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CN113278584B - 一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用 - Google Patents

一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用 Download PDF

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CN113278584B
CN113278584B CN202110554258.6A CN202110554258A CN113278584B CN 113278584 B CN113278584 B CN 113278584B CN 202110554258 A CN202110554258 A CN 202110554258A CN 113278584 B CN113278584 B CN 113278584B
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Abstract

本发明涉及一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用,使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体,这在国内外尚属首例,并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体,本发明在加入胰酶后,减少了胶原酶用量的同时,还提高了外泌体纯度。

Description

一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法及应用。
背景技术
心肌梗死又叫心肌梗塞,心肌梗塞(myocardialinfarction)是冠状动脉闭塞,血流中断,使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。
临床上有剧烈而较持久的胸骨后疼痛,发热、白细胞增多、红细胞沉降率加快,血清心肌酶活力增高及进行性心电图变化,可发生心律失常、休克或心力衰竭。
急性心肌梗死发病突然,应及早发现,及早治疗,并加强入院前处理。治疗原则为挽救濒死的心肌,缩小梗死面积,保护心脏功能,及时处理各种并发症。
目前国内外的研究均是基于某种特定细胞来源的外泌体或循环血中的外泌体进行相关研究,但急性心肌梗死局部由于血栓堵塞冠状动脉这一特殊病理生理情况,故而局部微环境可能与循环血有一定差异性,且血栓的组分复杂,并非单一细胞系,故而当前的常规外泌体研究体系并不适用。而既往Vella等人的报道(Vella LJ,Scicluna BJ,Cheng L,et al.A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.J ExtracellVesicles.2017.6(1):1348885.)证实,通过胶原蛋白酶及胰酶混合溶解大脑组织,进而提出组织外泌体。
本研究基于该报道并经过改进,使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体,这在国内外尚属首例,并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体,本发明在加入胰酶后,减少了胶原酶用量的同时,还提高了外泌体纯度。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法。
本发明的另一目的是提供一种外泌体在制备治疗急性心肌梗塞疾病药物中的应用。
本发明所述一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法为:
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffersaline,PBS)的15ml离心管中静置过夜;
S2:加入胰酶和II型胶原酶;
S3:充分震荡混匀后,置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解;
S4:去除非凝固状态的血液,随后吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓90-110mg至装有4ml PBS的15ml离心管中备用;
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2-5℃、2000gX 7-13min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
S6;将过滤除菌后的液体加入超速离心管2-5℃、120000gX 60-80min超速离心;
S7:弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体。
优选的,前述步骤S1静置过夜6h以上。
优选的,前述步骤S2加入10-200μg/ml的胰酶。
优选的,前述步骤S2加入20μg/ml的胰酶。
优选的,前述步骤S2加入10-200U/ml II型胶原酶。
优选的,前述步骤S2加入50U/ml II型胶原酶。
优选的,前述步骤S4取沉淀的血栓100mg至装有4ml PBS的15ml离心管中备用。
优选的,前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机4℃、2000gX 10min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用。
优选的,前述步骤S6将过滤除菌后的液体加入超速离心管4℃、120000gX 70min超速离心。
本发明所述方法而得外泌体在制备治疗急性心肌梗塞疾病药物中的应用。
有益效果:
发明与现有技术相比,具有以下有益效果:
现有技术的问题:目前国内外的研究均是基于某种特定细胞来源的外泌体或循环血中的外泌体进行相关研究,但急性心肌梗死局部由于血栓堵塞冠状动脉这一特殊病理生理情况,故而局部微环境可能与循环血有一定差异性,且血栓的组分复杂,并非单一细胞系,因此当前的常规外泌体研究体系并不适用。
本发明有益效果:本发明使用胶原酶混合胰酶的方法溶解血栓后使用超速离心法成功提取血栓内的外泌体,在国内外尚属首例,并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体,本发明在加入胰酶后,减少了胶原酶用量的同时,还提高了外泌体纯度。
附图说明
图1:各组血栓溶解图:A:0min时各组血栓情况;B:15min时各组血栓情况;C:30min时各组血栓情况;D:45min时各组血栓情况;E:1h时各组血栓情况。
图2:各组血栓溶解剩余质量统计图(1)。
图3:圆圈所示的白色沉淀物质即为超速离心后沉淀的外泌体。
图4:A:WB鉴定各组外泌体标记物CD36以及内参GAPDH,B:各组WB灰度值统计数据。
图5:各组血栓溶解液提取外泌体电镜图:A:①组小剂量胰酶(10μg/ml)+小剂量II型胶原酶(10U/ml)组、B:②组:小剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组、C:③组:胰酶+II型胶原酶组、D:④组:大剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组、E:⑤组:大剂量II型胶原酶+小剂量胰酶组。图中可见各组中外泌体呈标准的中间凹陷的圆盘状,大小在50-200nm之间。
图6:各组血栓溶解液提取外泌体NTA结果图:A:①组小剂量胰酶(10μg/ml)+小剂量II型胶原酶(10U/ml)组,结果可见外泌体峰值主要在123.6nm、154.2nm、191.2nm,随后有一个峰值集中在226.9nm;B:②组:小剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组,结果可见外泌体峰值主要在132.3nm、161nm、192nm,随后有一个峰值集中在242.5nm;C:③组:胰酶+II型胶原酶组:结果可见外泌体峰值主要在127.8nm、174.2nm、106.9nm,随后有一个峰值集中在236.9nm;D:④组:大剂量II型胶原酶+大剂量胰酶组:结果可见外泌体峰值主要在140.7nm、167.2nm、68nm,该组无超过200nm的峰值;E:⑤组:大剂量II型胶原酶+小剂量胰酶组:结果可见外泌体峰值主要在135.5nm、167.3nm、114.4nm,该组无超过200nm的峰值。
图7:各组血栓溶解图:A:0min时各组血栓情况;B:15min时各组血栓情况;C:30min时各组血栓情况;D:1h时各组血栓情况。
图8:各组血栓溶解剩余质量统计图(2)。
图9:A:WB鉴定各组外泌体标记物CD36及内参GAPDH。B:各组WB灰度值统计数据。
图10:各组外泌体电镜检测结果图,图A为胶原酶组,B为阿替普酶组,C为胰酶+胶原酶组。图中可见各组中外泌体呈标准的中间凹陷的圆盘状,大小在50-200nm之间。
图11:各组外泌体NTA检测结果图。图A:胶原酶组,可见外泌体最高峰值出现在127.1nm,但在210.8nm之后仍有峰值,提示纯度相对较低。B:阿替普酶组,可见外泌体最高峰值出现在136.7nm和177nm,但在243nm及202.6nm处仍有峰值,提示纯度相对较低。C:胰酶+胶原酶组,可见外泌体峰值在200nm以内,最高峰出现在127.8nm,仅有一个峰值出现在236.9nm,提示纯度相较前两组明显提高。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1急性心肌梗塞患者血栓外泌体提取方法
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜6h以上;
S2:加入胰酶20μg/ml和50U/ml II型胶原酶;
S3:充分震荡混匀后,置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解;
S4:去除非凝固状态的血液,随后吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓100mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用;
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机4℃、2000gX 10min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
S6;将过滤除菌后的液体加入超速离心管4℃、120000gX70min超速离心;
S7:弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体。
实施例2急性心肌梗塞患者血栓外泌体提取方法
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜;
S2:加入10μg/ml胰酶和10U/mlII型胶原酶;
S3:充分震荡混匀后,置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解;
S4:去除非凝固状态的血液,随后吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓90mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用;
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2℃、2000gX 7min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
S6;将过滤除菌后的液体加入超速离心管2℃、120000gX 60min超速离心;
S7:弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体。
实施例3急性心肌梗塞患者血栓外泌体提取方法
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜;
S2:加入200μg/ml胰酶和200U/mlII型胶原酶;
S3:充分震荡混匀后,置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解;
S4:去除非凝固状态的血液,随后吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓110mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用;
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机5℃、2000gX 13min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
S6;将过滤除菌后的液体加入超速离心管5℃、120000gX 80min超速离心;
S7:弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体。
实验例:
1、血栓溶解
1.1使用制剂:分别使用常规细胞或组织裂解时使用的胰酶(含0.05%EDTA,购买自GIBCO,货号25300054)、II型胶原酶(因为II型号胶原蛋白主要存在于血管内膜、心脏及肠道等组织,血栓可能含有部分血管及心脏组织,故使用II型。购买自GIBCO,货号17101015),以及临床常规抗凝/抗栓药物肝素(药品名:低分子肝素钙注射液,规格:1ml:5000IU,商品名尤尼舒,厂家:海南通用同盟药业有限公司)、尿激酶原(药品明:注射用重组人尿激酶原,规格:5mg/支出,商品名:普佑克,厂家:上海天士力药业有限公司)、阿替普酶(药品名:注射用阿替普酶,规格:20mg/支,商品名:爱通立,厂家:Boehringer Ingelh eimPharma GmbH&Co.KG)、链激酶(药品名:注射液重组链激酶,规格:10万单位/支,商品名:思凯通,厂家:北京四环生物制药有限公司),磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS,购买自GBICO)
1.2使用仪器:恒温摇床(上海善志,型号:TS-2102)
1.3步骤:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer saline,PBS)的15ml离心管中静置过夜(>6h),用于去除非凝固状态的血液,随后小心吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓约100mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用。
随后分组为:①组:小剂量胰酶(10μg/ml)+小剂量II型胶原酶(10U/ml)组、②组:小剂量II型胶原酶(10U/ml)+大剂量胰酶组(200μg/ml)、③组:胰酶+II型胶原酶组(20μg/ml胰酶+50U/ml胶原酶(优选组))、④组:大剂量II型胶原酶(200U/ml)+大剂量胰酶(200μg/ml)组、⑤组:大剂量II型胶原酶(200U/ml)+小剂量胰酶(10μg/ml)组,共计5组,分别按0min、15min、30min、45min、1h将血栓用镊子取出称重并拍照。
1.4结果(见图1、图2、表1):
表1:各组血栓溶解剩余质量统计表(结果用均值±标准差表示)
Figure BDA0003076462470000061
2、外泌体提取
2.1使用试剂及耗材:超速离心管(货号355644,贝克曼),磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS,购买自GBICO),5ml注射器,0.22μm针头滤器(Millipore)
2.2使用仪器:超速离心机(贝克曼,Optima XPN-100,使用TYPE45TI转头),高速冷冻离心机(艾本德,Eppendorf 5810R)
3.步骤:
1)将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机4℃,2000gX10min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
2)将过滤除菌后的液体加入超速离心管4℃、120000gX70min超速离心;
3)弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体(见图3)。
3、外泌体鉴定
3.1分别使用:
1)电镜鉴定外泌体的大小及形态。
2)纳米颗粒跟踪分析仪(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)鉴定外泌体的粒径。
3)Western Blot鉴定外泌体表面标记物CD63及CD9表达。
3.2所需仪器:ZetaView PMX 110(Particle Metrix,Meerbusch,Germany),小型垂直电泳转印仪(美国Bio-Rad,1658033),凝胶成像仪(美国Bio-Rad,Gel Doc XR),酶标仪(美国赛默飞,Varioskan LUX)
所需试剂及耗材:Formvar-carbon载样铜网、PBS、草酸双氧铀、甲基纤维素、BCA蛋白定量试剂(Thermo Scientific),5×上样缓冲液(Beyotime),SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(Beyotime),PVDF膜(0.45μm,美国Millpore),CD36兔抗人抗体(美国Abcam,ab133625),HBR羊抗兔IgG抗体(美国Abcam,ab6721),多聚甲醛(Beyotime),戊二醛(Beyotime),ECL显影液(美国Millpore)
3.3 BCA蛋白定量
3.3.1样品处理:将提取纯化后的外泌体加入适量的裂解液,冰上裂解30min,待测;
将BCA蛋白定量试剂盒平衡至室温,并观察各试剂是否有沉淀,若有沉淀请等待溶解;
3.3.2配制工作液:
3.3.3孔数计算:8个标准品+样品总孔数;
3.3.4总体积计算:每孔200ul工作液;
3.3.5工作液配制:按总体积的试剂A:试剂B=50:1配制。
3.3.6按不同倍率稀释标准品
取25ul标准品和合适浓度的目的样品(如果目的样品预判浓度较低,可以直接上样25ul,如果预判浓度较高,可以用稀释液稀释后上样25ul,例如稀释5倍即5ul样品+20ul的稀释液)分别添加于96孔板的微孔中。各孔加入200ul BCA工作液,轻轻震荡混匀。盖上96孔板盖,37℃孵育30分钟(如果浓度较低,颜色较浅,可适当提高孵育温度或延长孵育时间),提前打开酶标仪,选好测定程序。冷却至室温,用酶标仪测定A562,根据标准曲线计算出蛋白浓度(样品的蛋白终浓度需乘以相应的稀释倍数)。
3.4 Western Blot
3.4.1样品处理
将BCA定量后的外泌体蛋白样本,取合适的量加入1/4体积的5×上样缓冲液,混匀后沸水煮10min。
3.4.2配制SDS-PAGE
把玻璃板冲洗干净晾干后按要求放入制具,根据需求配制SDS-PAGE胶,先配分离胶,玻璃板中加入7ml分离胶,再加2ml无水乙醇,30min后等分离胶充分凝固后再配浓缩胶,弃去玻璃板中的无水乙醇,加入2ml浓缩胶,然后插入梳齿。
3.4.3上样电泳
等胶凝固好后,放入电泳槽,灌入电泳缓冲液,拔去梳子,电泳缓冲液清洗上样孔,将准备好的样品上样,每个样品取相同总蛋白量,缓慢加入上样孔内,120mA电泳90min。
3.4.4免疫印迹(湿转)
电泳结束后,使用转移电泳装置,在冰浴,300mA恒流条件下电转60min,将蛋白转移到PVDF膜上:在托盘中倒入适量的电转移缓冲液,把胶从电泳装置中取出来,按顺序从负极到正极依次放置:滤纸—胶—PVDF膜—滤纸(放置过程中注意胶与PVDF膜之间不要有气泡产生),把治具放入转移电泳装置中,加入适量的电转移缓冲液,进行转膜。
3.4.5免疫显色
封闭:用封闭液(含10%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h。
一抗孵育:封闭液稀释一抗,然后与封闭好的PVDF膜4℃冰箱孵育过夜,洗膜:PBST洗涤4次,每次8min。
二抗孵育:用封闭液1:5000稀释二抗,室温下孵育PVDF膜1h
洗膜:PBST洗涤4次,每次8min。
采用Immobilon Western HRP发光试剂(millipore公司)进行显色
X光显影:在暗房中进行获得显示条带的胶片,加ECL、曝光、显影、定影的具体步骤如下:
将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上,以1:1的比例混合A液和B液,将混合液均匀滴加在PVDF膜上,避光反应。
将膜取出,吸干多余的ECL底物反应液,放入暗盒,铺上保鲜膜(避免产生气泡),放上X光片(避免X光片的移动),关上暗盒,曝光。
取出X光片,放入显影液中,约1min后取出,在清水中漂洗几秒钟,后放入定影液中至少2min。
取出X光片,晾干,分析。
把晾干后的X光片,放入暗盒里,用记号笔把蛋白预染marker位置和样品名称标注在X光片上,然后对结果进行分析。
3.5电镜:
①重悬exosome到50-100μl2%多聚甲醛中;
②将5μlexosome悬液加到Formvar-carbon载样铜网上;
③将100μl PBS加到封口膜上。用镊子将铜网(Formvar膜面朝下)放在PBS液滴上清洗;
④将铜网放在50μl 1%戊二醛液滴上5min;
⑤将铜网放在100μl ddH2O 2min(洗8次);
⑥将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上pH 75min;
⑦将铜网放在甲基纤维素液滴上10min,冰上操作;
⑧铜网放到样品台顶端的不锈钢环上,在滤纸上吸去多余液体;
⑨空气中干燥5到10min;
⑩将铜网处在在盒子里,80kV下拍摄电镜照片。
3.6 NTA:
①以去离子水清洗样本池;
②仪器以聚苯乙烯微球(110nm)校准;
③以1X PBS清洗样本池;
样本以1X PBS稀释,进样检测。
3.7、结果(见图4、图5、图6):
结果显示:大剂量胶原酶+小剂量胰酶、胶原酶+胰酶、小剂量胶原酶+小剂量胰酶三个组内CD36均表达强阳性,而另外两组表达则为弱阳性。我们考虑与胰酶的剂量过大对外泌体膜损伤有关。
最终结合血栓溶解的效率、CD36表达情况以及NTA和电镜结果,我们发现随着胰酶量的增加,会明显减少大颗粒外泌体的数量,但可能会增加外泌体损伤,进而明显抑制提取效率,故而我们最终选取了胰酶+II型胶原酶组(20μg/ml胰酶+50U/ml胶原酶)这个组别。
随后,为与临床常见的几种抗凝、抗栓药物对比,我们进一步分组为:胰酶组(50μg/ml,引文:PMID:32489530)、II型胶原酶组(75U/ml,引文:PMID:28804598)、肝素组(4000U,按2019年国家卫健委《急性ST段抬高型心肌梗死溶栓治疗的合理用药治疗(第2版)》建议的50-70U/Kg计算)、阿替普酶组(15mg,按2019年国家卫健委《急性ST段抬高型心肌梗死溶栓治疗的合理用药治疗(第2版)》建议的首次剂量15mg)、尿激酶组(150万单位,按2019年国家卫健委《急性ST段抬高型心肌梗死溶栓治疗的合理用药治疗(第2版)》)、链激酶组(2万IU,参照药物说明书示:AMI时冠脉内单次推注2万IU)、胰酶+胶原酶组(20μg/ml胰酶+50U/ml胶原酶),共7组。
将各组放入恒温摇床上,37℃恒温孵育,随后分别在0min、15min、30min、1h将血栓用镊子取出称重并拍照。
结果(见图7、图8、表2):
表2:各组血栓溶解剩余质量统计表(结果用均值±标准差表示)
Figure BDA0003076462470000101
4、从七组血栓中提取的外泌体经BCA定量浓度,并按浓度乘以体积(200ul),最终结果分别为:胰酶组(100μg)、II型胶原酶组(80μg)、肝素组(18μg)、阿替普酶组(220μg)、尿激酶组(130μg)、链激酶组(110μg)、胰酶+胶原酶组(220μg),结果见图9、图10、图11。
结果显示:阿替普酶组、胶原酶组、胰酶+胶原酶组CD36均为强阳性,尿激酶、胶原酶、链激酶组表达弱阳性,而肝素组近乎无CD36表达,我们考虑与大剂量胰酶、尿激酶及链激酶对外泌体膜损伤有关。
本发明为国内外首次提取出血栓外泌体,并经过对比已有的胶原酶法提取组织外泌体,本实验在加入胰酶后,在减少了胶原酶用量的同时,还提高了外泌体纯度。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作出一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种提取急性心肌梗塞患者血栓外泌体的方法,其特征在于,所述提取方法为:
S1:取成人心肌梗死后冠脉血栓至装有5-10ml磷酸盐缓冲液的15ml离心管中静置过夜;
S2:加入20μg/ml的胰酶和50U/ml II型胶原酶;
S3:充分震荡混匀后,置于37℃恒温摇床4h直至血栓完全溶解;
S4:去除非凝固状态的血液,随后吸取上清液丢弃,取沉淀的血栓90-110mg至装有4mlPBS的15ml离心管中备用;
S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机2-5℃、2000gX 7-13min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用;
S6:将过滤除菌后的液体加入超速离心管2-5℃、120000gX 60-80min超速离心;
S7:弃上清,将沉淀以无菌PBS 100ul重悬,即为外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S1静置过夜6h以上。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S4取沉淀的血栓100mg至装有4ml PBS的15ml离心管中备用。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S5:将前述溶解后的血栓组织溶解液在高速离心机4℃、2000gX 10min离心,去除溶解液里残留的死细胞和细胞碎片,取上清液待用。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤S6将过滤除菌后的液体加入超速离心管4℃、120000gX 70min超速离心。
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