CN113278621B - 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’‑TTTCTTCTATTCGCGATCTCATACAACTTACTTATCTCATTTCTTTACC‑3’(SEQ ID NO：1)或5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG‑TTTCTTCTATTCGCGATCTCATACAACTTACTTATCTCATTTCTTTACC‑CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’(SEQ ID NO：2)。本发明的ssDNA核酸适配体对哈维氏弧菌具有特异性和高灵敏度，且无免疫原性。该ssDNA核酸适配体结构稳定、易修饰，便于合成和保存，可对哈维氏弧菌进行快速准确的检测和诊断。

Description

一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

技术领域

本发明涉及一种ssDNA核酸适配体及其应用，特别是涉及一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用。

背景技术

哈维氏弧菌又称哈氏弧菌，是海洋中常见的一种病原菌。哈维氏弧菌隶属于弧菌科中的弧菌属，主要感染虾及鱼类。哈维氏弧菌在海洋环境中分布范围很广，是海水中一种常见的病原菌，主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中。通常情况下，它是水产动物体表的正常菌群，只有在宿主体质变弱、菌株发生变异或者环境条件发生改变时，哈维氏弧菌才开始大量繁殖，侵染宿主。

目前对哈维氏弧菌的检测方法主要包括基于细菌生理生化反应的检测方法，基于抗体的免疫学检测技术，以及聚合酶链式反应(PCR)等。这些方法存在操作繁琐、检测耗时长、试验试剂保存条件苛刻等不足，无法满足养殖户在养殖现场对病原性哈维氏弧菌的快速准确检测的要求。因此应着力发展成本低、耗时短、操作便捷、灵敏度高的致病菌快速检测技术，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失极为重要。

指数富集的配基系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment technology,SELEX)是一种生物文库筛选技术，是基于分子生物学的认识：核酸分子与蛋白质分子等在体内的特异性相互作用，是基因转录、核酸复制、蛋白表达等一系列基本生命活动有序进行的保证。SELEX技术的基本原理：人工合成单链核酸文库(单链DNA或RNA)，文库含40nt左右的随机序列，其可能的序列理论上可达4⁴⁰种。一级序列的多样性，也导致了单链DNA或RNA二级和三级结构的多样性。这些不同序列与不同空间结构的核酸，经过多个循环的筛选，多种靶物质，如蛋白质、核酸、小肽和氨基酸等有机分子，甚至金属离子，在理论上都可以找到与之特异并稳固结合的核酸序列。经过多轮循环筛选及PCR/RT-PCR技术的扩增，再经克隆测序鉴定，进而可以大量生产并纯化得到与靶物质结合的这一段特异序列的核酸链-配基，也称核酸适配子或适配体。

核酸适配体能够特异性与靶物质牢固结合，因而可以在很大程度上相当于抗体的作用，而且在一些抗体还无法应用的领域也能发挥作用。适配子可以作为诊断试剂，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式，还可以应用于临床治疗等。

核酸适配体具有易筛选、易修饰、稳定性强、高特异性识别靶标分子等优点，目前已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具。首先，SELEX技术筛选周期短，通常核酸适配体的筛选需要6-30个SELEX循环，约3-8周的时间。而针对靶标分子筛选、制备特异性的生物抗体等则需要长达3-8个月的时间，且抗体存在成本高、易失活、保存条件苛刻、批次间的抗体质量存在差异等问题。其次，SELEX技术是在体外进行的化学筛选过程，因此靶标分子范围广范从金属离子、有机染料等简单体系，到病毒、细胞、组织等复杂体系，均可作为SELEX筛选的靶标分子，特别是具有细胞毒性、无免疫原性或者免疫原性弱的靶标分子，均能够使用SELEX技术在体外进行高特异性核酸适配体的筛选。因此，核酸适配体的研究日益受到国内外生物化学、生物医学、纳米材料、蛋白质科学等多学科研究者的广泛关注。目前，核酸适配体已发展成为一类广受关注的新型检测和治疗工具，其在重大疾病的生物医学基础研究、疾病诊断领域同样显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明在于提供一种高特异性、高灵敏度、无免疫原性、且稳定易修饰、便于合成和保存的用于检测水产致病菌哈维氏弧菌的ssDNA核酸适配体，以至少解决现有的生物学检测技术不能在现场快速对哈维氏弧菌进行准确检测和诊断的问题。

本发明的目地在于提供一种可特异性识别哈维氏弧菌的ssDNA核酸适配体，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-TGTAATGGGGGGGCTGGAAGGGGTTTGTGTTGGTTTGGTCGGAAGTTCCA-3’(SEQ ID NO：1)。

进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGTAATGGGGGGGCTGGAAGGGGTTTGTGTTGGTTTGGTCGGAAGTTCCACGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’(SEQ ID NO：2)。

更进一步地，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

更进一步地，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

更进一步地，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羟基荧光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)、羧基四甲基罗丹明(Carboxytetramethylrhodamine,TAMRA)中的一种或多种。

本发明还有一目地在于提供一种基于核酸适配体的用于致病性哈维氏弧菌快速检测的荧光分子探针(Aptamer H13-based Fluorescent Molecular Probe,H13-AFMP)，其特征在于，该分子探针含有上述ssDNA核酸适配体。将哈维氏弧菌与羟基荧光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)标记的上述SEQ ID：1或SEQ ID：2所示的ssDNA核酸适配体孵育结合并清洗后，用流式细胞仪进行检测，根据荧光值的变化检测致病性哈维氏弧菌。H13-AFMP可应用于开发基于核酸适配体的致病性哈维氏弧菌的快速检测试剂盒，适用于诊断水产养殖动物是否被哈维氏弧菌侵染的大批量快速检测，具有耗时短、操作简便、稳定性强、灵敏度高等优点。

本发明还有一目地在于提供一种应用上述ssDNA核酸适配体在检测哈维氏弧菌中的用途。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：本发明通过SELEX技术筛选得到的核酸适配体能够高亲和力和特异性识别哈维氏弧菌，而且核酸适配体无免疫原性；分子量小，便于体外化学合成；制备周期短；重现性好；易于对核酸适配体的不同部位进行化学基团修饰和取代；序列稳定，易于运输和保存等。采用本发明的基于核酸适配体的致病性哈维氏弧菌的快速检测方法(H13-AFMP)对哈维氏弧菌进行检测时，操作简单迅速，可用于开发相关的快速检测试剂盒。这对于哈维氏弧菌的快速检测具有重要意义，在水产致病菌哈维氏弧菌的检测领域有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例中，流式细胞仪检测羟基荧光素(FAM)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮、第10轮筛选文库与致病性哈维氏弧菌的结合情况，对照组Library：羟基荧光素(FAM)标记的非特异性随机ssDNA文库与致病性哈维氏弧菌的结合情况；

图2是本发明实施例中SEQ ID NO:2核酸适配体的二级结构预测图；

图3是本发明实施例中，流式细胞仪检测羟基荧光素(FAM)标记的SEQ ID NO:2核酸适配体(标记为H13)与哈维氏弧菌结合能力的检测结果；对照组1(Con1)：羟基荧光素(FAM)标记的非特异性随机ssDNA文库和哈维氏弧菌的结合情况；对照组2(Con2)：羟基荧光素(FAM)标记的SEQ ID NO:2核酸适配体与溶藻弧菌的结合情况；对照组3(Con3)：羟基荧光素(FAM)标记的SEQ ID NO:2核酸适配体与嗜水气单胞菌的结合情况；对照组4(Con4)：羟基荧光素(FAM)标记的SEQ ID NO:2核酸适配体与维氏气单胞菌的结合情况。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1:ssDNA核酸适配体的筛选

步骤1：合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物

随机起始单链ssDNA文库Library：

5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-N50-CGAAGGACGCAGAGAAGTCTC-3’

5’引物：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’；

3’引物：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3；

步骤2：SELEX筛选获得特异性识别水产致病菌哈维氏弧菌的核酸适配体

2.1将4nmol的上述起始文库溶于1000μl PBS，92℃恒温水浴10min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的随机文库与哈维氏弧菌在冰上孵育1h；

2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤哈维氏弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为包含有特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体的第1轮筛选文库。

步骤3：PCR扩增筛选文库

第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，具体的扩增条程序是：94℃5min，94℃1min，56℃30sec，72℃1min，经过20轮循环，72℃5min。第二轮及第二轮以后筛选得到的上清，取100μl用于进行PCR扩增。

步骤4：DNA单链文库的制备

将100μl链酶亲和素标记的纳米磁珠与PCR扩增所得的双链DNA在常温下孵育20min，利用生物素与链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面；将EP管放在磁性分离器上除去上清，用1mL PBS洗涤磁珠；然后在EP管中加入200μl NaOH(200mM)溶液，常温反应15min，利用磁性分离器分离回收上清；将上清液中正向ssDNA单链核酸用PCR纯化回收试剂盒纯化回收，收集到含有ssDNA单链文库的溶液。

步骤5：如上反复筛选

将步骤4中得到的ssDNA单链文库代替步骤(2)中的随机文库，重复步骤2-4所示的筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程9次。

步骤6：阴性筛选

在第二轮及第二轮以后筛选中，用溶藻弧菌为对照，将步骤5后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的单链DNA文库溶解、92℃恒温水浴、冰浴后，与溶藻弧菌在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液；然后将此上清溶液与哈维氏弧菌进行冰浴结合；孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤哈维氏弧菌活菌，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，收集到的上清即为经过阴性筛选的、包含有特异性识别哈维氏弧菌的核酸适配体的单链DNA筛选文库。

:步骤7：10轮筛选

将步骤6中收集到的上清溶液，经过步骤3的PCR扩增和步骤4的单链DNA文库制备后，依次重复进行步骤6、步骤2、步骤3和步骤4的过程，利用流式细胞仪检测所得文库对哈维氏弧菌识别能力的增强情况，直至9轮筛选后，单链DNA筛选文库对哈维氏弧菌识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测哈维氏弧菌的ssDNA核酸适配体，序列如SEQ ID NO：1所示。

步骤8：利用流式细胞仪检测筛选过程中核酸适配体文库的富集情况

将200nM羟基荧光素(FAM)标记的第1轮、第3轮、第5轮、第6轮、第7轮、第8轮、第9轮、第10轮筛选文库溶于500μl PBS中，然后与哈维氏弧菌在冰上孵育结合1h，1000g离心去上清，用10mL PBS离心洗涤三次，最终将哈维氏弧菌混匀在500μl PBS中，用于流式细胞仪检测50000个细胞。以羟基荧光素(FAM)标记的非特异性ssDNA随机文库Library与哈维氏弧菌的结合作为对照，检测结果如图1所示。该结果证实，经过10轮的筛选，证实第9轮筛选文库对哈维氏弧菌的特异性识别能力达到最高。

实施例2

实施例2的操作方式同实施例1，在步骤7中，最终得到可用于检测哈维氏弧菌活菌的ssDNA核酸适配体，其序列如SEQ ID NO：2所示。

步骤9：利用MFOLD软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)在线预测核酸适配体的二级结构

SEQ ID NO：2核酸适配体的二级结构预测结果如图2所示，核酸适配体形成特殊的茎环结构和发卡结构，其吉普斯自由能(ΔG)为-14.46KJ/mol。

步骤10：利用流式细胞仪检测本实施例中羟基荧光素(FAM)标记的核酸适配体对哈维氏弧菌的结合效果及其特异性

哈维氏弧菌与核酸适配体的孵育结合过程如上述所示，流式细胞仪的检测结果如图3所示，结果证实，与对照组的其他细菌相比，羟基荧光素(FAM)标记的上述SEQ ID NO：2所示的ssDNA核酸适配体对哈维氏弧菌具有高特异性识别能力。

实施例3

本发明实施例取用实施例1或2所得ssDNA核酸适配体，进行荧光分子探针(Aptamer H13-based Fluorescent Molecular Probe,H13-AFMP)试剂盒组装，形成一种用于水产致病菌哈维氏弧菌检测的H13-AFMP检测试剂盒。该分子探针含有上述ssDNA核酸适配体。

本发明实施例1、2通过SELEX技术筛选得到的ssDNA核酸适配体具有较好的亲和力及特异性，且本发明实施例1、2的ssDNA核酸适配体结构稳定，在进行基团标记及修饰后，仍具有较好的亲和力和特异性，可应用于荧光分子探针检测试剂盒中，且本发明实施例1、2的ssDNA核酸适配体相比于蛋白抗体具有制备周期短、重现性好、分子量小的特点，便于体外合成，在水产致病菌哈维氏弧菌的检测领域有良好的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

<130> 2021

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtaatgggggggctggaaggggtttgtgttggtttggtcggaagttcca 49

<210> 2

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacgcttactcaggtgtgactcgtgtaatgggggggctggaaggggtttgtgttggtttg 60

gtcggaagttccacgaaggacgcagatgaagtctc 95

Claims (6)

1.一种用于识别、检测哈维氏弧菌的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列为5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGTAATGGGGGGGCTGGAAGGGGTTTGTGTTGGTTTGGTCGGAAGTTCCACGAAGGACGCAGATGAAGTCTC-3’。

2.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体的核苷酸序列上结合有标记物。

3.根据权利要求2所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述标记物选自生物素、酶、发光基团中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述发光基团选自异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、羧基四甲基罗丹明中的一种或多种。

5.一种用于识别、检测哈维氏弧菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1～4任一项所述的ssDNA核酸适配体。

6.一种应用如权利要求1所述ssDNA核酸适配体的荧光分子探针检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：对ssDNA核酸适配体进行羟基荧光素标记；

步骤2：取待测样品1-100mg与步骤1所得浓度为100-200nM的ssDNA核酸适配体混合，并在冰上孵育结合20-60min；离心去上清，清洗待测样品，用流式细胞仪进行检测。

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