CN113321665B - 一种p23小分子抑制剂、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种p23小分子抑制剂、制备方法及应用，属于生物医药技术领域。所述p23小分子抑制剂的化学结构式如式(I)所示：

所述p23小分子抑制剂通过化学合成的方法得到，所述p23小分子抑制剂可抑制p23以及多种肺癌细胞系，还从体外和体内水平上验证了该抑制剂具有抗肿瘤的作用。本发明为肿瘤尤其是肺癌筛选新的治疗药物提供了可行方案和有效数据。

Description

一种p23小分子抑制剂、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种p23小分子抑制剂、制备方法及应用。

背景技术

p23是一种由PTGES3基因编码的分子伴侣，其作为一个高度保守的蛋白广泛分布于真核生物中。p23能够与Hsp90蛋白结合，促进Hsp90蛋白与多种生物功能分子聚合体的稳定性，例如雌激素受体、雄激素受体、端粒酶。研究发现p23在多种肿瘤中高表达，包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、白血病等。p23的高表达能够促进肿瘤细胞迁移，上调雄激素受体水平及生物活性，促进肿瘤发生。此外，研究还发现p23与肿瘤细胞耐药密切相关。因此，抑制p23的生物功能，对于防治肿瘤的发生发展具有重要意义。开发p23的抑制活性成分，将能够为新型抗肿瘤药物的研发提供候选药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种p23小分子抑制剂、制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过化学合成方法制备得到p23小分子抑制剂，该抑制剂可以抑制p23以及多种肺癌细胞系，还从体内和体外水平均验证了具有抗肿瘤作用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种p23小分子抑制剂，其化学结构式如式(I)所示：

本发明还提供一种根据所述的p23小分子抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：以2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛为底物，与保护剂PMBCl反应，生成化合物1，结构式如下：

步骤(2)：以2-羟基-5-甲基-苯乙酮为底物，与保护剂PMBCl反应，生成化合物2，结构式如下：

步骤(3)：将所述化合物2与所述化合物1在碱性条件下，搅拌反应18-25h，反应至所述化合物2消失，分离纯化得到化合物3，结构式如下：

步骤(4)：所述化合物3与水合肼搅拌反应12-15h，得到白色固体产物4，结构式如下：

步骤(5)：所述白色固体产物4、乙醇-甲醇混合液以及氢气在密闭条件下搅拌反应2-5h，得到粗产物5，结构式如下：

步骤(6)：所述粗产物5中加入异丙醇和2-羟基-5-甲基-苯甲醛，加热至85℃，反应1-3h，得到白色固体产物6，即为目标产物。

优选的是，步骤(1)和步骤(2)均是在碱性条件、室温下进行反应；

步骤(1)中所述2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与所述PMBCl摩尔质量比为1:1-1.5；

步骤(2)中2-羟基-5-甲基-苯乙酮与所述PMBCl摩尔质量比为1:1-1.5。

优选的是，步骤(2)中反应至所述化合物2消失后，先调节反应后的混合液为弱酸性，然后依次用乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析分离纯化反应后的混合物，得到所述化合物3。

优选的是，步骤(4)中所述化合物3和所述水合肼的摩尔质量比为1:8-12；

步骤(5)中所述乙醇-甲醇混合液为溶剂，所述乙醇-甲醇混合液是乙醇和甲醇按照体积比3:1混合而成；

步骤(6)中所述异丙醇为溶剂，所述粗产物5与所述2-羟基-5-甲基-苯甲醛的摩尔质量比为1:1-2；

本发明还提供一种根据所述的p23小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的是，所述肿瘤为肺部肿瘤。

优选的是，所述p23小分子抑制剂还包括药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或立体异构体。

优选的是，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的是，所述药物包括片剂、胶囊、颗粒剂或者注射剂。

本发明公开了以下技术效果：

本发明提供了一种p23小分子抑制剂，该抑制剂是通过化学合成的方法制备，方法简单易操作，并且原料易于获取。经实验验证发现，该抑制剂可抑制p23以及多种肺癌细胞系，还从体外和体内水平上均验证了该抑制剂具有抗肿瘤的作用。因此，本发明为肿瘤尤其是肺癌筛选新的治疗药物提供了可行方案和有效数据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为化合物6的合成路线图；

图2为化合物6的氢核磁共振谱图；

图3为化合物6的碳核磁共振谱图；

图4为化合物6的高分辨质谱图；

图5为化合物6对五种人肿瘤细胞系的抑制作用(H1975人非小细胞肺腺癌；H460人大细胞肺癌；H1299人肺癌细胞；H358人非小细胞肺腺癌；A549人肺腺癌细胞)；

图6为化合物6对小鼠体内肿瘤组织的抑制作用；(1)荷瘤小鼠肿瘤组织的形态对比；(2)小鼠肿瘤组织的体积变化；

图7为微量热泳法测定化合物6与p23蛋白的亲和力鉴定结果；

图8为化合物6抑制p23蛋白的生物功能；(1)化合物6抑制p23与DNA链的结合；(2)化合物6抑制p23的琥珀酰化。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1化学合成方法制备p23抑制剂(化合物6)

2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛在碱性条件下(K₂CO₃ 2当量，即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与K₂CO₃的摩尔质量比为1:2)与PMBCl(1当量，即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与PMBCl的摩尔质量比为1:1)反应，生成酚羟基保护的化合物1。相同条件下，将2-羟基-5-甲基-苯乙酮制备成酚羟基保护的化合物2。之后，将化合物2加入圆底烧瓶，加入95乙醇做溶剂。向得到的澄清溶液中加入预先溶解在少量水中的KOH(10当量，即得到的澄清溶液与KOH摩尔质量比为1:10)，搅拌半小时后加入底物1，室温搅拌18h直至TLC显示原料2消失。加入4N HCl调节pH至弱酸性。乙酸乙酯萃取，干燥，旋干。以乙酸乙酯/石油醚＝5:95为洗脱剂，经硅胶柱层析分离纯化，得到化合物3，收率55％。室温条件下，将化合物3加入圆底烧瓶，之后加入95乙醇做溶剂(浓度约为0.25M)。向得到的澄清溶液中加入水合肼(8当量，即得到的澄清溶液与水合肼摩尔质量比为1:8)，黄色固体析出，适当补充少量溶剂使反应能够搅拌，反应12小时，黄色析出物变为白色。静置，过滤，滤饼用少量水和乙醇冲洗，得到白色固体产物4，收率75.6％。将化合物4置于圆底烧瓶中，在氮气保护条件下加入Pd/C(10wt％)，密封后用注射器加入溶剂(乙醇-甲醇体积比3:1)，用氢气球置换反应瓶内气体为氢气(以充满反应瓶为准，约为一个标准大气压)，室温搅拌2h至原料反应完全。反应液经硅藻土过滤，立即旋干，得到粗产物5(不稳定，-20℃过夜亦会分解)。向上述粗产物5中加入异丙醇和2-羟基-5-甲基-苯甲醛(0.5当量，即粗产物5与2-羟基-5-甲基-苯甲醛摩尔质量比为1:0.5)，加热至85℃，1小时后反应有浅黄色固体析出，TLC显示原料消耗完全。降至室温，抽滤，用少量乙醇冲洗滤饼。所得白色固体即为产物6，两步反应收率约为42.8％。

实施例2化学合成方法制备p23抑制剂(化合物6)

2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛在碱性条件下(K₂CO₃ 2当量，即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与K₂CO₃摩尔质量比为1:2)与PMBCl(1.2当量，即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与PMBCl摩尔质量比为1:1.2)在DMF中搅拌反应过夜(室温)，生成酚羟基保护的化合物1。按照上述相同条件下，将2-羟基-5-甲基-苯乙酮制备成酚羟基保护的化合物2。之后，将化合物2加入圆底烧瓶，加入95乙醇做溶剂。向得到的澄清溶液中加入预先溶解在少量水中的KOH(10当量，即得到的澄清溶液与KOH摩尔质量比为1:10)，搅拌半小时后加入底物1，室温搅拌20h直至TLC显示原料2消失。加入4N HCl调节pH至弱酸性。使用乙酸乙酯萃取后，使用无水硫酸镁将乙酸乙酯溶液干燥，使用旋转蒸发仪除掉溶剂，等到固体产物。以乙酸乙酯/石油醚＝5:95为洗脱剂，经硅胶柱层析分离纯化，得到化合物3，收率55％。室温条件下，将化合物3加入圆底烧瓶，之后加入95乙醇做溶剂(浓度约为0.25M)。向得到的澄清溶液中加入水合肼(10当量，即得到的澄清溶液与水合肼的摩尔质量比为1:10)，黄色固体析出，适当补充少量溶剂使反应能够搅拌，反应12小时以后，黄色析出物变为白色。静置，过滤，滤饼用少量水和乙醇冲洗，得到白色固体产物4，收率77％。将化合物4置于圆底烧瓶中，在氮气保护条件下加入Pd/C(10wt％)，密封后用注射器后加入适量混合溶剂(乙醇-甲醇体积比3:1)至样品溶解，用氢气球置换反应瓶内气体为氢气(以充满反应瓶为准，约为一个标准大气压)，室温搅拌3h至原料反应完全。反应液经硅藻土过滤，立即旋干，得到粗产物5(不稳定，-20℃过夜亦会分解)。使用异丙醇将上述粗产物5溶解后，加入2-羟基-5-甲基-苯甲醛(1当量，即粗产物5与2-羟基-5-甲基-苯甲醛的摩尔质量比为1:1)，加热至85℃，3小时后反应有浅黄色固体析出，TLC显示原料消耗完全。降至室温，抽滤，用少量乙醇冲洗滤饼。所得白色固体即为产物6，两步反应收率约为44％。化合物6的波谱数据如图1-图4所示，具体如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.59(s,1H),9.23(s,1H),7.21–6.72(m,9H),6.11(s,1H),5.38(d,J＝9.3Hz,1H),3.84(d,J＝9.2Hz,1H),3.73(s,2H),3.62(dd,J＝17.3,9.0Hz,1H),3.50–3.38(m,1H),2.20(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ157.28,155.05,147.87,147.73,147.22,144.00,132.12,128.93,128.52,128.38,124.78,122.21,120.37,119.17,116.36,116.12,115.49,111.63,110.90,87.43,59.06,56.11,55.99,41.67,20.46.HRMS(+ESI)m/z 431.1619，[M-H]^-，计算值431.1612。

实施例3化学合成方法制备p23抑制剂(化合物6)

2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛在碱性条件下(K₂CO₃ 2当量，即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与K₂CO₃的摩尔质量比为1:2)与PMBCl(1当量，即即2-羟基-3-甲氧基-苯甲醛与PMBCl的摩尔质量比为1:1)反应，生成酚羟基保护的化合物1。相同条件下，将2-羟基-5-甲基-苯乙酮制备成酚羟基保护的化合物2。之后，将化合物2加入圆底烧瓶，加入95乙醇做溶剂。向得到的澄清溶液中加入预先溶解在少量水中的KOH(10当量，得到的澄清溶液与KOH的摩尔质量比为1:10)，搅拌半小时后加入底物1，室温搅拌25h直至TLC显示原料2消失。加入4N HCl调节pH至弱酸性。乙酸乙酯萃取，干燥，旋干。以乙酸乙酯/石油醚＝5:95为洗脱剂，经硅胶柱层析分离纯化，得到化合物3，收率54.8％。室温条件下，将化合物3加入圆底烧瓶，之后加入95乙醇做溶剂(浓度约为0.25M)。向得到的澄清溶液中加入水合肼(12当量，即得到的澄清溶液与水合肼的摩尔质量比为1:12)，黄色固体析出，适当补充少量溶剂使反应能够搅拌，反应15小时以后，黄色析出物变为白色。静置，过滤，滤饼用少量水和乙醇冲洗，得到白色固体产物4，收率75.0％。将化合物4置于圆底烧瓶中，在氮气保护条件下加入Pd/C(10wt％)，密封后用注射器后加入溶剂(乙醇-甲醇体积比3:1)，用氢气球置换反应瓶内气体为氢气(以充满反应瓶为准，约为一个标准大气压)，室温搅拌5h至原料反应完全。反应液经硅藻土过滤，立即旋干，得到粗产物5(不稳定，-20℃过夜亦会分解)。向上述粗产物5中加入异丙醇和2-羟基-5-甲基-苯甲醛(2当量，即粗产物5与2-羟基-5-甲基-苯甲醛的摩尔质量比为1:2)，加热至85℃，3小时后反应有浅黄色固体析出，TLC显示原料消耗完全。降至室温，抽滤，用少量乙醇冲洗滤饼。所得白色固体即为产物6，两步反应收率约为41.9％。

实施例4化合物6对五种人肺癌细胞系的生长抑制作用

本发明全面评价了化合物6对5种人肿瘤细胞的抑制作用，所选用的细胞系包括人非小细胞肺腺癌H1975、人大细胞肺癌H460、人肺癌细胞H1299、人非小细胞肺腺癌H358、人肺腺癌细胞A549。将上述细胞分别接种于96孔板中，每孔接种量为5000个细胞，于孵箱中培养过夜(37℃，5％CO₂)。次日，更换新鲜培养基，同时加入不同浓度的化合物6(5-50μM)。继续孵育培养48小时之后，加入CCK-8试剂，并通过酶标仪测定各孔样本在450nm处的吸光度。比较各孔吸光度值，计算细胞存活率，其中对照组设为100％。

如图5所示，化合物6对5种人肺癌细胞系具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性。

实施例5化合物6对小鼠体内肿瘤的抑制作用

5周龄雄性裸鼠，给予无菌水及标准饲料，饲养于SPF实验室。在开始实验前，适应性饲养1周；随机分为对照组与给药组(化合物6 10mg/kg，每天口服给药)。于小鼠腋窝皮下注射100微升的A549细胞PBS溶液(5×106细胞)。每两天使用卡尺测量一次肿瘤体积，计算公式V＝1/2(宽×长)，同时监测小鼠体重。四周之后，处死小鼠后，取出皮下肿瘤组织，测量体积。

如图6所示，给予化合物6的小鼠肿瘤组织显著小于对照组，表明化合物6能够抑制小鼠体内肿瘤组织的生长，具有确切的抗肿瘤作用。

实施例6化合物6对p23的抑制作用

通过基因编辑技术构建p23原核表达载体(pET-28a)，将构建好的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在LB培养基中加入1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于20℃环境中培养诱导蛋白。采用AKATA蛋白纯化系统得到重组表达p23蛋白(rp23)。采用MonolithTMRED-NHS二代蛋白标记试剂盒标记rp23，100nM标记的rp23通过倍稀的方式与化合物6混合孵育，共计12个化合物6浓度梯度，最高浓度为25μM。采用微量热泳动(MST)分子相互作用分析仪(德国NanoTemper)检测p23与化合物6的相互作用。

如图7所示，化合物6与p23存在显著的相互作用，Kd为1.18μM，表明化合物6通过与p23结合发挥药理作用。

将重组表达p23蛋白，不同浓度的化合物6，生物素标记的环氧化物酶2(COX-2)启动子DNA序列以及链霉亲和素标记的琼脂糖珠混合室温孵育4h。离心收集琼脂糖珠，加入western上样缓冲液煮沸后，采用western方法检测化合物6对p23与COX-2启动子结合的影响。如图8(1)所示，化合物6显著抑制p23与COX-2启动子结合，表明化合物6抑制p23的启动子活性，抑制炎症因子COX-2的表达。

将重组表达p23蛋白，不同浓度的化合物6以及琥珀酰辅酶A(Succ-CoA)混合37℃孵育15min，加入western上样缓冲液煮沸后，采用western方法检测化合物6对p23琥珀酰化的影响。如图8(2)所示，化合物6显著抑制p23的琥珀酰化，表明化合物6通过抑制p23的琥珀酰化，抑制其转录因子活性。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (2)

1.p23小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述p23小分子抑制剂为如式（I）所示化合物或药学上可接受的盐或立体异构体：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺部肿瘤。

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