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CN113264998A - 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用 - Google Patents

抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用 Download PDF

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CN113264998A
CN113264998A CN202110121056.2A CN202110121056A CN113264998A CN 113264998 A CN113264998 A CN 113264998A CN 202110121056 A CN202110121056 A CN 202110121056A CN 113264998 A CN113264998 A CN 113264998A
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Abstract

本发明提供了一种抗新冠病毒SARS‑CoV‑2表面S1蛋白的单链抗体，涉及细胞免疫学、分子病毒学技术领域，本发明的单克隆抗体包含scFv‑22序列SEQIDNO.1‑3的氨基酸序列的重链可变区，以及含有SEQIDNO.5‑7的氨基酸序列的轻链可变区，或包含scFv‑24序列SEQIDNO.9‑11的氨基酸序列的重链可变区，以及含有SEQIDNO.13‑16的氨基酸序列的轻链可变区。本发明的单链抗体可以特异性的与新冠病毒SARS‑CoV‑2的S1蛋白特异性结合，对新冠病毒具有中和活性，有效地抑制了新冠病毒对靶细胞的感染，可用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物开发。

Description

抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫学、分子病毒学技术领域，尤其是涉及一种抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用。
背景技术
新冠肺炎的全球传播引发了各界对抗病毒药行业的关注。在中国市场，最初是口罩、消毒剂等防护概念受到追捧。随着各界对疫情了解的深入，后续是研究各种检测试剂，疫情进行到目前阶段，各界更加关注疫苗和抗病毒药行业，抗体药的研发必将成为中长期趋势。
经过30年的发展，抗体药成为全球医药市场的重要组成部分。抗体药市场，仍由肿瘤、自身免疫两大领域主导。随着人们对疾病了解的不断加深、抗体技术的不断进化，抗体药在心血管、神经系统疾病、痛风、感染和神经系统疾病等并非传统的抗体药适应症领域也慢慢渗透。这是抗体药发展的新方向。随着技术的进步和免疫学基础研究的快速发展，抗体药的设计日益多样化，应用范围逐步扩大。
目前，新型冠状病毒在世界范围内传播，全球范围内新冠肺炎确诊病例超过5000万，死亡超过150万。针对新冠病毒的药物开发主要集中在病毒测试试剂、疫苗和中和性治疗抗体。试剂起检测作用，疫苗起预防作用，中和性抗体是实实在在起治疗作用的药物。但是到现在为止还没有正式能够应用于临床使用的抗体，大部分都还在实验阶段，小部分进入临床前研究，各个抗体的氨基酸序列不同，构建制备方法也不一样，实际应用效果也很难预判，推进不同类型的抗体研究势在必行。
国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织将感染此病毒引起的肺炎称为COVID-19。此病毒传染性强，传播途径广。该病毒能迅速适应人体环境，感染后在潜伏期即具有传播能力，同时还有一些无症状感染者报道，甚至在多种动物体内也检测到病毒核酸。这些因素使得对该病毒的防控变的非常复杂，而且目前没有有效治疗药物及疫苗上市。
SARS-CoV-2属于冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，大小约30kb，与 SARS-CoV相似性为79％，与蝙蝠体内分离的冠状病毒(Coronavirus，CoV) 相似性最高约88％。SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒特征，病毒包膜上有典型的棘突，形似日冕。Spike蛋白(刺突蛋白)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，决定了病毒的宿主范围和特异性，是宿主中和抗体的重要位点以及疫苗设计的关键靶点。
迄今为止，中和抗体已被证明是治疗病毒性疾病的有效方法。一般来说，当病毒、细菌等病原微生物入侵人体细胞时，这类抗体能够与病原微生物表面的抗原结合，把它们“中和”掉。科学研究表明，新冠病毒入侵人体细胞的“凶器”是其表面的刺突蛋白(S蛋白)，冠状病毒的结构如图1所示，这种蛋白与细胞表面受体-血管紧张素转化酶2(ACE2)结合后，新冠病毒就能入侵人体细胞，冠状病毒感染机体如图2所示。S蛋白的受体结构域(RBD)是冠状病毒表面重要的受体结合位点，所以是开发抗病毒中和抗体的重要靶点。
因此，需要开发能够抗新型冠状病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的具有高中和活性的抗体，以提供有效的诊断、预防和/或治疗新型冠状病毒感染的手段。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和 CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。 VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4 个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)， IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
单链抗体(例如，scFv)是指其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子。此类scFv分子可具有一般结构： NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列 (GGGGS)4的接头，但也可使用其变体。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指能清除或显著降低目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或抗体片段
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO 细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK293细胞、293T细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“中和活性”是指抗体或抗体片段具有与病毒上的抗原蛋白相结合，从而阻止病毒感染细胞和/或病毒子代的成熟和/或病毒子代的释放的功能活性，具有中和活性的抗体或抗体片段可以阻止病毒的扩增，从而抑制或消除病毒的感染。
如本文中所使用的，术语“新型冠状病毒肺炎”和“COVID-19”是指，因新型冠状病毒感染而导致的肺炎，二者具有相同的含义，可互换使用。
如本文中所使用的，术语“双特异性分子”是指单链抗体可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如受体的另一种抗体或配体)以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的单链抗体事实上可以进行衍生化或连接至一个以上其它功能性分子以生成与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子还意图为本文中所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。
有鉴于此，本发明提供了一种抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，其能够特异性识别和靶向新型冠状病毒的S蛋白，特别是S蛋白的受体结合结构域(RBD)，并且显示出了高效的中和病毒的能力。因此，本发明的抗体特别适合用于诊断、预防和治疗新型冠状病毒感染或与新型冠状病毒感染相关的疾病(例如新型冠状病毒肺炎)。
具体是采用噬菌体单链抗体展示库技术，收集COVID-19康复期患者的外周血，从外周血中分离B细胞，建立单链抗体(scFv)展示库，针对病毒外壳所带有的特异性的S1蛋白，从抗体库中筛选出靶向新冠病毒表面S蛋白S1亚基上RBD的全人源单克隆单链抗体。当这种中和抗体结合到病毒表面的S蛋白RBD区域后，新冠病毒将无法与人体细胞表面的ACE2结合，从而达到抑制病毒感染的效果。
在本申请的第一个方面，提供了一种抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，包括scFv-22序列或者scFv-24序列，其中：
所述scFv-22序列含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，以及含 CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
所述重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.1所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.2所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.3所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.5所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.6所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.7所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述scFv-24序列含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，以及含 CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
所述重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.8所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.9所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.10所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.11所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.12所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.13所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述单链抗体scFv-22序列的重链可变区包含与SEQID NO.4所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列，所述单链抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列；
所述单链抗体scFv-24序列的重链可变区包含与SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列，所述单链抗体scFv-24序列的轻链可变区包含与SEQ IDNO.16所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
在本申请的第二个方面，还提供了双特异性分子，其包含与第二功能性模块相连的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，所述第二功能性模块具有与所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体不同的结合特异性。
本文中所使用的，术语“双特异性分子”是指单链抗体可以进行衍生化或连接至另一功能性分子上，例如另一种肽或蛋白质(例如受体的另一种抗体或配体) 以生成与至少两种不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的单链抗体事实上可以进行衍生化或连接至一个以上其它功能性分子以生成与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；此类多特异性分子还意图为本文中所使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为创建本发明的双特异性分子，可以将本发明的抗体在功能上连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其它方式)至一种或多种其它结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模仿物，从而产生双特异性分子。
在本申请的第三个方面，还提供了抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体用于制备诊断试剂或诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。
在本申请的第四个方面，保护编码抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体的核酸分子。
在本申请的第五个方面，保护含有核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
在本申请的第六个方面，还保护前文任一所述单链抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用，所述产品的用途如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
所述新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病具体为人新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。
在本申请的第七个方面，还保护前文任一所述单链抗体或核酸分子或表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用，所述产品的用途如下：(d1)-(d2)中的任一种：
(d1)结合新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白；
(d2)检测新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白。
在本申请的第八个方面，还保护含有前文所述核酸分子的表达载体。
在本申请的第九个方面，还保护含有前文所述表达载体的宿主细胞。
本发明通过噬菌体单链抗体展示库技术得到一种具有全新的氨基酸序列的针对新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白的单链抗体，该单链抗体可以特异性的与新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白特异性结合，对新冠病毒具有中和活性，有效地抑制了新冠病毒对靶细胞的感染，可用于预防或治疗新型冠状病毒感染的药物开发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是现有技术中的冠状病毒结构示意图；
图2是现有技术中的冠状病毒感染机体示意图；
图3是本发明实施例1单链抗体scFv-22序列的不同OD值的克隆饼图；
图4是单链抗体scFv-22序列的流式细胞术荧光分析图；
图5是单链抗体scFv-22序列显示利用体外中和实验检测本发明的抗体的中和活性的结果图；
图6是实施例2单链抗体scFv-24序列的不同OD值的克隆饼图；
图7是单链抗体scFv-24序列的流式细胞术荧光分析图；
图8是单链抗体scFv-24序列显示利用体外中和实验检测本发明的抗体的中和活性的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1单链抗体scFv-22序列
一、抗体筛选
噬菌体单链抗体展示库构建
1、采集COVID-19康复期患者的外周血，从外周血中分离B细胞
实验于2020年5月19日，经过知情同意，采集20位COVID-19确诊患者恢复期外周血各20ml。经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的B细胞。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
提取PBMC细胞RNA，然后使用合成试剂盒将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH
(1)扩增VK&VL体系，如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
Figure BDA0002922305370000081
Figure BDA0002922305370000091
(2)扩增重链Fd段体系，如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
溶液或者组分 体积(μL)
cDNA 2
EX Buffer(10x) 8
dNTPs(10mM each) 10
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Tap 1U/μl 0.8
dH<sub>2</sub>O 75
(3)反应程序，如表3所示。
表3反应程序
Figure BDA0002922305370000092
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的 pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到噬菌体单链抗体展示库。
6、噬菌体单链抗体展示库的包装
噬菌体展示库筛选
具体以新冠病毒S1蛋白进行筛库，得到阳性克隆鉴定并测序。
1.取适量单链抗体库至500ml 2xTY培养基中，调OD600＝0.1，置37摄氏度摇床中，250rpm约2小时，待OD600＝0.5时取出。
2.加入过量辅助噬菌体KM13，之后置于37摄氏度水浴锅中孵化1小时。离心，弃上清，沉淀重悬至500ml 2xTY培养基中，置25摄氏度摇床中，250rpm 过夜。
3.4摄氏度离心10分钟，上清经0.45微米滤膜过滤。所得滤液按照100ml PEG溶液/400ml滤液的比例加入适量PEG溶液，冰上放置1小时，之后4摄氏度离心30分钟，弃上清，沉淀重悬至1ml PBS中。
4.将上述噬菌体溶液加入空白96孔板中，室温放置1小时进行预封闭。
5.将前一天包被S1蛋白的96孔板取出(每个蛋白6个孔，共12个孔)。 PBS洗三次后，加入5％的脱脂奶进行封闭约1小时。
6.将预封闭的噬菌体溶液加入上述包被S1蛋白的各个孔中，室温振荡孵育2小时。之后加入洗脱液将各孔中阳性噬菌体洗涤下来，并将其加入处于对数生长期的TG1菌液中。37摄氏度感染1小时。
7.将上述菌液室温离心10分钟，沉淀重悬至2xTY溶液中。最后均涂在若干个15cm2xTY Agar平板上。30摄氏度生长过夜。
8.第二天收集克隆至2xTY溶液中。
9.重复2轮上述筛选。取第三轮筛选得到的192个单克隆进行后续的 ELISA鉴定，选择OD值大于1.8的42个克隆进行测序，得到14个不同的anti-S1 scFv的序列，如图3所示。
二、流式细胞术检测单链抗体scFv-22与抗原结合情况
1.在293T细胞上，用PEI转染试剂瞬时转染含scFv-22的表达质粒；
2.转染后24h，向各孔中加入生物素化标记的S1蛋白进行孵育，室温孵育1小时，收集细胞，PBS洗3次；
3.向各孔加入APC-Streptavidin室温孵育30分钟，PBS洗3次；
4.FACS分析。
如图4所示，Ctrl为未进行转染的对照组，S1和Neg Ctrl S2组均转染了单链抗体scFv22，再分别加入生物素化标记的S1蛋白或S2蛋白作为阴性对照，结果显示，scFv22可以特异性的结合S1蛋白，但与阴性对照S2蛋白没有结合。
三、单链抗体scFv-22中和活性鉴定
再将scFv-22克隆进含Fc的分泌表达载体，取上清液进一步验证其对新冠病毒的假病毒对靶细胞感染的阻断作用。
中和实验流程：
在本实施例中，参照Temperton N J等人，Emerg Infect Dis,2005,11(3),411416的描述，利用微孔细胞中和实验法，检测scFv22-Fc对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。本实验所应用的SARS-CoV-2假病毒由本公司自行制备，其具有与真病毒相似的细胞感染特点，能够模拟真病毒感染细胞的早期过程，并且携带报告基因luciferase，可以快速方便地进行检测分析。操作假病毒的安全性高，在P2级实验室内就可完成中和实验，通过检测荧光素酶报告基因来检测抗体的中和活性(使用Promega公司的Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒)。
实验方法的具体步骤如下。
1.取96孔板，在细胞对照孔中加入100μl/孔的DMEM完全培养基(含有 1％的抗生素，25mM HEPES，10％FBS)；在病毒对照孔中加入100μl/孔的 DMEM完全培养基；并且，在实验孔中加入DMEM完全培养基稀释成各浓度梯度的待测抗体(100μl/孔)。实验使用的稀释抗体浓度分别为10-2nM、10-1nM、 100nM、101nM、102nM、103nM、104nM和105nM。
2.用DMEM完全培养基将SARS-CoV-2假病毒稀释至约1.0×104/ml，然后向病毒对照孔和实验孔中添加50μl/孔的SARS-CoV-2假病毒。
3.将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。
4.孵育结束后，向细胞对照孔、病毒对照孔和实验孔中添加50μl，0.02M/ 孔的细胞，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养48小时。
5.从细胞培养箱中取出96孔板，从每个孔中吸弃上清，然后加入50μl裂解液，室温反应5min。
6.用移液器将各个孔中的液体转移至对应的96孔不透光化学发光检测板中，加入50μl detection buffer室温避光反应5min，用Promega GloMax发光检测仪读取发光值。
7.计算中和抑制率：抑制率＝1-(读数样品-读数阴性对照)/(读数假病毒对照-读数阴性对照)
8.根据中和抑制率的结果，计算待测抗体的IC50。
9.实验结果显示，scFv22-Fc对SARS-CoV-2假病毒具有良好的中和活性，其IC50为4.2nM，如图5所示。
实施例2单链抗体scFv-24序列
一、抗体筛选
噬菌体单链抗体展示库构建
1、采集COVID-19康复期患者的外周血，从外周血中分离B细胞
实验于2020年5月19日，经过知情同意，采集20位COVID-19确诊患者恢复期外周血各20ml。经密度梯度离心法，分离20ml肝素抗凝血中的B细胞。
2、PBMC中RNA的提取和cDNA的合成
提取PBMC细胞RNA，然后使用合成试剂盒将RNA反转录成cDNA。
3、PCR扩增VK，VL和VH
(1)扩增VK&VL体系，如表1所示。
表1扩增VK&VL体系
Figure BDA0002922305370000121
Figure BDA0002922305370000131
(2)扩增重链Fd段体系，如表2所示。
表2扩增重链Fd段体系
溶液或者组分 体积(μL)
cDNA 2
EX Buffer(10x) 8
dNTPs(10mM each) 10
P1(10μM) 2
P2(10μM) 2
EX Tap 1U/μl 0.8
dH<sub>2</sub>O 75
(3)反应程序，如表3所示。
表3反应程序
Figure BDA0002922305370000132
PCR产物过2％琼脂糖凝胶电泳，回收750bp左右的片段。
4、轻链克隆(将VK和VL克隆入pComb3H载体)
VK和VL经XbaⅠ和SacⅠ酶切后与同样经XbaⅠ和SacⅠ酶切的pComb3H载体连接后，回收连接产物，然后电转XL1-Blue感受态细胞。
电击菌液涂15cm大平皿，次日刮菌，提质粒即为轻链库。此时重组质粒为pComb3H-VK和pComb3H-VL。
5、重链克隆(将VH基因克隆入pComb3H-VK和pComb3H-VL轻链库中)
将轻链库pComb3-L和Fd片段分别经XhoI和SpeI双酶切，与同样经XhoI 和SpeI双酶切的pComb3H-VK和pComb3H-VL连接，然后电转即得到噬菌体单链抗体展示库。
6、噬菌体单链抗体展示库的包装
噬菌体展示库筛选
具体以新冠病毒S1蛋白进行筛库，得到阳性克隆鉴定并测序。
1.取适量单链抗体库至500ml 2xTY培养基中，调OD600＝0.1，置37摄氏度摇床中，250rpm约2小时，待OD600＝0.5时取出。
2.加入过量辅助噬菌体KM13，之后置于37摄氏度水浴锅中孵化1小时。离心，弃上清，沉淀重悬至500ml 2xTY培养基中，置25摄氏度摇床中，250rpm 过夜。
3.4摄氏度离心10分钟，上清经0.45微米滤膜过滤。所得滤液按照100ml PEG溶液/400ml滤液的比例加入适量PEG溶液，冰上放置1小时，之后4摄氏度离心30分钟，弃上清，沉淀重悬至1ml PBS中。
4.将上述噬菌体溶液加入空白96孔板中，室温放置1小时进行预封闭。
5.将前一天包被S1蛋白的96孔板取出(每个蛋白6个孔，共12个孔)。 PBS洗三次后，加入5％的脱脂奶进行封闭约1小时。
6.将预封闭的噬菌体溶液加入上述包被S1蛋白的各个孔中，室温振荡孵育2小时。之后加入洗脱液将各孔中阳性噬菌体洗涤下来，并将其加入处于对数生长期的TG1菌液中。37摄氏度感染1小时。
7.将上述菌液室温离心10分钟，沉淀重悬至2xTY溶液中。最后均涂在若干个15cm2xTY Agar平板上。30摄氏度生长过夜。
8.第二天收集克隆至2xTY溶液中。
9.重复2轮上述筛选。取第三轮筛选得到的192个单克隆进行后续的 ELISA鉴定，选择OD值大于1.8的42个克隆进行测序，得到14个不同的anti-S1 scFv的序列，如图6所示。
二、流式细胞术检测单链抗体scFv-24与抗原结合情况
1.在293T细胞上，用PEI转染试剂瞬时转染含scFv-24的表达质粒；
2.转染后24h，向各孔中加入生物素化标记的S1蛋白进行孵育，室温孵育1小时，收集细胞，PBS洗3次；
3.向各孔加入APC-Streptavidin室温孵育30分钟，PBS洗3次；
4.FACS分析。
如图7所示，Ctrl为未进行转染的对照组，S1和Neg Ctrl S2组均转染了单链抗体scFv24，再分别加入生物素化标记的S1蛋白或S2蛋白作为阴性对照，结果显示，scFv24可以特异性的结合S1蛋白，但与阴性对照S2蛋白没有结合。
三、单链抗体scFv-24中和活性鉴定
再将scFv-24克隆进含Fc的分泌表达载体，取上清液进一步验证其对新冠病毒的假病毒对靶细胞感染的阻断作用。
中和实验流程：
在本实施例中，参照Temperton N J等人，Emerg Infect Dis,2005,11(3),411416的描述，利用微孔细胞中和实验法，检测scFv24-Fc对SARS-CoV-2假病毒的中和活性。本实验所应用的SARS-CoV-2假病毒由本公司自行制备，其具有与真病毒相似的细胞感染特点，能够模拟真病毒感染细胞的早期过程，并且携带报告基因luciferase，可以快速方便地进行检测分析。操作假病毒的安全性高，在P2级实验室内就可完成中和实验，通过检测荧光素酶报告基因来检测抗体的中和活性(使用Promega公司的Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒)。
实验方法的具体步骤如下。
1.取96孔板，在细胞对照孔中加入100μl/孔的DMEM完全培养基(含有 1％的抗生素，25mM HEPES，10％FBS)；在病毒对照孔中加入100μl/孔的 DMEM完全培养基；并且，在实验孔中加入DMEM完全培养基稀释成各浓度梯度的待测抗体(100μl/孔)。实验使用的稀释抗体浓度分别为10-2nM、10-1nM、 100nM、101nM、102nM、103nM、104nM和105nM。
2.用DMEM完全培养基将SARS-CoV-2假病毒稀释至约1.0×104/ml，然后向病毒对照孔和实验孔中添加50μl/孔的SARS-CoV-2假病毒。
3.将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时。
4.孵育结束后，向细胞对照孔、病毒对照孔和实验孔中添加50μl，0.02M/ 孔的细胞，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO2)培养48小时。
5.从细胞培养箱中取出96孔板，从每个孔中吸弃上清，然后加入50μl裂解液，室温反应5min。
6.用移液器将各个孔中的液体转移至对应的96孔不透光化学发光检测板中，加入50μl detection buffer室温避光反应5min，用Promega GloMax发光检测仪读取发光值。
7.计算中和抑制率：抑制率＝1-(读数样品-读数阴性对照)/(读数假病毒对照-读数阴性对照)
8.根据中和抑制率的结果，计算待测抗体的IC50。
9.实验结果显示，scFv24-Fc对SARS-CoV-2假病毒具有良好的中和活性，其IC50为0.84nM，如图8所示。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
<130> 20210118
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<170> PatentIn version 3.3
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Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln
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Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asn Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Gly Arg Phe Ser
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Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
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Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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<213> 人工合成
<400> 16
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Asn Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ile Val Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (10)

1.一种抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，其特征在于，包括scFv-22序列或scFv-24序列，其中：
所述scFv-22序列含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，以及含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
所述重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.1所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.2所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.3所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.5所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.6所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.7所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述scFv-24序列含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，以及含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，
所述重链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.9所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.10所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；重链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.11所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR1包含SEQ ID NO.13所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR2包含SEQ ID NO.14所示或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区的CDR3包含SEQ ID NO.15所示或其保守修饰形式的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体scFv-22序列的重链可变区包含与SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列，所述单链抗体的轻链可变区包含与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列；
所述单链抗体scFv-24序列的重链可变区包含与SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列，所述单链抗体scFv-24序列的轻链可变区包含与SEQ ID NO.16所示的氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列。
3.一种双特异性分子，其特征在于，其包含与第二功能性模块相连的权利要求1或2所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体，所述第二功能性模块具有与所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体不同的结合特异性。
4.权利要求1或2所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体用于制备诊断试剂或诊断试剂盒、药物或药物组合物的用途。
5.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求1或2所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体。
6.含有权利要求5所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
7.权利要求4所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用，其特征在于，用途如下(c1)和/或(c2)：
(c1)预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引起的疾病；
(c2)抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2感染。
8.权利要求4所述的抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体或权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在制备产品中的应用，其特征在于，用途如下：(d1)-(d2)中的任一种：
(d1)结合新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白；
(d2)检测新冠病毒SARS-CoV-2的S1蛋白。
9.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求5所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求9所述的表达载体。
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Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113603786A (zh) * 2021-08-26 2021-11-05 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体
CN113603793A (zh) * 2021-08-31 2021-11-05 南华大学 一种新型冠状病毒的重组s蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用
CN113698477A (zh) * 2021-08-23 2021-11-26 厦门福宸百奥生物技术有限公司 一种抗SARS-CoV-2单链抗体及其制备方法和应用
CN114316040A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN114702576A (zh) * 2022-03-01 2022-07-05 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN114716542A (zh) * 2022-02-27 2022-07-08 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种针对新冠病毒刺突蛋白的单克隆抗体及应用
CN115281150A (zh) * 2022-07-05 2022-11-04 四川大学华西医院 脾脏切除注射法建立肺腺癌肝转移小鼠模型的方法
CN115960218A (zh) * 2022-09-30 2023-04-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途
CN115975019A (zh) * 2022-09-30 2023-04-18 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途
CN116178529A (zh) * 2022-03-28 2023-05-30 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用
WO2023108666A1 (zh) * 2021-12-19 2023-06-22 中国人民解放军总医院 一类靶向covid-19病毒s蛋白的超高亲和力小蛋白及用途
WO2023151312A1 (zh) * 2022-02-14 2023-08-17 北京昌平实验室 乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN117467668A (zh) * 2020-11-25 2024-01-30 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies
CN116178529B (zh) * 2022-03-28 2024-11-15 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724069A (zh) * 2009-12-22 2010-06-09 陕西北美基因股份有限公司 一种抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法及其应用
CN111592594A (zh) * 2020-03-13 2020-08-28 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN111620945A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体
CN111620946A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分
US20200283495A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-10 ST Phi Therapeutics Chimeric Endocytic Receptors and Method of Use Thereof
US10787501B1 (en) * 2020-04-02 2020-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN111848754A (zh) * 2020-08-10 2020-10-30 四川大学华西医院 新型冠状病毒n蛋白重组抗原及其用途
CN113214367A (zh) * 2020-04-20 2021-08-06 北京派迪畅科技发展有限公司 一种covid-19冠状病毒重组s1蛋白及其应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101724069A (zh) * 2009-12-22 2010-06-09 陕西北美基因股份有限公司 一种抗人血清/浆中高丰度蛋白卵黄抗体IgY的制备方法及其应用
US20200283495A1 (en) * 2019-03-08 2020-09-10 ST Phi Therapeutics Chimeric Endocytic Receptors and Method of Use Thereof
CN111592594A (zh) * 2020-03-13 2020-08-28 北京大学 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
US10787501B1 (en) * 2020-04-02 2020-09-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN113214367A (zh) * 2020-04-20 2021-08-06 北京派迪畅科技发展有限公司 一种covid-19冠状病毒重组s1蛋白及其应用
CN111620945A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体或其衍生体
CN111620946A (zh) * 2020-05-09 2020-09-04 江苏省疾病预防控制中心(江苏省公共卫生研究院) 分离的新型冠状病毒单克隆抗体或其抗原结合部分
CN111848754A (zh) * 2020-08-10 2020-10-30 四川大学华西医院 新型冠状病毒n蛋白重组抗原及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAUDIO UCCIFERRI等: "Role of monoclonal antibody drugs in the treatment of COVID-19", 《WORLD JOURNAL OF CLINICAL CASES》 *
李焕杰等: "新型冠状病毒IgM-IgG抗体检测试剂盒的制备及对15例患者临床应用初试", 《山东大学学报（医学版）》 *

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11732030B2 (en) 2020-04-02 2023-08-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
US11999777B2 (en) 2020-06-03 2024-06-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing SARS-CoV-2 infections and COVID-19 with anti-SARS-CoV-2 spike glycoprotein antibodies
CN117467668B (zh) * 2020-11-25 2024-06-21 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
CN117467668A (zh) * 2020-11-25 2024-01-30 苏州大学 抗严重急性呼吸系统综合征ii型冠状病毒sars-cov-2的中和抗体
CN113698477A (zh) * 2021-08-23 2021-11-26 厦门福宸百奥生物技术有限公司 一种抗SARS-CoV-2单链抗体及其制备方法和应用
CN113603786A (zh) * 2021-08-26 2021-11-05 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 特异性结合SARS-CoV-2 S蛋白和N蛋白的双特异性抗体
CN113603793A (zh) * 2021-08-31 2021-11-05 南华大学 一种新型冠状病毒的重组s蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用
WO2023108666A1 (zh) * 2021-12-19 2023-06-22 中国人民解放军总医院 一类靶向covid-19病毒s蛋白的超高亲和力小蛋白及用途
WO2023151312A1 (zh) * 2022-02-14 2023-08-17 北京昌平实验室 乙型冠状病毒广谱中和抗体及其应用
CN114716542A (zh) * 2022-02-27 2022-07-08 武汉滨会生物科技股份有限公司 一种针对新冠病毒刺突蛋白的单克隆抗体及应用
CN114702576B (zh) * 2022-03-01 2023-09-01 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN114702576A (zh) * 2022-03-01 2022-07-05 武汉科技大学 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合区的单域抗体及其编码基因和应用
CN114316040B (zh) * 2022-03-02 2024-03-29 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN114316040A (zh) * 2022-03-02 2022-04-12 南昌大学 一种抗新型冠状病毒的全人源单克隆抗体及其用途
CN116178529A (zh) * 2022-03-28 2023-05-30 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用
CN116178529B (zh) * 2022-03-28 2024-11-15 广州医科大学附属市八医院 一株人源中和抗体或其抗原结合片段及其应用
CN115281150A (zh) * 2022-07-05 2022-11-04 四川大学华西医院 脾脏切除注射法建立肺腺癌肝转移小鼠模型的方法
CN115975019A (zh) * 2022-09-30 2023-04-18 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途
CN115960218A (zh) * 2022-09-30 2023-04-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途
CN115975019B (zh) * 2022-09-30 2024-02-02 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途
CN115960218B (zh) * 2022-09-30 2024-02-06 中国医学科学院病原生物学研究所 一种抗新型冠状病毒的抗体及其用途

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