CN113214360B - 一种rhamm拮抗多肽及其衍生物与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RHAMM拮抗多肽及其衍生物与应用，具体公开了RHAMM拮抗多肽：所述RHAMM拮抗多肽HL12‑RP1的氨基酸残基序列为：Leu‑Ile‑Leu‑Arg‑Cys‑Arg‑Arg‑Ser‑Phe‑Ile‑Gly‑Tyr SEQ ID NO.1。还公开了RHAMM拮抗多肽及其衍生物在抗肿瘤中的应用。本发明提供了一种RHAMM拮抗多肽HL12‑RP1及其衍生物，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与RHAMM结合，并特异性与RHAMM结合抑制RHAMM信号通路；通过阻断RHAMM的信号通路抑制结直肠癌细胞增殖，进而促进结直肠癌细胞发生凋亡。

Description

一种RHAMM拮抗多肽及其衍生物与应用

技术领域

本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，本发明是结直肠癌靶点RHAMM受体拮抗多肽HL12-RP1及其衍生物与应用。

背景技术

1.1结直肠癌

结直肠癌(CRC)是世界上常见的恶性肿瘤之一。世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)报告指出，结直肠癌发病率位于肺癌、乳腺癌之后居恶性肿瘤第3位，死亡率位于肺癌、肝癌和胃癌之后，居恶性肿瘤第4位。结直肠癌发病地域分布在世界范围内有显著差异性，欧美区域发病率较亚洲地区更高。中国的CRC发生率为29人/10万人，死亡率为14人/10万人。但随着物质生活水平的不断提高，生活方式的改变，特别是饮食习惯的改变，我国结直肠癌的发病率呈现逐渐上升的趋势。相比之下，欧美国家因较早的开展结直肠癌筛查，近20年来结直肠癌的发病率和病死率却明显下降。与欧美国家人相比较，中国人结直肠癌呈现“三高一低”的特点：1、结肠癌的发病率稍低于直肠癌，但近几年结肠癌发病率呈上升趋势；2、低位直肠癌所占比例较高；3、青年人比例很高约占10％-15％；4、早期筛查就诊率低。

目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，逐渐的认识到结直肠癌的发生、发展是多基因共同作用、多个信号通路参与而引起的“炎症-增生-癌变”的演变过程。国内外研究发现，K-ras的基因突变、DNA分子的甲基化及胰岛素样生长因子是促进CRC发生发展的重要原因。随着对CRC病因的不断研究，与其发病的相关高危因素逐渐被认识，如长期高脂摄入、亚硝酸盐化合物食物摄入、维生素缺乏、长期酗酒等饮食因素；溃疡性结肠炎、结肠腺瘤、家族性腺瘤性息肉病(FAP)等被认为是癌前性病变的疾病；年龄增大(＞60岁)及家族遗传等因素都是CRC的高危因素。

目前结直肠癌患者的治疗手段主要是外科手术治疗，化学药物治疗，放射线放射治疗。其中外科手术目前是结直肠癌治疗最重要、最有效的手段，放疗与化疗已成为结直肠癌辅助治疗的重要组成部分。与此同时，靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对CRC患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。

1.2促癌因子RHAMM与肿瘤

透明质酸介导的运动受体(Receptor for hyaluronan mediated motility，RHAMM)也叫CD168，最初被发现是迁移的细胞分泌的一种可溶性的蛋白质，能够通过和透明质酸(hyaluronan，HA)相互作用促进细胞运动和浸润。RHAMM是一种酸性的卷曲螺旋蛋白质，在脊椎动物中最先被发现，而在低等生物和昆虫中不表达。RHAMM没有跨膜结构域，也没有信号肽序列。在通常情况下，RHAMM主要定位于细胞内，但是在某些刺激下，能够分泌到细胞外。RHAMM全长大小约85kDa，由N端高碱性HEAD区域，C端TAIL区域和之间的长约600多个氨基酸的a-螺旋区域组成。细胞表面的RHAMM是作为跨膜膜蛋白的共同受体与HA相互作用，从而激活细胞内的信号级联系统，并参与正常细胞及肿瘤细胞的胞间黏附及细胞迁移。RHAMM被鉴定为一种新的微管结合蛋白(microtublin associated protein,MAP)，它N端的1-69氨基酸的碱性序列和外显子4编码的氨基酸序列是与微管的结合位点。如果同时敲除RHAMM的N端头部结构域和与之相邻的外显子4编码的序列，则会完全破坏其与微管之间的相互作用。胞内RHAM的表达受到细胞周期的调控，其表达曲线与Cyclin B十分类似。RHAMM在G2/M期和有丝分裂前期表达量较高，并随细胞周期呈周期性变化。

近年来,恶性肿瘤侵袭转移分子机制已成为研究热点。由细胞表面黏附分子所介导的细胞-细胞或细胞-细胞外基质的相互作用,是癌细胞侵袭进而实现转移的生物学基础。细胞外基质是HA的重要组成部分,通过与细胞表面相应受体的结合促进正常细胞的游走和肿瘤细胞的侵袭,因而在众多影响癌细胞侵袭和转移的因素中,细胞外基质中的HA与癌细胞表面相应受体的相互作用备受关注。虽然RHAMM的mRNA在大多数稳态组织中很难检测到，但是在多种肿瘤中，RHAMM通常持续高表达。在一些恶性肿瘤包括白血病、乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌和卵巢癌中，细胞表面的RHAMM已经作为一种肿瘤抗原来检测。在脑部肿瘤、胃癌、结肠直肠癌、多发性骨髓瘤、口腔鳞状细胞癌、子宫内膜瘤和膀胱癌中，细胞内的RHAMM的表达水平也比正常组织提高。RHAMM通常在肿瘤晚期高度表达，其表达水平和肿瘤分期以及和某些肿瘤的不良预后呈正相关。RHAMM最初被发现是作为一种分泌的HA结合蛋白，分泌到细胞外的RHAMM能够活化细胞表面跨膜粘附分子和HA受体CD44的促细胞迁移和浸润功能。这种RHAMM调节的活化过程导致细胞表面CD44表达的上升以及CD44介导的ERK1/2的激活。在乳腺癌肿瘤发生上，细胞外HA结合介导的CD44-RHAMM的活化赋予肿瘤恶性的潜能。RHAMM-CD44和RAS/ERK1/2信号通路之间强有力的联系表明这些HA受体复合物能控制在许多肿瘤中过度活化的信号通路。细胞表面的RHAMM能够与CD44形成复合物在浸润性乳腺癌细胞系的上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中发挥运动受体的功能。另外细胞表面的RHAMM也能和RON(一种c-Met家族的酪氨酸受体激酶)相互作用。因此，细胞外的RHAMM与细胞表面一种或多种粘附/生长因子受体作用来活化关键信号通路，促进肿瘤转移。

1.3噬菌体展示技术

噬菌体展示技术(phage display techniques,PDT)是1985年由Smith等人提出的；1988年，噬菌体展示肽库首次构建成功；从1990年至今，噬菌体展示肽库得到快速发展和应用。噬菌体展示技术的原理是将外DNA通过基因工程技术克隆到适当的噬菌体载体上,使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性。然后利用靶分子，采用适当的淘洗方法洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来。该技术的显著特点是建立了基因型和表现型之间的对应关系。噬菌体展示技术适合用于全人源抗体药物的制备。治疗类风湿关节炎的抗肿瘤坏死因子α的Humira是第一个应用噬菌体抗体库技术生产的并被美国食品药品管理局批准的全人源抗体药物。到2014为止，被美国食品药品管理局批准的应用噬菌体抗体库技术生产的抗体有6个，且同时有30种以上的相关药物处于临床试验阶段。除筛选制备型抗体外，噬菌体抗体库技术也能被用于筛选相应抗原。因此，噬菌体展示技术抗体库因其具有的高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域正越来越受到的重视，可以作为筛选肿瘤表面抗原的靶向抗体工具。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种由噬菌体展示库筛选得到的RHAMM拮抗多肽，该拮抗多肽与受体RHAMM具有特异性高亲和力，能够通过与RHAMM的结合来阻断RHAMM的信号通路，证明该多肽在靶向抑制结直肠癌细胞增殖、促进结直肠癌细胞凋亡等方面起着重要的作用，其在结直肠癌靶向治疗方面具有巨大的应用价值。

本发明的另一目的在于提供上述RHAMM受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与RHAMM受体具有特异性高亲和力，且特异性与RHAMM结合。

本发明的再一目的在于提供上述RHAMM拮抗多肽及其衍生物的应用。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

本发明一个方面，提供了RHAMM的特异性拮抗多肽，利用噬菌体展示随机肽库筛选得到1条多肽片段，其氨基酸序列HL12-RP1为:Leu-Ile-Leu-Arg-Cys-Arg-Arg-Ser-Phe-Ile-Gly-Tyr SEQ ID NO.1(简写为：LILRCRRSFIGY)。

上述RHAMM拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用RHAMM质粒转染293T细胞，获得永久高表达RHAMM的稳定细胞系，以野生型293T细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取50个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链DNA测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。

亲水性分析表明，HL12-RP1为弱疏水性多肽；

本发明另一个方面提供了RHAMM拮抗多肽的衍生物，所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物为如前所述的拮抗多肽氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者RHAMM拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；

所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰；

所述的标签为His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。

所述的RHAMM拮抗多肽及其衍生物可以来源于哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物(人类)；啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠，兔，马，牛，犬类，猫等。

所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物优选为：上述RHAMM拮抗多肽末端进行酰胺化修饰。

所述的RHAMM拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。

本发明再一个方面提供了一种多聚核苷酸，其如前所述的RHAMM拮抗多肽或其衍生物。

本发明再一个方面提供了一种载体，其包含了如前所述的多聚核苷酸。

本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，其转染了如前所述的载体。

本发明再一个方面提供了一种药物，所述药物包含如前所述的RHAMM拮抗多肽或如前所述的衍生物。

所述的药物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；

所述的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；

所述的药物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

优选地，所述药学上可以接受的载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂中包含如前所述的RHAMM拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

本发明再一个方面提供了一种RHAMM拮抗多肽或RHAMM拮抗多肽的衍生物的抗体，所述RHAMM拮抗多肽如前所示的RHAMM拮抗多肽，所述RHAMM拮抗多肽的衍生物如权利要求2所述的衍生物。

本发明再一个方面提供了如前所述的RHAMM拮抗多肽、如前所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达RHAMM的肿瘤细胞增殖、促进高表达RHAMM的肿瘤细胞凋亡、抑制细胞迁移或抑制肿瘤血管生成的药物中的用途；

优选地，高表达RHAMM的肿瘤细胞选自直肠癌细胞、结肠癌细胞、脑胶质瘤细胞、胃癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、口腔鳞状细胞癌细胞、子宫内膜瘤细胞和膀胱癌细胞。

本发明再一个方面提供了如前所述的RHAMM拮抗多肽、如前所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达RHAMM的肿瘤疾病的药物中的用途；

优选地，高表达RHAMM的肿瘤疾病选自直肠癌、结肠癌、脑胶质瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、口腔鳞状细胞癌、子宫内膜瘤和膀胱癌。

在本发明的具体实验中，利用RHAMM拮抗多肽HL12-RP1可以特异性的与高表达RHAMM的细胞293T RHAMM^+/+结合。

在进一步试验中，利用高表达RHAMM的结直肠癌细胞HCT-116作为细胞模型验证了RHAMM拮抗多肽HL12-RP1的功能，与对照组相比，发现HL12-RP1可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的增殖。

在本发明的另一具体实验中，采用流式细胞技术检测发现RHAMM拮抗多肽HL12-RP1促进HCT-116发生凋亡。

同时在Western Blotting实验中检测发现，RHAMM拮抗多肽HL12-RP1是通过促进Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达来激活了Caspase-3介导的凋亡通路。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:

(1)本发明提供了一种RHAMM拮抗多肽HL12-RP1及其衍生物，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与RHAMM结合，并特异性与RHAMM结合抑制RHAMM信号通路。

(2)本发明筛选得到的RHAMM拮抗多肽及其衍生物可以通过阻断RHAMM的信号通路抑制结直肠癌细胞增殖，促进结直肠癌细胞发生凋亡，可以作为RHAMM结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和/或治疗结直肠癌药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1示出了Western blotting检测结直肠癌细胞中的RHAMM表达水平。A：Westernblotting蛋白印迹；B：蛋白表达量统计。

图2示出了HPLC检测RHAMM拮抗多肽的纯度。

图3示出了MS质谱鉴定RHAMM拮抗多肽的大小。

图4示出了MTT法检测RHAMM拮抗多肽对于结直肠癌细胞HCT-116增殖能力的影响。

图5示出了细胞流式技术法检测RHAMM拮抗多肽促进结直肠癌细胞HCT-116发生凋亡的情况。A：流式细胞仪检测细胞凋亡；B：Western Blotting检测HL12-RP1作用后凋亡相关信号蛋白变化；C：细胞凋亡数据统计；D，E，F分别是Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达水平统计。

图6示出了划痕实验检测RHAMM拮抗多肽抑制结直肠癌细胞HCT-116迁移的情况。A：Transwell实验检测细胞迁移能力；B：迁移细胞数量统计。

图7示出了克隆形成实验检测RHAMM拮抗多肽抑制结直肠癌细胞HCT-116体外克隆形成实验。A：克隆实验检测细胞克隆形成能力；B：克隆数量统计。

图8示出了HUVEC血管形成实验检测RHAMM拮抗多肽抑制HUVEC血管形成能力。A：HUVEC血管形成实验检测血管形成能力；B：是给药后HUVEC形成血管的平均长度；C，是给药后HUVEC形成血管的面积比；D，是给药后HUVEC形成血管的分支密度。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1：进行RHAMM拮抗多肽HL12-RP1的淘选、扩增、纯化、测序及合成。

本实施例主要是为了筛选获得与RHAMM特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链DNA(ssDNA)进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽HL12-RP1。

具体如下：

实施例1 Western blotting检测不同癌细胞中RHAMM蛋白的表达水平

取293T，结直肠癌细胞Caco2，HCT-116和LOVO细胞。加入预冷的PBS洗涤三次，再加入细胞裂解液(RIPA:PMSF＝100:1)，4℃孵育40min，然后收集蛋白置于4℃冷冻离心机离心5min(12000g/min)，加入5×Buffer，制成蛋白样品。在将蛋白样品进行电泳，转膜，得到含有蛋白的PVDF膜用含质量分数为5％的脱脂奶粉的TBST室温封闭1h，然后用含质量分数为5％BSA的TBST稀释RHAMM抗体(ABclonal，A12445)和β-actin抗体(ABclonal，AC026)，加入上述一抗后，4℃孵育过夜。次日，加入羊抗兔的二抗(1:2000)后，用ECL试剂盒显色，用Quantity-One软件分析实验结果。

结果如图1所示，可以看出RHAMM受体在293T中低表达，而在结直肠癌细胞Caco2，HCT-116和LOVO中高表达。

实施例2 RHAMM拮抗多肽的筛选、合成和鉴定

1、RHAMM拮抗多肽的筛选

(1)建立永久高表达RHAM的293T细胞系：293T-RHAMM^+/+:

①选取生长旺盛的可发光的人293T细胞，在转染前一天以5×10⁵个/孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；

②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；

③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μL的opti-MEM培养基；

④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；

⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；

⑥48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达RHAMM的293T细胞系。

⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μg RNA进行逆转录(逆转录试剂盒，购于Promega公司)，并用特异引物序列进行qPCR。

所用特异引物序列为Hu-RHAMM引物序列：

Fw 5′-AGAACCAACTCAAGCAACAGG-3′SEQ ID NO.2

Rv 5′-AGGAGACGCCACTTGTTAATTTC-3′SEQ ID NO.3

⑧与转染了pSM2c-Hu-scramble RNA的做比较，检测RHAMM的高表达水平，并命名为：293T-RHAMM^+/+，即可以用于阳性噬菌体筛选。

(2)进行RHAMM拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成

①ER2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μL LB-Tet液体培养基于1.5mL灭菌离心管中，再从E.coli ER2738的甘油冻存物中取0.2μL菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于LB-Tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3mL LB-Tet液体培养基的10mL灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10mL灭菌离心管，无菌操作加入3mL LB-Tet液体培养基，取30μL过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpm/min振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状(OD₆₀₀～0.5)。

②RHAMM拮抗肽的淘选：将高表达RHAMM细胞按10⁵个/培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60×15mm²培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗(同时用不表达RHAMM的细胞系作为空白对照)每轮洗脱液先取1μL测滴度，剩下的将其加入到20mL LB培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于-20℃保存。

③测定噬菌体的滴度:取4支灭菌的10mL离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂(Agarose Top)，每管加入3mL顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块LB/IPTG/Xgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将OD₆₀₀～0.5的E.coli ER2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μL/管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5mL离心管，分别盛有100μL、90μL、90μL、90μL LB-Tet培养基，将待测噬菌体吸取1μL入100μL LB-Tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μL待滴定的各稀释度的噬菌体与200μL E.coli ER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LB/IPTG/Xgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。

④洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250mL的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至20mL LB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50mL离心管中，4℃ 10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃ 10,000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入1/4体积的PEG/NaCl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃,12,000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1mL TBS重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2mL离心管中，4℃10,000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入1/4体积的PEG/NaCl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃ 12,000rpm离心20min，去掉上清；用200μL TBS重悬沉淀，4℃ 10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括⑴按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至2mL LB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃ 250r/min剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10,000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。

⑤琼脂糖凝胶电泳鉴定M13噬菌体ssDNA：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取DNA电泳用琼脂糖1g放入250mL的三角烧瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温(手握烧瓶可以耐受)，再加入溴化乙锭5μL，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100mL；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用Loading buffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。

⑥ssDNA测序及序列分析：将提取的M13噬菌体ssDNA送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行DNA测序。测序以后用Bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为Leu-Ile-Leu-Arg-Cys-Arg-Arg-Ser-Phe-Ile-Gly-Tyr SEQ ID NO.1(简写为：LILRCRRSFIGY)，以HL12-RP1表示，最后短肽由强耀生物科技有限公司合成。

(3)RHAMM拮抗多肽的合成和鉴定

采用CS936多肽合成仪(美国CSBio公司)，Fmoc固相合成法合成(由上海强耀生物公司合成)，合成过程包括下述步骤：

(1)去保护：用哌啶(piperidine，上海紫一试剂厂)溶液去除氨基的保护基团；

(2)激活与交联：下一个氨基酸的羧基被激活剂HBTU(HCTU/HITU)+NMM所激活溶解，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键；

(3)循环：(1)、(2)两步反应反复循环直到整条肽链合成完毕；

(4)洗脱和脱保护：根据肽链所含的残基不同，用不同的脱树脂溶剂从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护；

(5)合成好的短肽经过Varian Prostar210纯化柱(美国VARIAN公司)纯化，纯化的过程中采用UV-Vis-detector:Varian Prostar345(美国VARIAN公司)检测；

(6)采用System Gold HPLC(美国贝克曼公司)验证纯度达到99％以上；

(7)采用Thermo Finnigan LCQ deca XP plus(美国Thermo公司)检测合成短肽的分子量。

图2为HPLC检测合成的RHAMM拮抗多肽的纯度，结果表明，合成的RHAMM拮抗多肽的纯度高达98.22％。

图3为MS质谱鉴定RHAMM拮抗多肽的大小，结果表明，合成的RHAMM拮抗多肽的大小为1496.84Da

实施例3 HL12-RP1可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的增殖

①将结直肠癌细胞HCT-116以5ⅹ10³个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(100μM，10μM，1μM，0.1μM，0.01μM，0.001μM)的HL12-RP1多肽分别培养24小时、48小时、72小时；

③每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

图4显示，不同浓度的HL12-RP1短肽可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖，并且随着作用时间的增加，短肽抑制结直肠癌细胞HCT-116细胞增殖的作用也更为显著。

实施例4 HL12-RP1可以促进结直肠癌细胞HCT-116的凋亡

①将结直肠癌细胞HCT-116以5ⅹ10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的HL12-RP1多肽分别培养24小时、48小时、72小时；

③先将上清收集到离心管中，再用不含EDTA的胰酶小心消化收集细胞培养液到离心管。500g左右离心5分钟，沉淀细胞；

④用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；

⑤加入100μL预冷的1ⅹAnnexinV Binding Buffer，重悬细胞；

⑥加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，轻轻混匀，室温避光反应15分钟；

⑦加入400μL预冷的1ⅹAnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。

图5显示，通过流式细胞仪分析发现，随着作用浓度的升高，HL12-RP1短肽可以明显促进结直肠癌细胞HCT-116发生凋亡。^**P<0.01与对照组相比较。RHAMM拮抗多肽HL12-RP1是通过促进Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达来激活Caspase-3介导的凋亡通路促进结直肠癌细胞发生凋亡。

实施例4 HL12-RP1可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的迁移

①Transwell上室种2ⅹ10⁵个细胞，加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的HL12-RP1多肽培养24小时；

②下室加入800ul含有10％FBS的培养基；

③用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

④用PBS洗3次，0.5％的结晶紫染色1h；

⑤用棉签小心刮掉上层细胞，显微镜下拍照

图6显示，通过细胞划痕实验发现，随着作用浓度的升高，HL12-RP1短肽可以明显抑制结直肠癌细胞HCT-116迁移。^**P<0.01与对照组相比较。

实施例5 HL12-RP1可以显著抑制结直肠癌细胞HCT-116的体外克隆形成能力

①将结直肠癌细胞HCT-116以1000个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，培养24h，然后饥饿过夜；

②加入不同浓度梯度(12.5μM，25μM，50μM)的HL12-RP1多肽培养10天；

③PBS洗3次，4％多聚甲醛固定30min；

④用PBS洗3次，加入0.5％的结晶紫染色1h；

⑤用PBS洗3次，显微镜拍照。

图7显示，通过克隆实验发现，随着作用浓度的升高，HL12-RP1短肽可以明显抑制结直肠癌细胞HCT-116克隆形成。^**P<0.01与对照组相比较。

实施例6 HL12-RP1可以显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管形成能力

①先用Matrigel铺板24孔板过夜；

②将HUVEC细胞以5ⅹ10⁴个/孔接种于24孔细胞培养板中，加入不同浓度梯度(25μM，50μM)的HL12-RP1多肽培养6h；

③用PBS洗3次，显微镜拍照。

图8示出了HUVEC血管形成结果，实验结果显示RHAMM拮抗多肽具有抑制HUVEC血管形成能力。A：HUVEC血管形成实验检测血管形成能力；B：是给药后HUVEC形成血管的平均长度；C，是给药后HUVEC形成血管的面积比；D，是给药后HUVEC形成血管的分支密度。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 一种RHAMM拮抗多肽及其衍生物与应用

<130> CP121010387

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ile Leu Arg Cys Arg Arg Ser Phe Ile Gly Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agaaccaact caagcaacag g 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aggagacgcc acttgttaat ttc 23

Claims (13)

1.一种RHAMM拮抗多肽，其特征在于，所述RHAMM拮抗多肽HL12-RP1的氨基酸残基序列为：

Leu-Ile-Leu-Arg-Cys-Arg-Arg-Ser-Phe-Ile-Gly-Tyr SEQ ID NO.1。

2.一种权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物，其特征在于：

所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物为权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽氨基酸侧链基团上、权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；

所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰；

所述的标签为His₆、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。

3.一种多聚核苷酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

4.一种载体，其特征在于，其包含了权利要求3所述的多聚核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，其转染了权利要求4所述的载体。

6.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

7.权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物含有一种或者是多种药学上可以接受的载体。

8.权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药学上可以接受的载体为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

9.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂中包含权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽或权利要求2所述的衍生物。

10.权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽、权利要求2所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物在制备抑制高表达RHAMM的肿瘤细胞增殖、促进高表达RHAMM的肿瘤细胞凋亡、抑制高表达RHAMM的肿瘤细胞迁移或抑制血管形成的药物中的用途。

11.权利要求10所述的用途，所述高表达RHAMM的肿瘤细胞选自直肠癌细胞、结肠癌细胞、脑胶质瘤细胞、胃癌细胞、多发性骨髓瘤细胞、口腔鳞状细胞癌细胞、子宫内膜瘤细胞和膀胱癌细胞。

12.权利要求1所述的RHAMM拮抗多肽、权利要求2所述的RHAMM拮抗多肽的衍生物在制备治疗高表达RHAMM的肿瘤疾病的药物中的用途。

13.权利要求12所述的用途，所述高表达RHAMM的肿瘤疾病选自直肠癌、结肠癌、脑胶质瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、口腔鳞状细胞癌、子宫内膜瘤和膀胱癌。

Images