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CN113302198A - 免疫球蛋白纯化方法和免疫球蛋白纯化装置、以及免疫球蛋白制造方法和免疫球蛋白制造装置 - Google Patents

免疫球蛋白纯化方法和免疫球蛋白纯化装置、以及免疫球蛋白制造方法和免疫球蛋白制造装置 Download PDF

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CN113302198A
CN113302198A CN202080009801.8A CN202080009801A CN113302198A CN 113302198 A CN113302198 A CN 113302198A CN 202080009801 A CN202080009801 A CN 202080009801A CN 113302198 A CN113302198 A CN 113302198A
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CN
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immunoglobulin
desorption
zirconia particles
porous zirconia
adsorption
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Application number
CN202080009801.8A
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加藤且也
永田夫久江
笠原真二郎
广部由纪
大塚淳
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Niterra Co Ltd
Original Assignee
NGK Spark Plug Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Abstract

本发明提供不使抗体特性失活且免疫球蛋白的回收率高的免疫球蛋白纯化方法。免疫球蛋白纯化方法具备吸附工序和解吸工序。吸附工序是在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的工序。解吸工序是利用中性解吸液使吸附于多孔氧化锆粒子的免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸的工序。

Description

免疫球蛋白纯化方法和免疫球蛋白纯化装置、以及免疫球蛋 白制造方法和免疫球蛋白制造装置
技术领域
本发明涉及免疫球蛋白纯化方法和免疫球蛋白纯化装置、以及免疫球蛋白制造方法和免疫球蛋白制造装置。
背景技术
免疫球蛋白作为治疗药、体外诊断药是有用的，预测今后需求也越来越高。为了用于这样的用途，需要开发出能够高纯度地纯化免疫球蛋白的技术。在免疫球蛋白的纯化中，通常使用利用了蛋白A的亲和层析(参考例如专利文献1)。蛋白A是对IgG显示出结合特性的、由金黄色葡萄球菌(Staphyrococal aureus)的菌体膜分离出的蛋白质。蛋白A具有与来自各种动物的免疫球蛋白特异性地结合的性质，并且每单位蛋白质的免疫球蛋白的结合量多，因此使用固定化有该蛋白A的载体的亲和层析被用在工业规模的抗体纯化工艺中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2017-47365号公报
发明内容
发明所要解决的问题
但是，使用该蛋白A的亲和层析中，作为使吸附的免疫球蛋白溶出的方法，使用pH4以下的酸性溶液，因此，有可能抗体的高级结构发生变化，进而向缔合、凝聚发展。
另外，在细胞培养的阶段也出现了免疫球蛋白的凝聚体，含有这些免疫球蛋白的聚合物(凝聚体)的杂质难以通过使用了蛋白A的亲和层析除去。
因此，为了解决上述问题，通常使用在通过使用了蛋白A的亲和层析进行纯化后组合离子交换层析、疏水性相互作用层析的方法。
但是，在以往的离子交换层析中，只能分离免疫球蛋白的单体的条件范围窄，因此存在免疫球蛋白的回收率低的问题。另外，在疏水性相互作用层析中，免疫球蛋白的回收率低，而且需要长时间，因此存在免疫球蛋白的纯化成本高的问题。
本发明是鉴于上述实际情况而完成的，目的在于提供不使抗体特性失活且免疫球蛋白的回收率高的免疫球蛋白纯化方法和免疫球蛋白纯化装置、以及免疫球蛋白制造方法和免疫球蛋白制造装置。本发明能够通过以下方式来实现。
用于解决问题的手段
[1]一种免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附工序；和
利用中性解吸液使吸附于上述多孔氧化锆粒子的上述免疫球蛋白从上述多孔氧化锆粒子解吸的解吸工序。
[2]如[1]所述的免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，上述解吸液为磷酸缓冲液。
[3]如[1]或[2]所述的免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，上述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种。
Figure BDA0003166550180000031
(通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
[4]一种免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附部；和
利用中性解吸液使吸附于上述多孔氧化锆粒子的上述免疫球蛋白从上述多孔氧化锆粒子解吸的解吸部。
[5]如[4]所述的免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，上述解吸液为磷酸缓冲液。
[6]如[4]或[5]所述的免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，上述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种。
Figure BDA0003166550180000032
(通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
[7]一种免疫球蛋白制造方法，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附工序；和
利用中性解吸液使吸附于上述多孔氧化锆粒子的上述免疫球蛋白从上述多孔氧化锆粒子解吸的解吸工序。
[8]如[7]所述的免疫球蛋白制造方法，其特征在于，上述解吸液为磷酸缓冲液。
[9]如[7]或[8]所述的免疫球蛋白制造方法，其特征在于，上述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种。
Figure BDA0003166550180000041
(通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
[10]一种免疫球蛋白制造装置，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附部；和
利用中性解吸液使吸附于上述多孔氧化锆粒子的上述免疫球蛋白从上述多孔氧化锆粒子解吸的解吸部。
[11]如[10]所述的免疫球蛋白制造装置，其特征在于，上述解吸液为磷酸缓冲液。
[12]如[10]或[11]所述的免疫球蛋白制造装置，其特征在于，上述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种。
Figure BDA0003166550180000042
(通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
发明效果
本发明的免疫球蛋白纯化方法在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子，利用中性解吸液使免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸，因此免疫球蛋白的抗体特性不会失活。另外，本发明的免疫球蛋白纯化方法的免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白纯化方法中，在解吸液为磷酸缓冲液的情况下，免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白纯化方法中，在解吸液含有选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种的情况下，免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白纯化装置在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子，利用中性解吸液使免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸，因此免疫球蛋白的抗体特性不会失活。另外，本发明的免疫球蛋白纯化装置的免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白纯化装置中，在解吸液为磷酸缓冲液的情况下，免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白纯化装置中，在解吸液含有选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种的情况下，免疫球蛋白的回收率高。
本发明的免疫球蛋白制造方法在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子，利用中性解吸液使免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸，因此免疫球蛋白的抗体特性不会失活。另外，本发明的免疫球蛋白制造方法的免疫球蛋白的制造效率高。
本发明的免疫球蛋白制造方法中，在解吸液为磷酸缓冲液的情况下，免疫球蛋白的制造效率高。
本发明的免疫球蛋白制造方法中，在解吸液含有选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种的情况下，免疫球蛋白的制造效率高。
本发明的免疫球蛋白制造装置在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子，利用中性解吸液使免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸，因此免疫球蛋白的抗体特性不会失活。另外，本发明的免疫球蛋白纯化装置的免疫球蛋白的制造效率高。
本发明的免疫球蛋白制造装置中，在解吸液为磷酸缓冲液的情况下，免疫球蛋白的制造效率高。
本发明的免疫球蛋白制造装置中，在解吸液含有选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种的情况下，免疫球蛋白的制造效率高。
附图说明
图1是示出乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA)的推定负载结构的示意图。
图2是说明免疫球蛋白纯化装置的框图。
图3是说明免疫球蛋白制造装置的框图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，关于数值范围，使用“～”的记载的情况下，只要没有特别声明，则包括下限值和上限值。例如，“10～20”这样的记载的情况下，作为下限值的“10”、作为上限值的“20”中的任一者均包括在内。即，“10～20”与“10以上且20以下”意思相同。
1.免疫球蛋白纯化方法
本发明的免疫球蛋白纯化方法具备吸附工序和解吸工序。
(1)吸附工序
吸附工序是在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的工序。
(1.1)中性缓冲液
中性缓冲液优选为pH6.1以上且pH8.0以下的缓冲液，更优选为pH6.5以上且pH7.5以下的缓冲液，进一步优选为pH6.6以上且pH7.4以下的缓冲液。构成缓冲液的缓冲剂根据所使用的pH从本领域技术人员通常使用的缓冲剂中适当选择即可，可以例示磷酸盐、乙酸盐、碳酸盐、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)。中性缓冲液的浓度没有特别限定，优选为0.1mM以上且200mM以下、更优选为1mM以上且100mM以下、进一步优选为5mM以上且20mM以下。
从维持免疫球蛋白的抗体特性的观点出发，特别优选中性缓冲液为磷酸缓冲生理盐水(PBS)。
需要说明的是，中性缓冲液的温度没有特别限定，通常在4℃以上且50℃以下使用。
(1.2)免疫球蛋白
免疫球蛋白可以为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE中的任一种。IgG、IgD、IgE以单体的形式存在，IgA以单体或二聚体的形式存在，IgM以五聚体或六聚体的形式存在，大小为约10nm～约30nm。
(1.3)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子没有特别限定，优选下述多孔氧化锆粒子。即，多孔氧化锆粒子优选D50、D90和总细孔容积为下述范围内。
需要说明的是，多孔氧化锆粒子除了各个粒子相互独立的形态以外，也可以为两个以上的粒子凝聚而成的凝聚体的形态。
(1.3.1)D50、D90和总细孔容积
多孔氧化锆粒子优选在通过BET法测定的孔径分布中累积细孔容积达到总细孔容积的50％的细孔径D50为3.20nm以上且6.50nm以下，优选累积细孔容积达到总细孔容积的90％的细孔径D90为10.50nm以上且100.00nm以下。细孔径D50更优选为3.35nm以上且6.30nm以下、进一步优选为3.50nm以上且5.00nm以下。细孔径D90更优选为10.80nm以上且50.00nm以下、进一步优选为11.00nm以上且30.00nm以下。
多孔氧化锆粒子优选总细孔容积大于0.10cm3/g。总细孔容积更优选大于0.15cm3/g、进一步优选大于0.30cm3/g。需要说明的是，总细孔容积的上限值没有特别限定，通常为10.00cm3/g。
D50、D90和总细孔容积为上述范围内时，吸附的免疫球蛋白的选择特异性变高。需要说明的是，通过使D90为100.00nm以下，容易选择性地吸附免疫球蛋白的非凝聚体。免疫球蛋白的非凝聚体的大小为约10nm～约30nm，另一方面，免疫球蛋白的凝聚体的大小为约100nm。因此，通过使D90为100.00nm以下，可避免吸附免疫球蛋白的凝聚体，容易只吸附免疫球蛋白的非凝聚体。
需要说明的是，孔径分布和细孔容积例如可以使用细孔分布测定装置(Micromeritics自动比表面积/细孔分布测定装置(TriStarII岛津制作所))来测定。
在此，对D50、D90的计算方法进行说明。
首先，对D50的计算方法进行说明。从孔径分布的数据读取夹着累积细孔容积50％且与累积细孔容积50％最近的两点A、B的累积细孔容积(X(％))和细孔径(Y(nm))。具体而言，读取A(Xa(％)、Ya(nm))、B(Xb(％)、Yb(nm))(其中，Xa＞Xb，Ya＞Yb)。然后，使用这些值通过下述式(1)求出D50。
式(1)
D50＝log(Xb)+((log(Xa)-log(Xb))*[(50-(Yb))/((Ya)-(Yb))]
同样地求出D90。即，首先，从孔径分布的数据读取夹着累积细孔容积90％且与累积细孔容积90％最近的两点C、D的累积细孔容积(X(％))和细孔径(Y(nm))。具体而言，读取C(Xc(％)、Yc(nm))、D(Xd(％)、Yd(nm))(其中，Xc＞Xd，Yc＞Yd)。然后，使用这些值通过下述式(2)求出D90。
式(2)
D90＝log(Xd)+((log(Xc)-log(Xd))*[(90-(Yd))/((Yc)-(Yd))]
(1.3.2)粒径
多孔氧化锆粒子的粒径没有特别限定，一次粒子通常为10nm～100nm，优选为10nm～50nm，进一步优选为10nm～30nm。一次粒子通过形成凝聚体而形成尺寸为50nm～1000nm的二次粒子。一次粒径为该范围内时，多孔氧化锆粒子的比表面积大幅增大，因此倾向于免疫球蛋白的吸附量增加。
(1.3.3)负载有螯合剂的多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子可以在表面负载有螯合剂。通过负载螯合剂，免疫球蛋白吸附的选择性进一步提高。
螯合剂没有特别限定。螯合剂优选为选自由下述通式(2)所表示的化合物、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DETPA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DETPPA)和它们的盐组成的组中的至少一种。需要说明的是，作为盐，例如适当地例示碱金属(钠等)的盐。
Figure BDA0003166550180000101
(通式(2)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
作为通式(2)的R1中的碳原子数1～10的亚烷基，例如例示出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
另外，作为R2～R5中的碳原子数1～10的亚烷基，例如例示出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
从进一步提高对免疫球蛋白的选择性的观点出发，螯合剂优选通式(2)所表示的化合物。通式(2)所表示的化合物中，特别优选乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA；N,N,N’,N’-Ethylenediaminetetrakis(methylenephos phonic Acid))。
螯合剂的负载量没有特别限定。从进一步提高对免疫球蛋白的选择性的观点出发，螯合剂的负载量优选每1mg氧化锆为0.01μg～10μg、更优选为0.02μg～5μg、进一步优选为0.05μg～3μg。
需要说明的是，螯合剂的负载量可以由TG-DTA(热重差示热分析)的重量减少来计算。
螯合剂的负载方式还不清楚，但推测是来自螯合剂的配体与锆原子结合。例如，在螯合剂为乙二胺四亚甲基膦酸的情况下，推测为图1的结构。
(1.3.4)多孔氧化锆粒子的制造方法
多孔氧化锆粒子的制造方法没有特别限定。多孔氧化锆粒子例如可以通过下述方法来制造。以锆石作为原料，得到氧氯化锆(ZrOCl2·8H2O)溶液。然后，通过水解反应，制成Zr(OH)4微粒，对其进行烧成，从而制成多孔氧化锆粒子。
(1.4)多孔氧化锆粒子的量与中性缓冲液的量的关系
吸附工序中的多孔氧化锆粒子的量与中性缓冲液的量的关系没有特别限定。例如，相对于多孔氧化锆粒子1mg，可以以10μL以上且300μL以下的比例使用中性缓冲液。
(2)解吸工序
解吸工序是利用中性解吸液使吸附于多孔氧化锆粒子的免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸(溶出)的工序。
(2.1)中性解吸液
中性解吸液优选为pH6.0以上且pH8.0以下的解吸液，更优选为pH6.5以上且pH7.5以下的解吸液，进一步优选为pH6.8以上且pH7.2以下的解吸液。
解吸液优选为磷酸缓冲液。作为磷酸缓冲液，例如可以适当地使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)。
解吸液的浓度没有特别限定，可以根据解吸液的种类适当选择。
例如，在使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)的情况下，从提高免疫球蛋白的回收率的观点出发，优选为50mM以上且200mM以下、更优选为60mM以上且150mM以下、进一步优选为70mM以上且130mM以下。需要说明的是，在吸附工序中使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)作为中性缓冲液、并且在解吸工序中使用磷酸缓冲生理盐水(PBS)作为解吸液的情况下，从提高免疫球蛋白的回收率的观点出发，优选两者的浓度为下述关系。即，优选解吸工序的磷酸缓冲生理盐水(PBS)的浓度高于吸附工序的磷酸缓冲生理盐水(PBS)。
解吸液可以含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种。
Figure BDA0003166550180000121
(通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基。另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此可以相同也可以不同。)
作为通式(1)的R1中的碳原子数1～10的亚烷基，例如例示出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
另外，作为R2～R5中的碳原子数1～10的亚烷基，例如例示出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、六亚甲基、亚异丁基等。
从提高免疫球蛋白的回收率的观点出发，选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种中，优选乙二胺四亚甲基膦酸(EDTPA；N,N,N’,N’-Ethylenediaminetetrakis(methylenephosphonic Acid))及其盐中的至少一种。
从提高免疫球蛋白的回收率的观点出发，选自由通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种的浓度(两种以上的情况下为合计浓度)优选为0.1mM以上且10mM以下、更优选为0.5mM以上且8mM以下、进一步优选为2mM以上且6mM以下。
需要说明的是，解吸液的温度没有特别限定，通常在4℃以上且50℃以下使用。
(2.2)多孔氧化锆粒子的量与解吸液的量的关系
解吸工序中的多孔氧化锆粒子的量与解吸液的量的关系没有特别限定。例如，相对于多孔氧化锆粒子1mg，可以以10μL以上且300μL以下的比例使用解吸液。
2.免疫球蛋白纯化装置
本发明的免疫球蛋白纯化装置1具备吸附部和解吸部。在图2中示出具备作为吸附部和解吸部发挥功能的吸附解吸部3的免疫球蛋白纯化装置1的一例。吸附解吸部3例如具备具有两个开口的筒状部，在其中填充有多孔氧化锆粒子4。另外，该免疫球蛋白纯化装置1具备用于装入中性缓冲液(吸附液)的吸附液容器5、用于装入中性解吸液的解吸液容器7和用于回收从吸附解吸部3排出的液体的回收容器9。在吸附工序(吸附工艺)中，利用泵从吸附液容器5向吸附解吸部3供给含有免疫球蛋白的中性缓冲液(吸附液)，使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子4。在解吸工序(解吸工艺)中，利用泵从解吸液容器7向吸附解吸部3供给中性解吸液，使吸附于多孔氧化锆粒子4的免疫球蛋白解吸(溶出)。吸附液与解吸液的切换通过切换部11来进行。
需要说明的是，在免疫球蛋白纯化装置1中，对于“中性缓冲液”、“免疫球蛋白”、“多孔氧化锆粒子”、“中性解吸液”这样的术语，直接应用“1.免疫球蛋白纯化方法”中的说明。
3.免疫球蛋白制造方法
本发明的免疫球蛋白制造方法具备吸附工序和解吸工序。
需要说明的是，在免疫球蛋白制造方法中，对于“吸附工序”、“解吸工序”，直接应用“1.免疫球蛋白纯化方法”中的说明。
在本发明的免疫球蛋白制造方法中，能够制造与吸附工序中使用的免疫球蛋白(原料免疫球蛋白)相比提高了纯度的免疫球蛋白。原料免疫球蛋白例如可以从血液中、组织液中分离来获得，也可以生物合成、化学合成，还可以经过培养工序，通过公知的方法获得。本发明的免疫球蛋白制造方法可以具备原料免疫球蛋白的获得工序。
4.免疫球蛋白制造装置
本发明的免疫球蛋白制造装置21具备吸附部和解吸部。在图3中示出具备作为吸附部和解吸部发挥功能的吸附解吸部23的免疫球蛋白制造装置21的一例。吸附解吸部23例如具备具有两个开口的筒状部，在其中填充有多孔氧化锆粒子24。另外，该免疫球蛋白制造装置21具备用于装入中性缓冲液(吸附液)的吸附液容器25、用于装入中性解吸液的解吸液容器27和用于回收从吸附解吸部23排出的液体的回收容器29。在吸附工序(吸附工艺)中，利用泵从吸附液容器25向吸附解吸部23供给含有免疫球蛋白的中性缓冲液(吸附液)，使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子24。在解吸工序(解吸工艺)中，利用泵从解吸液容器27向吸附解吸部23供给中性解吸液，使吸附于多孔氧化锆粒子24的免疫球蛋白解吸(溶出)。吸附液与解吸液的切换通过切换部31来进行。
需要说明的是，在免疫球蛋白制造装置21中，对于“中性缓冲液”、“免疫球蛋白”、“多孔氧化锆粒子”、“中性解吸液”这样的术语，直接应用“1.免疫球蛋白纯化方法”中的说明。
在本发明的免疫球蛋白制造装置21中，能够制造与吸附部中使用的免疫球蛋白(原料免疫球蛋白)相比提高了纯度的免疫球蛋白。原料免疫球蛋白例如可以从血液中、组织液中分离来获得，也可以生物合成、化学合成，还可以经过培养工序，通过公知的方法获得。本发明的免疫球蛋白制造装置21可以具备原料免疫球蛋白的获得部。
实施例
对本发明更具体地进行说明。
1.实验A
(1)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子使用表1中记载的多孔氧化锆粒子。
需要说明的是，试验例1～9中，使用作为中性缓冲液的PBS(磷酸缓冲生理盐水)作为吸附液，但是，试验例10中，使用酸性的HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸，2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid)溶液。
[表1]
Figure BDA0003166550180000151
在表1中，“PCS140(SD)”是新日本电工株式会社制造的多孔氧化锆粒子。
在表1中，“PCS140(SD)-P(0.00125M)”是利用0.00125M的EDTPA溶液对新日本电工株式会社制造的多孔氧化锆粒子(PCS140(SD)、原料)进行处理而得到的负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子。
在表1中，“PCS140(SD)-P(0.0025M)”是利用0.0025M的EDTPA溶液对新日本电工株式会社制造的多孔氧化锆粒子(PCS140(SD)、原料)进行处理而得到的负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子。对于这些简称，在下述表2～3中也是同样。
需要说明的是，“PCS140(SD)-P(0.00125M)”的制备以下述方式进行。对于预先在100℃下脱气干燥2小时的多孔氧化锆粒子(PCS140(SD))250mg，添加0.00125M的EDTPA溶液10mL，进行15分钟脱气后，搅拌和/或振荡17小时。然后，进一步回流4小时后，利用纯水进行清洗，进行冷冻干燥，得到PCS140(SD)-P(0.00125M)。
“PCS140(SD)-P(0.0025M)”的制备也与“PCS140(SD)-P(0.00125M)”同样地进行。即，除了使用“0.0025M的EDTPA溶液”代替“0.00125M的EDTPA溶液”以外，与“PCS140(SD)-P(0.00125M)”的情况同样地制备“PCS140(SD)-P(0.0025M)”。
需要说明的是，EDTPA的负载量由TG-DTA(热重差示热分析)的重量减少计算出。即，称量约10mg的负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子，测定从常温起至1000℃为止的重量变化，进行差示热分析(TG-DTA；Thermo plus TG8120，理学)。由200℃～600℃的重量减少量计算出的结果是，每1mg多孔氧化锆粒子负载有0.06μg～2.20μg的EDTPA。
(2)吸附评价
＜试验例1～9＞
使用表1中记载的各种多孔氧化锆粒子，对蛋白质的吸附性进行评价。
对于各多孔氧化锆粒子，对IgG、HAS(人血清白蛋白，Albumin from humanserum)、Trf(人转铁蛋白，Transferrin human)这三种蛋白质分别实施下述试验。
在Spitz管中装入500μL的吸附液，向该液体中加入3mg多孔氧化锆粒子。使多孔氧化锆粒子充分分散后，添加500μL蛋白质的液体(500μg/500μL)，在遮光下于4℃搅拌一晩。
将Spitz管以12000转离心10分钟，使多孔氧化锆粒子沉淀分离。使用蛋白质定量染色液(BIO-RAD)通过酶标仪(InfiniteF200PRO，TECAN)对残留在上清溶液中的未固定的蛋白质的质量进行定量。将最初添加的蛋白质的质量与未吸附的蛋白质的质量的差作为被吸附的蛋白质的质量。计算出被吸附的蛋白质的质量相对于最初添加的蛋白质的质量的比例作为吸附率(％)。
＜试验例10＞
通过与试验例1～9同样的操作，投入的蛋白质的液体使用750μg/500μL，添加500μL该液体，实施试验例10。除了蛋白质的投入量以外，与试验例1～9同样地实施试验例10。
(3)试验结果
将试验结果一并记载于表1中。
(3.1)吸附液的种类的影响
对于吸附液的种类给蛋白质的吸附性带来的影响进行研究。
在此，对试验例1～3、10的结果进行比较研究。关于IgG的吸附率，可知试验例1～3高于试验例10。根据该结果可以确认，在吸附液使用中性缓冲液的情况下，IgG的吸附率提高。
接着，根据试验例1、10的结果对IgG的选择性进行考察。在试验例10中确认到，除了吸附IgG以外还吸附了HAS、Trf。在试验例10中，IgG的吸附率为31.7％，HAS的吸附率为72.7％，Trf的吸附率为60.2％。可见，在试验例10中，相对于IgG的吸附率，HAS的吸附率和Trf的吸附率高，IgG吸附的选择性低。
另一方面，在试验例1中，除了吸附IgG以外还吸附了HAS、Trf，但是，相对于IgG的吸附率，HAS的吸附率和Trf的吸附率低，IgG吸附的选择性高。
根据这些结果可知，通过使用中性缓冲液作为吸附液，能够提高IgG吸附的选择性，能够高效地吸附IgG。另外，由于使该被吸附的IgG解吸后回收IgG，因此，结果是通过使用中性缓冲液作为吸附液，高效地吸附IgG使得IgG的回收率提高。
(3.2)负载螯合剂的效果
对于使多孔氧化锆粒子负载螯合剂给蛋白质的吸附性带来的影响进行研究。
对使用了未负载EDTPA的多孔氧化锆粒子的试验例1与使用了负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子的试验例2～3的结果进行比较。与试验例1相比，在试验例2～3中，相对于IgG的吸附率，HAS的吸附率和Trf的吸附率更低，IgG的吸附选择性提高。因此，通过使多孔氧化锆粒子负载螯合剂，IgG的选择性进一步提高，IgG的回收率进一步提高。
(3.3)吸附液的浓度的影响
对于吸附液的浓度给蛋白质的吸附性带来的影响进行研究。
在此，对试验例4～6的结果进行比较研究。关于IgG的吸附率，可知吸附液的浓度为10mM的试验例4最高。
根据该结果能够确认，通过使吸附液的浓度为5mM以上且20mM以下，IgG的吸附率上升，IgG的回收率提高。
(3.4)吸附液的pH的影响
对于吸附液的pH给蛋白质的吸附性带来的影响进行研究。
在此，对试验例7～9的结果进行比较研究。关于IgG的吸附率，可知吸附液的pH为7.0的试验例8最高。
根据该结果能够确认，通过使吸附液的pH为6.6以上且7.4以下，IgG的吸附率上升，IgG的回收率提高。
2.实验B
(1)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子使用表2中记载的负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子(PCS140(SD)-P(0.0025M))。
[表2]
Figure BDA0003166550180000201
(2)吸附解吸评价
(2.1)吸附评价
在Spitz管中装入500μL的吸附液，向该液体中添加3mg负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子(PCS140(SD)-P(0.0025M))。使负载有EDTPA的多孔氧化锆粒子充分分散后，添加500μL的IgG的液体(500μg/500μL)，在遮光下于4℃搅拌一晩。
将Spitz管以14000转离心5分钟，使多孔氧化锆粒子沉淀分离。通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，ATTO制造的图像分析软件CS Analyzer 4)对残留在上清溶液中的未固定的IgG的质量进行定量。将最初添加的IgG的质量与未吸附的IgG的质量的差作为被吸附的IgG的质量。计算出被吸附的IgG的质量相对于最初添加的IgG的质量的比例作为吸附率(％)。
(2.2)解吸评价
上述吸附评价后，使用表2中记载的各种解吸液，对IgG的解吸进行评价。
IgG的解吸以下述方式进行。即，上述吸附评价后，除去上清溶液，在除去了上清溶液的Spitz管中装入表2中记载的各解吸液500μL，再次悬浮，使IgG解吸(洗脱)。
接着，将Spitz管以14000转离心5分钟，使多孔氧化锆粒子沉淀分离。通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，ATTO制造的图像分析软件CS Analyzer 4)对从多孔氧化锆粒子解吸而出现在上清溶液中的IgG的质量进行定量。将如此求出的IgG的质量作为被回收的IgG的质量。
然后，计算出被回收的IgG的质量相对于最初添加的IgG的质量的比例作为回收率(％)。需要说明的是，回收率(％)的计算方法在试验C中也是同样。
(3)试验结果
将试验结果一并记载于表2中。
可以确认到，与使用了酸性解吸液的试验例17相比，使用了中性解吸液的试验例11～16的回收率高。
3.实验C
(1)多孔氧化锆粒子
多孔氧化锆粒子使用表3中记载的多孔氧化锆粒子。需要说明的是，“Rhinophase-AB”是指Zir Chrom Seperations Inc.制造的多孔氧化锆粒子。
[表3]
Figure BDA0003166550180000211
(2)吸附解吸评价
(2.1)试验例18-19
使用表3中记载的多孔氧化锆粒子，使用500μL的IgG(300μg/500μL)的山羊的血清，除此以外与试验例11同样地进行吸附解吸评价。
(2.2)试验例20-21
使用表3中记载的多孔氧化锆粒子，使用20mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸，2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid)、4M EDTPA、50mM NaCl的溶液作为吸附液，使用20mMMES、4M EDTPA、2M NaCl的溶液作为解吸液，除此以外与试验例11同样地进行吸附解吸评价。需要说明的是，试验例20-21是作为现有技术的Rhinophase-AB的标准纯化工艺。
(3)试验结果
将试验结果一并记载于表3中。
首先，对试验例18、20的结果进行比较研究。试验例18中，吸附液和解吸液均为中性缓冲液。另一方面，试验例20中，吸附液和解吸液均为酸性缓冲液。关于吸附率，吸附液为中性的试验例18为69.8％，吸附液为酸性的试验例20为63.8％，两者没有显著的差异。但是，关于回收率，试验例18为69.8％，试验例20为30.3％，试验例18的回收率显著高于试验例20。
接着，对试验例19、21的结果进行比较研究。试验例19中，吸附液和解吸液均为中性缓冲液。另一方面，试验例21中，吸附液和解吸液均为酸性缓冲液。关于吸附率，试验例19为26.5％，试验例21为45.5％，可知试验例21的吸附率高。但是，关于回收率，试验例19为14.6％，试验例21为6.5％，试验例19的回收率显著高于试验例21。
根据以上结果可知，如果使用中性缓冲液作为解吸液，则吸附于多孔氧化锆粒子的IgG容易解吸，回收率提高。
需要说明的是，如果着眼于试验例18的吸附率和回收率，则吸附率为69.8％、回收率为69.8％，可知吸附于多孔氧化锆粒子的IgG几乎全部解吸。
4.实施例的效果
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子并利用中性解吸液使免疫球蛋白从多孔氧化锆粒子解吸的免疫球蛋白纯化方法中，免疫球蛋白的回收率高。而且，在该免疫球蛋白纯化方法中，由于不使用酸溶液、碱溶液，因此免疫球蛋白的抗体特性不会失活。
＜其它实施方式(变形例)＞
需要说明的是，本发明不限于上述实施例和实施方式，在不脱离其主旨的范围内能够在各种方式中实施。
(1)在上述说明中，对免疫球蛋白纯化装置1、免疫球蛋白制造装置21的一例进行了说明，但免疫球蛋白纯化装置1、免疫球蛋白制造装置21的构成可以根据吸附液、解吸液的种类、装置的规模等适当变更。
(2)在上述说明中，吸附解吸部3具备筒状部，但也可以不具备筒状部。
产业上的可利用性
本发明的免疫球蛋白纯化方法适合用于免疫球蛋白(抗体)的纯化。
本发明的免疫球蛋白制造方法适合用于免疫球蛋白(抗体)的制造。
本发明的免疫球蛋白纯化装置适合用于免疫球蛋白(抗体)的纯化。
本发明的免疫球蛋白制造装置适合用于免疫球蛋白(抗体)的制造。
符号说明
1…免疫球蛋白纯化装置
3…吸附解吸部
4…多孔氧化锆粒子
5…吸附液容器
7…解吸液容器
9…回收容器
11…切换部
21…免疫球蛋白制造装置
23…吸附解吸部
24…多孔氧化锆粒子
25…吸附液容器
27…解吸液容器
29…回收容器
31…切换部。

Claims (12)

1.一种免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附工序；和
利用中性解吸液使吸附于所述多孔氧化锆粒子的所述免疫球蛋白从所述多孔氧化锆粒子解吸的解吸工序。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，所述解吸液为磷酸缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的免疫球蛋白纯化方法，其特征在于，所述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种，
Figure FDA0003166550170000011
通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基；另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此相同或不同。
4.一种免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附部；和
利用中性解吸液使吸附于所述多孔氧化锆粒子的所述免疫球蛋白从所述多孔氧化锆粒子解吸的解吸部。
5.如权利要求4所述的免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，所述解吸液为磷酸缓冲液。
6.如权利要求4或5所述的免疫球蛋白纯化装置，其特征在于，所述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种，
Figure FDA0003166550170000021
通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基；另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此相同或不同。
7.一种免疫球蛋白制造方法，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附工序；和
利用中性解吸液使吸附于所述多孔氧化锆粒子的所述免疫球蛋白从所述多孔氧化锆粒子解吸的解吸工序。
8.如权利要求7所述的免疫球蛋白制造方法，其特征在于，所述解吸液为磷酸缓冲液。
9.如权利要求7或8所述的免疫球蛋白制造方法，其特征在于，所述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种，
Figure FDA0003166550170000022
通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基；另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此相同或不同。
10.一种免疫球蛋白制造装置，其特征在于，具备：
在中性缓冲液中使免疫球蛋白吸附于多孔氧化锆粒子的吸附部；和
利用中性解吸液使吸附于所述多孔氧化锆粒子的所述免疫球蛋白从所述多孔氧化锆粒子解吸的解吸部。
11.如权利要求10所述的免疫球蛋白制造装置，其特征在于，所述解吸液为磷酸缓冲液。
12.如权利要求10或11所述的免疫球蛋白制造装置，其特征在于，所述解吸液含有选自由下述通式(1)所表示的化合物及其盐组成的组中的至少一种，
Figure FDA0003166550170000031
通式(1)中，R1为碳原子数1～10的亚烷基；另外，R2～R5为碳原子数1～10的亚烷基，彼此相同或不同。
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