例如，x＝0，并且y可以为1≤y≤5。在另一示例性实施方式中，x＝1，并且y可以为1≤y≤4。在又一示例性实施方式中，x＝2，并且y可以为1≤y≤3。在又一示例性实施方式中，x＝3，并且y可以为1≤y≤2。相应的数值范围基于表3中列出的值确定。
根据本发明，公开了用于将第一化学官能团特异性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246的R1′-L2-SSFI。
根据本发明的一个方面，本发明提供了用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂，其特征在于(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)长于D248,max(约)。例如，Lc可以具有约约约约约或约的值。
在具体的实施方式中，当R1′-L2-SSFI具有选自式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3中的任一种结构时，D3为Cx亚烷基，X3为N，D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，X1为S，其中y可以为大于或等于1的整数，并且x和y之和可以大于或等于9。x和y的和还可以为9、10、11或12。例如，x＝0，并且y可以为9≤y≤12。在另一示例性实施方式中，x＝1，并且y可以为8≤y≤11。在又一示例性实施方式中，x＝2，并且y可以为7≤y≤10。在又一示例性实施方式中，x＝3，并且y可以为6≤y≤9。可选地，D2可以为亚炔基。当D2为亚炔基时，(Xa1)′的侧链可能变得立体刚性，从而防止侧链的弯曲。
根据本发明，公开了用于将第一化学官能团选择性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248的R1′-L2-SSFI。
根据本发明的一个方面，本发明提供了用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂，其特征在于(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)具有长于或等于D246,min(约)且短于或等于D248,max(约)的值。在这种情况下，Lc可以具有约约约约约约约或约的值。
在具体的实施方式中，当R1′-L2-SSFI具有选自式5、式5-1至式5-3和式6-1至式6-3中的任一种结构时，D3为Cx亚烷基，X3为N，D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，X1为S，其中y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为6≤x+y≤8。在这种情况下，x和y的和可以为6、7或8。例如，x＝0，并且y可以为6≤y≤8。在另一示例性实施方式中，x＝1，并且y可以为5≤y≤7。在又一示例性实施方式中，x＝2，并且y可以为4≤y≤6。在又一示例性实施方式中，x＝3，并且y可以为3≤y≤5。
根据本发明，公开了制备R1′-L2-SSFI的方法，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸248。
作为第4.2节所述的制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-L2-SSAI的方法，其特征在于包括：使根据本发明的接头与根据本发明的位点特异性抗体相互作用组反应，其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，以及
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为1≤x+y≤5。通过该方法制备的R1′-L2-SSAI还可以与抗体反应，以将所述第一化学官能团特异性地转移至所述抗体的Fc结构域的赖氨酸248。
根据本发明，公开了用于制备R1′-L2-SSFI的试剂盒，所述试剂盒用于将第一化学官能团特异性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸248。
作为第4.2节所述的制备将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-L2-SSAI的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；以及
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为1≤x+y≤5。
根据本发明，公开了制备R1′-L2-SSFI的方法，R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246。
作为第4.2节所述的制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-L2-SSAI的方法，其特征在于包括：
使根据本发明的接头与根据本发明的位点特异性抗体相互作用组反应，其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，并且x与y之和为9≤x+y≤12。通过该方法制备的R1′-L2-SSAI还可以与抗体反应，从而将所述第一化学官能团特异性地转移至所述抗体的Fc结构域中的赖氨酸246。
根据本发明，公开了用于制备R1′-L2-SSFI的试剂盒，所述试剂盒用于将第一化学官能团特异性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246。
作为第4.2节所述的制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-L2-SSAI的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；以及
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为9≤x+y≤12。
根据本发明，公开了制备R1′-L2-SSFI的方法，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团选择性地转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。
作为第4.2节所述的制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-L2-SSAI的方法，其特征在于包括：
使根据本发明的接头与根据本发明的位点特异性抗体相互作用组反应，其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，以及
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为6≤x+y≤8。通过该方法制备的R1′-L2-SSAI可以与抗体反应，以选择性地将第一化学官能团转移至抗体的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。
根据本发明，公开了用于制备R1′-L2-SSFI的试剂盒，所述试剂盒用于将第一化学官能团选择性地转移到抗体的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。
作为第4.2节所述的制备用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-L2-SSAI的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；以及
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为6≤x+y≤8。
根据本发明，公开了制备抗体的方法，该抗体具有特异性地转移到其Fc结构域中的赖氨酸248的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-Ab的方法，其特征在于包括：
用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂与抗体或其片段进行反应，
其中，在将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)短于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3为Cx亚烷基，并且D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为1≤x+y≤5。
根据本发明，公开了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有特异性地转移到其Fc结构域中的赖氨酸248的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂；以及
抗体或其片段，
其中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)短于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3是Cx亚烷基，并且D2是Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为1≤x+y≤5。
可选地，作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
抗体或其片段，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，且
位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为1≤x+y≤5。
根据本发明，公开了制备抗体的方法，该抗体具有特异性地转移至其Fc结构域中的赖氨酸246的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-Ab的方法，其特征在于包括：
允许抗体或其片段与用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂反应，
其中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)长于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3为Cx亚烷基，并且D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为9≤x+y≤12。
根据本发明，公开了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有特异性地转移至其Fc结构域中的赖氨酸246的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
用于将第一化学官能团转移至本发明抗体的试剂；以及
抗体或其片段，
其中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)长于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3为Cx亚烷基，并且D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为9≤x+y≤12。
可选地，作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
抗体或其片段，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
所述位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为9≤x+y≤12。
根据本发明，公开了制备抗体的方法，该抗体具有选择性地转移至其Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了制备R1′-Ab的方法，其特征在于包括：
用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂与抗体或其片段进行反应，
其中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)长于或等于约且短于或等于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3为Cx亚烷基，并且D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为6≤x+y≤8。
根据本发明，公开了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有选择性地转移到其Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248的第一化学官能团。
作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
用于将第一化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂；以及
抗体或其片段，
其中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)长于或等于约且短于或等于约
在具体的实施方式中，在用于将第一化学官能团转移至抗体的试剂中，D3为Cx亚烷基，并且D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，
其中，y可为大于或等于1的整数，且x与y之和可为6≤x+y≤8。
可选地，作为第5.2节所述的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的一个实例，本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，其特征在于包括：
根据本发明的接头；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
抗体或其片段，
其中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且
所述位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，
其中，y为大于或等于1的整数，且x与y之和为6≤x+y≤8。
根据本发明，公开了制备抗体的方法，该抗体具有转移至其Fc结构域中的赖氨酸246和248两者的第一化学官能团。
本发明提供了制备R1′-Ab的方法，所述方法包括：
用于将第一化学官能团转移至抗体的第一试剂与抗体或其片段进行反应；以及
用于将第一化学官能团转移至抗体的第二试剂与抗体或其片段进行反应。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第一试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸248，并且用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第二试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸246。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第一试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸246，并且用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第二试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸248。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第一试剂与抗体或其片段的反应、以及用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第二试剂与抗体或其片段的反应可以依次进行。
根据本发明，公开了用于制备抗体的试剂盒，该抗体具有转移到其Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248两者的第一化学官能团。
本发明提供了用于制备R1′-Ab的试剂盒，所述试剂盒包括：
用于将第一化学官能团转移至抗体的第一试剂；
用于将第一化学官能团转移至抗体的第二试剂；以及
抗体或其片段。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第一试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸248，并且用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第二试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸246。
在具体的实施方式中，用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第一试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸246，并且用于将第一化学官能团转移至抗体的所述第二试剂可以为R1′-L2-SSFI，所述R1′-L2-SSFI用于将第一化学官能团特异性地转移至如上所述的Fc结构域中的赖氨酸248。
5.5.通过调节所述第一羰基基团的反应性，可以更位点特异性地转移第一化学官能团。
如上文第5.2节所述，可以通过所述抗体的亲核体攻击R1′-L2-SSFI的第一羰基基团来制备含有第一化学官能团的抗体。所述第一羰基基团的特征在于具有比所述接头的所述第二羰基基团更温和的反应性(参见第2.2节)。可以调节所述第一羰基基团的反应性，使得仅当特定的胺基在所述第一羰基基团附近时所述抗体的特定胺基才能与所述第一羰基基团反应。这样，本发明通过反应的附近条件(vicinity conditions)允许所述第一羰基基团不与任何胺基良好地反应，并且使得反应的位置特异性高。
公开号US 2018/0141976A1和WO 2018/199337A1中公开的现有技术旨在使用Fc-III的类似物位点选择性地调节Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。因为现有技术使用双琥珀酰亚胺交联剂，所以所述第一羰基基团和第二羰基基团具有同样高的反应性(参见第2.2节)。因此，由于所述第一羰基基团具有高的反应性并且不具有反应的附近条件，任何赖氨酸残基都极有可能被标记。
5.6.根据本发明制备的含有第一化学官能团的抗体具有高的均一性和产率。
特异性地将(1)“期望数量”的第一化学官能团转移到(2)“抗体的特定位点”的技术问题和技术方案已经参考第5.3节和第5.4节进行了详细描述。如从以下实验实施例可见的，可以看出通过本技术方案制备的含有第一化学官能团的抗体的化学官能团被高特异性和高产率地转移至其Fc结构域中的特定赖氨酸残基(参见实验实施例3.3)。因此，基于这些事实完成了本发明。
如背景技术中所示，由于抗体标记而具有高均一性的偶联产物具有以下优点：(1)所述抗体偶联物的功能得到均一保证，(2)所述抗体偶联物由于其效果可预测而安全，以及(3)可以避免抗体功能的下降，因为可以在标记抗体的同时避开抗体的功能区。
公开号US 2018/0141976A1和WO 2018/199337A1中公开的现有技术旨在使用Fc-III的类似物位点选择性地调节Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。然而，根据现有技术，由于两个原因，抗体的均一性和产率可能不可避免地低。根据现有技术，首先，由于(Xa1)′的β碳与所述第一羰基碳之间的距离(Lc)为约因此可以选择性地标记246位或248位的赖氨酸，但不可能特异性地选择待标记的赖氨酸246和赖氨酸248中的一个。其次，根据现有技术的交联剂的第一羰基基团由于高反应性而没有反应的邻近条件(参见第5.5节)。结果，所述第一羰基基团极有可能与任何赖氨酸残基反应。因此，现有技术存在如下的缺点：经抗体标记的产物的均一性和产率不如本发明。
5.7.因为根据本发明的含有第一化学官能团的抗体在其中没有被封闭的FcRn结合位点，所以所述抗体的功能没有降低。
所述抗体标记位点的设计原则为：(1)与互补位间隔开；以及(2)与已在上面的第1.1节中描述的包括FcRn的FcR识别位点间隔开。由于赖氨酸246和赖氨酸248被包含在Fc结构域中，赖氨酸246和赖氨酸248与互补位间隔开，但对应位点可能与FcRn的识别位点重叠，这可能存在问题。
已知FcRn具有多种功能，并且特别地通过参与IgG再循环而在延长抗体的半衰期方面发挥重要作用。当将抗体在体内使用时，即当将抗体用作治疗剂、造影剂等时，FcRn与抗体之间的相互作用可能不会顺利发生，从而由于抗体的短的半衰期而使得抗体无法正常发挥作用。
5.7.1.赖氨酸246和赖氨酸248与所述抗体的FcRn结合位点间隔开
Fc结构域中的赖氨酸残基与Fc的FcRn结合位点之间的间距为选择Fc结构域中的赖氨酸残基的重要考虑因素。图13显示了Fc结构域和FcRn之间的结合结构以及FcRn结合位点和Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248的位置。论文和计算机建模被用来显示Fc结构域和FcRn之间的结合结构(Ying T、Ju TW、Wang Y、Prabakaran P、Dimitrov DS.，Interactions of IgG1 CH2 and CH3 Domains with FcRn，Front Immunol.2014；5:146；Monnet C,Jorieux S,Urbain R等,Selection of IgG Variants with Increased FcRnBinding Using Random and Directed Mutagenesis:Impact on EffectorFunctions.Front Immunol.2015；6:39)(参见图13的左图)。在同一文章数据中公开的FcRn结合位点以及赖氨酸246和赖氨酸248在Fc结构域中示出(参见图13的右图)。参考这两个图，可以看出赖氨酸246和赖氨酸248的侧链指向与FcRn结合位点相反的方向。
从这些事实中，在预期之列的是当选择抗体标记位点时，所述抗体标记位点不会影响FcRn和Fc结构域之间的相互作用。实际上，证实了所制备的抗体的半衰期没有缩短，使得该抗体标记位点不会如所打算的影响FcRn的结合(参见实验实施例5)。
5.8.根据本发明的制备含有第一化学官能团的抗体的方法的特征在于SSAI离去
如从第5.2节的方案4和方案5看出的，根据本发明的制备R1′-Ab的过程的特征在于SSAI离开终产物R1′-Ab，因为SSAI被包含在亲核取代反应的离去基团中。与Fc和FcRn之间的结合位点相比，分析了根据本发明的SSFI和Fc结构域之间的结合结构(参见第3.2节)。结果证实，FcRn结合位点的一部分被SSFI覆盖(图14)。在这方面可以预期，当所述SSFI在制备R1′-Ab的过程中没有离开时，所述SSFI对所述抗体的物理性质(例如，半衰期等)具有负面影响。
公开号US 2018/0141976A1中公开的现有技术旨在使用Fc-III的类似物位点选择性地调节Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。然而，相应的现有技术与本发明的不同之处在于SSFI被包含在最终的抗体标记的产品中，因为所述SSFI在制备过程中没有离开。
公开号WO 2018/199337A1中公开的现有技术旨在使用Fc-III的类似物位点选择性地调节Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248，其中SSFI没有被包含在最终的抗体标记的产品中。然而，相应的现有技术进一步包括在制备过程中切割“其为二价基团的可切割接头”以去除所述SSFI，但本发明的优点在于SSFI在偶联反应期间离开而无需任何额外过程。作为根据相应发明的二价基团的可切割接头的切割具有形成抗体结构的二硫键可被切割的缺点。由于本发明采用亲核取代反应，其无需任何特殊条件即可容易地发生，因此可以显著改善该问题。
5.9.因为根据本发明的包含第一点击化学官能团的抗体不包含高生物反应性的化学官能团，所以除了偶联物形成反应之外不会发生副反应。
根据本发明的制备R1′-Ab的方法制备的抗体具有式7表示的结构：
[式7]
当将R1′转移至赖氨酸246或赖氨酸248时，X4可以为NH，并且D1可以为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。在这种情况下，连接至所述抗体的-NH-(CO)-为在体内通常稳定的酰胺键。D1通常还具有生物反应性不高的结构。因此，预期根据本发明制备的R1′-Ab具有高安全性，因为高生物反应性结构未被添加至经标记的分子(R1′)以外的分子。
特别地，当R1′-Ab为具有转移到其的点击化学残基的H1-Ab时，高生物反应性的结构未被添加至R1′-Ab。因此，可以提高点击化学反应的产率，因为除了所述点击化学反应之外不会发生二次反应。
公开号WO 2018/199337A1中公开的现有技术旨在使用Fc-III的类似物并使用双正交官能团来位点选择性地调节Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。然而，相应的现有技术与本发明的不同之处在于，在“作为二价基团的可切割接头”的切割过程中，根据相应的现有技术的抗体产品被允许具有额外的化学官能团，例如硫醇、羟基、羧酸、磷酸、胺等。这种额外的化学官能团为生物反应性官能团，因此可能会影响抗体产品的安全性。
6.有效载荷(Cm-H2)
根据本发明，公开了有效载荷。这种化合物在本文中由符号“Cm-H2”示出。
本发明提供由式9表示的Cm-H2：
[式9]
Cm—————H2
其中，Cm为载荷部分，
H2为第二点击化学官能团。
在具体的实施方式中，Cm可包括载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。R1′还可以包括药物部分。此外，R1′可包括VC接头。在其它的具体实施方式中，R1′可包括抗体或其类似物，所述抗体或其类似物包括互补位。
在具体的实施方式中，当Cm包括药物部分时，所述药物部分可以为抗癌药物。所述抗癌药物还可包括选自以下中的一种或多种：DM1、DM3、DM4、相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、凋亡诱导剂、抗血管生成剂、淋巴因子、紫杉烷、DNA-烷化剂、蒽环、Tubulysin类似物、倍癌霉素类似物、auristatin E、auristatin F、美登素类化合物(maytansinoid)、包含反应性聚乙二醇残留部分的细胞毒性剂、taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、t.秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-二氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺铂、更生霉素、博来霉素、氨茴霉素、卡奇霉素、阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、达沙替尼、多西他赛、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、奈达铂、尼洛替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙铂、索拉非尼、vemurafenib、舒尼替尼、替尼泊苷、triplatin和长春瑞滨。
在具体的实施方式中，Cm可包括多个载体部分、荧光部分、药物部分或放射性部分。Cm还可以包括两个或更多个药物部分。此外，Cm可以包括VC接头。
在具体的实施方式中，H2可包括选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任一种。此外，H2可以为叠氮化物或张力炔烃。此外，H2可以为叠氮化物或二苯并环辛炔-胺。此外，H2可以为二烯或亲二烯体。此外，H2可以为四嗪或降冰片烯。或者，H2可以为四嗪或反式环辛烯。
在具体的实施方式中，当H2与根据本发明的H1-Ab反应时，H2可以与所述第一点击化学官能团(H1)互补。
7.抗体-有效载荷偶联物(Cm-Ab)
根据本发明，公开了抗体和有效载荷的偶联物(即，抗体-有效载荷偶联物)。这种化合物在本文中由符号“Cm-Ab”示出。
本发明提供由式10表示的Cm-Ab：
[式10]
其中，Cm为载荷部分，
B为通过第一点击化学官能团和第二点击化学官能团之间的点击化学反应形成的结构，
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基，
X4为NH、O或S，并且
Ab为抗体。
所述载荷部分的内容应用至第“6.有效载荷”节公开的内容。
在具体的实施方式中，B可以为通过选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任一种与其伴侣“点击化学”官能团”之间的点击化学反应形成的结构。B还可以为选自如下中的任一种：
其中A1和A2两者都连接到载荷部分或D1，使得A1和A2不会连接到相同的部分，并且Rx可以选自H、卤素和C1-3烷基。此外，B可为此外，B可为
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任一种。此外，D1可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在一个具体的实施方式中，X4可为NH。
在具体的实施方式中，Ab可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，Ab可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，Ab可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，Ab可以为所述抗体的片段。
在具体的实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fab结构域连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246连接。此外，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸248连接。或者，X4和Ab可以通过Ab的Fc结构域中的赖氨酸246和赖氨酸248连接。在具体的实施方式中，X4和Ab可以仅通过Ab的两个Fc结构域中的一个连接。在其它的具体实施方式中，X4和Ab可以通过Ab的两个Fc结构域连接。
本发明提供了包含下述式10-1的氨基酸序列的抗体或其片段：
[式10-1]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-（K）″-P-K-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:23)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)”为
其中，Cm为载荷部分，
B为通过第一点击化学官能团和第二点击化学官能团之间的点击化学反应形成的结构，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。所述抗体或其片段具有偶联至其Fc结构域中的赖氨酸246、或对应于赖氨酸246的位点的载荷部分。
所述载荷部分的内容应用至第“6.有效载荷”节所公开的内容。
在具体的实施方式中，B可以为通过选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任一种与其伴侣“点击化学官能团”之间的点击化学反应形成的结构。B还可以为选自如下中的任一种：
其中A1和A2两者都连接至载荷部分或D1，使得A1和A2不会连接至相同的部分，并且Rx可以选自H、卤素和C1-3烷基。此外，B可为此外，B可为
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任意一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-1的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-1的氨基酸序列。
本发明提供包含下述式10-2的氨基酸序列的抗体或其片段：
[式10-2]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-K-P-(K)″-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:24)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)”为
其中，Cm为载荷部分，
B为通过第一点击化学官能团和第二点击化学官能团之间的点击化学反应形成的结构，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。所述抗体或其片段具有偶联至其Fc结构域中的赖氨酸246、或对应于赖氨酸246的位点的载荷部分。
所述载荷部分的内容应用至第“6.有效载荷”节所公开的内容。
在具体的实施方式中，B可以为通过选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任一种与其伴侣“点击化学官能团”之间的点击化学反应形成的结构。B还可以为选自如下中的任一种：
其中A1和A2两者都连接至载荷部分或D1，使得A1和A2不会连接至相同的部分，并且Rx可以选自H、卤素和C1-3烷基。此外，B可为此外，B可为
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-2的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-2的氨基酸序列。
本发明提供包含下述式10-3的氨基酸序列的抗体或其片段：
[式10-3]
G-P-S-V-F-L-F-P-P-(k)″-P-(K)″-D-T-L-M-I(SEQ ID NO:25)
其中，G为甘氨酸，P为脯氨酸，S为丝氨酸，V为缬氨酸，F为苯丙氨酸，L为亮氨酸，K为赖氨酸，D为天冬氨酸，T为苏氨酸，M为甲硫氨酸，I为异亮氨酸，并且
(K)”各自独立地为其中Cm为载荷部分，
B为通过第一点击化学官能团和第二点击化学官能团之间的点击化学反应形成的结构，并且
D1为任意亚烷基、亚烯基或亚炔基。所述抗体或其片段具有偶联至其Fc结构域中的赖氨酸246、或对应于赖氨酸246的位点的载荷部分。
所述载荷部分的内容应用至第“6.有效载荷”节所公开的内容。
在具体的实施方式中，B可以为通过选自炔烃、叠氮化物、张力炔烃、二烯、亲二烯体、烯烃、硫醇和四嗪中的任一种与其伴侣“点击化学”官能团”之间的点击化学反应形成的结构。B还可以为选自如下中的任一种：
其中A1和A2两者都连接至载荷部分或D1，使得A1和A2不会连接至相同的部分，并且Rx可以选自H、卤素和C1-3烷基。此外，B可为此外，B可为
在具体的实施方式中，D1可以包括选自共价键、C1-4亚烷基、C2-4亚烯基、C2-4亚炔基和C3-8亚环烷基中的任一种。D1还可以为-CH2OCH2-。此外，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体可以为人抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为非人的动物抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以为免疫球蛋白G(IgG)。在具体的实施方式中，所述抗体可以为完整的抗体。在其它的具体实施方式中，所述抗体可以为抗体的片段。
在具体的实施方式中，所述抗体可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-3的氨基酸序列。在其它的具体实施方式中，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-3的氨基酸序列。
本发明提供包含选自式10-1、式10-2和式10-3中的一个或多个氨基酸序列的抗体或其片段。在这种情况下，式10-1至式10-3的内容如上所述。
在具体的实施方式中，D1可以为共价键。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式10-1的氨基酸序列而可以不包括式10-2和式10-3的氨基酸序列。此外，所述抗体或其片段可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-1的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-1的氨基酸序列。
在其它的具体实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式10-2的氨基酸序列，而可以不包括式10-1和式10-3的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-2的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-2的氨基酸序列。
在具体的实施方式中，所述抗体或其片段可以仅包括式10-3的氨基酸序列，而可以不包括式10-1和式10-2的氨基酸序列。所述抗体或其片段还可仅在其两个Fc结构域之一中包含式10-3的氨基酸序列。此外，所述抗体可在其两个Fc结构域中均包含式10-3的氨基酸序列。
7.1.抗体-药物偶联物(ADC)
根据本发明，公开了新型抗体-药物偶联物(ADC)。根据本发明的ADC是指抗体-有效载荷偶联物中包括药物部分的有效载荷。
本发明提供根据本发明的Cm-Ab，其中所述载荷部分包括药物部分。
在具体的实施方式中，所述载荷部分可包括两个或更多个药物部分。
在具体的实施方式中，所述药物部分可以为抗癌药物。所述抗癌药物还可包括选自以下中的一种或多种：DM1、DM3、DM4、相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、白喉毒素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活剂、细胞因子、凋亡诱导剂、抗血管生成剂、淋巴因子、紫杉烷、DNA-烷化剂、蒽环、Tubulysin类似物、倍癌霉素类似物、auristatin E、auristatin F、美登素类化合物(maytansinoid)、包含反应性聚乙二醇残留部分的细胞毒性剂、taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、t.秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-二氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺、氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C、顺铂、更生霉素、博来霉素、氨茴霉素、卡奇霉素、阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、达沙替尼、多西他赛、表柔比星、厄洛替尼、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、奈达铂、尼洛替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、沙铂、索拉非尼、vemurafenib、舒尼替尼、替尼泊苷、triplatin和长春瑞滨。
在具体的实施方式中，所述载荷部分可包括VC接头。
7.2.制备抗体-有效载荷偶联物的方法
根据本发明，公开了制备抗体-有效载荷偶联物的方法。
本发明的抗体-有效载荷偶联物可以通过使Cm-H2与H1-Ab反应来制备。在这种情况下，H1-Ab的内容应用至第5.1节中公开的内容，且第6节中公开的内容应用至所述Cm-H2。当H1-Ab的所述第一点击化学官能团和Cm-H2的所述第二点击化学官能团彼此互补时，即当H1-Ab的所述第一点击化学官能团和Cm-H2的所述第二点击化学官能团作为伴侣点击化学官能团起作用时，可以发生点击化学反应以制备根据本发明的抗体-有效载荷偶联物。所述点击化学反应的内容在上文的“定义”部分中进行了充分的描述。所述点击化学反应为双正交反应，并且优点为反应以非常快的反应速度发生并被用于形成强的结合结构。因此，所述点击化学反应具有与以下的第7.3节和第7.4节相同的优点。
本发明提供了制备抗体-有效载荷偶联物的方法，其特征在于该方法包括使含有根据本发明的第一点击化学官能团的抗体与根据本发明的有效载荷反应，其中所述有效载荷的H2为与所述第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团。
在这种情况下，第5.1节提供的抗体应用至含有所述第一点击化学官能团的抗体，并且第6节中提供的有效载荷应用至所述有效载荷。因为在第5.1节中公开了包含赖氨酸246和/或赖氨酸248中的第一点击化学官能团的所有抗体，所以期望其中载荷部分偶联至赖氨酸246和/或赖氨酸248的抗体-有效载荷偶联物以完全可重现的程度公开(参见第7节中的式10和式10-1至式10-3)。
本发明提供了用于制备抗体-有效载荷偶联物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有根据本发明的第一点击化学官能团的抗体；以及根据本发明的有效载荷，其中所述有效载荷的H2为与所述第一点击化学官能团互补的第二点击化学官能团。
在这种情况下，第5.1节提供的抗体应用至含有所述第一点击化学官能团的抗体，并且第6节中提供的有效载荷应用至所述有效载荷。
可选地，本发明提供了用于制备抗体-有效载荷偶联物的试剂盒，所述试剂盒包括：
抗体；
用于将第一点击化学官能团转移至根据本发明的抗体的试剂；
根据本发明的有效载荷。
在具体的实施方式中，用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以为H1-L2-SSFI，所述H1-L2-SSFI用于将第一点击化学官能团特异性地转移至根据本发明的抗体的Fc结构域中的赖氨酸246或赖氨酸248。在其它的具体实施方式中，用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以为H1-L2-SSFI，所述H1-L2-SSFI用于将第一点击化学官能团特异性地转移至根据本发明的抗体的Fc结构域中的赖氨酸246。在又一具体的实施方式中，用于将第一点击化学官能团转移至抗体的试剂可以为H1-L2-SSFI，所述H1-L2-SSFI用于将第一点击化学官能团特异性地转移至根据本发明的抗体的Fc结构域中的赖氨酸248。
可选地，本发明提供了用于制备抗体-有效载荷偶联物的试剂盒，所述试剂盒包括：
抗体；
根据本发明的接头；
根据本发明的位点特异性抗体相互作用组；以及
根据本发明的有效载荷。
在具体的实施方式中，所述接头中的D2为Cy亚烷基、Cy亚烯基或Cy亚炔基，并且所述位点特异性抗体相互作用组中的D3为Cx亚烷基，其中y可以为大于或等于1的整数。x和y的和还可以为1≤x+y≤5。另外，x和y的和可以为6≤x+y≤8。进一步地，x和y的和可以为9≤x+y≤12。
7.3.根据本发明的抗体-有效载荷偶联物使用双正交反应以形成稳定键。
根据本发明的抗体-有效载荷偶联物通过点击化学反应形成。所述点击化学反应为双正交反应，该反应不会影响在体内自然发生的生化现象。由双正交反应形成的键也不被体内裂解酶识别。因此，根据本发明的抗体-有效载荷偶联物的优点在于抗体和所述载荷部分在体内形成非常稳定的键。
7.4.根据本发明制备的抗体-有效载荷偶联物具有高的均一性和产率。
如上文第5.6节所述，根据本发明的含有第一点击化学官能团的抗体具有高的均一性和产率。因此，从根据本发明的抗体制备的抗体-有效载荷偶联物的优点在于其还具有高的均一性和产率。Cm-Ab的均一性必须很高，以使抗体偶联物具有均一的性质。
在通过公开号US 2018/0141976A1和WO 2018/199337A1中公开的现有技术制备的抗体偶联物的情况下，由于抗体偶联物具有差的产率和均一性，如上文第5.6节所述，可能对性能的均一性存在负面影响。
7.5.因为根据本发明的抗体-有效载荷偶联物在其中没有被封闭的FcRn结合位点，所以所述抗体的功能没有降低。
根据本发明的Cm-Ab具有与第5.7节和第5.8节中描述相同的优点。特别是，体内使用的ADC的药代动力学(PK)特性可能会极大改善，因为ADC具有增加的半衰期。
通过公开号US 20180141976A1中公开的现有技术制备的ADC的FcRn结合位点被封闭，因为最终的抗体标记的产物中含有SSFI。因此，与根据相应的现有技术的ADC相比，根据本发明的ADC具有优异的PK特性。
7.6.根据本发明的抗体-药物偶联物是稳定的，因为抗体-药物偶联物不包含高生物反应性的化学官能团。
根据本发明的Cm-Ab具有与第5.9节中描述相同的优点。特别是，在体内使用的ADC的药效学(PD)特性可能会极大改善，因为ADC能够实现平稳的抗体药物作用。
在通过公开号WO 2018199337A1中公开的现有技术制备的ADC的情况下，在最终的抗体标记的产品中包含额外的化学官能团，如硫醇、羟基、羧酸、磷酸、胺等。因此，与根据相应的现有技术的ADC相比，根据本发明的ADC具有优异的PD特性。
8.组合物
根据本发明，公开了包含抗体的组合物。在这种情况下，所述抗体可以为包含根据本发明的第一化学官能团的抗体。或者，所述抗体可以为根据本发明的抗体-有效载荷偶联物。所述抗体还可以为根据本发明的抗体-药物偶联物。
取决于包含在所述组合物中的抗体的功能，根据本发明的组合物可用于各种应用。例如，当第一化学官能团或载荷部分包括放射性部分时，相应的组合物可用作放射性造影剂等。或者，当所述第一化学官能团或载荷部分包括荧光部分时，相应的组合物可用作酶联免疫吸附测定(ELISA)等中使用的标记。或者，当所述第一化学官能团或载荷部分包括药物部分时，相应的组合物可被用作药物组合物。在这种情况下，通常在相关领域中使用的组合物的组分落入本发明的范围内。而且，通常在本领域中使用的相应组分的组成比例也落入本发明的范围内。
本发明提供了组合物，该组合物包括含有根据本发明的第一化学官能团的抗体。在具体的实施方式中，含有所述第一化学官能团的抗体可以为选自式7、式7-1至式7-3、式8和式8-1至式8-3中的至少一种。
本发明还提供了组合物，该组合物包括含有根据本发明的第一点击化学官能团的抗体。在具体的实施方式中，含有所述第一点击化学官能团的抗体可以为选自式8和式8-1至式8-3中的至少一种。
此外，本发明提供了包含根据本发明的抗体-有效载荷偶联物的组合物。在这种情况下，第7节中描述的内容应用至所述抗体-有效载荷偶联物的内容。
可选地，本发明提供了包含根据本发明的抗体-药物偶联物的组合物。
在这种情况下，第7.1节中描述的内容应用至所述抗体-药物偶联物的内容。
药物组合物
下述内容涉及组合物，所述组合物为用于诊断、预防和/或治疗目的的药物组合物。仅在此处的“药物组合物”的内容中，根据本发明的R1′-Ab、H1-Ab、Cm-Ab和ADC均与术语“抗体或其片段”互换使用。
本发明提供了包含根据本发明的抗体或其片段的药物组合物。所述药物组合物还可以为用于治疗癌症的组合物。此外，所述癌症可以包括选自以下中的任一种：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌(gastriccancer)、胃癌(stomach cancer)、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。此外，所述癌症可以为乳腺癌。
本发明提供了治疗方法，该方法包括向受试者给予包含根据本发明的抗体或其片段的药物组合物。所述治疗方法还可以为治疗癌症的方法。此外，所述癌症可以包括选自以下中的任一种：膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、心脏癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、纤维肉瘤、胃癌、胃癌、头颈癌、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸生殖细胞癌、胸腺瘤和胸腺癌。此外，所述癌症可以为乳腺癌。
为了制备包含抗体或其片段的药物组合物或无菌组合物，可将根据本发明的抗体或其片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。所述组合物可进一步包括适用于治疗或预防癌症的一种或多种其它治疗剂，所述癌症例如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌、外周神经鞘膜瘤、神经鞘瘤、头颈癌、膀胱癌、食管癌、Barrett食管癌、胶质母细胞瘤、软组织透明细胞肉瘤、恶性间皮瘤、神经纤维瘤病、肾癌、黑色素瘤、前列腺癌、良性前列腺肥大(BPH)、男性乳腺发育、横纹肌肉瘤和子宫内膜异位症。
治疗剂和诊断剂的制剂可以通过与生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备，例如以冻干粉剂、糖浆剂、水性溶液剂、洗剂或混悬剂的形式(参见例如，Hardman等，Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，NewYork，N.Y.，2001；Gennaro，Remington:The Science and Practice ofPharmacy，Lippincott,Williams和Wilkins，New York,N.Y.,2000；Avis等(编著)，Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY，1993；Lieberman等(编著)，Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets，Marcel Dekker，NY，1990；Lieberman等(编著)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker，NY，1990；Weiner和Kotkoskie，Excipient Toxicity and Safety，Marcel Dekker,Inc.,New York，N.Y.，2000)。
在具体的实施方式中，根据本发明的抗体-药物偶联物的临床服务形式(CSF)为存在于含有ADC、琥珀酸钠和聚山梨醇酯20的小瓶中的冻干物。所述冻干物可用注射用水重构，并且该溶液包括ADC、琥珀酸钠、蔗糖和聚山梨醇酯20，pH值约为5.0。对于连续的静脉内给药，所得溶液通常被进一步稀释到载体溶液中。
治疗给药方案的选择取决于多种因素，包括物质的血清或组织替代率、症状水平、物质的免疫原性以及生物基质中的靶细胞的可及性。在具体的实施方式中，所述给药方案使待递送至患者的治疗剂的量最大化以满足可接受水平的副作用。因此，待给予的生物制剂的量部分取决于特定物质和所治疗病症的严重程度。指南可用于选择合适剂量的抗体、细胞因子和小分子(参见例如Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios ScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(编著)，Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis，Marcel Dekker，New York，N.Y.，1991；Bach(编著)，Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，Marcel Dekker，New York，N.Y.，1993；Baert等，New Engl.J.Med.348:601-608，2003；Milgrom等，New Engl.J.Med.341:1966-1973，1999；Slamon等，New Engl.J.Med.344:783-792，2001；Beniaminovitz等，NewEngl.J.Med.342:613-619,2000；Ghosh等，New Engl.J.Med.348:24-32,2003；Lipsky等，New Engl.J.Med.343:1594-1602,2000)。
合适的剂量例如由临床医师使用相关领域中已知的或怀疑影响治疗的参数或因素、或使用预期影响治疗的参数或因素来确定。通常，所述剂量以比最佳剂量稍小的量开始，然后以小的增量增加，直到相对于任何负面副作用实现期望或最佳效果。例如，重要的诊断措施物包括炎症症状或所产生的炎性细胞因子的水平。
根据本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以达到在特定患者、组合物和给药方式中实现期望的治疗应答而不会引起患者中的任何毒性的活性成分的有效量。所选择的剂量水平可取决于各种药代动力学因素而确定，所述药代动力学因素包括：所使用的本发明的某种组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径、给药时间、所使用的特定化合物的分泌速率、治疗的持续时间、其它药物、与所使用的特定化合物联合使用的物质和/或化合物、年龄、性别、体重、病情、整体健康状况和待治疗患者的既往病史，以及医疗领域中已知的其它因素。
根据本发明的包含抗体或其片段的组合物可以通过连续输注给予，或以单剂量给予，例如每天、每周、每周一至七次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次或每八周一次。该剂量可以静脉内、皮下、局部、口服、鼻内、直肠内、肌肉内、脑内或通过吸入给药。特定给药方案涉及最大剂量或给药频率，其避免显著的不需要的副作用。
对于根据本发明的抗体或其片段，待给予至患者的剂量可以处于0.0001mg/kg至100mg/kg(患者体重)的范围。该剂量可处于如下的范围：0.0001mg/kg至20mg/kg、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001mg/kg至0.15mg/kg、0.0001mg/kg至0.10mg/kg、0.0001mg/kg至0.05mg/kg、0.01mg/kg至0.25mg/kg或0.01mg/kg至0.10mg/kg(患者体重)。根据本发明的抗体或其片段的剂量可以通过将患者的体重(千克(kg))乘以待给予的剂量(mg/kg)来计算。
根据本发明的抗体或其片段可以被重复地给予，并且可以以至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月的间隔进行给予。在具体的实施方式中，可以每三周重复地给予根据本发明的抗体或其片段。
待给予至特定患者的有效量可取决于诸如如下的因素而变化：待治疗的病症、患者的整体健康状况，给药的方式、途径和剂量，以及副作用的严重程度(参见例如，Maynard等，A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，Fla.，1996；Dent，Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ，London，UK，2001)。
给药途径可以为例如通过局部或皮肤应用，通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内、髓内、病灶内注射或输注，或通过缓释体系或植入物(参见例如，Sidman等，Biopolymers 22：547-556，1983；Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277，1981；Langer，Chem.Tech.12：98-105，1982；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692，1985；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034，1980；美国专利号6,350,466和6,316,024)。必要时，该组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂(例如，利多卡因)以缓解注射部位处的疼痛。例如，该组合物还可以使用吸入器或喷雾器进行配制，或者可以通过使用雾化剂进行配制而用于肺部给药。参见例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其全部内容在此以引入的方式并入。
本发明的组合物还可以使用相关领域已知的一种或多种的各种方法通过一种或多种给药途径进行给药。如本领域普通技术人员所认识到的，给药途径和/或方式将取决于期望的结果。对根据本发明的抗体或其片段选择的给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、椎管内或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注给药的途径。肠胃外给药通常代表不同于肠内和局部给药的通过注射给药的方式，并且包括静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，但本发明不限于此。或者，本发明的组合物可以通过非肠胃外给药途径给药，例如局部、表皮内或粘膜内给药途径，并且可以例如鼻内、口服、阴道、直肠内、舌下、或局部地给药。在一个示例性实施方式中，根据本发明的抗体或其片段可以通过输注给予。在另一示例性实施方式中，可以皮下给予根据本发明的抗体或其片段。
当使用控释体系或迟释体系给予根据本发明的抗体或其片段时，可以使用泵来实现控释或迟释(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref Biomed.Eng.14：20，1987；Buchwald等，Surgery 88：507，1980；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574，1989)。聚合材料可用于在本发明的治疗中实现所述控释或迟释(参见例如，Medical Applications ofControlled Release,Langer和Wise(编著)，CRC Pres.，Boca Raton,Fla，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编著)，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61，1983；还参见Levy等，Science 228：190，1985；During等，Ann.Neurol.25：351，1989；Howard等，J.Neurosurg.7 1：105，1989；美国专利第5,679,377号；美国专利第5,916,597号；美国专利第5,912,015号；美国专利第5,989,463号；美国专利第5,128,326号；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253)。用于缓释制剂的聚合物的实例包括聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯，但本发明不限于此。在一个示例性的实施方式中，用于缓释制剂的聚合物为非活性的，不具有可过滤的杂质，并且在储存、灭菌时为稳定的且为生物降解性的。控释体系或迟释体系可能临近预防或治疗靶点定位，并因此需要全身性剂量的一部分(参见例如，Goodson，in Medical Applicationsof Controlled Release，同上，第2卷，第115-138页，1984)。
控释体系在文章“Langer,Science 249:1527-1533,1990”的评论中进行了讨论。本领域普通技术人员已知的任何现有技术可用于生产包含根据本发明的一种或多种抗体或其片段的缓释制剂。参见例如，美国专利号4,526,938、PCT公开号WO 91/05548、PCT公开号WO 96/20698，Ning等，Radiotherapy&Oncology 39:179-189，1996；Song等，PDA Journalof Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397，1995；Cleek等，Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，24:853-854，1997；以及Lam等，Proc.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，24:759-760，1997，其全部内容在此以引入的方式并入。
当根据本发明的抗体或其片段局部给药时，该抗体或其片段可被配制成软膏剂、乳膏剂、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、洗发剂、喷雾剂、气雾剂、溶液剂或乳液的形式或者本领域普通技术人员公知的其它形式。例如参见Remington’s Pharmaceutical Sciences andIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。不可喷雾的局部剂型包括载体或适用于局部应用的一种或多种赋形剂。在一些情况下，具有比水更高的运动粘度的粘性、半固体或固体形式通常可用作局部剂型。合适的制剂包括溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂、粉剂、搽剂、油膏剂等，所有这些制剂都经过灭菌或与影响各种特性(例如必要时，如渗透压)的辅助剂(例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、缓冲剂或盐)混合，但本发明不限于此。在一些情况下，其它合适的局部剂型包括在活性成分与固体或液体非活性载体组合后装填在经压缩的挥发性物质(例如，气态推进剂，如氟利昂)的混合物或挤压瓶中的可喷射的气雾剂制剂。必要时，还可以向药物组合物和剂型添加保湿剂或湿润剂。这种额外组分的实例在现有技术中是已知的。
当鼻内给予包含抗体或其片段的组合物时，可将组合物配制成气雾剂、喷雾剂、雾化剂或滴剂的形式。特别地，用于本发明的预防剂或治疗剂可以使用合适的推进剂(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体)从经加压的包装或喷雾器中以气溶胶喷雾剂型方便地递送。在经加压的气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送经计量的量来确定。用于吸入器或吹药器的胶囊和药筒(例如，由明胶组成)可以被配制为包括化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)。
用于与第二治疗剂(例如细胞因子、类固醇、化学治疗剂、抗生素或放射治疗剂)共同给药或治疗的方法在相关领域中为已知的，参见例如，Hardman等，(编著)(2001)Goodmanand Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill，NewYork，N.Y,；Poole和Peterson(编著)(2001)Pharmacotherapeutics for AdvancedPractice:A Practical Approach，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila，PA.；Chabner和Longo(编著)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，Pa.。所述治疗剂的有效量可使症状减轻至少10％、至少20％、至少约30％、至少40％或至少50％。
可以与根据本发明的抗体或其片段组合给予的另外的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以与根据本发明的抗体或其片段一起以如下的间隔给予：小于5分钟的间隔、小于30分钟的间隔、1小时的间隔、约1小时的间隔、约1小时至约2小时的间隔、约2小时至约3小时的间隔、约3小时至约4小时的间隔、约4小时至约5小时的间隔、约5小时至约6小时的间隔、约6小时至约7小时的间隔、约7小时至约8小时的间隔、约8小时至约9小时的间隔、约9小时至约10小时的间隔、约10小时至约11小时的间隔、约11小时至约12小时的间隔、约12小时至18小时的间隔、18小时至24小时的间隔、24小时至36小时的间隔、36小时至48小时的间隔、48小时至52小时的间隔、52小时至60小时的间隔、60小时至72小时的间隔、72小时至84小时的间隔、84小时至96小时的间隔或96小时至120小时的间隔。两种或更多种治疗剂可以在患者的同一次就诊期间给予。
在具体的实施方式中，可以配制根据本发明的抗体或其片段以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高度亲水的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物穿过血脑屏障(必要时)，它们可以例如配制在脂质体中。对于制备脂质体的方法，例如，参见美国专利号4,522,811、5,374,548和5,399,331。所述脂质体可以包括选择性地转运至特定细胞或器官的一个或多个部分，从而增强靶向药物的递送(参见例如，Ranade，(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如美国专利第5,416,016号(授予Low等))、甘露糖苷(参见Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)、抗体(参见Bloeman等，(1995)FEBS Lett.357:140；Owais等，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)、表面活性剂蛋白A受体(参见Briscoe等，(1995)Am.J.Physiol.1233:134)、p 120(参见Schreier等，(1994)J.Biol.Chem.269:9090)等。还可参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
本发明提供了用于向有需要的受试者单独或与其它疗法组合地给予药物组合物的方案，所述药物组合物包括根据本发明的抗体或其片段。本发明的用于联合治疗的治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)可以同时或依次给予至受试者。用于本发明的联合治疗的治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)也可以周期性地给药。周期性治疗包括给予第一治疗剂(例如，第一预防剂或治疗剂)预定的时间段，给予第二治疗剂(例如，第二预防剂或治疗剂)预定时间段，然后依次重复给药步骤，即用以减少对治疗剂中的一种(例如，激动剂)的耐药性的发生、和/或预防或减少治疗剂中的一种(例如，激动剂)的副作用、和/或提高治疗剂的功效的预定周期。
用于本发明的联合治疗的治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)可以同时给予至受试者。
术语“同时”是指治疗(例如，预防剂或治疗剂)不需要在完全相同的时间不受限制地给予，而为与包含根据本发明的抗体或其片段的药物组合物序贯地给予至受试者，并且相比于以与其它疗法不同的时间给予本发明的抗体时，以可用于提供更高益处的时间间隔给予。例如，各个治疗剂可以在相同时间或不同时间点以任何顺序依次给予至受试者；但应以足够短的时间间隔给药，以在不同时间给药时提供期望的治疗或预防效果。各个治疗剂可以通过任何合适的给药途径以任何适当的形式给予至受试者。在各种示例性实施方式中，所述治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)可以以如下间隔给予至受试者：小于15分钟的间隔、小于30分钟的间隔、小于1小时的间隔、约1小时的间隔、约1小时至约2小时的间隔、约2小时至约3小时的间隔、约3小时至约4小时的间隔、约4小时至约5小时的间隔、约5小时至约6小时的间隔、约6小时至约7小时的间隔、约7小时至约8小时的间隔、约8小时至约9小时的间隔、约9小时至约10小时的间隔、约10小时至约11小时的间隔、约11小时至约12小时的间隔、24小时的间隔、48小时的间隔、72小时的间隔或一周的间隔。在其它的示例性实施方式中，两种或更多种治疗剂(例如，预防剂或治疗剂)可以在患者的同一次就诊期间给予。
用于联合治疗的预防剂或治疗剂可以在相同的药物组合物中给予至受试者。或者，用于联合治疗的预防剂或治疗剂可以在单独的药物组合物中同时给予至受试者。所述预防剂或治疗剂可以通过相同或不同的给药途径给予至受试者。
实验实施例
1.制备用于将位点特异性第一点击化学官能团转移至抗体的试剂的化合物的制备实施例
1.1.接头(H1-L1)结构的合成和确认
1.1.1.化合物I(SO1接头：NHS&降冰片烯)
[方案6]
化合物I的合成(方案6，图15)
化合物1的合成
将2g(10.98mmol，1.0eq.)的2-(双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基甲氧基)乙酸溶解在50mL的DCM中，然后在室温下搅拌的同时将0.085mL(1.098mmol，0.1eq.)DMF和1.91mL(21.96mmol，2.0eq.)草酰氯逐滴加入。将反应溶液搅拌3小时后，减压浓缩，以得到1.97g目标化合物(产率90％)。
化合物2的合成
将1.97g(9.88mmol，1.0eq.)化合物1溶解在20mL乙腈(ACN)中，然后在室温下搅拌的同时将0.68mL(9.88mmol,1.0eq.)巯基乙酸和2.06mL(14.82mmol，1.5eq.)三乙胺逐滴加入。将反应溶液搅拌18小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液添加水，并将反应溶液用乙酸乙酯(EA)萃取3次。将有机层用硫酸镁干燥，减压浓缩，然后通过柱色谱法(DCM:MeOH＝10:1)纯化，以得到2.05g目标化合物(产率：79％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.15-6.01(m，2H)，4.20(t，J＝5.0Hz，1H)，3.77-3.71(m，2H)，3.68-3.57(m，1H)，3.56-3.45(m，1H)，2.84(s，2H)，1.81-1.69(m，2H)，1.30(ddd，J＝19.8，14.5，8.6Hz，4H)，1.15(ddd，J＝16.0，7.6，3.3Hz，1H).
化合物I的合成
将2.05g(7.81mmol，1.0eq.)化合物2溶解在50mL的ACN中，然后在室温下搅拌的同时加入2.76g(14.44mmol，1.8eq.)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCi)和2.21g(19.25mmol，2.46eq.)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。将反应溶液搅拌18小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用EA萃取3次。回收有机层，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩。然后，使用色谱法(EA∶Hex＝2∶1)在硅胶柱上纯化残余物以获得2.7g目标化合物(产率：98％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.15-6.03(m，2H)，4.45(s，1H)，4.21(d，J＝5.0Hz，1H)，3.97(s，1H)，3.65(dd，J＝12.0.7.3Hz，1H)，3.52(t，J＝8.9Hz，1H)，2.83(dd，J＝24.4，11.8Hz，6H)，1.81-1.67(m，1H)，1.30(dq，J＝27.0，9.5Hz，4H)，1.16(ddd，J＝15.3，7.4，3.8Hz，1H).
化合物I的结构的确认
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.15-6.03(m，2H)，4.45(s，1H)，4.21(d，J=5.0Hz，1H)，3.97(s，1H)，3.65(dd，J＝12.0，73Hz，1H)，3.52(t，J＝8.9Hz，1H)，2.83(dd，J＝24.4，11.8Hz，6H)，1.81-1.67(m，1H)，1，30(dq，J＝27.0，9，5Hz，4H)，1.16(ddd，J＝15.3，7.4，3.8Hz，1H).
LRMS(ESI)：m/z 371.2[M+NH4 +]
化合物I的结构通过质谱法确认。结果示于图16。
1.1.2.化合物II(SO2接头：NHS&降冰片烯)
[方案7]
化合物II的合成(方案7，图17)
化合物3的合成
将0.55g(2.33mmol，1.0eq.)化合物1溶解在5mL乙腈(ACN)中，然后在室温下搅拌的同时滴加0.2mL(2.33mmol，1.0eq.)3-巯基丙酸和0.49mL(3.49mmol，1.5eq.)三乙胺。将反应溶液搅拌11小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用乙酸乙酯(EA)萃取3次。将有机层用硫酸镁干燥，减压浓缩，然后通过硅胶柱色谱法(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，以得到0.56g目标化合物(产率：89％)。
化合物II的合成
将0.56g(2.07mmol，1.0eq.)化合物3溶解在10mL乙腈(ACN)中，然后在室温下搅拌的同时加入0.81g(4.21mmol，2.0eq.)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCi)和0.65g(5.61mmol，2.7eq.)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。将反应溶液搅拌12小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用EA萃取3次。将有机层用硫酸镁干燥，并减压浓缩。然后，通过硅胶柱色谱法(EA∶Hex＝2∶1)纯化残余物，以得到0.63g目标化合物(产率：83％)。
化合物II的结构的确认
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.16-6.14(m，2H)，4.45(s，1H)，4.21-4.08(m，1H)，3.69-3.58(m，1H)，3.51(dt，J＝14.5，8.9Hz，1H)，3.22(t，J＝7.1Hz，2H)，2.96(t，J＝7.1Hz，2H)，2.79-2.83(m，6H)，1.81-1.67(m，1H)，1.37-1.21(m，4H)，1.13-1.18(m，1H).
LRMS(ESI)：m/z 385.1[M+NH4 +]
化合物II的结构通过质谱法确认。结果示于图18。
1.1.3.化合物III(SO3接头：NHS&降冰片烯)
[方案8]
化合物III的合成(方案8，图19)
化合物4的合成
将0.5g(3.62mmol，1.0eq.)外-5-降冰片烯羧酸溶于20mL的DCM中，然后在室温下搅拌的同时滴加0.028mL(0.37mmol，0.94eq.)DMF和0.63mL(7.24mmol，2.0eq.)草酰氯。将反应溶液搅拌3小时后，减压浓缩，以得到0.47g目标化合物(产率83％)。
化合物5的合成
将0.47g(3.0mmol，1.0eq.)化合物4溶于15mL乙腈(ACN)中，然后在室温下搅拌的同时滴加0.21mL(3.0mmol，1.0eq.)巯基乙酸和0.63mL(4.5mmol，1.5eq.)三乙胺。将反应溶液搅拌18小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用乙酸乙酯(EA)萃取3次。将有机层用硫酸镁干燥，减压浓缩，然后通过柱色谱法(DCM∶MeOH＝10∶1)纯化，以得到0.3g目标化合物(产率：47％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ9.82(brs，1H)，6.24-6.07(m，2H)，3.76(s，2H)，3.12(s，1H)，2.97(s，1H)，2.54(dd，J＝9.0，4.7Hz，1H)，2.04-1.87(m，1H)，1.57(d，J＝8.5Hz，1H)，1.48-1.35(m，2H).
化合物III的合成
将0.26g(1.22mmol，1.0eq.)化合物5溶解在15mL乙腈(ACN)中，然后在室温下搅拌的同时加入0.35g(1.83mmol，1.5eq.)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCi)和0.28g(2.44mmol，2.0eq.)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。将反应溶液搅拌3小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用EA萃取3次。将有机层回收，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩。然后，使用色谱法(EA∶Hex＝2∶1)在硅胶柱上纯化残余物，以获得0.32g目标化合物(产率：85％)。
化合物III的结构的确认
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ6.21(dd，J＝5.5，3.0Hz，1H)，6.15(dd，J＝5.5，3.1Hz，1H)，4.01(s，2H)，3.15(s，1H)，2.98(s，1H)，2.86(s，4H)，2.54(dd，J＝9.2，4.6Hz，1H)，2.02(dt，J＝11.9，4.0Hz，1H)，1.59(d，J＝8.6Hz，1H)，1.46-1.36(m，2H).
LCMS(ESI)：m/z 332.16[M+Na+]
化合物III的结构经质谱确认。结果示于图20。
1.1.4.化合物IV(SO4接头：NHS&叠氮化物)
[方案9]
化合物IV的合成(方案9，图21和图22)
化合物6的合成
将2-(2-氯乙氧基)乙醇(2mL，18.94mmol)溶解在蒸馏水(12mL)中，并向其中加入NaN3(3.08g，47.35mmol，2.5eq.)。将所得混合物在80℃下搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，并倒入5％NaOH(aq.)(20mL)中，然后搅拌约10分钟。将反应混合物用乙醚萃取3次，并且将有机层用硫酸镁干燥并过滤。减压浓缩滤液，以得到2.47g目标化合物(产率99％)。
化合物7的合成
将2.47g(18.84mmol)化合物6溶解在丙酮(50mL)中，然后在0℃下缓慢加入1MJone试剂(75.36mL，75.36mmol，4eq.)。将反应混合物在0℃搅拌3小时，升温至室温，然后搅拌约10分钟。将反应混合物用乙酸乙酯(EA)萃取3次，并且将有机层用硫酸镁干燥并过滤。减压浓缩滤液，以得到2.69g目标化合物(产率98％)。
化合物8的合成
将2.69g(18.57mmol，1.0eq.)化合物7溶解在50mL的DCM中，然后在室温下搅拌的同时滴加0.1mL(1.29mmol，0.07eq.)DMF和2.43mL(27.86mmol，1.5eq.)草酰氯。将反应溶液搅拌3小时后，减压浓缩，以得到2.42g目标化合物(产率80％)。
化合物9的合成
将0.88g(5.40mmol，1.0eq.)化合物8溶解在30mL的DCM中，然后在室温下搅拌的同时滴加0.8g(5.40mmol，1.0eq.)的2-巯基乙酸叔丁酯和1.41mL(8.10mmol，1.5eq.)的N,N-二异丙基乙胺。将反应混合物搅拌2小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用二氯甲烷(DCM)萃取3次。将有机层用硫酸镁干燥，减压浓缩，然后通过柱色谱法(Hex:EA＝5:1)纯化，以得到0.73g目标化合物(产率：49％)。
化合物10的合成
将0.73g(2.66mmol，1eq.)化合物9溶解于10mL的DCM中，然后在室温下搅拌的同时滴加10mL(129.8mmol，48eq.)三氟乙酸。将反应溶液搅拌8小时后，减压浓缩，以得到0.40g目标化合物(产率70％)。
化合物IV的合成
将1.97g(9.0mmol，1.0eq.)化合物10溶解在25mL乙腈(ACN)中，并在室温下搅拌的同时加入2.58g(13.5mmol，1.5eq.)的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCi)和2.07g(18.0mmol，2.0eq.)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。将反应溶液搅拌3小时，然后减压浓缩。随后，向反应溶液中加入水，并将反应溶液用EA萃取3次。将有机层回收，用硫酸镁干燥，然后减压浓缩。然后，使用色谱法(EA∶Hex＝2∶1)在硅胶柱上纯化残余物，以获得1.03g目标化合物(产率：36％)。
化合物IV的结构的确认
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ4.30(s，2H)，4.00(s，2H)，3.87-3.75(m，2H)，3.55-3.47(m，2H)，2.86(s，4H).
LRMS(ESI)：m/z 334.0[M+NH4 +]
化合物IV的结构通过质谱法确认。结果示于图23。
1.2.位点特异性Fc相互作用组(SSFI)的合成和结构的确认
1.2.1.SSFI的合成和结构的确认(其中Xa1为赖氨酸)
SSFI(6Lys)的合成
所使用的Fmoc氨基酸的引入的列表和顺序
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
制备方法
(a)氨基酸的引入
以下过程中使用的试剂的量基于0.25mmol。将0.5g(0.48mmol/g)的透明酰胺树脂(PeptideInternational Inc.，USA)放入合成反应器中，并称取1mmol的各Fmoc-氨基酸嵌段，以制备按上述顺序的从C-端到N-端的肽氨基酸序列。
从C-端氨基酸依次进行用于活化Fmoc-氨基酸以将活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应。
在包含20％哌啶的DMF中进行Fmoc的去除，并且残基的活化和引入通过将对应于序列制备的氨基酸与2mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液、2mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液和174μL的DIPEA混合5分钟来进行，并将所得混合物在含有树脂的反应器中混合2小时。
引入反应的确认使用Kaiser试验法进行。当确认引入反应不完全时，再次重复引入反应，或者使用含20％Ac2O的DMF溶液进行封端。在每个引入反应和Fmoc去除中，树脂都用DMF和DCM彻底洗涤，然后移至下一步。重复进行此过程，直到完成目标肽序列。
(b)H-PEG8-OH的引入
为了在氨基酸的引入完成后将H-PEG8-OH引入至序列的N-端，将1mL的0.5M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid-in-DMF溶液、1mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液、1mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液和87μL的DIPEA混合5分钟，并将所得混合物在含有反应性树脂的反应器中混合2小时。
通过Kaiser试验法监测反应进程。当发现有未反应的胺残留时，反应时间再延长1～3小时，或弃去反应液，并且再次重复上述反应过程。使用含20％哌啶的DMF去除N-端Fmoc保护基团，然后干燥并称重附着有肽的树脂。
(c)将步骤(b)中制备的250mg附着有肽的树脂与2mL的TFA、TIS、水和EDT(94:1.0:2.5:2.5)的混合溶液在室温下搅拌120分钟，以从所述树脂中切割所述肽。将经切割的混合物过滤，并使用氮气将滤液浓缩至其体积的约一半。随后，将乙醚倒入混合物中以沉淀肽。将经沉淀的肽用乙醚洗涤3次，并在氮气下干燥。将经干燥的沉淀溶解在含0.1％TFA-30％ACN的水中，搅拌6小时，然后浓缩。
将浓缩物以0.1mg/mL的浓度溶解在含有5％-DMSO-20％-ACN的0.01M醋酸铵缓冲液(pH 6.5)溶液中，然后在暴露于空气的同时搅拌3天。通过HPLC监测二硫键形成反应的进程。当发现反应不再进展时，将反应溶液冻干以获得肽沉淀。
(d)纯化
将步骤(c)中通过冻干得到的肽沉淀在下表4中所列的制备型LC一级纯化条件下进行分离，在下表5中所列的制备型LC二级纯化条件下进一步纯化，然后冻干。通过分析型HPLC确认所得肽具有90％或更高的纯度，并且使用LC/MS质谱仪确认合成肽的分子量。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Lys-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2(Cys*：二硫键位点)
<表4>制备型LC一级纯化条件
<表5>制备型LC二级纯化条件
SSFI(6Lys)的结构的确认
通过基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱法进行的分子量测量确认了SSFI(6Lys)的合成。
测量设备：Ultraflextreme(Bruker)
测量基质：CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)和DHB(2,5-二羟基苯甲酸)
经计算的分子量：2010.29g/mol
经测量的分子量(M+H)+：2011.89g/mol
将SSFI(6Lys)的质谱结果在图24中示出。
1.2.2.SSFI(其中Xa1为鸟氨酸)的合成和结构的确认
SSFI(6Orn)的合成
所使用的Fmoc氨基酸的引入顺序和列表
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
制备方法
(a)氨基酸的引入
以下过程中使用的试剂的量基于0.25mmol。将0.5g(0.48mmol/g)的透明酰胺树脂(PeptideInternational Inc.，USA)放入合成反应器中，并称取1mmol的各Fmoc-氨基酸嵌段，以制备按上述顺序的从C-端到N-端的肽氨基酸序列。
从C-端氨基酸依次进行用于活化Fmoc-氨基酸以将活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应。
在包含20％哌啶的DMF中进行Fmoc的去除，并且残基的活化和引入通过将对应于序列制备的氨基酸与2mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液、2mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液和174μL的DIPEA混合5分钟来进行，并将所得混合物在含有树脂的反应器中混合2小时。
引入反应的确认使用Kaiser试验法进行。当确认引入反应不完全时，再次重复引入反应，或者使用含20％Ac2O的DMF溶液进行封端。在每个引入反应和Fmoc去除中，树脂都用DMF和DCM彻底洗涤，然后移至下一步。重复进行此过程，直到完成目标肽序列。
(b)H-PEG8-OH的引入
为了在氨基酸的引入完成后将H-PEG8-OH引入至序列的N-端，将1mL的0.5M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid-in-DMF溶液、1mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液、1mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液和87μL的DIPEA混合5分钟，并将所得混合物在含有反应性树脂的反应器中混合2小时。
通过Kaiser试验法监测反应进程。当发现有未反应的胺残留时，反应时间再延长1～3小时，或弃去反应液，并且再次重复上述反应过程。使用含20％哌啶的DMF去除N-端Fmoc保护基团，然后干燥并称重附着有肽的树脂。
(c)将步骤(b)中制备的250mg附着有肽的树脂与2mL的TFA、TIS、水和EDT(94:1.0:2.5:2.5)的混合溶液在室温下搅拌120分钟，以从所述树脂中切割所述肽。将经切割的混合物过滤，并使用氮气将滤液浓缩至其体积的约一半。随后，将乙醚倒入混合物中以沉淀肽。将经沉淀的肽用乙醚洗涤3次，并在氮气下干燥。将经干燥的沉淀溶解在含0.1％TFA-30％ACN的水中，搅拌6小时，然后浓缩。
将浓缩物以0.1mg/mL的浓度溶解在含有5％-DMSO-20％-ACN的0.01M醋酸铵缓冲液(pH 6.5)溶液中，然后在暴露于空气的同时搅拌3天。通过HPLC监测二硫键形成反应的进程。当发现反应不再进展时，将反应溶液冻干以获得肽沉淀。
(d)纯化
将步骤(c)中通过冻干得到的肽沉淀在下表6中所列的制备型LC一级纯化条件下进行分离，在下表7中所列的制备型LC二级纯化条件下进一步纯化，然后冻干。通过分析型HPLC确认所得肽具有90％或更高的纯度，并且使用LC/MS质谱仪确认合成肽的分子量。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Orn-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2(Cys*：二硫键位点)
<表6>制备型LC一级纯化条件
<表7>制备型LC二级纯化条件
SSFI(6Orn)的结构的确认
通过基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱法进行的分子量测量确认了SSFI(6鸟氨酸)的合成。
测量设备：Ultraflextreme(Bruker)
测量基质：CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)和DHB(2,5-二羟基苯甲酸)
经计算的分子量：1996.26g/mol
经测量的分子量(M+2H)2+：999.13g/mol
将SSFI(6Orn)的质谱结果在图25中示出。
1.2.3.SSFI的合成和结构的确认(其中Xa1为二氨基丁酸(Dab))
SSFI(6Dab)的合成
所使用的Fmoc氨基酸的引入顺序和列表
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
制备方法
(a)氨基酸的引入
以下过程中使用的试剂的量基于0.25mmol。将0.5g(0.48mmol/g)的透明酰胺树脂(PeptideInternational Inc.，USA)放入合成反应器中，并称取1mmol的各Fmoc-氨基酸嵌段，以制备按上述顺序的从C-端到N-端的肽氨基酸序列。
从C-端氨基酸依次进行用于活化Fmoc-氨基酸以将活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应。
在包含20％哌啶的DMF中进行Fmoc的去除，并且残基的活化和引入通过将对应于序列制备的氨基酸与2mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液、2mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液和174μL的DIPEA混合5分钟来进行，并将所得混合物在含有树脂的反应器中混合2小时。
引入反应的确认使用Kaiser试验法进行。当确认引入反应不完全时，再次重复引入反应，或者使用含20％Ac2O的DMF溶液进行封端。在每个引入反应和Fmoc去除中，树脂都用DMF和DCM彻底洗涤，然后移至下一步。重复进行此过程，直到完成目标肽序列。
(b)H-PEG8-OH的引入
为了在氨基酸的引入完成后将H-PEG8-OH引入至序列的N-端，将1mL的0.5M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid-in-DMF溶液、1mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液、1mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液和87μL的DIPEA混合5分钟，并将所得混合物在含有反应性树脂的反应器中混合2小时。
通过Kaiser试验法监测反应进程。当发现有未反应的胺残留时，反应时间再延长1～3小时，或弃去反应液，并且再次重复上述反应过程。使用含20％哌啶的DMF去除N-端Fmoc保护基团，然后干燥并称重附着有肽的树脂。
(c)将步骤(b)中制备的250mg附着有肽的树脂与2mL的TFA、TIS、水和EDT(94:1.0:2.5:2.5)的混合溶液在室温下搅拌120分钟，以从所述树脂中切割所述肽。将经切割的混合物过滤，并使用氮气将滤液浓缩至其体积的约一半。随后，将乙醚倒入混合物中以沉淀肽。将经沉淀的肽用乙醚洗涤3次，并在氮气下干燥。将经干燥的沉淀溶解在含0.1％TFA-30％ACN的水中，搅拌6小时，然后浓缩。
将浓缩物以0.1mg/mL的浓度溶解在含有5％-DMSO-20％-ACN的0.01M醋酸铵缓冲液(pH 6.5)溶液中，然后在暴露于空气的同时搅拌3天。通过HPLC监测二硫键形成反应的进程。当发现反应不再进展时，将反应溶液冻干以获得肽沉淀。
(d)纯化
将步骤(c)中通过冻干得到的肽沉淀在下表8中所列的制备型LC一级纯化条件下进行分离，在下表9中所列的制备型LC二级纯化条件下进一步纯化，然后冻干。通过分析型HPLC确认所得肽具有90％或更高的纯度，并且使用LC/MS质谱仪确认合成肽的分子量。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dab-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2(Cys*：二硫键位点)
<表8>制备型LC一级纯化条件
<表9>制备型LC二级纯化条件
SSFI(6Dab)的结构的确认
通过基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱法进行的分子量测量确认了SSFI(6Dab)的合成。
测量设备：Ultraflextreme(Bruker)
测量基质：CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)和DHB(2，5-二羟基苯甲酸)
经计算的分子量：1982.24g/mol
经测量的分子量(M+2H)2+：992.33g/mol
将SSFI(6Dab)的质谱结果在图26中示出。
1.2.4.SSFI的合成和结构的确认(其中Xa1为二氨基丙酸(Dap))
SSFI(6Dap)的合成
序列：Nor.-PEG8-DCAWHA(β氨基丙氨酸，Dap)GELVWCT-CONH2所使用的Fmoc氨基酸的引入顺序和列表
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH、Fmoc-L-Val-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH、Fmoc-L-His(Trt)-OH、Fmoc-L-Trp(Boc)-OH Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(tBu)-OH。
制备方法
(a)氨基酸的引入
以下过程中使用的试剂的量基于0.25mmol。将0.5g(0.48mmol/g)的透明酰胺树脂(PeptideInternational Inc.，USA)放入合成反应器中，并称取1mmol的各Fmoc-氨基酸嵌段，以制备按上述顺序的从C-端到N-端的肽氨基酸序列。
从C-端氨基酸依次进行用于活化Fmoc-氨基酸以将活化的残基连接到透明酰胺树脂的反应。
在包含20％哌啶的DMF中进行Fmoc的去除，并且残基的活化和引入通过将对应于序列制备的氨基酸与2mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液、2mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液和174μL的DIPEA混合5分钟来进行，并将所得混合物在含有树脂的反应器中混合2小时。
引入反应的确认使用Kaiser试验法进行。当确认引入反应不完全时，再次重复引入反应，或者使用含20％Ac2O的DMF溶液进行封端。在每个引入反应和Fmoc去除中，树脂都用DMF和DCM彻底洗涤，然后移至下一步。重复进行此过程，直到完成目标肽序列。
(b)H-PEG8-OH的引入
为了在氨基酸的引入完成后将H-PEG8-OH引入至序列的N-端，将1mL的0.5M Fmoc-N-amido-dPEG8-acid-in-DMF溶液、1mL的0.5M包含HBTU的DMF溶液、1mL的0.5M包含HOBt的DMF溶液和87μL的DIPEA混合5分钟，并将所得混合物在含有反应性树脂的反应器中混合2小时。
通过Kaiser试验法监测反应进程。当发现有未反应的胺残留时，反应时间再延长1～3小时，或弃去反应液，并且再次重复上述反应过程。使用含20％哌啶的DMF去除N-端Fmoc保护基团，然后干燥并称重附着有肽的树脂。
(c)将步骤(b)中制备的250mg附着有肽的树脂与2mL的TFA、TIS、水和EDT(94:1.0:2.5:2.5)的混合溶液在室温下搅拌120分钟，以从所述树脂中切割所述肽。将经切割的混合物过滤，并使用氮气将滤液浓缩至其体积的约一半。随后，将乙醚倒入混合物中以沉淀肽。将经沉淀的肽用乙醚洗涤3次，并在氮气下干燥。将经干燥的沉淀溶解在含0.1％TFA-30％ACN的水中，搅拌6小时，然后浓缩。
将浓缩物以0.1mg/mL的浓度溶解在含有5％-DMSO-20％-ACN的0.01M醋酸铵缓冲液(pH 6.5)溶液中，然后在暴露于空气的同时搅拌3天。通过HPLC监测二硫键形成反应的进程。当发现反应不再进展时，将反应溶液冻干以获得肽沉淀。
(d)纯化
将步骤(c)中通过冻干得到的肽沉淀在下表10中所列的制备型LC一级纯化条件下进行分离，在下表11中所列的制备型LC二级纯化条件下进一步纯化，然后冻干。通过分析型HPLC确认所得肽具有90％或更高的纯度，并且使用LC/MS质谱仪确认合成肽的分子量。
H-PEG8-Asp-Cys*-Ala-Trp-His-Dap-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys*-Thr-NH2(Cys*：二硫键位点)
<表10>制备型LC一级纯化条件
<表12>制备型LC二级纯化条件
SSFI(6Dap)的结构的确认
测量设备：Quattro Premier Xe(Waters)
经计算的分子量：1968.21g/mol
经测量的分子量(M+2H)2+：984.71g/mol
将SSFI(6Dap)的质谱结果在图27中示出。
1.3.VC接头的合成和结构的确认
1.3.1.VC接头(DD2)结构的合成和确认
[方案10]
DD2的合成
VC接头(DD2)的合成
化合物11的合成
将5g(14.7mmol，1.0eq.)的Fmoc-Val-OH和1.7g(14.7mmol，1.0eq.)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在140mL二甲氧基乙烷(DME)中，并搅拌。在0℃下滴加2.5mL(16.2mmol，1.1eq.)的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)并搅拌16小时。减压下过滤反应溶液以除去漂浮物，并减压浓缩滤液。将残留物溶于丙酮中，并在冰箱中低温下储存4小时。之后，将所得溶液减压过滤以除去重新形成的漂浮物，并无需任何纯化而用于下一步反应中(粗品产率：5.5g，86％)。TLC(EA:Hex＝1:1)；Rf＝0.5。
化合物12的合成
将2.0g(11.5mmol，1.0eq.)的L-瓜氨酸溶解在100mL的四氢呋喃(THF)和水的1:1混合溶液中并搅拌。向其中加入988mg碳酸氢钠并搅拌。随后，将5.0g(11.5mmol，1.0eq.)化合物8溶解在80mL丙酮中，滴加到反应溶液中并搅拌。将所得混合物搅拌21小时，然后减压浓缩以除去有机溶剂。将水层用乙酸乙酯(EA)洗涤，然后通过缓慢滴加2N HCl滴定至pH 3。向其中加入EA以萃取有机层中的沉淀物。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并且无需任何纯化而用于下一步反应中(粗品产率：5.6g，98％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1，一滴甲酸)；Rf＝0.1。
化合物13的合成
将50mL的处于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％哌啶滴加至2.84g(5.72mmol，1.0eq.)化合物12并搅拌。4小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并且将残留物溶解于水中，并减压过滤以除去所形成的漂浮物。将水层浓缩以得到目标化合物，其无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物14的合成
将54mg(0.22mmol，1.0eq.)的化合物10溶解在2mL的DMF中，并向其中滴加0.05mL(0.264mmol，1.2eq.)的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。通过加入2mL水使化合物13完全溶解，并在室温下向其中滴加0.05mL(0.528mmol，2.4eq.)乙酸酐。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并将浓缩物通过反相柱色谱法进行纯化，以得到目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.05。
化合物15的合成
将1g(3.16mmol,1.0eq.)化合物14溶于30mL的DCM和甲醇的2:1混合溶液，并且向其中加入868mg(3.48mmol，1.1eq.)的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)并搅拌。向其中加入451mg(3.66mmol，1.16eq.)4-氨基苄醇并搅拌5小时。将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得419mg目标化合物(产率：32％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
化合物DD2的合成
将109mg(0.3mmol，1.2eq.)苯酚活化的SN38和0.06mL(0.33mmol，1.3eq.)DIPEA滴加到通过将105mg(0.25mmol，1.0eq.)化合物15溶解在10mL DMF中而获得的溶液。将所得混合物搅拌20小时，然后减压浓缩以除去反应溶液。通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.2。
VC接头(DD2)的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 840.4[M+H+]
将结果在图28中示出。
1.3.2.VC接头(DD3)的合成和结构的确认
[方案11]
VC接头(DD3)的合成
化合物16的合成
将5g(14.7mmol，1.0eq.)的Fmoc-Val-OH和1.7g(14.7mmol，1.0eq.)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在140mL二甲氧基乙烷(DME)中，并搅拌。在0℃下滴加2.5mL(16.2mmol，1.1eq.)的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)并搅拌16小时。将反应溶液减压过滤以除去漂浮物，并将滤液减压浓缩。将残留物溶于丙酮中，在冰箱中低温下储存4小时。之后，将所得溶液减压过滤以除去重新形成的漂浮物，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.5g，86％)。TLC(EA:Hex＝1:1)；Rf＝0.5。
化合物17的合成
将2.0g(11.5mmol，1.0eq.)的L-瓜氨酸溶解在100mL的四氢呋喃(THF)和水的1:1混合溶液中并搅拌。向其中加入988mg碳酸氢钠并搅拌。随后，将5.0g(11.5mmol，1.0eq.)化合物16溶解在80mL丙酮中，滴加到反应溶液中并搅拌。将所得混合物搅拌21小时，然后减压浓缩以除去有机溶剂。将水层用乙酸乙酯(EA)洗涤，然后通过滴加2N HCl而滴定至pH 3。向其中加入EA以使得萃取有机层中的沉淀物。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.6g，98％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1，一滴甲酸)；Rf＝0.1。
化合物18的合成
将50mL处于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％哌啶滴加至2.84g(5.72mmol，1.0eq.)化合物17并搅拌。4小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并且将残留物溶解于水中，并减压过滤以除去所形成的漂浮物。将水层浓缩以得到目标化合物，其无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物19的合成
将54mg(0.22mmol，1.0eq.)的化合物18溶解在2mL的DMF中，并向其中滴加0.05mL(0.264mmol，1.2eq.)的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。通过加入2mL水而将化合物15完全溶解，并在室温下向其中滴加0.05mL(0.528mmol，2.4eq.)乙酸酐。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并将浓缩物通过反相柱色谱法纯化，以得到目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.05。
化合物20的合成
将1g(3.16mmol,1.0eq.)化合物19溶于30mL的DCM和甲醇的2:1混合溶液，并且向其中加入868mg(3.48mmol，1.1eq.)的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)并搅拌。向其中加入451mg(3.66mmol，1.16eq.)的4-氨基苄醇并搅拌5小时。将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得419mg目标化合物(产率：32％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
化合物21的合成
将240mg(0.55mmol，1.0eq.)的化合物20溶解在10mL的DMF中，并且向其中滴加0.3mL(1.65mmol，3.0eq.)的DIPEA并搅拌。随后，通过添加509mg(1.65mmol，3.0eq.)双-(4-氨基苯基)碳酸酯进行反应。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并向其中加入乙醚以使目标化合物沉淀，将该化合物减压过滤。所得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。
化合物22的合成
将33mg(0.06mmol，1.0eq.)化合物21溶于5mL的DMF中，并且向其中滴加16mg(0.08mmol,1.3eq.)的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氨基乙烷和0.02mL(0.08mmol，1.3eq.)的DIPEA并搅拌。将所得混合物搅拌7小时，然后减压浓缩以除去反应溶液，并向其中加入乙醚以使目标化合物沉淀，将该化合物减压过滤。得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
化合物23的合成
将17mg(0.03mmol，1.0eq.)的化合物22溶解在1mL的DCM中，然后在0℃下向其中滴加1mL的三氟乙酸(TFA)。通过在0℃下搅拌所得混合物30分钟并随后在室温下搅拌30分钟来进行反应。随后，将混合物减压浓缩以除去反应溶液如DCM，然后将该浓缩重复3次。将经浓缩的物质在高真空下干燥，并通过反相柱色谱法纯化，以得到13mg目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物DD3的合成
将0.01mL(0.04mmol,1.5eq.)的DIPEA滴加到通过将13mg(0.03mmol,1.0eq.)化合物23溶解在3mL的DMF中而获得的溶液，并向其中加入22mg(0.04mmol,1.5eq.)苯酚活化的SN38。将所得混合物搅拌1小时，然后减压浓缩以除去反应溶液。通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.2。
VC接头(DD3)的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 926.4[M+H+]
将结果在图29中示出。
1.3.3.VC接头(DD4)的合成和结构的确认
[方案12]
VC接头(DD4)的合成
化合物24的合成
将5g(14.7mmol，1.0eq.)的Fmoc-Val-OH和1.7g(14.7mmol，1.0eq.)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在140mL二甲氧基乙烷(DME)中，并搅拌。在0℃下滴加2.5mL(16.2mmol，1.1eq.)的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)并搅拌16小时。将反应溶液减压过滤以除去漂浮物，并将滤液减压浓缩。将残留物溶于丙酮中，并在冰箱中低温下储存4小时。之后，将所得溶液减压过滤以除去重新形成的漂浮物，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.5g，86％)。TLC(EA:Hex＝1:1)；Rf＝0.5。
化合物25的合成
将2.0g(11.5mmol，1.0eq.)的L-瓜氨酸溶解在100mL的四氢呋喃(THF)和水的1:1混合溶液中并搅拌。向其中加入988mg碳酸氢钠并搅拌。随后，将5.0g(11.5mmol，1.0eq.)化合物21溶解在80mL丙酮中，滴加到反应溶液中并搅拌。将所得混合物搅拌21小时，然后减压浓缩以除去有机溶剂。将水层用乙酸乙酯(EA)洗涤，然后通过缓慢滴加2N HCl滴定至pH 3。向其中加入EA以萃取有机层中的沉淀物。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.6g，98％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1，一滴甲酸)；Rf＝0.1。
化合物26的合成
将50mL的处于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％哌啶滴加至2.84g(5.72mmol，1.0eq.)化合物25并搅拌。4小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并且将残留物溶解于水中，并减压过滤以除去所形成的漂浮物。将水层浓缩以得到目标化合物，其无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物27的合成
将54mg(0.22mmol，1.0eq.)的化合物26溶解在2mL的DMF中，并向其中滴加0.05mL(0.264mmol，1.2eq.)的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。通过加入2mL水使化合物23完全溶解，并在室温下向其中滴加0.05mL(0.528mmol，2.4eq.)乙酸酐。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并将浓缩物通过反相柱色谱法纯化，以得到目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.05。
化合物28的合成
将300mg(0.95mmol，1.0eq.)化合物27溶于6mL的DMF中，然后向其中加入550mg(1.43mmol，1.5eq.)的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。随后，滴加0.25mL(1.43mmol，1.5eq.)的DIPEA，并将230mg(1.43mmol，1.5eq.)的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-氨基乙烷溶于3.5mL的DMF中，并在室温下滴加。7小时后，将反应溶液用乙酸乙酯(EA)稀释，并将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。然后，将有机层用饱和盐溶液和硫酸钠干燥，并过滤以得到目标化合物。得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.5。
化合物29的合成
将化合物28溶解在DCM和TFA的2:1混合溶液中，然后在0℃下进行反应。随后，将反应混合物减压浓缩以除去反应溶液(如DCM)，然后将该浓缩重复3次。将残留物在高真空下干燥，并通过反相柱色谱法纯化，以得到370mg目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物DD4的合成
将0.03mL(0.17mmol,1.2eq.)的DIPEA滴加到通过将50mg(0.14mmol,1.0eq.)化合物26溶解在3mL DMF中而获得的溶液，并向其中添加107mg(0.21mmol,1.5eq.)苯酚活化的SN38。将所得混合物搅拌1小时，然后减压浓缩以除去反应溶液。通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
VC接头(DD4)的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 777.3[M+H+]
将结果在图30中示出。
1.3.4.VC接头(DD5)的合成和结构的确认
[方案13]
VC接头(DD5)的合成
化合物30的合成
将5g(14.7mmol，1.0eq.)的Fmoc-Val-OH和1.7g(14.7mmol，1.0eq.)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在140mL二甲氧基乙烷(DME)中，并搅拌。在0℃下滴加2.5mL(16.2mmol，1.1eq.)的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)并搅拌16小时。将反应溶液减压过滤以除去漂浮物，并且将滤液减压浓缩。将残留物溶于丙酮中，并在冰箱中低温下储存4小时。之后，将所得溶液减压过滤以除去重新形成的漂浮物，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.5g，86％)。TLC(EA:Hex＝1:1)；Rf＝0.5。
化合物31的合成
将2.0g(11.5mmol，1.0eq.)的L-瓜氨酸溶解在100mL的四氢呋喃(THF)和水的1:1混合溶液中并搅拌。向其中加入988mg碳酸氢钠并搅拌。随后，将5.0g(11.5mmol，1.0eq.)化合物30溶解在80mL丙酮中，滴加到反应溶液中并搅拌。将所得混合物搅拌21小时，然后减压浓缩以除去有机溶剂。将水层用乙酸乙酯(EA)洗涤，然后通过缓慢滴加2N HCl滴定至pH 3。向其中加入EA以萃取有机层中的沉淀物。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.6g，98％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1，一滴甲酸)；Rf＝0.1。
化合物32的合成
将50mL的处于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％哌啶滴加至2.84g(5.72mmol，1.0eq.)化合物31并搅拌。4小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应液，并且将残留物溶解于水中，并减压过滤以除去所形成的漂浮物。将水层浓缩以得到目标化合物，其无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物33的合成
将54mg(0.22mmol，1.0eq.)的化合物29溶解在2mL的DMF中，并向其中滴加0.05mL(0.264mmol，1.2eq.)的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。通过加入2mL水使化合物32完全溶解，并在室温下向其中滴加0.05mL(0.528mmol，2.4eq.)乙酸酐。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并将浓缩物通过反相柱色谱法纯化，以得到目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.05。
化合物34的合成
将1g(3.16mmol,1.0eq.)化合物33溶于30mL的DCM和甲醇的2:1混合溶液，并且向其中加入868mg(3.48mmol，1.1eq.)的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)并搅拌。向其中加入451mg(3.66mmol，1.16eq.)的4-氨基苄醇并搅拌5小时。将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得419mg目标化合物(产率：32％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
化合物35的合成
将240mg(0.55mmol，1.0eq.)的化合物34溶解在10mL的DMF中，并且向其中滴加0.3mL(1.65mmol，3.0eq.)的DIPEA并搅拌。随后，通过添加509mg(1.65mmol，3.0eq.)双-(4-氨基苯基)碳酸酯进行反应。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并向其中加入乙醚以使目标化合物沉淀，将该化合物减压过滤。得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。
化合物36的合成
将33mg(0.06mmol，1.0eq.)化合物35溶于5mL的DMF中，并且向其中滴加16mg(0.08mmol,1.3eq.)的N-[(叔丁氧基)羰基]-N,N′-二甲基乙二胺和0.02mL(0.08mmol，1.3eq.)的DIPEA并搅拌。将所得混合物搅拌7小时，然后减压浓缩以除去反应溶液，并且向其中加入乙醚以使目标化合物沉淀，将该化合物减压过滤。得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
化合物37的合成
将17mg(0.03mmol，1.0eq.)的化合物36溶解在1mL的DCM中，然后在0℃下向其中滴加1mL的三氟乙酸(TFA)。通过在0℃下搅拌所得混合物30分钟并随后在室温下搅拌30分钟来进行反应。随后，将混合物减压浓缩以除去反应溶液如DCM，然后将该浓缩重复3次。将经浓缩的物质在高真空下干燥，并通过反相柱色谱法纯化，以得到13mg目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物DD5的合成
将0.01mL(0.04mmol,1.5eq.)的DIPEA滴加到通过将13mg(0.03mmol,1.0eq.)化合物37溶解在3mL的DMF中而获得的溶液，并向其中加入22mg(0.04mmol,1.5eq.)苯酚活化的SN38。将所得混合物搅拌1小时，然后减压浓缩以除去反应溶液。通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.2。
3-4-2.VC接头(DD5)的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 954.4[M+H+]
将结果在图31中示出。
1.3.5.VC接头(DD6)的合成和结构的确认
[方案14]
VC接头(DD6)的合成
化合物38的合成
将5g(14.7mmol，1.0eq.)的Fmoc-Val-OH和1.7g(14.7mmol，1.0eq.)的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶解在140mL二甲氧基乙烷(DME)中，并搅拌。在0℃下滴加2.5mL(16.2mmol，1.1eq.)的N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)并搅拌16小时。将反应溶液减压过滤以除去漂浮物，并将滤液减压浓缩。将残留物溶于丙酮中，并在冰箱中低温下储存4小时。之后，将所得溶液减压过滤以除去重新形成的漂浮物，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.5g，86％)。TLC(EA:Hex＝1:1)；Rf＝0.5。
化合物39的合成
将2.0g(11.5mmol，1.0eq.)的L-瓜氨酸溶解在100mL的四氢呋喃(THF)和水的1:1混合溶液中并搅拌。向其中加入988mg碳酸氢钠并搅拌。随后，将5.0g(11.5mmol，1.0eq.)化合物38溶解在80mL丙酮中，滴加至反应溶液并搅拌。将所得混合物搅拌21小时，然后减压浓缩以除去有机溶剂。将水层用乙酸乙酯(EA)洗涤，然后通过缓慢滴加2N HCl滴定至pH 3。向其中加入EA以萃取有机层中的沉淀物。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并且无需任何纯化而用于下一步反应(粗品产率：5.6g，98％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1，一滴甲酸)；Rf＝0.1。
化合物40的合成
将50mL的处于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的10％哌啶滴加至2.84g(5.72mmol，1.0eq.)化合物39并搅拌。4小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应液，并且将残留物溶解于水中，并减压过滤以除去所形成的漂浮物。将水层浓缩以得到目标化合物，其无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物41的合成
将54mg(0.22mmol，1.0eq.)的化合物40溶解在2mL的DMF中，并向其中滴加0.05mL(0.264mmol，1.2eq.)的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)。通过加入2mL水使化合物37完全溶解，并在室温下向其中滴加0.05mL(0.528mmol，2.4eq.)乙酸酐。3小时后，将所得混合物减压浓缩以除去反应溶液，并将浓缩物通过反相柱色谱法纯化，以得到目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.05。
化合物42的合成
将300mg(0.95mmol，1.0eq.)化合物41溶于6mL的DMF中，然后向其中加入550mg(1.43mmol，1.5eq.)的1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(HATU)。随后，滴加0.25mL(1.43mmol，1.5eq.)的DIPEA，并将230mg(1.43mmol，1.5eq.)的N-[(叔丁氧基)羰基]-N,N’-二甲基乙二胺溶于3.5mL的DMF中，并在室温下滴加。7小时后，将反应溶液用乙酸乙酯(EA)稀释，并将有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。然后，将有机层用饱和盐水溶液和硫酸钠干燥，并过滤以得到目标化合物。得到的目标化合物无需任何纯化而用于下一步反应。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.5。
化合物43的合成
将化合物42溶解在DCM和TFA的2:1混合溶液中，然后在0℃下进行反应。随后，将反应混合物减压浓缩以除去反应溶液(如DCM)，然后将该浓缩重复3次。将残留物在高真空下干燥，并通过反相柱色谱法进行纯化，以得到370mg目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.01。
化合物DD6的合成
将0.03mL(0.17mmol,1.2eq.)的DIPEA滴加到通过将50mg(0.14mmol,1.0eq.)化合物43溶解在3mL的DMF中而获得的溶液，并向其中加入107mg(0.21mmol,1.5eq.)苯酚活化的SN38。将所得混合物搅拌1小时，然后减压浓缩以除去反应溶液。通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化浓缩物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.1。
VC接头(DD6)的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 805.5[M+H+]
将结果在图32中示出。
2.用于将位点特异性第一点击化学官能团转移至抗体(H1-L2-SSFI)的试剂的制备
2.1.化合物I-SSFI(其中Xa1为赖氨酸)的合成及结构确认
化合物I-SSFI(Lys)的合成方法
化合物I-SSFI的合成在DMF中进行，并且将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物I溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物I引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物I-SSFI。纯化后，将化合物I-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为12mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：71％)。
化合物I-SSFI的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier Xe
经计算的分子量：2246.99g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1124.90g/mol
将结果在图33中示出。
2.2.化合物II-SSFI(其中Xa1为赖氨酸)的合成及结构确认
化合物II-SSFI(Lys)的合成方法
化合物II-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物II溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物II引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物II-SSFI。纯化后，将化合物II-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为13mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：78％)。
化合物II-SSFI(Lys)的结构的确认
测量设备：Ultraflextreme(Bruker)
测量基质：CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)和DHB(2,5-二羟基苯甲酸)
经计算的分子量：2261.01g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：2263.26g/mol
将结果在图34中示出。
2.3.化合物III-SSFI(其中Xa1为赖氨酸)的合成及结构确认
化合物III-SSFI(Lys)的合成方法
化合物III-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物III溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物III引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物III-SSFI。纯化后，将化合物III-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为12mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：75％)。
化合物III-SSFI(Lys)的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier Xe
经计算的分子量：2202.97g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1103.64g/mol
将结果在图35中示出。
2.4.化合物III-SSFI(其中Xa1为鸟氨酸)的合成及结构确认
化合物III-SSFI(Orn)的合成方法
化合物III-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物III溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物III引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物III-SSFI。纯化后，将化合物III-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为14mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：87％)。
化合物III-SSFI(Orn)的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier Xe
经计算的分子量：2188.97g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1096.64g/mol
将结果在图36中示出。
2.5.化合物III-SSFI(其中Xa1为2,4-二氨基丁酸(Dab))的合成及结构确认
化合物III-SSFI(Dab)的合成方法
化合物III-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物III溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物III引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物III-SSFI。纯化后，将化合物III-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为12mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：75％)。
化合物III-SSFI(Dab)的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier Xe
经计算的分子量：2174.94g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1089.94g/mol
将结果在图37中示出。
2.6.化合物III-SSFI(其中Xa1为2,3-二氨基丙酸(Dap))的合成及结构确认
化合物III-SSFI(Dap)的合成方法
化合物III-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物III溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物III引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物III-SSFI。纯化后，将化合物III-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为12mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：75％)。
化合物III-SSFI(Dap)的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier xe
经计算的分子量：2160.92g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1082.34g/mol
将结果在图38中示出。
2.7.化合物IV-SSFI(其中Xa1为Dap)的合成及结构确认
化合物IV-SSFI(Dap)的合成方法
化合物IV-SSFI的合成在DMF中进行，并将3当量的DIPEA和8.4μmol的化合物IV溶解在7.3μmol的SSFI中并搅拌，以将化合物IV引入SSFI中。
确认反应终止后，将该反应溶液浓缩，并尝试通过制备型-HPLC纯化化合物IV-SSFI。纯化后，将化合物IV-SSFI冻干，以得到目标化合物，确认该化合物的量为12mg(纯度：>95％以上(HPLC)，且产率：76％)。
化合物IV-SSFI(Dap)的结构的确认
测量设备：Waters Quattro Premier Xe
经计算的分子量：2167.90g/mol
经测量的分子量(M/2+H)2+：1085.60g/mol
将结果在图39中示出。
3.以位点特异性的方式包含第一点击化学官能团的抗体的合成及结构确认
3.1.抗体-降冰片烯的合成
曲妥珠单抗-降冰片烯的合成方法(1)
使用化合物I-SSFI(Lys)的引入反应
使用化合物I-SSFI(Lys)在缓冲液中进行Ab(246/248Lys)-降冰片烯的合成。将1×PBS缓冲液(0.01％Tween 20，pH 7.4)用作反应缓冲液。为了在抗体(曲妥珠单抗，4mg/mL)的特定位点处引入降冰片烯，每1个抗体加入8当量的化合物I-SSFI(Lys)，并在室温下反应72小时，并且反应的监测和终止通过HIC-HPLC确认。随着降冰片烯与所述抗体结合的进行，观察到色谱图上的峰从4分钟迁移至4.5分钟和5分钟，从而确认反应的进展程度。使用1×PBS缓冲液(pH 7.4)将Ab-降冰片烯偶联物透析3次，并使用尺寸排阻色谱技术进行纯化。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物I-SSFI(Lys)之间的结合反应的观察在图40中示出。
曲妥珠单抗-降冰片烯的合成方法(2)
使用化合物II-SSFI(Lys)的引入反应
使用化合物II-SSFI(Lys)在缓冲液中进行Ab(246/248Lys)-降冰片烯的合成。将1×PBS缓冲液(0.01％Tween 20，pH 7.4)用作反应缓冲液。为了在抗体(曲妥珠单抗，4mg/mL)的特定位点处引入降冰片烯，每1个抗体加入8当量的化合物II-SSFI(Lys)，并在室温下反应72小时，并且反应的监测和终止通过HIC-HPLC确认。随着降冰片烯与所述抗体结合的进行，观察到色谱图上的峰从4分钟迁移至4.5分钟，从而确认反应的进展程度。使用1×PBS缓冲液(pH 7.4)将Ab-降冰片烯偶联物透析3次，并使用尺寸排阻色谱技术进行纯化。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物II-SSFI(Lys)之间的结合反应的观察在图41中示出。
曲妥珠单抗-降冰片烯的合成方法(3)
使用化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn或Lys)的引入反应
使用化合物III-SSFI(Lys)在缓冲液中进行Ab(246/248Lys)-降冰片烯的合成。将1×PBS缓冲液(0.01％Tween 20，pH 7.4)用作反应缓冲液。为了在抗体(赫赛汀或曲妥珠单抗，4mg/mL)的特定位点处引入降冰片烯，每一个抗体加入10当量的化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn或Lys)，并在室温下反应28小时，并且反应的监测和终止通过HIC-HPLC确认。随着降冰片烯与所述抗体结合的进行，观察到色谱图上的峰从6.2分钟迁移至6.4-6.7分钟，从而确认反应的进展程度。Ab-降冰片烯偶联物使用1×PBS缓冲液(pH 7.4)进行透析，并使用尺寸排阻色谱技术进行纯化。
将化合物III-SSFI(Dap、Dab、Orn或Lys)与所述抗体之间的反应在图42中示出，并将终产物(即，Ab(246/248)-降冰片烯)的结构在图43中示出。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(Dap)之间的结合反应的观察在图44中示出。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(Dab)之间的结合反应的观察在图45中示出。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(Orn)之间的结合反应的观察在图46中示出。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(Lys)之间的结合反应的观察在图47中示出。
3.2.抗体-叠氮化物的合成
曲妥珠单抗-叠氮化物(4)的合成方法
使用化合物IV-SSFI(Dap)的引入反应
使用化合物IV-SSFI(Dap)在缓冲液中进行Ab(246/248Lys)-叠氮化物的合成。将1×PBS缓冲液(0.01％Tween 20，pH 7.4)用作反应缓冲液。为了在抗体(曲妥珠单抗，4mg/mL)的特定位点处引入叠氮化物，每一个抗体加入10当量的化合物IV-SSFI(Dap)，并在室温下反应24小时，并且反应的监测和终止通过HIC-HPLC确认。随着叠氮化物与所述抗体结合的进行，观察到色谱图上的峰从6分钟迁移至6.3分钟，从而确认反应的进展程度。使用1×PBS缓冲液(pH 7.4)将Ab-叠氮化物偶联物透析三次，并使用尺寸排阻色谱技术进行纯化。
根据反应时间对曲妥珠单抗和化合物IV-SSFI(Dap)之间的结合反应的观察在图48中示出。
3.3.曲妥珠单抗-降冰片烯偶联物的结构和位点特异性结合的确认
通过质谱法确认了其中降冰片烯接头通过化合物III-SSFI(Dap)与抗体结合的抗体-降冰片烯复合物。在用IdeS酶对抗体-降冰片烯复合物进行处理后，确定降冰片烯通过F(ab’)2和Fc/2结合到抗体的哪个位点。确认了发现Ides Fc/2-降冰片烯复合物具有2991.68的“Obs-Theo”值，考虑到N-聚糖的质量值的组合值、一个赖氨酸残基的缺失值和一个降冰片烯分子的值，该值确切地匹配，其对应于120Da的分子量(认为-0.10的值是高质量分子量分析中的系统误差)。检测Ides_F(ab’)2的观察到的质谱，但由于各自质谱的复杂性，一个电荷的质量值并未发生迁移，从而使得无法获得相应的质量值。
将由于抗体-降冰片烯结合而具有增加的分子量的复合物的谱图在图49和图50中示出，并且将归因于降冰片烯偶联的分子量变化在表12中列出。
<表l2>抗体-降冰片烯偶联物分子量的变化
所述抗体-降冰片烯复合物的降冰片烯结合位点还通过MS/MS谱与曲妥珠单抗的比较得到确认。结果，确认降冰片烯分子与序列LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF的K248位点结合。MS/MS色谱图在图51-图54中示出，并且基于MS/MS谱的序列匹配结果在图55中示出。
分析的条件如下：
UPLC条件
测量设备：Acquity UPLC I-Class系统
1.色谱柱：Thermo MAbPacTM RP(2.1mm×5mm)
2.柱温：60℃
3.流动相
A.处于水中的0.1％甲酸
B.处于乙腈中的0.1％甲酸
质谱条件
测量设备：LTQ Elite(Thermo)
源类型：HESI
毛细管温度：320℃
源加热器温度：300℃
鞘气流量：40.00
辅助气流量：20.00
吹扫气流量：5.00
源电压(KV)：4.00
FTMS分辨率：120,000
FTMS质量范围：400至4,000
3.4.曲妥珠单抗-叠氮化物的结构确认
使用质谱法确认其中叠氮化物接头通过化合物IV-SSFI(Dap)与抗体结合的抗体-叠氮化物复合物。当两个叠氮化合物分子与曲妥珠单抗结合时，确认了249Da的分子量增加。曲妥珠单抗的经测量的质谱在图56中示出，并且两个叠氮化物分子结合至其的抗体-叠氮化物复合物的质谱在图57中示出。
测量设备：Ultraflex III(TOF/TOF)
分析模式：线性模式
极性：正极
检测：m/z 2,000至300,000
激光重复率：100Hz
拍摄张数：1000张
偏转：开，5,000Da
电压：离子源kV，离子源II 23.00kV，透镜9.00kV
经计算的分子量：148,271g/mol
经测量的分子量：148,262g/mol
4.抗体-有效载荷偶联物的合成及结构确认4.1.有效载荷的合成方法及结构确认[方案15]
四嗪-DM1的合成
四嗪-DM1
四嗪-DM1的合成方法
化合物41的合成
将0.53g(0.8mmol，1.0eq.)的Fmoc-PEG8-OH溶解在7mL的DMF中并搅拌。随后，向其中滴加0.38g(1.0mmol，1.25eq.)的HATU和0.3mL(1.7mmol，2.1eq.)的DIPEA。向其中滴加0.205g(0.86mmol，1.1eq.)甲基四嗪-胺HCl以及滴加0.3mL(1.7mmol，2.1eq.)的DIPEA。将所得混合物搅拌4小时，然后减压浓缩以除去溶剂。通过柱色谱法(处于DCM中的5％MeOH)纯化混合物，以获得目标化合物。TLC(DCM:MeOH＝20:1)；Rf＝0.3。
化合物42的合成
将0.527g(0.62mmol，1.0eq.)的化合物41溶解在6mL的DMF中，并向其中滴加0.3mL二乙胺。将所得混合物搅拌2.5小时，然后减压浓缩以除去溶剂。将混合物通过柱色谱法(DCM:MeOH:NH4OH＝80:25:2.5)纯化，以得到目标化合物，确认该化合物的量为0.273g(产率：70％)。TLC(DCM:MeOH:NH4OH＝80:25:2.5)；Rf＝0.1。
四嗪-DM1的合成
将0.355g(0.57mmol，1.5eq.)的化合物42溶解在25mL的DMF中并搅拌。向其中加入0.405g(0.38mmol，1.0eq.)的DM1-SMCC-NHS，并滴加DIPEA直至混合物达到pH 9.0。随后，将混合物搅拌2小时。将反应溶液减压浓缩，然后通过柱色谱法(处于DCM中的10％MeOH)纯化，以得到目标化合物，确认该化合物的量为0.434g(产率：73％)。TLC(DCM:MeOH＝10:1)；Rf＝0.5。
四嗪-DM1的结构的确认
LRMS(ESI):m/z 782.6[M+2H+]
将结果在图58中示出。
4.2.抗体-有效载荷偶联物的合成和结构的确认
4.2.1.抗体-降冰片烯-四嗪-DM1
曲妥珠单抗-降冰片烯-四嗪-DM1的合成方法(1)
使用化合物III-SSFI(Dap)将四嗪-DM1引入曲妥珠单抗-降冰片烯中的反应
使用曲妥珠单抗构建抗体-有效载荷偶联物，通过化合物III-SSFI(Dap)向其中引入两个降冰片烯分子。使用25mL浓度为4.5mg/mL的抗体-有效载荷偶联物进行反应，并尝试将四嗪-PEG8-DM1药物的偶联用于与偶联至所述抗体的降冰片烯的双正交反应(即，双正交化学)。每个抗体使用40当量的药物，并且偶联反应在室温下在20mM组氨酸乙酸盐溶液(pH5.5)中进行24小时。通过HIC-HPLC监测偶联反应，并且观察到仅降冰片烯分子与曲妥珠单抗结合后于7.7分钟处出现的峰迁移至8.7分钟(DAR 1)和10.5分钟(DAR 2)，作为与抗体-降冰片烯接头反应的四嗪-PEG8-DM1药物。结果，观察到抗体-有效载荷偶联物的形成。
产品‘抗体-有效载荷偶联物’的结构在图59中示出，并且通过HIC-HPLC进行的反应监测在图60中示出(表13)。
<表13>通过HIC-HPLC对抗体-有效载荷偶联物的形成进行的反应监测
保留时间 组合物
6.6分钟 曲妥珠单抗
7.7分钟 曲妥珠单抗-降冰片烯偶联物
8.7分钟 曲妥珠单抗-DM1偶联物(1个位点，DAR1)
10.5分钟 曲妥珠单抗-DM1偶联物(2个位点，DAR2)
曲妥珠单抗-降冰片烯-四嗪-DM1结构的确认(2)
通过质谱法确认了其中四嗪-DM1与曲妥珠单抗-降冰片烯结合的抗体-药物偶联物。在用IdeS酶对抗体-药物偶联物进行处理后，确定四嗪-DM1通过F(ab’)2和Fc/2结合到抗体的哪个位点。确认了发现Ides Fc/2-DM1复合物具有1673.5的“Obs-Theo”值，表明考虑到一个四嗪-DM1分子的组合值，该药物与所述偶联物结合，其对应于1，688.80Da的分子量(在DM1系列药物的分子量分析中观察到脱水反应)。检测Ides_F(ab’)2的观察到的质谱，但由于各自质谱的复杂性，一个电荷的质量值并未发生迁移，从而使得无法获得相应的质量值。
将由于曲妥珠单抗-降冰片烯-四嗪-DM1结合而具有增加的分子量的复合物的谱图在图61和图62中示出。
UPLC条件
测量设备：Acquity UPLC I-Class系统
1.柱：Thermo MAbPacTM RP(2.1mm×5mm)
2.柱温：60℃
3.流动相
A.处于水中的0.1％甲酸
B.处于乙腈中的0.1％甲酸
质谱条件
测量设备：LTQ Elite(Thermo)
源类型：HESI
毛细管温度：320℃
源加热器温度：300℃
鞘气流量：40.00
辅助气流量：20.00
吹扫气流量：5.00
源电压(KV)：4.00
FTMS分辨率：120,000
FTMS质量范围：400至4,000
5.抗体-药物偶联物的FcRn结合分析
本专利中构建的抗体-药物偶联物被命名为“Pro”。
为了核查所述抗体-药物偶联物(参见图59；Pro(NC,DM1))是否具有抗体再循环功能，分析了该偶联物对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力，这与体内抗体再循环密切相关。作为生物分子相互作用系统之一，将Octet(型号：Octet QK384)用于确定FcRn对所构建的ADC的反应亲和力。由表面变化引起的光反射差异被认为是没有标记的，因此进行了动力学分析，所述表面变化根据附着至传感器表面的分子与样品中的分子之间的反应程度而发生。将曲妥珠单抗、赫赛莱和Pro(NC，DM1)用作样品，以在pH 6.0的条件下测量FcRn的结合亲和力。结果确认，所测得的KD值分别为1.12×10-7M、1.12×10-7M和8.84×10-8M，表明与赫赛莱相比，Pro具有相似或优越的结合亲和力(表14)。
<表14>抗体-药物偶联物的FcRn结合分析
6.抗体-药物偶联物的抗原结合分析
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析确定Her2蛋白是否与抗体-药物偶联物结合。将使用曲妥珠单抗和化合物III-SSFI(Dap)构建的所述抗体-降冰片烯复合物用作测量抗原结合亲和力的抗体-药物偶联物。将待与抗体-降冰片烯复合物结合的三种药物的结构在图63中示出。
赫赛汀(曲妥珠单抗)、赫赛莱、Pro(NC，DM1)、Pro(VC，DM1)和Pro(VC，MMAE)与抗原的解离常数(Kd)经确认分别为约98.6pM、约94.8pM、约121.4pM、约137.0pM和约117.3pM。基于该结果确认了，药物的结合位点不影响所构建的ADC对抗原的结合亲和力。
将测量抗体-药物偶联物的抗原结合亲和力的图在图64中示出(表15)。
<表15>抗体-药物偶联物的抗原结合分析
7.抗体-药物偶联物的血清稳定性的确认
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析确定抗体-药物偶联物在血清中是否稳定。在室温下测试了抗体-药物偶联物在大鼠、兔和人血清中的稳定性。确认了自行构建的ADC“Pro(NC，DM1)”随时间推移的完整ADC(即药物结合的ADC)残留水平的模式与赫赛莱组的模式一致。
将所述抗体-药物偶联物的血清稳定性分析的结果在图65至图67中示出。
8.抗体-药物偶联物(Pro)在细胞水平上的药效评价(体外细胞毒性检测)
根据癌细胞中的靶标志物的水平评估使用曲妥珠单抗的三种抗体-药物偶联物(ADC、Pro系列)的药效，并分别使用NCI-N87和MDA-MB-468作为表达靶抗原(Her2)“细胞系”的阳性细胞系和表达BT474的阴性细胞系来进行细胞毒性试验。在将细胞用不同浓度的抗体-药物偶联物处理后，观察到在Her2过表达细胞NCI-N87中构建的三种抗体-药物偶联物(Pro(NC，DM1)、Pro(VC，DM1)和Pro(VC，MMAE))。结果确认了抗体-药物偶联物具有207.7ng/mL、93.9ng/mL和57.7ng/mL的IC50值，表明所述抗体-药物偶联物具有优异的抗癌作用。在将细胞用不同浓度的抗体-药物偶联物处理后，观察到在另一Her2过表达细胞系BT474中构建的三种抗体-药物偶联物(Pro(NC，DM1)、Pro(VC，DM1)和Pro(VC，MMAE))。结果确认了，抗体-药物偶联物具有47.7ng/mL、44.6ng/mL和1.09ng/mL的IC50值，表明所述抗体-药物偶联物具有优异的抗癌作用。Pro(VC，MMAE)作为新型ADC的效用得到证实，因为与作为可商购的赫赛汀ADC的赫赛莱相比，观察到Pro(VC，MMAE)具有相当或更好的细胞凋亡作用。
将检测结果在图68至图70中示出。
9.抗体-药物偶联物(Pro)在动物水平上的药效评价(体外细胞毒性试验)
将过表达靶抗原的NCI-N87胃癌细胞系皮下移植到小鼠中，以建立异种移植模型，并将小鼠分为4组以进行针对所给予的材料的抗癌功效试验。由于本试验中使用的BALB/c裸鼠缺乏T细胞，因此容易将癌细胞移植到BALB/c裸鼠中，因此，BALB/c裸鼠被用作适合使用啮齿动物的抗癌功效试验的模型。
(a)细胞系的制备
将一小瓶人肿瘤细胞系(NCI-N87细胞系)放入含有RPMI1640培养基(Gibco，22400-089)的细胞培养瓶中，该培养基补充有热灭活的10％胎牛血清(FBS；Gibco，10082-742)，并在37℃、5％CO2的培养箱中培养。将细胞培养基用PBS洗涤，并用2.5％胰蛋白酶-EDTA(Gibco,15090)稀释10倍。随后，加入经稀释的细胞培养基以分离细胞，并将细胞离心(在1,000rpm下5分钟)以丢弃上清液。将新鲜培养基加入细胞团块中以获得细胞悬浮液。使用显微镜确认细胞的活力，并将细胞用由培养基和基质胶以1:1的混合比混合得到的溶液稀释至1.25×107个细胞/mL的浓度，以制备细胞系。
(b)细胞系的移植
使用“4.3)(4)细胞系的制备”部分中描述的方法制备细胞系。将细胞重新悬浮并匀化以制备细胞系，并将所制备的细胞系立即给予至动物。为了移植细胞系，将动物的背部区域用70％酒精消毒，用拇指和食指牵拉背部皮肤，以在皮肤和肌肉之间形成空间。随后，将带有26号针头的注射器插入拇指和食指之间的皮下袋中，然后从动物前面以2.5×106个细胞/0.2mL/头的剂量皮下注射细胞系。在适应期中选择健康动物，并使其经受细胞系接种。当细胞系移植部点中的肿瘤大小达到约100～150mm3时，按照分级肿瘤的大小对小鼠进行分组，使各组中的肿瘤大小分布尽可能均匀。
(c)实验组的配置以及剂量和给药方法的确定
细胞系＝NCI-N87
小鼠类型＝BALB/c裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrljOri)
每组数量＝5
给药方法＝静脉内注射(使用26号针头注射器)
剂量＝5mg/kg
给药次数＝一次/3天，给药3次
观察期＝5周
第1组：PBS；第2组：赫赛汀(曲妥珠单抗)；第3组：赫赛莱；第4组：Pro(NC，DM1)；第5组：Pro(VC，DM1)；和第6组：Pro(VC，MMAE)
(d)观察和检查项目
一般症状
在给药和观察期间，每天一次地观察一般症状类型(包括死亡)、症状发作日期和症状严重程度，并对每个个体进行记录。一般症状恶化的所述个体被隔离。
体重
在分组日或给予试验物质的起始日测量体重，然后每周测量两次。
肿瘤大小的测量
从给予试验物质的起始日起，每周测量两次肿瘤大小，持续5周。使用卡尺测量肿瘤的长轴长度和短轴长度，并根据以下等式计算肿瘤大小。
肿瘤大小＝ab2/2(a：长轴长度；且b：短轴长度)
(e)结果
注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)的组和注射赫赛汀(曲妥珠单抗)的组中的小鼠在5周的观察期内没有表现出抑制肿瘤生长的趋势。确认与赫赛汀相比，根据本发明构建的Pro系列抗体-药物偶联物具有更优异的抑制肿瘤生长的能力，表明根据本发明的抗体-药物偶联物成功地作为ADC起作用。
将相关的结果在图71和图72示出。
10.抗体-药物偶联物的药代动力学(PK)试验
为了分析使用Pro制造的抗体药物偶联物(ADC)的药代动力学特征，进行了酶联免疫吸附测定(ELISA)以确认所述抗体药物偶联物的药代动力学。所制造的ADC具有如图59所示的Pro(NC，DM1)结构，并与赫赛莱进行了比较验证。大鼠(n＝3)用于动物模型。在这种情况下，向大鼠静脉内注射5mg/kg ADC，然后随时间监测。经确认，所给予的Pro(NC,DM1)的完整ADC形式(与药物结合的完整ADC)随时间减少。据判断，与赫赛莱相比，完整的ADC具有相似或改善的药物特性。
将结果在图73中示出。
<110> 阿比蒂斯有限公司（Abtis co.， ltd.）
成均馆大学校产学协力团（Research & Business FoundationSungkyunkwan University）
<120> 位点特异性的抗体偶联和作为其具体实例的抗体-药物偶联物
<130> CP20-056
<150> US 62/815557
<151> 2019-03-08
<160> 25
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体Fc结构域的一部分
<400> 1
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-III中的基序
<400> 2
Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是两个Xaa，第二个X是Xa1，第三个X是E或N，第四个X是
W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个
<400> 3
Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是Xa1，第二个X是E或N，第三个X是W、萘丙氨酸或苯
丙氨酸中的一个
<400> 4
Ala Trp His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位于N-端和C-端的P形成D-脯氨酸-L-脯氨酸模板，第一个X是两个
Xaa，第二个X是Xa1，第三个X是E或N，第四个X是W、萘丙氨酸
或苯丙氨酸中的一个
<400> 5
Pro Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是1至3个Xaa，第二个X是两个Xaa，第三个X是Xa1，第四个X
是E或N，第五个X是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个，且第六个X
是1至3个Xaa，其中与N-端和C-端相距2至4个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 6
Xaa Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 位于N-端和C-端的P形成D-脯氨酸-L-脯氨酸模板，第一个X是两个
Xaa，第二个X是Xa1，第三个X是E或N，第四个X是W、萘丙氨酸
或苯丙氨酸中的一个，其中与N-端和C-端相距3个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 7
Pro Asp Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Thr Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C-端的C可以连接，第一个X是两个Xaa，第二个X是Xa1，
第三个X是E或N，第四个X 是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的
一个，其中与N-端和C-端相距3个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 8
Cys Asp Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Thr Cys
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是两个Xaa，第二个X是Xa1，第三个X是E或N，第四个X是
W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个，其中与N-端和C-端相距2个氨基酸的两
个C可以任选地连接
<400> 9
Asp Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是Xa1，其中与N-端和C-端相距2个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 10
Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是两个Xaa，第二个X是(Xa1)'，第三个X是E或N，
第四个X是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个
<400> 11
Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是1至3个Xaa，第二个X是两个Xaa，第三个X是(Xa1)'，第四
个X是E或N，第五个X是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个，且第六
个X是1至3个Xaa，其中与N-端和C-端相距2至4个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 12
Xaa Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是Xa1，其中与N-端和C-端相距2个氨基酸的两个C可以任选地连接
<400> 13
Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是两个Xaa，第二个X是(Xa1)'，第三个X是E或N，第四个X
是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个，其中(Xa1)'包含H1
<400> 14
Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 第一个X是1至3个Xaa，第二个X是两个Xaa，第三个X是(Xa1)'，第四
个X是E或N，第五个X 是W、萘丙氨酸或苯丙氨酸中的一个，且第六个
X为1至3个Xaa，其中与N-端和C-端相距2至4个中的两个C可以任选地连接，
并且(Xa1)'包括
<400> 15
Xaa Cys Xaa His Xaa Gly Xaa Leu Val Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是Xa1，其中与N-端和C-端相距2个氨基酸的两个C可以任选地连接，并且(Xa1)'
包含H1
<400> 16
Asp Cys Ala Trp His Xaa Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'
<400> 17
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'
<400> 18
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'
<400> 19
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'，其中(K)'包含H1
<400> 20
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'，其中(K)'包含H1
<400> 21
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)'，其中(K)'包含H1
<400> 22
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)''
<400> 23
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Lys Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)''
<400> 24
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X是(K)''
<400> 25
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Xaa Pro Xaa Asp Thr Leu Met
1 5 10 15
Ile

Claims (24)

1.一种具有式6-3结构的肽-化合物偶联物：
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T
其中，
D为天冬氨酸残基，C为半胱氨酸残基，A为丙氨酸残基，W为色氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，E为谷氨酸残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，T为苏氨酸残基，并且
(Xa1)′为其中，
H1为第一点击化学官能团，
D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，
X1为S，
D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基和C2～7亚炔基，
D3为共价键或C1～3亚烷基，并且
X3为NH，
并且其中，N-端的半胱氨酸残基与C-端的半胱氨酸残基任选地连接，
其中，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基和亚环烷基分别包括杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基和杂亚环烷基。
2.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，D1为共价键或-(CH2)1-4-。
3.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，D1包括至少一个杂原子。
4.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，H1选自炔烃和烯烃。
5.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，H1选自张力炔烃和二烯。
6.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，H1为亲二烯体。
7.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，H1选自叠氮化物、二苯并环辛炔-胺、反式环辛烯和降冰片烯。
8.根据权利要求1所述的肽-化合物偶联物，其中，D2为-CH2-。
9.一种制备包含第一点击化学官能团的抗体或其片段的方法，所述方法包括使具有式6-3结构的肽-化合物偶联物与抗体或其片段反应：
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T
其中，
D为天冬氨酸残基，C为半胱氨酸残基，A为丙氨酸残基，W为色氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，E为谷氨酸残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，T为苏氨酸残基，并且
(Xa1)′为其中，
H1为第一点击化学官能团，
D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，
X1为S，
D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基和C2～7亚炔基，
D3为共价键或C1～3亚烷基，并且
X3为NH，
并且其中，N-端的半胱氨酸残基与C-端的半胱氨酸残基任选地连接，
其中，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基和亚环烷基分别包括杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基和杂亚环烷基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，D1为共价键或-(CH2)1-4-。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，D1包括至少一个杂原子。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，H1选自炔烃和烯烃。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，H1选自张力炔烃和二烯。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，H1为亲二烯体。
15.根据权利要求9所述的方法，其中，H1选自叠氮化物、二苯并环辛炔-胺、反式环辛烯和降冰片烯。
16.根据权利要求9所述的方法，其中，D2为-CH2-。
17.一种用于制备包含第一点击化学官能团的抗体或其片段的试剂盒，所述试剂盒包含具有式6-3结构的肽-化合物偶联物和抗体或其片段：
[式6-3]
D-C-A-W-H-(Xa1)′-G-E-L-V-W-C-T
其中，
D为天冬氨酸残基，C为半胱氨酸残基，A为丙氨酸残基，W为色氨酸残基，H为组氨酸残基，G为甘氨酸残基，E为谷氨酸残基，L为亮氨酸残基，V为缬氨酸残基，T为苏氨酸残基，
(Xa1)′为其中，
H1为第一点击化学官能团，
D1选自共价键、C1～4亚烷基、C2～4亚烯基、C2～4亚炔基和C3～8亚环烷基，
X1为S，
D2选自C1～7亚烷基、C2～7亚烯基和C2～7亚炔基，
D3为共价键或C1～3亚烷基，并且
X3为NH，
其中，N-端的半胱氨酸残基与C-端的半胱氨酸残基任选地连接，
其中，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基和亚环烷基分别包括杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基和杂亚环烷基。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，D1为共价键或-(CH2)1-4-。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，D1包括至少一个杂原子。
20.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，H1选自炔烃和烯烃。
21.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，H1选自张力炔烃和二烯。
22.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，H1为亲二烯体。
23.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，H1选自叠氮化物、二苯并环辛炔-胺、反式环辛烯和降冰片烯。
24.根据权利要求17所述的试剂盒，其中，D2为-CH2-。
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