CN113403208A - 高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，包括：1)构建基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统；2)利用米曲霉曲酸合成基因评估步骤1)构建的米曲霉基因编辑系统，所述米曲霉曲酸合成基因选自kojA、kojR和kojT；3)将kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密码子后面，构建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed，以此评估非功能性DsRed作为报告基因用于筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。本发明实现了从米曲霉CRISPR/Cas9突变株中批量的初步筛选突变体，避免了大量提取DNA的繁琐，无需进行批量的米曲霉转化子测序筛选。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术的基因工程领域，具体涉及高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法。
背景技术
米曲霉广泛用于食品发酵、酶及次级代谢产物的工业生产。基因工程技术的发展极大地提高了米曲霉的产品质量和产量，其中CRISPR/Cas9系统为米曲霉的基因改造提供了强大的基因工程工具。CRISPR/Cas9系统包含两个组成部分：Cas9核酸酶和一个sgRNA。sgRNA可以引导Cas9核酸酶识别并切割位于原间隔基序(protospacer adjacent motif，PAM)上游的靶序列。当Cas9产生的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks，DSB)通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)机制或同源定向修复(homology-directed repair，HDR)机制修复时，靶位点会产生核苷酸的随机插入或缺失(insertionsor deletions，InDels)。CRISPR/Cas9系统已广泛应用于米曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉等各种丝状真菌。然而，为了满足工业化生产和功能研究的需求，需要对CRISPR/Cas9系统产生的突变体进行快速筛选。
目前突变体的鉴定方法主要是基于PCR、限制性内切酶和测序技术。例如，PCR/限制性内切酶(PCR/RE)分析需要扩增和消化靶位点中可用的限制性内切酶位点，一旦靶位点中的限制性内切酶位点被编辑破坏掉，就会引起靶位点的无法酶切而鉴定出突变体。类似地，T7EI分析方法利用了噬菌体分解酶T7EI，该酶对通过CRISPR/Cas9基因编辑引入的靶位点的错配具有更大的切割活性，从而鉴定出突变体。虽然这些测序可以准确鉴定突变体的突变类型，但是批量筛选突变体的成本高、难度大。直接观察材料的荧光是快速鉴定突变体的一个好方法。已有研究报道，利用绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)报告基因与Cas9编码基因融合来获得转化材料，但仅凭荧光不能将转化材料与大量未转化材料区分开来。因此，非常有必要建立一种高效的方法来鉴定CRISPR/Cas9产生的突变体。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，包括：
1)构建基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统；
2)利用米曲霉曲酸合成基因评估步骤1)构建的米曲霉基因编辑系统，所述米曲霉曲酸合成基因选自kojA、kojR和kojT；
3)将kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密码子后面，构建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed，以此评估非功能性DsRed作为报告基因用于筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。
优选地，步骤1)又包括：
1-1)将优化的Cas9基因序列插入到pEX1载体的XhoI和BamHI识别位点之间，得到pEX1-Cas9载体；
1-2)将含有构巢曲霉gpdA启动子、Cas9和trpC终止子的Cas9表达盒进行PCR扩增，将获得的Cas9表达盒插入到pPTRII载体的HindIII位点，产生pPTRII-Cas9重组载体；
1-3)将包括靶基因原间隔区序列的sgRNA序列与U6启动子和U6终止子融合，然后插入到pPTRII-Cas9重组载体，产生pPTRII-Cas9-靶基因载体。
更优选地，步骤1-2)中，PCR扩增的引物序列如下：
pEX1-Cas9-F：5′-TGATTACGCCAAGCTTTGTGACGAACTCGTGTGCTC-3′；
pEX1-Cas9-R：5′-GCAGGCATGCAAGCTTAAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTGT-3′。
优选地，步骤2)又包括构建敲除米曲霉曲酸合成基因的基因编辑载体：
2-1)用正向引物PU6-F和含有kojA/kojR/kojT靶向序列的反向引物PU6-kojA/kojR/kojT-R扩增U6启动子PU6，获得PU6-kojA/kojR/kojT片段；
2-2)以sgRNA和U6终止子序列sgRNA-TU6为模板，以TU6-R和TU6-kojA/kojR/kojT-F为引物，通过PCR扩增，将kojA/kojR/kojT的靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段；
2-3)将PU6-kojA/kojR/kojT片段和kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段进行重叠PCR，获得PU6-kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段；
2-4)将PU6-kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段重组连接到pPTRII-Cas9-靶基因载体的SmaI位点上，获得pPTRII-Cas9-kojA/kojR/kojT载体。
更优选地，步骤2-1)中，以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板。
更优选地，步骤2-1)中，正向引物PU6-F和反向引物PU6-kojA/kojR/kojT-R的序列如下：
PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；
PU6-kojA-R：TGGTCAAGTTCTGTGAGACGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTT；
PU6-kojR-R：TGAAGCATGGGGGCAGTTGGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
PU6-kojT-R：TCGGTATTGGCGGAAGGACTACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
步骤2-2)中，引物TU6-R和TU6-kojA/kojR/kojT-F的序列如下：
TU6-R AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG；
TU6-kojA-F CGTCTCACAGAACTTGACCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-kojR-F CCAACTGCCCCCATGCTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-kojT-F AGTCCTTCCGCCAATACCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA。
优选地，步骤2)还包括：筛选PEG介导的米曲霉转化子，并通过测序确认转化子中的基因突变。
优选地，步骤3)包括：
以DsRed为模板，利用在5’端添加了kojA靶向序列及其PAM的pEX2B-nDsRed-kojA-F正向引物和反向引物pEX2B-nDsRed-kojA-R进行PCR扩增，扩增的产物为在起始密码子下游插入kojA靶向序列及其PAM序列的nDsRed报告基因nDsRed-kojA。
更优选地，正向引物pEX2B-nDsRed-kojA-F和反向引物pEX2B-nDsRed-kojA-R的引物序列为：
pEX2B-nDsRed-kojA-F：CGTGCCCGTGCTTAAGATGCGTCTCACAGAACTTGACCAAGGGCCTCCTCCGAGGACGT；
pEX2B-nDsRed-kojA-R：AACGTTAAGTGGATCCCTACAGGAACAGGTGGTGGC。
优选地，步骤3)包括：
3-1)将nDsRed-kojA片段克隆到具有米曲霉amyB启动子的线性化载体pEX2B中，获得质粒pEX2B-nDsRed-kojA；
3-2)利用PEG介导的原生质体法将重组质粒pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA共转化到米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体中；
3-3)将转有pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA两种载体的米曲霉菌丝，转接，培养，对转化子进行DsRed荧光初筛，获得候选阳性转化子，然后通过测序鉴定kojA基因靶位点的突变。
本发明的有益效果如下：
本发明基于构建的AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统，利用含有靶基因的靶向序列及其PAM的非功能性DsRed作为报告基因，通过其红色荧光的恢复情况，快速鉴定靶基因是否发生编辑，从而实现从米曲霉CRISPR/Cas9突变株中批量的初步筛选突变体，避免了大量提取DNA的繁琐，无需进行批量的米曲霉转化子测序筛选。
附图说明
图1显示Cas9表达盒的构建。
图2显示基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑质粒的构建。
图3显示利用米曲霉曲酸合成基因评估AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统。
图4显示利用非功能性DsRed作为报告基因构建米曲霉CRISPR/Cas9突变体的工作流程。
图5显示以kojA为例显示了利用非功能性DsRed作为报告基因筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体的可行性。
图6显示利用非功能性DsRed荧光筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。
图7显示测序验证利用非功能性DsRed荧光筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
以下如未有特殊说明，实施例中的材料和方法可采用常规技术手段实现。
实施例
以下用到的相关引物见表1。
表1引物信息
本实施例的主要步骤如下：
一、基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统的构建
人工合成优化的Cas9基因，该基因以Katayama等人(2016，Biotechnol Lett 38:637–642)报道的Cas9为参考；将该优化的Cas9基因序列(SEQ ID NO：1)插入到pEX1载体(Nguyen等人(2016)World J Microbiol Biotechnol，32:204)的XhoI和BamHI识别位点之间，得到pEX1-Cas9载体，该载体含有构巢曲霉gpdA基因的启动子、Cas9基因和trpC基因终止子(TtrpC)(图1)；然后用引物pEX1-Cas9-F和pEX1-Cas9-R将含有gpdA启动子、Cas9和trpC终止子的Cas9表达盒进行PCR扩增。
表2.Cas9表达盒PCR扩增体系(50μl)
PCR扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
将获得的Cas9表达盒(PgpdA-Cas9-TtrpC)插入到pPTRII载体(日本TaKaRa公司，Code No.3622，是一种基于AMA1的可以在Aspergillus属真菌内进行自主复制的穿梭载体)的HindIII位点，产生pPTRII-Cas9重组载体。将包括靶基因原间隔区序列的sgRNA序列与U6启动子和U6终止子融合：取PU6和TU6-sgRNA的PCR产物各2μl，加上5×Buffer 10μl、dNTPs(10mM each)1μl、酶1μl，退火温度为55℃，扩增5次后，再添加引物(PU6-F和TU-R混合物(10μM))4μl，继续扩增30个循环。
然后插入到pPTRII-Cas9重组载体，产生pPTRII-Cas9-靶基因载体(图2)。
二、基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统的评估
1.敲除米曲霉曲酸合成基因(kojA，kojR，kojT)的基因编辑载体构建
对于CRISPR/Cas9载体，以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板，用正向引物PU6-F和反向引物PU6-kojA/kojR/kojT-R(反向引物含有kojA/kojR/kojT的靶向序列)扩增U6启动子(PU6)，获得PU6-kojA/kojR/kojT片段。
表3.PU6-kojA/kojR/kojT片段扩增体系(50μl)
扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
用基因合成法直接合成sgRNA和U6终止子序列(sgRNA-TU6，见SEQ ID NO：2)，并以此为模板，以TU6-kojA/kojR/kojT-F和TU6-R为引物，将kojA/kojR/kojT的靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6(将靶基因的靶向序列作为引物接头，然后通过PCR，即可将靶向序列引入，无需特殊条件)；将上述两个片段，PU6-kojA/kojR/kojT和kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6(这两个片段都含有kojA/kojR/kojT的靶向序列)进行重叠PCR：取PU6-kojA/kojR/kojT和kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6的PCR产物各2μl，加上5×Buffer10μl、dNTPs(10mM each)1μl、酶1μl，，退火温度为55℃，扩增5次后，再添加引物(PU6-F和TU-R混合物(10μM))4μl，继续扩增30个循环；获得PU6-kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段。将该片段(37℃孵育30min)重组连接到上述pPTRII-Cas9载体SmaI位点上，获得pPTRII-Cas9-kojA/kojR/kojT载体，见图3A-3C。
2.PEG介导的米曲霉转化和转化子的筛选
将米曲霉3.042孢子接种到DPY液体培养基(2％葡萄糖、1％多聚蛋白胨、0.5％酵母抽提物、0.5％磷酸二氢钾、0.05％七水硫酸镁、pH 5.5)，培养16-20h后收集菌丝，并用酶缓冲液(50mM马来酸，0.6M(NH4)2SO4，pH 5.5)洗涤；用1％Yatalase(TaKaRa)和1.5％细胞裂解酶(Sigma)处理上述菌丝，从而分离原生质体；用洗涤缓冲液(1.2M山梨醇，50mM CaCl2·2H2O，35mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 7.5)重悬原生质体；将重组载体(10μg)与原生质体混匀，冰上孵育30min。然后加入PEG缓冲液(60％PEG 4000，50mM CaCl2·2H2O，10mM Tris-HCl，pH 7.5)中混合，室温下静置10-20分钟后，用洗涤缓冲液稀释经PEG处理的原生质体，离心收集原生质体(1,000rpm，8min，4℃)，并与含1.2M山梨醇和0.5％琼脂的M+Met培养基(0.2％NH4Cl，0.1％(NH4)2SO4，0.05％KCl，0.05％NaCl，0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.002％FeSO4·7H2O，2％glucose，0.15％methionine，l.2M sorbitol，pH 5.5)混匀，平铺在含1.2M山梨醇和1.5％琼脂的M+Met培养基平板上，30℃培养3-5天。
3.米曲霉曲酸合成基因(kojA，kojR，kojT)的CRISPR/Cas9敲除菌株的筛选
挑取上述MM培养基长出的菌丝，转移至含0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上，进行二次筛选。经过二次筛选后，用含有0.5mM FeCl3的CD液体培养基培养转化子。曲酸与FeCl3发生螯合反应生成红色，说明有曲酸的产生，这可用于曲酸的观察，见图3D。培养7天后，通过10,000rpm离心5分钟收集上清液，并通过比色法测量曲酸的浓度(Terabayashi等人，2010)，见图3E。同时使用表1中列出的引物扩增靶基因并进行测序，以确认每个基因中的突变。
结果显示，利用构建的AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统成功获得kojA敲除株2个、kojR敲除株3个和kojT敲除株2个，见图3。
三、利用非功能DsRed辅助选择米曲霉CRISPR/Cas9产生的突变体
工作流程如图4所示。具体包括：
1.构建nDsRed报告载体
以DsRed为模板，利用在5’端添加了kojA靶向序列及其PAM的pEX2B-nDsRed-kojA-F正向引物和反向引物pEX2B-nDsRed-kojA-R进行PCR扩增。
表4.nDsRed-kojA片段扩增体系(50μl)
扩增条件：95℃预变性30s，95℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸5min，35个循环，72℃彻底延伸5min。
扩增的产物便是在起始密码子下游插入kojA靶向序列及其PAM序列(总共23bp)的nDsRed报告基因(由于在DsRed中插入了23bp，导致DsRed移码，翻译提前终止，产生非功能的nDsRed)，将该片段命名为nDsRed-kojA(SEQ ID NO：3)。将nDsRed-kojA片段克隆到具有米曲霉amyB启动子(PamyB)的线性化载体pEX2B(Nguyen等人(2017)World J MicrobiolBiotechnol，33:107)中，获得质粒pEX2B-nDsRed-kojA。
2.构建含有nDsRed报告载体的米曲霉CRISPR/Cas9敲除菌株
利用PEG介导的原生质体法将重组质粒pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA共转化到米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体中。
3.利用nDsRed辅助选择米曲霉CRISPR/Cas9敲除菌株
将上述转有pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA两种载体的米曲霉菌丝，转接到含有0.1μg/ml吡啶硫胺素的CD培养基上，培养3-5天后，挑取新生菌丝，制片后直接用ZOETM荧光细胞成像仪(BIO-RAD)检测转化子的DsRed荧光(excitation at 556±20nm,emission at 615±61nm)，对转化子进行DsRed荧光初筛，获得候选阳性转化子，然后利用引物kojA-F/R鉴定kojA基因靶位点的突变。荧光筛选结果见图5，显示了利用非功能性DsRed作为报告基因筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体的可行性。
本实施例通过对14个米曲霉转化子(kojA-1～koj-14)的荧光筛选，nDsRed-kojA荧光恢复的转化子有8株，见图6。对上述14个米曲霉转化子(kojA-1～koj-14)进行测序验证的结果见图7。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
序列表
<110> 江西科技师范大学
江西省农业科学院园艺研究所
<120> 高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggattaca aggatgacga cgataagatc atggccccaa agaagaagcg gaaggtcggt 60
atccacggag tcccagcagc cgacaagaag tactccatcg gtctcgacat cggtaccaac 120
tccgtcggtt gggccgtcat caccgacgag tacaaggtcc cctccaagaa gttcaaggtc 180
ctcggtaaca ccgaccgtca ctccatcaag aagaacctca tcggtgccct cctcttcgac 240
tccggtgaga ccgccgaggc cacccgtctc aagcgtaccg cccgtcgtcg ttacacccgt 300
cgtaagaacc gtatctgcta cctccaggag atcttctcca acgagatggc taaggtcgat 360
gactccttct tccaccgtct cgaggagtcc ttcctcgtcg aggaggataa gaagcacgag 420
cgtcacccca tcttcggtaa catcgtcgac gaggtcgcct accacgagaa gtaccccacc 480
atctaccacc tccgtaagaa gcttgtcgac tctactgata aggctgacct tcgtctcatc 540
tacctcgccc tcgcccacat gatcaagttc cgtggtcact tcctcatcga gggtgacctc 600
aaccctgaca actccgatgt cgacaagctc ttcatccagc tcgttcagac ttacaaccag 660
ctcttcgaag agaaccccat caacgcttcc ggtgttgacg ccaaggccat cctctccgct 720
cgtctctcca agtcccgtcg tctcgagaac ctcatcgctc agctccctgg tgagaagaag 780
aacggtctct tcggtaacct tatcgccctc tctctcggtc tcacccccaa cttcaagtcc 840
aacttcgacc tcgccgagga tgccaagctt cagctctcca aggacaccta cgatgacgat 900
ctcgacaacc tcctcgccca gatcggtgac cagtacgctg acctcttcct tgccgctaag 960
aacctctccg acgccatcct cctctccgat atcctccgtg tcaacaccga gatcaccaag 1020
gctcccctct ccgcttctat gatcaagcgt tacgatgagc accaccagga cctcactctt 1080
ctcaaggccc ttgtccgtca gcagctccct gagaagtaca aggagatctt cttcgatcag 1140
tccaagaacg gttacgccgg ttacatcgac ggcggtgctt cccaggagga gttctacaag 1200
ttcatcaagc ccatcctcga gaagatggac ggtaccgagg agctcctcgt caagctcaac 1260
cgtgaggatc tcctccgtaa gcagcgtact ttcgacaacg gttccatccc ccaccagatc 1320
caccttggcg aactccacgc tatcctccgt cgtcaggagg acttctaccc cttcctcaag 1380
gacaaccgtg agaagatcga gaagatcctc accttccgta tcccctacta cgttggcccc 1440
ctcgcccgtg gtaactcccg tttcgcctgg atgactcgta agtccgaaga gaccatcact 1500
ccctggaact tcgaggaagt cgtcgataag ggtgcctctg cccagtcctt catcgagcgt 1560
atgactaact tcgacaagaa cctccctaac gagaaggtcc ttcctaagca ctctctcctt 1620
tacgagtact tcactgttta caacgagctc accaaggtca agtacgtcac cgaaggtatg 1680
cgtaagcccg ccttcctctc tggtgagcag aagaaggcta tcgtcgacct cctcttcaag 1740
accaaccgta aggttaccgt caagcagctc aaggaagact acttcaagaa gatcgagtgc 1800
ttcgactccg ttgagatctc cggtgtcgag gatcgtttca acgcttccct cggtacctac 1860
cacgatctcc tcaagatcat caaggacaag gacttcctcg acaacgagga gaacgaggac 1920
atccttgagg acatcgtcct cacccttacc ctcttcgagg atcgtgagat gatcgaagaa 1980
cgtctcaaga cttacgctca cctcttcgac gacaaggtca tgaagcagct caagcgtcgt 2040
cgttacactg gttggggccg tctctcccgt aagctgatca acggcatccg tgacaagcag 2100
tctggtaaga ctatcctcga cttccttaag tccgatggtt tcgccaaccg taacttcatg 2160
cagctcatcc acgacgactc tctcaccttc aaggaggaca tccagaaggc tcaggtttcc 2220
ggtcagggtg actcccttca cgagcacatc gctaacctcg ccggttcccc cgctatcaag 2280
aagggtatcc tccagaccgt taaggtcgtc gatgagctcg tcaaggttat gggtcgtcac 2340
aagcccgaga acatcgttat cgagatggcc cgtgagaacc agactaccca gaagggtcag 2400
aagaactctc gtgaacgtat gaagcgtatc gaggagggta tcaaggaact cggctcccag 2460
atccttaagg agcaccccgt cgagaacacc cagcttcaga acgagaagct ctacctctac 2520
tacctccaga acggccgtga catgtacgtt gatcaggagc tcgacatcaa ccgtctctcc 2580
gactacgacg tcgatcacat cgtcccccag tccttcctca aggatgactc tatcgacaac 2640
aaggtcctca cccgttccga taagaaccgt ggcaagtctg acaacgtccc ctccgaagag 2700
gttgtcaaga agatgaagaa ctactggcgt cagcttctca acgccaagct catcacccag 2760
cgtaagttcg ataacctcac taaggctgaa cgtggtggcc tctctgagct cgacaaggcc 2820
ggcttcatca agcgtcagct tgttgagact cgtcagatca ccaagcacgt cgcccagatt 2880
ctcgactctc gcatgaacac caagtacgat gagaacgaca agctcatccg tgaggtcaag 2940
gttatcactc tcaagtctaa gctcgtctcc gacttccgta aggacttcca gttctacaag 3000
gtccgtgaga tcaacaacta ccaccacgcc cacgatgcct acctcaacgc tgtcgttggc 3060
actgctctta tcaagaagta ccccaagctt gagtccgagt tcgtctacgg tgactacaag 3120
gtctacgatg ttcgtaagat gatcgctaag tccgagcagg agatcggtaa ggccaccgct 3180
aagtacttct tctactccaa catcatgaac ttcttcaaga ccgagatcac cctcgccaac 3240
ggtgagatcc gtaagcgtcc cctcatcgag accaacggtg agactggtga gatcgtctgg 3300
gacaagggtc gtgacttcgc cactgtccgt aaggtcctct ccatgcccca ggtcaacatc 3360
gtcaagaaga ccgaggtcca gaccggtggc ttctccaagg aatctatcct ccccaagcgt 3420
aactccgaca agctcatcgc tcgcaagaag gactgggacc ccaagaagta cggcggtttc 3480
gactctccca ctgtcgctta ctccgtcctc gttgtcgcca aggtcgagaa gggtaagtct 3540
aagaagctca agtccgtcaa ggagctcctc ggcatcacca tcatggagcg ttcctccttc 3600
gagaagaacc ccatcgactt cctcgaggcc aagggttaca aggaggtcaa gaaggacctc 3660
atcatcaagc ttcccaagta ctccctcttc gagcttgaga acggtcgtaa gcgtatgctc 3720
gcttccgccg gtgagctcca gaagggtaac gagctcgctc tcccctccaa gtacgtcaac 3780
ttcctctacc tcgcctccca ctacgagaag ctcaagggtt ctcccgaaga caacgagcag 3840
aagcagctct tcgtcgagca gcacaagcac taccttgatg agatcatcga gcagatctcc 3900
gagttctcca agcgtgtcat cctcgccgac gctaacctcg ataaggtcct ctccgcttac 3960
aacaagcacc gtgacaagcc catccgtgag caggctgaga acatcatcca cctcttcact 4020
ctcaccaacc ttggtgcccc tgctgccttc aagtacttcg acaccaccat cgaccgtaag 4080
cgttacacct ctaccaagga ggtcctcgac gccactctca tccaccagtc cattaccggt 4140
ctctacgaga ctcgtatcga cctctctcag ctcggtggtg actcccgtgc tgaccccaag 4200
aagaagcgta aggtctga 4218
<210> 2
<211> 214
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt 120
atggaggtgc agaatggcta ttttgttatt ggagcgggtt cgaaacggag ggcaggagac 180
tttttctaaa tacgtcacgt gatatagagc tgct 214
<210> 3
<211> 701
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgtctca cagaacttga ccaagggcct cctccgagga cgtcatcaag gagttcatgc 60
gcttcaaggt gcgcatggag ggctccgtga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg 120
gcgagggccg cccctacgag ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc 180
ccctgccctt cgcctgggac atcctgtccc cccagttcca gtacggctcc aaggtgtacg 240
tgaagcaccc cgccgacatc cccgactaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt 300
gggagcgcgt gatgaacttc gaggacggcg gcgtggtgac cgtgacccag gactcctccc 360
tgcaggacgg ctccttcatc tacaaggtga agttcatcgg cgtgaacttc ccctccgacg 420
gccccgtaat gcagaagaag actatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc 480
gcgacggcgt gctgaagggc gagatccaca aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact 540
acctggtgga gttcaagtcc atctacatgg ccaagaagcc cgtgcagctg cccggctact 600
actacgtgga ctccaagctg gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggagc 660
agtacgagcg cgccgagggc cgccaccacc tgttcctgta g 701
Claims (10)
1.高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，包括：
1)构建基于AMA1自主复制质粒的米曲霉基因编辑系统；
2)利用米曲霉曲酸合成基因评估步骤1)构建的米曲霉基因编辑系统，所述米曲霉曲酸合成基因选自kojA、kojR和kojT；
3)将kojA的sgRNA和PAM序列置于DsRed的起始密码子后面，构建含有kojA的sgRNA和PAM序列的非功能性DsRed，以此评估非功能性DsRed作为报告基因用于筛选米曲霉CRISPR/Cas9突变体。
2.根据权利要求1所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤1)又包括：
1-1)将优化的Cas9基因序列插入到pEX1载体的XhoI和BamHI识别位点之间，得到pEX1-Cas9载体；
1-2)将含有构巢曲霉gpdA启动子、Cas9和trpC终止子的Cas9表达盒进行PCR扩增，再将获得的Cas9表达盒插入到pPTRII载体的HindIII位点，产生pPTRII-Cas9重组载体；
1-3)将包括靶基因原间隔区序列的sgRNA序列与U6启动子和U6终止子融合，然后插入到pPTRII-Cas9重组载体，产生pPTRII-Cas9-靶基因载体。
3.根据权利要求2所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤1-2)中，PCR扩增的引物序列如下：
pEX1-Cas9-F：TGATTACGCCAAGCTTTGTGACGAACTCGTGTGCTC；
pEX1-Cas9-R：GCAGGCATGCAAGCTTAAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTGT。
4.根据权利要求2所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤2)又包括构建敲除米曲霉曲酸合成基因的基因编辑载体：
2-1)用正向引物PU6-F和含有kojA/kojR/kojT靶向序列的反向引物PU6-kojA/kojR/kojT-R扩增U6启动子PU6，获得PU6-kojA/kojR/kojT片段；
2-2)以sgRNA和U6终止子序列sgRNA-TU6为模板，以TU6-R和TU6-kojA/kojR/kojT-F为引物，通过PCR扩增，将kojA/kojR/kojT的靶向序列连接到sgRNA-TU6的N端，获得kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段；
2-3)将PU6-kojA/kojR/kojT片段和kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段进行重叠PCR，获得PU6-kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段；
2-4)将PU6-kojA/kojR/kojT-sgRNA-TU6片段重组连接到pPTRII-Cas9-靶基因载体的SmaI位点上，获得pPTRII-Cas9-kojA/kojR/kojT载体。
5.根据权利要求4所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤2-1)中，以米曲霉RIB40菌株的基因组DNA作为模板。
6.根据权利要求4所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤2-1)中，正向引物PU6-F和反向引物PU6-kojA/kojR/kojT-R的序列如下：
PU6-F：CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTAATGCCGGCTCATTCAAA；
PU6-kojA-R：TGGTCAAGTTCTGTGAGACGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTT；
PU6-kojR-R：TGAAGCATGGGGGCAGTTGGACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
PU6-kojT-R：TCGGTATTGGCGGAAGGACTACTTGTTCTTCTTTACAATGATTTATTTA；
步骤2-2)中，引物TU6-R和TU6-kojA/kojR/kojT-F的序列如下：
TU6-R：AATTCGAGCTCGGTACCCGGGAGCAGCTCTATATCACGTGACG；
TU6-kojA-F：CGTCTCACAGAACTTGACCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-kojR-F：CCAACTGCCCCCATGCTTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA；
TU6-kojT-F：AGTCCTTCCGCCAATACCGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAA。
7.根据权利要求4或5所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤2)还包括：筛选PEG介导的米曲霉转化子，并通过测序确认转化子中的基因突变。
8.根据权利要求1所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，步骤3)包括：
以DsRed为模板，利用在5’端起始密码子后面添加了kojA靶向序列及其PAM的pEX2B-nDsRed-kojA-F正向引物和反向引物pEX2B-nDsRed-kojA-R进行PCR扩增，扩增的产物为在起始密码子下游插入kojA靶向序列及其PAM序列的nDsRed报告基因nDsRed-kojA。
9.根据权利要求8所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，正向引物pEX2B-nDsRed-kojA-F和反向引物pEX2B-nDsRed-kojA-R的引物序列为：
pEX2B-nDsRed-kojA-F：CGTGCCCGTGCTTAAGATGCGTCTCACAGAACTTGACCAAGGGCCTCCTCCGAGGACGT；
pEX2B-nDsRed-kojA-R：AACGTTAAGTGGATCCCTACAGGAACAGGTGGTGGC。
10.根据权利要求8所述的高效鉴定米曲霉CRISPR/Cas9突变体的方法，其特征在于，
步骤3)包括：
3-1)将nDsRed-kojA片段克隆到具有米曲霉amyB启动子的线性化载体pEX2B中，获得质粒pEX2B-nDsRed-kojA；
3-2)利用PEG介导的原生质体法将重组质粒pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA共转化到米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变体中；
3-3)将转有pPTRII-Cas9-kojA和pEX2B-nDsRed-kojA两种载体的米曲霉菌丝，转接，培养，对转化子进行DsRed荧光初筛，获得候选阳性转化子，然后通过测序鉴定kojA基因靶位点的突变。
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