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CN113227151B - 抗her2/pd1双特异性抗体 - Google Patents

抗her2/pd1双特异性抗体 Download PDF

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CN113227151B CN201980068587.0A CN201980068587A CN113227151B CN 113227151 B CN113227151 B CN 113227151B CN 201980068587 A CN201980068587 A CN 201980068587A CN 113227151 B CN113227151 B CN 113227151B
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Abstract

一种抗HER2/PD1双特异性抗体、制备方法和在抗肿瘤中的应用。具体地，单链可变片段scFv和免疫球蛋白抗体IgG通过肽接头连接获得双特异性抗体，该双特异性抗体能同时靶向肿瘤细胞表面分子HER2抗原和T淋巴细胞表面分子PD1。实验结果显示，提供的双特异性抗体，能够抑制HER2阳性肿瘤细胞的增殖，同时能够阻断PD‑1/PD‑L1的结合，解除T细胞的抑制状态，发挥抗肿瘤的作用。

Description

抗HER2/PD1双特异性抗体
技术领域
本发明属于肿瘤治疗和生物技术领域，涉及一种抗HER2和PD1的双特异性抗体分子制备方法和用途。
背景技术
HER2(human epidermal growth factor receptor2)，具有受体酪氨酸蛋白激酶活性，是人表皮生长因子受体家族成员之一，只在成年人的少数正常组织中呈低水平表达。但研究表明，HER2在多种肿瘤中过表达，如在约30％的乳腺癌患者和16％的胃癌患者中均存在过度表达情况，HER2在肿瘤中的过表达可以显著促进肿瘤血管的新生、肿瘤的生长，并增强肿瘤的侵袭和转移能力，是这类患者预后较差的重要指征。因此，早在1998年，第一个靶向于HER2的单克隆抗体药物Herceptin(Genentech/Roche)被FDA批准上市，并用于HER2过表达的乳腺癌和胃癌的治疗。
人程序性细胞死亡受体-1(PD1)是由288个氨基酸组成的I型膜蛋白，胞外段为负责结合配体的Ig可变型(V-型)结构域，胞内段为负责结合信号转导分子的胞质尾区。PD1胞质尾区含有两个基于酪氨酸的信号转导模体，分别为ITIM(免疫受体酪氨酸抑制作用模体)和ITSM(免疫受体酪氨酸转换作用模体)。PD1表达在已经激活的T淋巴细胞表面，它与配体PD-L1(程序性死亡受体-配体1，programmed cell death-Ligand 1)和PD-L2(程序性死亡受体-配体2，programmed cell death-Ligand 2)结合可以抑制T淋巴细胞的活性及相关的体内细胞免疫反应。大量研究表明，PD1和PD-L1的相互作用不仅维持了体内免疫系统的平衡，也是导致PD-L1表达阳性的肿瘤细胞规避免疫监视的主要机制。通过阻断PD1/PD-L1信号通路，能够激活免疫系统，恢复T细胞的免疫杀伤功能。
(pembrolizumab)是第一个上市的针对PD1的人源化单克隆抗体，于2014年9月被FDA批准用于治疗黑色素瘤，至2018年获批的适应症包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、胃癌和带有MSI-H或dMMR的实体肿瘤。/>(nivolumab)是百时美施贵宝公司的一款PD1单克隆抗体，于2014年12月获FDA批准上市，适应症包括：黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、经典霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞癌、膀胱癌、结直肠癌和肝细胞癌。由三生国健自主研发的抗PD1单克隆抗体是一种全新的抗PD1人源化单克隆抗体。体内外生物学活性以及抗肿瘤活性研究显示，抗PD1的生物学活性介于阳性对照药Opdivo和Keytruda之间，在某些方面略优于阳性对照药Opdivo。
双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是指能同时结合两个(或多个)不同抗原表位的抗体分子。与传统的单克隆抗体相比，双特异性抗体具有独特的作用机制：1)双特异性抗体可以同时结合2个或多个不同的抗原分子或相同分子的不同表位，而联合用药往往不具备这种效应。2)介导细胞间的相互作用，双特异性抗体可分别结合效应细胞和靶细胞上的两种抗原上，在效应细胞和靶细胞之间架起桥梁，促进细胞间的相互作用，例如介导免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。因此双特异性抗体具有传统单克隆抗体不具备的独特优势。
发明内容
本发明提供了一种新的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，还提供了该双特异性抗体的制备方法和应用。
因此，本发明的目的在于提供一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体；提供编码所述双特异性抗体的核苷酸分子；提供包含所述核苷酸分子的表达载体；提供所述表达载体的宿主细胞；提供所述双特异性抗体的制备方法；提供包含所述双特异性抗体的药物组合物；提供所述双特异性抗体在制备药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明一方面提供了一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变区片段scFv，其中每个单链可变片段scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，每个单链可变片段scFv通过接头肽L2与免疫球蛋白抗体IgG串联。
本发明所述的“双特异性抗体”是指拥有两个不同的抗原结合位点，能同时结合HER2和PD1的双特异性抗体，其包含两个单链可变片段scFv和与之缀合的免疫球蛋白抗体IgG，每个scFv经由肽接头L2连接至免疫球蛋白抗体IgG每条重链，形成双特异性抗体的重链融合蛋白，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接。
本发明所述的“单链可变区片段scFv”是指包含免疫球蛋白重链VH和轻链VL可变区的融合蛋白，VH与VL通过肽接头相连，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。
本发明所述的“免疫球蛋白抗体IgG”是约150kDa的分子，它由四条肽链构成，含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状，叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类(例如IgG1、2、3、4)。
作为优选的方案，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述VL包含互补决定区LCDR1-3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述免疫球蛋白抗体IgG的重链包含互补决定区HCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其中HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其中HCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述免疫球蛋白抗体IgG的轻链包含互补决定区LCDR4-6，其中LCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中LCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，其中LCDR6的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
本领域中，抗体的结合区通常均含有一条轻链可变区和一条重链可变区，每一个可变区均含有3个CDR结构域。抗体的重链和轻链的CDR结构域分别称为HCDR和LCDR。因此，常规抗体抗原结合位点包含六个CDR，包括分别来自重链和轻链V区的CDR集合。
作为优选的方案，scFv的VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；所述免疫球蛋白抗体IgG的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
作为优选的方案，所述肽接头L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
作为优选的方案，所述肽接头L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv1的分子结构形式为VL-L1-VH，每个scFv的N末端经由肽接头L2连接至免疫球蛋白抗体IgG重链的C末端。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
作为优选的方案，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv2的分子结构形式为VH-L1-VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至免疫球蛋白抗体IgG重链的N末端。
作为优选的方案，所述单链可变片段scFv2的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
作为优选的方案，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
在构建本发明的双特异性抗体时，与该双特异性抗体的化学和物理稳定性相关的问题也得到了解决，诸如表达物理稳定的分子、增加热和盐依赖的稳定性、降低聚集、增加在高浓度下的溶解度以及维持分别针对两种抗原HER2和PD1的亲和力等。
本发明另一方面提供了一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述所述的双特异性抗体。
作为优选的方案，所述核苷酸分子编码能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；或所述核苷酸分子编码能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
本发明所述核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码上述单克隆抗体的核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的核苷酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述双特异性抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该双特异性抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的核苷酸分子。
其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见Current Protocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明所述表达载体较佳地为pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR，pTT5，pDHFF，pGM-CSF或pCHO1.0，更佳地为pTT5。
本发明另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述表达载体较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
作为优选的方案，所述宿主细胞是真核细胞。优选CHO细胞或293E细胞。
本发明另一方面提供了上述能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体；
b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及抗体分离纯化技术手册。本发明中公开的抗HER2/PD1双特异性抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体；分离和纯化所述的抗HER2/PD1双特异性抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗HER2/PD1双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗HER2/PD1双特异性抗体。本发明的发明人对所得抗HER2/PD1双特异性抗体进行了检测实验，实验结果表明该抗HER2/PD1双特异性抗体能很好地与靶细胞和抗原结合，具有较高的亲和力。
本发明另一方面提供了一种组合物，所述组合物包含上述所述的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供的双特异性抗体，可以和药学上可接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明的双特异性抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。所述双特异性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。
对于本发明的双特异性抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的载体较佳地包括但不限于：表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合。其中表面活性剂较佳地包括但不限于：非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使抗HER2/PD1双特异性抗体的颗粒化趋势最小。溶液稳定剂较佳地包括但不限于以下列举之一或其组合：糖类，例如，还原性糖和非还原性糖；氨基酸类，例如，谷氨酸单钠或组氨酸；醇类，例如：三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇等，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态。等渗调节剂较佳地包括但不限于氯化钠、甘露醇之一或其组合。缓冲液较佳地包括但不限于：Tris、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一或其组合。
本发明另一方面提供了上述能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体、或上述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗癌症或肿瘤。
本发明所称的用于治疗癌症或肿瘤的药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
本发明所述的药物所针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、肛门区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病和所述癌的组合。
本发明的双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。
本发明的双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药以达到更加有效治疗肿瘤的目的，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物：1)作用于核酸化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝脲类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)和草酸铂(Oxaliplatin)等；抗生素类如阿霉素(Adriamycin/Doxorubicin)、放线菌素D(DactinomycinD)、柔红霉素(Daunorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、光辉霉素(Mithramycin)等；2)影响核酸代谢的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和培美曲塞(Pemetrexed)等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5-氟尿嘧啶、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(Hydroxycarbamide)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)和吉西他滨(Gemcitabine)等；3)作用于微管蛋白的药物：多西他赛(Docetaxel)、长春花碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱等；2、激素类药物：抗雌激素如他莫昔芬(Tamoxifen)、屈洛昔芬(Droloxifene)、依西美坦(Exemestane)等；芳香化酶抑制剂如氨鲁米特(Aminoglutethimide)、福美司坦(Formestane)、来曲唑(Letrozle)、阿那曲唑(Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂类药物：此类药物主要通过调节机体免疫功能以到抗肿瘤的效果，如干扰素类(Interferon)；白细胞介素-2(Interleukin-2)；胸腺肽类(Thymosins)等；4、单克隆抗体类药物：曲妥昔单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)等；5、其他类抗肿瘤药物：包括一些目前机制尚不明确、有待进一步研究的药物等。本发明公开的双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
本发明提供了能靶向肿瘤细胞表面分子HER2和T淋巴细胞表面分子PD1的双特异性抗体，其能够保持两端抗体的活性，能同时结合PD1和HER2抗原；细胞水平上，能够抑制HER2阳性的肿瘤细胞增殖，能阻断PD-1/PD-L1的结合，并且在针对两个靶点的N87-PDL1肿瘤细胞模型上，表现出优于HER2单抗、HER2单抗与PD1单抗联合使用的活性。动物实验上，小鼠N87肿瘤模型的实验结果显示，该双特异性抗体HER2端能抑制肿瘤增殖；人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型的实验结果显示，该双特异性抗体PD-1端能抑制肿瘤增殖。因此，本发明的双抗较好地保持了两端的活性，能够发挥协同抗肿瘤作用。
本发明的积极进步效果在于：此HER2/PD1双特异抗体，可以同时发挥三方面的功效，协同发挥杀伤肿瘤的作用。其一，阻断PD-1/PD-L1信号通路。PD-L1在肿瘤细胞和一些免疫调节细胞上表达，而T细胞上表达PD-1。PD-1与PD-L1结合能够抑制T细胞增殖活化。阻断此通路，可恢复T细胞的免疫杀伤功能。其二，此双抗的抗HER2抗体的Fc段可与NK等细胞的Fc受体结合，使Fc受体的免疫效应细胞发挥ADCC作用，杀伤肿瘤细胞，而对T细胞无明显杀伤。其三，此双抗的抗HER2活性，可以与高表达HER2抗原的肿瘤细胞结合，抑制肿瘤增殖。综上所述，此HER2/PD1双特异抗体可以同时结合PD1与HER2抗原，阻断信号通路，激活免疫效应细胞。三方面功效同时发挥作用抑制杀伤肿瘤细胞，并且该双特异性抗体具有良好的稳定性。
附图说明
图1A：抗HER2/PD1双抗a结构示意图
图1B：抗HER2/PD1双抗b结构示意图
图2A：抗HER2/PD1双抗a的HPLC检测图谱
图2B：抗HER2/PD1双抗b的HPLC检测图谱
图2C：抗HER2/PD1双抗a、b的SDS-PAGE检测结果
图3A：ELISA检测抗HER2/PD1双抗a，b与HER2的结合
图3B：ELISA检测抗HER2/PD1双抗a，b与PD1-ECD的结合
图4A：抗HER2/PD1双抗a、抗HER2/PD1双抗b与BT474细胞的结合FACS
图4B：抗HER2/PD1双抗a与PD1/CHO细胞的结合FACS
图4C：抗HER2/PD1双抗b与PD1/CHO细胞的结合FACS
图5：抗HER2/PD1双抗a、b对BT474细胞体外增殖抑制作用
图6A：抗HER2/PD1双抗a阻断PD1/PD-L1结合的细胞水平的活性
图6B：抗HER2/PD1双抗b阻断PD1/PD-L1结合的细胞水平的活性
图7A：检测抗HER2/PD1双抗a的抗HER2抗体的半衰期
图7B：用生物素化的PD1检测抗HER2/PD1双抗a抗体的半衰期
图7C：用proteinA检测抗HER2/PD1双抗a抗体的半衰期
图7D：检测抗HER2/PD1双抗b的抗HER2抗体的半衰期
图7E：检测抗HER2/PD1双抗b的抗PD1抗体的半衰期
图7F：用proteinA检测抗HER2/PD1双抗b抗体的半衰期
图8A：NK对CD4+T细胞的杀伤作用
图8B：NK对BT474肿瘤细胞的ADCC作用
图9A：抗HER2/PD1双抗a对N87-PDL1细胞的协同杀伤作用
图9B：PD1对照单抗对N87-PDL1细胞的作用
图10：抗HER2/PD1双抗a在NCI-N87移植瘤模型上的抗肿瘤作用
图11：抗HER2/PD1双抗a在人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型上的抗肿瘤作用
图12A：抗HER2/PD1双抗a的DSC图
图12B：抗HER2/PD1双抗b的DSC图
图12C：抗HER2/PD1双抗a的37℃稳定性，0时与第24天的SEC-HPLC
图12D：抗HER2/PD1双抗b的37℃稳定性，0时与第24天的SEC-HPLC
具体实施方式
以下实施例、实验例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为是对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press.
以下实施例中使用的实验材料和来源以及实验试剂的配制方法具体说明如下。
实验材料：
CHO细胞：购自Thermo fisher公司，货号A29133。
293E细胞：来自NRC biotechnology Research Institute。
人乳腺癌细胞BT474：来自中科院细胞库，目录号TCHu143。
PD-L1aAPC/CHO-K1细胞：购自Promega公司，货号J1252。
CD4+T细胞：购自Allcells，货号LP180329。
NK细胞：购自Allcells公司，货号PB012-C。
Protein A芯片：label No：29139131-AA；lot：10261132。
SD大鼠：购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证SCXK(浙)2018-0001。
人胃癌细胞株NCI-N87：购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
BALB/c裸小鼠：购自上海灵畅生物科技有限公司。
MC38小鼠结肠癌细胞株：和元生物技术(上海)股份有限公司。
人源化PD1小鼠品系C57BJ/6J-PDCD1em1(Hpdcd1)/Smoc：产品编号：NM-KI-00015，购自上海南方模式生物科技股份有限公司。
PBMC：购自塞笠生物，货号SLB-HP040A。
实验试剂：
HRP标记的鼠抗人Fab抗体：购自sigma，货号A0293。
Streptavidin HRP：购自BD Biosciences，货号554066.
羊抗人IgG-FITC：购自sigma，货号F4143。
抗CD28抗体：购自Abcam，货号ab213043。
IL-2：购自R&D，货号202-IL。
PBS：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B548117。
PBST：PBS+0.05％Tween 20。
BSA：购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号A60332。
TMB：购自BD公司，货号555214。
Bio-Glo：购自Promega，货号G7940。
FBS：购自Gibco，货号10099。
HBS-EP工作液：购自Life science，BR-1006-69。
CellTiter-Glo：购自promega，货号G775B。
实验仪器：
HiTrap MabSelectSuRe柱：购自GE公司。
Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪：购自Beckman公司。
SpectraMax i3x酶标仪：购自MolecularDevices公司。
SpectraMaxM5酶标仪：购自MolecularDevices公司。
微量热差式扫描量热仪MicroCal VP-Capillary DSC。
本发明实施例中所述的HER2单克隆抗体是指三生国健药业按照Herceptin的氨基酸序列，参照与实施例2中双抗相同的表达纯化方法得到的人鼠嵌合单克隆抗体。本发明实施例中所述的PD1单克隆抗体是指中国专利申请CN201710054783.5公开的由三生国健药业自主研发的全新的抗PD1人源化单克隆抗体。
实施例1.抗HER2/PD1双抗分子的构建
本发明采用了HER2单抗IgG和PD1单抗的scFv串联的方式构建了抗HER2/PD1双特异性抗体a。
将抗PD1单克隆抗体的轻链可变区VL(SEQ ID NO：14)和重链可变区VH(SEQ IDNO：13)通过肽接头L1(SEQ ID NO：17)连接起来，得到抗PD1的单链抗体片段VL-L1-VH，即抗PD1片段scFv1(SEQ ID NO：19)。利用L2(SEQ ID NO：18)将该单链抗体片段和抗HER2单克隆抗体的重链连接起来，从而得到双特异性抗体分子抗HER2/PD1双抗a的重链(SEQ ID NO：20)，HER2单抗的轻链(SEQ ID NO：21)则保持不变。为了提高抗体分子在CHO细胞中的表达效率，委托金唯智公司对抗HER2/PD1双抗a分子的核酸序列进行密码子优化。优化主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA二级结构、重复序列等因素，随后委托金唯智公司合成。抗HER2/PD1双抗a重链核酸序列为SEQ ID NO：22，轻链核酸序列为SEQ ID NO：23。抗HER2/PD1双抗a结构如图1A所示，序列见附录序列表。
抗HER2/PD1双抗b的分子构建如下所述：
将抗PD1单克隆抗体PD1单抗的轻链可变区VL(SEQ ID NO：14)和重链可变区VH(SEQ ID NO：13)通过肽接头L1(SEQ ID NO：17)连接起来，得到抗PD1的单链抗体片段VH-L1-VL，即抗PD1片段scFv2(SEQ ID NO：24)。利用L2(SEQ ID NO：18)将该单链抗体片段和抗HER2单克隆抗体的重链连接起来，从而得到双特异性抗体分子抗HER2/PD1双抗b的重链(SEQ ID NO：25)，HER2单抗的轻链(SEQ ID NO：21)则保持不变。为了提高抗体分子在CHO细胞中的表达效率，委托金唯智公司对抗HER2/PD1双抗b分子的核酸序列进行密码子优化。优化主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA二级结构、重复序列等因素，随后委托金唯智公司合成。抗HER2/PD1双抗b重链核酸序列为SEQ ID NO：26，轻链核酸序列为SEQ ID NO：23。抗HER2/PD1双抗b结构如图1B所示，序列见附录序列表。
实施例2.双抗的表达与纯化
将双抗的重链和轻链的DNA片段分别亚克隆到pTT5载体中，提取重组质粒共转染CHO细胞和/或293E细胞。细胞培养5-7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤后，上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用含有100mM柠檬酸，pH3.5的洗脱液一步洗脱蛋白，回收目标样品并透析至pH7.4的PBS。将纯化后的蛋白用HPLC检测，抗HER2/PD1双抗a、b的HPLC检测图谱分别如图2A、2B所示，抗体分子状态均一，单体纯度达到97％以上。取纯化后的抗HER2/PD1双抗a、b分别加入非还原电泳缓冲液，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；取纯化后的抗HER2/PD1双抗a、b分别加入还原电泳缓冲液并煮沸，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳图见图2C。双抗全长理论分子量为199KD。
实施例3.酶联免疫吸附法(ELISA)测定双抗对抗原的亲和力
为了检测抗HER2/PD1双抗a和b，分别与HER2抗原的亲和力，用pH7.4的PBS缓冲液将HER2-ECD-His蛋白(三生国健自制)稀释至250ng/ml，然后100μl/孔加入ELISA板中；4℃孵育过夜；次日用PBST洗板两次；每孔加入PBST+1％BSA进行封闭，37℃封闭1h；用PBST洗板两次；然后加入用PBS+1％BSA梯度稀释的待检测抗体，HER2单抗作为阳性对照，起始浓度为100nM，逐级3倍稀释12个梯度。37℃孵育1h；PBST洗板两次，加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，37℃再孵育40min；PBST洗板三次并拍干，每孔加入100μl TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2MH2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，GraphPad Prism6进行数据分析，作图并计算EC50。实验结果如图3A所示，抗HER2/PD1双抗a，b和阳性对照HER2单抗与HER2结合的EC50分别为0.1975，0.2294和0.221，三者亲和力相当。
为了检测抗HER2/PD1双抗a和b，分别与PD1的结合能力，将重组PD1-ECD-hFc蛋白(三生国健自制)用pH7.4的PBS稀释至200g/ml，100μl/孔加入酶标版，4℃包被过夜。PBST洗板2次，加入200μl/孔封闭液(PBS+2％BSA)，37℃放置1小时后PBST洗板1次待用。然后加入用PBS+1％BSA梯度稀释的待检测抗体，PD1单抗作为阳性对照，起始浓度为100nM，逐级3倍稀释12个梯度。加入封闭后的酶标板，100μl/孔，37℃放置1小时。PBST洗板2次，加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，37℃放置30分钟。PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2MH2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值，GraphPad Prism6进行数据分析，作图并计算EC50。实验结果如图3B所示，抗HER2/PD1双抗a，b和阳性对照PD1单抗与PD1结合的EC50分别为0.1384，0.1525和0.1557。三者亲和力相当。
实施例4.检测双抗对靶细胞的结合亲和力
本实验以细胞表面HER2高表达的人乳腺癌细胞BT474作为靶细胞，用含有0.5％BSA的PBS洗涤三次，每次300g离心5分钟，弃上清。0.5％BSA的PBS重悬细胞，细胞浓度为1×106细胞/mL，100μL/孔加入96孔板。将抗HER2/PD1双抗a、b及阳性对照HER2单抗稀释为400nM，逐级稀释11个梯度，100μL/孔加入96孔板，将BT474细胞混合均匀。4℃孵育1h。PBS洗涤细胞两次以去除未结合的待检抗体。再将细胞与100μl的1g/ml羊抗人IgG-FITC于4℃孵育30分钟。300g离心5分钟，PBS洗涤细胞两次以去除未结合的二抗。最后将细胞重悬在200μl PBS中，通过Beckman Coulter CytoFLEX流式细胞仪测定双抗对该细胞的结合亲和力。所得数据通过GraphPad Prism6软件拟合分析。实验结果如图4A所示，抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b都能特异性的结合细胞表面表达的HER2。实验结果如图4A所示，抗HER2/PD1双抗a，b和阳性对照HER2单抗与BT474细胞结合的EC50分别为1.64，5.669，1.556。其中抗HER2/PD1双抗a和阳性对照HER2单抗亲和力相当，而抗HER2/PD1双抗b与阳性对照HER2单抗相比，亲和力稍弱。
同样的，以细胞表面表达PD1的CHO稳转细胞作为靶细胞，通过流式细胞仪测定抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b，对该细胞的结合亲和力。方法如前所述，所得数据通过GraphPad Prism 6软件拟合分析。实验结果如图4B，4C所示，抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b都可以特异性的结合细胞表面表达的PD1。抗HER2/PD1双抗a和阳性对照PD1单抗EC50分别为1.777和0.8981；抗HER2/PD1双抗b和阳性对照抗PD1单抗EC50分别为1.192和0.8891。三者亲和力相当。
实施例5.双抗对BT474细胞体外增殖抑制作用
人乳腺癌细胞系BT474表达HER2抗原分子在其细胞表面。由于BT474细胞在体外培养过程中，其正常的增殖，部分依赖HER2受体传递的生长信号。在培养基中加入抗HER2抗体，则可抑制该细胞增殖。在一定范围内，抗体的浓度与细胞增殖抑制的程度成量效关系。细胞增殖的程度可通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)细胞增殖毒性试剂来检测。量效关系曲线为反”S”曲线。
将BT474细胞用胰酶消化，重悬后进行细胞计数，根据活细胞的密度，用完全培养基调整细胞密度至5×104细胞/mL，100μL/孔加入96孔细胞培养板的B～G行。A、H两行加入200μL/孔的培养基或PBS封边。放置37℃，5％CO2培养箱中贴壁培养3～5小时。将抗HER2/PD1双抗a、b与阳性对照HER2单抗样品用完全培养基作为稀释液配制为300nM溶液，再逐级3倍稀释，共计11个梯度。将稀释好的样品，加入对应的96孔板细胞中。置于37℃、5％CO2的培养箱内继续培养7天。孵育7天的细胞培养板，按照1∶10的比例(样品稀释液：CCK-8)加入显色液，放入CO2培养箱中继续孵育3～5h。酶标仪以650nm为参比波长，450nm下测定OD值。所得数据通过GraphPad Prism 6软件分析，实验结果如图5所示。抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b和阳性对照HER2单抗IC50分别为0.4967、0.9427、0.5914。三者抑制率相当。
实施例6.双抗阻断PD1/PD-L1结合的细胞水平的活性
取对数期生长的PD-L1aAPC/CHO-K1，胰酶消化成单个细胞后转移到白色底透96孔板，100μL/孔，40000细胞/孔，置于37℃，5％CO2，孵育过夜。取抗HER2/PD1双抗a、b、抗PD1单抗、同型阴性对照样品逐级3倍梯度稀释成2×工作液浓度：起始浓度为600nM。取密度在1.4-2×106细胞/mL，细胞活率在95％以上的PD1效应细胞，胰酶消化成1.25×106细胞/ml的单细胞悬液。取前一天铺好的PD-L1aAPC/CHO-K1细胞，弃掉上清，加入40μl梯度稀释的双抗/PD1单抗工作液；再加入等体积的PD1效应细胞。置于37℃，5％CO2，孵育6小时。每孔加入80μl检测试剂Bio-Glo。室温孵育10分钟后，用spectramax i3读取luminescence。
所有数据均为双复孔，所得信号值取平均值后用4-parameter法拟合，绘制曲线，如图6A，6B所示，获得抗HER2/PD1双抗a的IC50，top，bottom，hillslope等数据。如表1所示：
表1
抗HER2/PD1双抗a 抗PD1单抗
Bottom 2.707 -1.048
Top 101.1 95.61
lgIC50 0.5161 -0.05017
HillSlope 1.048 0.8425
IC50 3.282 0.8909
抗HER2/PD1双抗b的IC50，top，bottom，hillslope等数据。如表2所示：
表2
抗HER2/PD1双抗b 抗PD1单抗
Bottom 4.435 4.39
Top 121.3 102.8
lgIC50 0.6467 0.03983
HillSlope 0.8171 0.7548
IC50 4.433 1.096
实施例7.BiacoreTM 8K测定双抗对抗原的亲和力
使用proteinA捕获法测定双抗和抗原HER2-ECD-his结合的动力学参数。将浓度为1μg/ml的双抗结合在Protein A芯片上，将抗原HER2-ECD-his用1×HBS-EP工作液从50nM往下2倍稀释，设6个浓度梯度与抗体结合，于HBS-EP工作液中解离。
使用proteinA捕获法测定双抗和抗原PD1-ECD-his结合的动力学参数。将浓度为1μg/ml的双抗结合在Protein A芯片上，将抗原PD1-ECD-his用1×HBS-EP工作液从250nM往下2倍稀释设5个浓度梯度与抗体结合，于HBS-EP工作液中解离。
抗HER2/PD1双抗a和HER2-ECD-His、PD1-ECD-his结合的动力学参数见表3。结果表明，抗HER2/PD1双抗a与抗原PD1和HER2有良好的亲和力。
表3
Analyte Solution ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PD1-ECD-his 2.43E+04 8.57E-05 3.53E-09
HER2-ECD-his 5.88E+04 1.92E-04 3.27E-09
KD为亲和力常数；ka为抗原抗体结合速率；kd为抗原抗体解离速率；KD＝kd/ka。
抗体抗HER2/PD1双抗b和HER2-ECD-His、PD1-ECD-his结合的动力学参数见表4。结果表明，抗HER2/PD1双抗b与抗原PD1和HER2有良好的亲和力。
表4.抗HER2/PD1双抗b的动力学参数
Analyte Solution ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PD1-ECD-his 3.85E+04 1.86E-04 4.83E-09
HER2-ECD-his 2.16E+05 1.71E-04 7.92E-10
KD为亲和力常数；ka为抗原抗体结合速率；kd为抗原抗体解离速率；KD＝kd/ka。
实施例8.抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b的药代动力学研究
取每组4只SD大鼠，体重200g左右，每只大鼠通过尾静脉注射剂量为2mg的抗体。分别在给药后的特定时间眼眶取血，血液自然凝固后8000rpm/min离心取血清。
抗HER2/PD1双抗a的血清中药物浓度采用以下方法检测：
1)HER2-His包被ELISA板，50ng/孔。共两板。4℃包被过夜，次日PBST洗板两次，然后用PBS+2％BSA于37℃封闭2小时。取起始浓度为0.5μg/mL的抗HER-2/PD1双抗a标准品，逐级两倍稀释12个梯度。将每个血清样品稀释2000倍。将以上样品加入封闭好的ELISA板。37℃孵育一小时。然后PBST洗板两次。
检测抗HER2的抗体：取其中一板加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，1∶3000稀释，100μL/孔。37℃孵育40min。PBST洗板4次，拍干。每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
检测抗PD1的抗体：取另一板加入生物素化的PD1-hFc，7.5ng/孔，孵育1小时。洗板并加入Streptavidin HRP，1∶1000倍稀释。37℃放置30分钟；PBST洗板4次，拍干。每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl的2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
2)proteinA包被ELISA板，检测抗体Fab段。用proteinA包被，包被量为100ng/孔，4℃过夜；次日PBST洗板两次，然后用PBS+2％BSA于37℃封闭2小时。PBST洗板两次。抗HER2/PD1双抗a标准品从1000ng/mL起始，逐级两倍稀释12个梯度。大鼠血清样品2000倍稀释。以上两组样品加入封闭后的ELISA板，孵育1小时；PBST洗板两次后加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，37℃放置30分钟；PBST洗板3次后，在吸水纸上尽量拍干残留液滴，每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
用Phoenix软件计算抗体药物在大鼠体内的半衰期，用GraphPad Prism6进行数据整理分析和作图。药代动力学参数见表5、6、7，实验结果如图7A，7B，7C所示，用两种方法检测的大鼠体内半衰期分别为：方法一的抗HER2抗体的为273小时，抗PD1抗体的为333小时；方法二检测的半衰期是333小时。三组数据相差不大，可以推测抗HER2/PD1双抗a的半衰期在300小时左右。
检测抗HER2抗体的半衰期见表5：
表5
用生物素化的PD1检测抗HER2/PD1双抗a抗体的半衰期见表6：
表6
group HL_Lambda_z(hr)
1 382.77325
2 294.69571
3 302.13064
4 353.0152
平均 333
用proteinA检测抗HER2/PD1双抗a抗体的半衰期见表7：
表7
group HL_Lambda_z(hr)
1 346.75496
2 369.60234
3 306.45773
4 310.91707
平均 333
抗HER2/PD1双抗b的血清中药物浓度采用以下方法检测：
1)检测抗HER2的抗体：HER2-His包被ELISA板，50ng/孔。4℃包被过夜，次日PBST洗板两次，然后用PBS+2％BSA于37℃封闭2小时。取起始浓度为0.5μg/mL的抗HER2/PD1双抗b标准品，逐级两倍稀释12个梯度。将每个血清样品稀释2000倍，加入封闭好的ELISA板。37℃孵育1小时。然后PBST洗板两次。加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，1∶3000稀释，100μL/孔。37℃孵育40min。PBST洗板4次，拍干。每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
2)检测抗PD1的抗体：PD1-ECD-hFc包被ELISA板，20ng/孔。包被，洗板，以及标准品稀释方法同上。将血清样品稀释1000-2000倍，加入封闭好的ELISA板。37℃孵育1小时。然后PBST洗板两次。加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，1∶3000稀释，100μL/孔。37℃孵育40min。PBST洗板4次，拍干。每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
3)proteinA包被ELISA板，检测抗体Fab段。用proteinA包被，包被量为100ng/孔，4℃过夜；次日PBST洗板两次，然后用PBS+2％BSA于37℃封闭2小时。PBST洗板两次。抗HER2/PD1双抗b标准品从1000ng/mL起始，逐级两倍稀释12个梯度。大鼠血清样品500-1000倍稀释，加入封闭后的ELISA板，孵育1小时；PBST洗板两次后加入HRP标记的鼠抗人Fab抗体，37℃放置30分钟；PBST洗板4次，拍干。每孔加入100μl的TMB，室温(20±5℃)避光放置5分钟；每孔加入50μl2M的H2SO4终止液终止底物反应，酶标仪450nm处读取OD值。
用Phoenix软件计算抗体药物在大鼠体内的半衰期，用GraphPad Prism6进行数据整理分析和作图。药代动力学参数见表8、9、10，实验结果如图7D，7E，7F所示。用三种方法检测的大鼠体内半衰期分别为：方法一为312小时；方法二为280小时。方法三为277小时。三组数据相差不大，可以推测抗HER2/PD1双抗b的半衰期在280小时左右。
检测抗HER2抗体的半衰期见表8：
表8
group HL_Lambda_z(hr)
1 249.10194
2 279.51118
3 366.19333
4 355.05384
平均 312
检测抗PD1抗体的半衰期见表9：
表9
group HL_Lambda_z(hr)
1 375.61812
2 216.88057
3 196.51091
4 331.40524
平均 280
用proteinA检测抗HER2/PD1双抗b抗体的半衰期见表10：
表10
group HL_Lambda_z(hr)
1 189.38172
2 333.14994
3 389.77667
4 196.6228
平均 277
实施例9.抗HER2/PD1双抗a的ADCC效应
由于HER2/PD1双抗不仅可以结合肿瘤细胞，结合表达PD-1的T细胞，抗体的Fc段还可以结合NK细胞。
本实验一方面检测NK细胞对抗体结合的CD4+T细胞是否有杀伤；另一方面检测NK细胞对抗体结合的BT474肿瘤细胞的杀伤。
1)NK细胞对CD4+T细胞是否有杀伤作用：活化的T细胞上表达PD1，加入抗HER2/PD1双抗a抗体与其结合，而抗HER2/PD1双抗a的Fc段与效应细胞NK的Fc受体结合，加入NK细胞可检测对T细胞是否有杀伤。
实验方法如下：
CD4+T细胞的激活：用D-PBS配制抗CD3抗体，浓度为5μg/mL，包被24孔细胞培养板，4℃过夜。次日，每孔加入5×105个CD4+T细胞，同时加入2μg/mL的抗CD28抗体以及100U/mL的IL2。放于37℃，CO2培养箱，激活72h。
收集活化的T细胞，FACS检测PD1的表达。然后将高表达PD1的T细胞，用含5％FBS的1640培养基，配制成2×105细胞/mL，50μL/孔。加入96孔板。
抗HER2/PD1双抗a以及阴性对照样品HER2单抗的稀释：将抗HER2/PD1双抗a以及HER2单抗配制为初始浓度400nM，逐级5倍稀释后，加入铺入T细胞的96孔板中。放于37℃，CO2培养箱，孵育15min。期间，将NK细胞用含5％FBS的1640培养基调整为5×105细胞/mL，100μL/孔加入上述96孔板中，放于37℃，CO2培养箱，杀伤3h。
将96孔板300g离心5min，转移上清再离心一次，转移100μL上清到另一96孔板。加入50μL/孔的LDH底物，孵育15min。在SpectraMaxM5酶标仪上，以450nm为检测波长，650nm为参比波长，进行读数，用GraphPad Prism6进行数据分析，作图。结果如图8A显示，NK细胞对CD4+T细胞无明显杀伤作用，仅在抗HER2/PD1双抗a高浓度下有微弱的杀伤。
2)NK对BT474肿瘤细胞ADCC效应
BT474细胞表面表达HER2抗原，加入抗HER2/PD1双抗a可与其结合。而抗HER2/PD1双抗a的Fc段与效应细胞NK的Fc受体结合，加入NK细胞可检测对BT474细胞是否有杀伤。
实验方法如下：
将BT474细胞，用含5％FBS的1640培养基稀释为2×105个细胞/mL，加入96孔平底板中，50μL/孔。放于37℃，5％CO2培养箱过夜。
抗HER2/PD1双抗a以及阴性对照样品HER2单抗的稀释：将抗HER2/PD1双抗a以及HER2单抗配制为初始浓度200nM，逐级4倍稀释后，加入铺入BT474细胞的96孔板中。放于37℃，5％CO2培养箱，孵育15min。期间，将NK细胞用含5％FBS的1640培养基调整为5×105细胞/mL，100μL/孔加入上述96孔板中，放于37℃，CO2培养箱，孵育3h。
将96孔板300g离心5min，转移上清再离心一次，转移100μL上清到另一96孔板。加入50μL/孔的LDH底物，孵育15min。在SpectraMaxM5酶标仪上，以450nm为检测波长，650nm为参比波长，进行读数，用GraphPad Prism6进行数据分析，作图。结果如图8B显示，NK细胞对BT474肿瘤细胞有明显杀伤作用，结果与HER2单抗相似。
实施例10.细胞水平上检测抗HER2/PD1双抗a的协同作用
细胞水平上检测抗HER2/PD1双抗两个靶点的协同作用，需要满足以下条件：肿瘤细胞上有HER2抗原表达，并且肿瘤细胞的增殖能被HER2抗体抑制；同时有PD-L1表达，可以与T细胞上的PD-1结合，因此加入PD1抗体后阻断PD-1/PD-L1结合，T细胞的抑制被解除，发挥杀伤肿瘤的作用。由于未筛选到满足这些条件的细胞株，因此采用慢病毒转染法，将PD-L1基因重组到人胃癌细胞株NCI-N87。构建的N87-PDL1细胞，FACS检测细胞表面高表达PD-L1。
取对数生长期的N87-PDL1细胞，胰酶消化后，用1640培养基加1％FBS稀释为1×105/mL，100μL/孔转移到白色透底96孔板。放于37℃，5％CO2培养箱过夜。次日加待检抗体和新鲜的PBMC细胞，各50μL/孔。抗体为抗HER2/PD1双抗a，抗HER2单抗，抗HER2单抗加抗PD1单抗，抗PD1单抗，浓度为4nM。PBMC用1640培养基加1％FBS稀释，为105/孔。放于37℃，5％CO2继续培养6天后，用PBS洗板三次，用培养基1∶1稀释CellTiter-Glo，100μL/孔加入96孔板。用spectramax i3读取luminescence。用GraphPad Prism进行数据分析作图，见图9A，9B。数据显示，抗HER2/PD1双抗a杀伤肿瘤的效果优于HER2单抗，并且优于抗HER2单抗加PD1单抗，说明双抗发挥了协同抗肿瘤的作用。
实施例11.抗HER2/PD1双抗a在NCI-N87移植瘤模型上的抗肿瘤作用
收集体外培养的人胃癌细胞株NCI-N87细胞，将细胞浓度调整为5×107细胞/mL，重悬于无血清培养基中，在无菌条件下，接种100μL细胞悬液于裸小鼠背部皮下。用游标卡尺测量移植瘤长与宽，计算肿瘤体积，待肿瘤生长至100-200mm3后将动物随机分组。
受试样品抗HER2/PD1双抗a的用药剂量分为两组，20mg/kg，4mg/kg，即0.4mg/只，0.08mg/只，阳性对照药HER2单抗单药的剂量为15mg/kg，即0.3mg/只。对照组给以相同体积的PBS。给药方式为腹腔给药，给药体积为0.2mL/鼠(20g)，每周两次给药，连续给药三周。
每周测量2次移植瘤体积，同时对小鼠称重，记录。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×长×宽2。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式为：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)；抑瘤率＝1-T/C(％)。疗效评价标准：T/C(％)＞40％为无效；T/C(％)≤40，并经统计学处理p≤0.05为有效。实验结果如图10所示，抗HER2/PD1双抗a与阳性对照HER2单抗近似。
实施例12.抗HER2/PD1双抗a在人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型上的抗肿瘤作用
受试样品抗HER2/PD1双抗a的剂量为13mg/kg，阳性对照抗PD1单抗的剂量设置为10mg/kg，对照组给以相同体积的生理盐水。收集体外培养的MC38小鼠结肠癌细胞，将细胞悬液浓度调整为1×107细胞/ml。在无菌条件下，接种100μl细胞悬液于人源化PD1小鼠右侧肋部皮下。人源化PD1小鼠皮下移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待平均肿瘤体积生长至100-200mm3后将动物随机分组。抗PD1单抗、抗HER2/PD1双抗a按剂量给药、对照组给等量生理盐水，每周腹腔注射给药2次，连续给药3周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称小鼠体重。肿瘤体积(tumorvolume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×长×宽2。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relativetumorvolume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。疗效评价标准：T/C(％)＞40％为无效；T/C(％)≤40，并经统计学处理p≤0.05为有效。实验重复两次。实验结果如图11所示。结果表明，在人源化PD1小鼠MC38移植瘤模型上，抗HER2/PD1双抗a可以通过阻断PD1抑制肿瘤生长，抑瘤效果与阳性对照PD1单抗近似。
实施例13.抗HER2/PD1双抗a和抗HER2/PD1双抗b的稳定性研究
本实验可用于评估与相互作用有关的热力学参数，如在辅料加入情况下蛋白质去折叠的情况等，从而揭示研发最优制剂所需的重要机理信息。
实验使用MicroCal VP-Capillary DSC，用0.22um滤膜将样品及其缓冲液过滤，分别取400μl样品及其匹配缓冲液置于96孔板中，样品在25℃-100℃条件下扫描，扫描速率为每小时120℃。
抗HER2/PD1双抗a，抗HER2/PD1双抗b保存在pH7.4的PBS中。DSC检测双抗的Tm值见表11。图谱见图12A，12B。由此可知，此双抗较稳定。后续的37℃长期稳定性实验结果也验证了这一点。HPLC-SEC结果见图12C，12D。
表11
样品号 Tm Onset Tm1 Tm2
抗HER2/PD1双抗a-CHO 50 58 83
抗HER2/PD1双抗a-293E 51 58 83
抗HER2/PD1双抗b-293E 53 62 81
由上述实验可知，本发明提供的双特异性抗体，结构稳定。能同时结合HER2和PD1抗原。阻断HER2信号通路，可抑制表达HER2抗原的肿瘤细胞增殖；同时能阻断PD-1/PD-L1通路，可恢复T细胞的免疫杀伤功能，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。同时，此双抗HER2抗体的Fc段可以与NK细胞的Fc受体结合，发挥ADCC效应，杀伤肿瘤细胞，而对T淋巴细胞并无明显杀伤作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 抗HER2/PD1双特异性抗体
<130> SH363-19P422635
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Composite
<400> 1
Ser Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Composite
<400> 2
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Composite
<400> 3
Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Composite
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe Leu His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Composite
<400> 5
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Composite
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> Composite
<400> 7
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> Composite
<400> 8
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Composite
<400> 9
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Composite
<400> 10
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> Composite
<400> 11
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Composite
<400> 12
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
1 5
<210> 13
<211> 117
<212> PRT
<213> Composite
<400> 13
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> Composite
<400> 14
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> Composite
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> Composite
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Composite
<400> 17
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> Composite
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 244
<212> PRT
<213> Composite
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp
145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
210 215 220
Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 20
<211> 709
<212> PRT
<213> Composite
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro
465 470 475 480
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn
485 490 495
Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
500 505 510
Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser
515 520 525
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
530 535 540
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro
545 550 555 560
His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
565 570 575
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
595 600 605
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
610 615 620
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
625 630 635 640
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
645 650 655
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
660 665 670
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
675 680 685
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
690 695 700
Val Thr Val Ser Ser
705
<210> 21
<211> 214
<212> PRT
<213> Composite
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 2127
<212> DNA
<213> Composite
<400> 22
gaggtccaac tggtggagtc cggaggagga ctggtgcaac ccggcggatc cctccggctg 60
tcttgtgctg ctagcggctt taacatcaag gatacctata tccattgggt taggcaagct 120
cccggtaagg gcttagaatg ggtcgctagg atctacccca ccaatggcta tactcgttac 180
gccgacagcg tgaagggtcg gttcaccatc tccgctgaca cctccaagaa cacagcttac 240
ctccaaatga actctttacg ggccgaggac acagccgtgt actactgttc ccggtgggga 300
ggcgacggct tctatgctat ggattactgg ggccaaggta ctttagtgac agtgtccagc 360
gccagcacaa aaggaccttc cgtcttccct ctggctccct cctccaagag caccagcggc 420
ggaacagctg ctctcggctg tctggtgaag gactacttcc ccgaacccgt taccgtgtct 480
tggaattccg gcgctttaac ctccggcgtg cacacctttc ccgctgtttt acagagcagc 540
ggcctctatt ctttaagctc cgtggtcaca gtgcctagca gctctttagg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaacca taagcccagc aataccaagg tcgacaagaa ggtggagccc 660
aagagctgcg ataagaccca cacatgtcct ccttgtcccg ctcccgaact gctgggagga 720
cccagcgtgt ttttattccc ccccaaaccc aaagacaccc tcatgatcag ccggaccccc 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtctcc cacgaagacc ccgaagtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gagtcgaggt gcataacgcc aagacaaaac cccgggagga gcaatacaac 900
tccacctatc gtgtggtgag cgtgctcacc gtgctgcatc aagattggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtcag caacaaggct ctgcccgctc ctatcgagaa gacaatcagc 1020
aaagccaaag gccaaccccg ggagccccaa gtgtatactt tacccccctc ccgggaagag 1080
atgaccaaga accaagtttc tttaacatgt ttagtgaaag gcttttaccc ctccgacatc 1140
gccgtcgagt gggagtccaa tggccagccc gaaaataact acaagacaac cccccccgtg 1200
ctcgattccg atggatcctt ctttttatac agcaagctca cagtggataa gtcccggtgg 1260
cagcaaggaa acgtgttttc ttgttccgtc atgcacgagg ccctccataa ccactacacc 1320
cagaaatccc tctctctcag ccccggtaaa ggcggaggag gatccggcgg cggcggaagc 1380
ggaggaggcg gctccgagat cgtgctgacc cagtcccccg ctacactgtc cctctctccc 1440
ggtgaacggg ctactttaag ctgtcgtgcc agccaaagca tcagcaactt tttacactgg 1500
taccaacaga aacccggcca agctccccgg ctgctgatca agtacgcttc ccagagcatc 1560
agcggcattc ccgctaggtt ctccggcagc ggcagcggaa ccgatttcac tttaaccatc 1620
agctctttag agcccgagga cttcgccgtc tacttctgcc aacagagcaa tagctggcct 1680
cacacattcg gccaaggtac aaaggtcgag atcaaaggtg gaggtggcag cggtggcggc 1740
ggcagcggtg gtggtggaag cggaggcgga ggctccgagg tgaagctcgt ggaatctggc 1800
ggaggtttag tgcagcccgg tggctcttta aggctgagct gtgctgccag cggctttgcc 1860
tttagctcct acgacatgag ctgggtgcgt caagctcccg gaaagaggct ggagtgggtg 1920
gccacaatct ccggcggtgg tcgttatacc tattaccccg acaccgtcaa aggccggttt 1980
accatcagcc gggacaacgc taagaacagc cattacctcc agatgaattc tttacgggct 2040
gaggacaccg ctgtgtattt ctgtgctagc ccctacggcg gctactttga tgtctgggga 2100
caaggtaccc tcgtgaccgt gagctcc 2127
<210> 23
<211> 642
<212> DNA
<213> Composite
<400> 23
gacatccaga tgacacagag cccctcctct ttatccgctt ccgtgggaga tcgtgtcacc 60
atcacttgtc gtgcctccca agatgtgaac accgctgtgg cttggtacca gcagaagccc 120
ggtaaggctc ccaagctgct gatctactcc gccagctttt tatactccgg cgtgccctct 180
cgtttctccg gatctcgttc cggcaccgac ttcactttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccctac cttcggacaa 300
ggtaccaagg tggagatcaa gaggaccgtg gccgccccct ccgtcttcat ctttccccct 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tccgtggtgt gtttactgaa taacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctt tacagtccgg caacagccaa 480
gaaagcgtga ccgaacaaga tagcaaggac tccacctact ctttatcctc cactttaact 540
ttaagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgctt gtgaggtgac ccatcaaggt 600
ttaagcagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgaat gc 642
<210> 24
<211> 244
<212> PRT
<213> Composite
<400> 24
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile
180 185 190
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys
<210> 25
<211> 709
<212> PRT
<213> Composite
<400> 25
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser His Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Tyr Gly Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile
180 185 190
Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
225 230 235 240
Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
260 265 270
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
275 280 285
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
290 295 300
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
305 310 315 320
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
325 330 335
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
340 345 350
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
355 360 365
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
370 375 380
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
385 390 395 400
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
405 410 415
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
420 425 430
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
435 440 445
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
450 455 460
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
465 470 475 480
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
485 490 495
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
500 505 510
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
515 520 525
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
530 535 540
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
545 550 555 560
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
565 570 575
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
580 585 590
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
595 600 605
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
610 615 620
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
625 630 635 640
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
645 650 655
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
660 665 670
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
675 680 685
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
690 695 700
Leu Ser Pro Gly Lys
705
<210> 26
<211> 2127
<212> DNA
<213> Composite
<400> 26
gaggtgaagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ctggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggctt cgccttctcc tcctacgaca tgtcctgggt gaggcaggcc 120
cctggcaaga ggctggagtg ggtggccacc atctccggcg gcggcaggta cacctactac 180
cctgacaccg tgaagggcag gttcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcccactac 240
ctgcagatga actccctgag ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc ctccccttac 300
ggcggctact tcgacgtgtg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc cggcggcggc 360
ggctccggcg gcggcggctc cggcggcggc ggctccggcg gcggcggctc cgagatcgtg 420
ctgacccagt cccctgccac cctgtccctg tcccctggcg agagggccac cctgtcctgc 480
agggcctccc agtccatctc caacttcctg cactggtacc agcagaagcc tggccaggcc 540
cctaggctgc tgatcaagta cgcctcccag tccatctccg gcatccctgc caggttctcc 600
ggctccggct ccggcaccga cttcaccctg accatctcct ccctggagcc tgaggacttc 660
gccgtgtact tctgccagca gtccaactcc tggcctcaca ccttcggcca gggcaccaag 720
gtggagatca agggcggcgg cggctccggc ggcggcggct ccggcggcgg cggctccgag 780
gtccaactgg tggagtccgg aggaggactg gtgcaacccg gcggatccct ccggctgtct 840
tgtgctgcta gcggctttaa catcaaggat acctatatcc attgggttag gcaagctccc 900
ggtaagggct tagaatgggt cgctaggatc taccccacca atggctatac tcgttacgcc 960
gacagcgtga agggtcggtt caccatctcc gctgacacct ccaagaacac agcttacctc 1020
caaatgaact ctttacgggc cgaggacaca gccgtgtact actgttcccg gtggggaggc 1080
gacggcttct atgctatgga ttactggggc caaggtactt tagtgacagt gtccagcgcc 1140
agcacaaaag gaccttccgt cttccctctg gctccctcct ccaagagcac cagcggcgga 1200
acagctgctc tcggctgtct ggtgaaggac tacttccccg aacccgttac cgtgtcttgg 1260
aattccggcg ctttaacctc cggcgtgcac acctttcccg ctgttttaca gagcagcggc 1320
ctctattctt taagctccgt ggtcacagtg ccttcctcct ccctgggcac ccagacctac 1380
atctgcaacg tgaaccacaa gccttccaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcctaag 1440
tcctgcgaca agacccacac ctgccctcct tgccctgccc ctgagctgct gggcggccct 1500
tccgtgttcc tgttccctcc taagcctaag gacaccctga tgatctccag gacccctgag 1560
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aggtgaagtt caactggtac 1620
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccta gggaggagca gtacaactcc 1680
acctacaggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1740
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccta tcgagaagac catctccaag 1800
gccaagggcc agcctaggga gcctcaggtg tacaccctgc ctccttccag ggaggagatg 1860
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaagggct tctacccttc cgacatcgcc 1920
gtggagtggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc tcctgtgctg 1980
gactccgacg gctccttctt cctgtactcc aagctgaccg tggacaagtc caggtggcag 2040
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 2100
aagtccctgt ccctgtcccc tggcaag 2127

Claims (22)

1.一种能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体，其特征在于，其包含免疫球蛋白抗体IgG和两个相同的单链可变片段scFv，其中每个单链可变片段scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过肽接头L1连接，每个单链可变片段scFv通过肽接头L2与所述免疫球蛋白抗体IgG串联；
其中，所述VH包含互补决定区HCDR1-3，其中HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述VL包含互补决定区LCDR1-3，其中LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
所述免疫球蛋白抗体IgG的重链包含互补决定区HCDR4-6，其中HCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，HCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，HCDR6的氨基酸序列如SEQ IDNO：9所示；
所述免疫球蛋白抗体IgG的轻链包含互补决定区LCDR4-6，其中LCDR4的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，LCDR5的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，LCDR6的氨基酸序列如SEQID NO：12所示。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述VH的氨基酸序列如SEQ IDNO：13所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示；
所述免疫球蛋白抗体IgG包含重链可变区和轻链可变区，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述肽接头L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的分子结构形式为VL-L1-VH，每个scFv的N末端经由肽接头L2连接至所述免疫球蛋白抗体IgG重链的C末端。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
8.一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码如权利要求1-7任一项所述的双特异性抗体。
9.如权利要求8所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO： 22所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
10.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的分子结构形式为VH-L1-VL，每个scFv的C末端经由肽接头L2连接至所述免疫球蛋白抗体IgG重链的N末端。
11.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
12.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示，其轻链氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码如权利要求10-12任一项所述的双特异性抗体。
14.如权利要求13所述的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子编码能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO： 26所示，编码其轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示。
15.一种表达载体，所述表达载体含有权利要求8、9、13或14任一项所述的核苷酸分子。
16.根据权利要求15所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR和pTT5。
17.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求15或16任一项所述的表达载体。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自CHO细胞和293E细胞。
19.一种制备如权利要求1-7、10-12任一项所述的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如权利要求17-18任一项所述的宿主细胞，从而表达能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体；
b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。
20.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-7、10-12任一项所述的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
21.权利要求5-7任一项所述的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体在制备药物中的应用，其特征在于所述药物用于治疗癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤选自乳腺癌、胃癌、结肠癌。
22.权利要求10-12任一项所述的能与HER2和PD1特异结合的双特异性抗体在制备药物中的应用，其特征在于所述药物用于治疗癌症或肿瘤，所述癌症或肿瘤选自乳腺癌。
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