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CN113195721A - 治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法 - Google Patents

治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法 Download PDF

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CN113195721A CN201980082770.6A CN201980082770A CN113195721A CN 113195721 A CN113195721 A CN 113195721A CN 201980082770 A CN201980082770 A CN 201980082770A CN 113195721 A CN113195721 A CN 113195721A
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Abstract

提供在宿主细胞中表达α1抗胰蛋白酶(AAT)的组合物和方法。还提供用于治疗患有α1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的受试者的组合物和方法。

Description

治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法
本申请案要求2018年10月18日提交的美国临时申请号62/747,522的优先权益。前述申请的说明书全文以引用方式并入本文。
α-1抗胰蛋白酶(AAT或A1AT)或血清胰蛋白酶抑制剂是由SERPINA1基因编码的一类丝氨酸蛋白酶抑制剂(也被称为丝氨酸蛋白酶抑制因子)。AAT主要由肝细胞合成和分泌，并且用来抑制肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性。在没有足够数量的运作AAT的情况下，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶不受控制并且破坏肺部中的肺泡。因此，SERPINA1中的导致AAT水平减少、或正确地运作AAT的水平减少的突变导致肺部病状。此外，SERPINA1中的导致产生错误形成的AAT的突变由于AAT在肝细胞中的积累而导致肝脏病变。因此，由SERPINA1突变导致的不充足和不正确地形成的AAT可导致肺部和肝脏病变。
已描述SERPINA1基因的一百种以上等位基因变体。变体总体上根据其对于血清AAT水平的效应来分类。举例来说，M等位基因是与正常血清AAT水平相关联的正常变体，而Z和S等位基因是与AAT水平减少相关联的突变型变体。Z和S等位基因的存在与α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD或A1AD)相关联，所述缺乏症是由SERPINA1基因中的导致产生异常AAT的突变来表征的遗传病症。
存在许多形式和程度的AATD。“Z-变体”是最常见的AATD，其导致肝脏和肺部中的严重临床疾病。Z-变体的特征在于第5个外显子的5'末端中的单一核苷酸变化，结果在氨基酸位置342处的谷氨酸至赖氨酸的错义突变(E342K)。在Z等位基因处纯合(ZZ)和杂合(MZ或SZ)的患者中出现症状。存在一个或两个Z等位基因导致SERPINA1mRNA不稳定性，以及AAT蛋白质聚合和在肝脏细胞中的聚集。具有至少一种Z等位基因的患者由于聚集AAT蛋白在肝脏中的积累而具有增加的肝癌发病率。除了肝脏病变以外，由至少一种Z等位基因来表征的AATD还由肺病来表征，这是由于肺泡中的AAT减少和所导致的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制的减少。在北欧人群中，严重ZZ形式(即，Z变体的纯合表达)的发病率是1:2,000，并且在美国的发病率是1:4,500。另一种常见突变是S变体，其导致蛋白在分泌之前在细胞内被降级。与Z变体相比，S变体导致血清AAT的较轻微减少和肺病的较低风险。存在改善肝脏和肺部中的AATD的不利影响的需要。
本公开提供在人类基因组基因座，诸如白蛋白安全港位点处表达异源AAT，从而允许分泌异源AAT和减轻肺部中的AATD的不利影响的组合物和方法。本公开还提供剔除内源性SERPINA1基因，从而消除患有AATD的患者中的与肝脏症状相关联的突变型AAT的产生的组合物和方法。本发明将剔除内源性SERPINA1等位基因与在安全港位点处插入异源AAT结合，以便恢复细胞或生物体中的AAT功能。
具体地说，本文提供用于将编码AAT的核酸序列靶向插入人类安全港位点，诸如白蛋白安全港位点的内含子1中的指导RNA。还提供了包含编码AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)，其用于靶向插入人类安全港位点，诸如白蛋白安全港位点的内含子1。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA可与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和包含编码AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)组合使用。在一些实施方案中，供体构建体(例如，双向构建体)可与任何一个或多个基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统)一起使用。提供以下实施方案。
在一些实施方案中，本公开提供将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群中的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群中。在一些实施方案中，本公开提供在有需要的受试者中表达AAT的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而在有需要的受试者中表达AAT。
在一些实施方案中，本公开提供治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而治疗受试者的AATD。
在一些实施方案中，本公开提供增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌的方法，包括施用：i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；ii)RNA指导的DNA结合剂；和iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，从而增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌。
附图说明
图1A-1C示出跨原代小鼠肝细胞中的靶位点来体外筛选双向构建体的结果。图1A表示所测试载体的示意图。图1B示出使用所测试的各种gRNA的不同水平的编辑(指导编号在x轴上指示)。图1C示出高水平编辑不一定导致转基因的更有效表达。
图2A至图2C示出了跨原代食蟹猴肝细胞中的靶位点活体外筛选双向构建体的结果。图2A示出对于所测试的每种组合，检测到不同水平的编辑。图2B和图2C示出了显著水平的编辑(如在特定靶位点的插入缺失形成)不一定导致转基因的更有效插入或表达。
图3A至图3C示出了跨原代人肝细胞中的靶位点活体外筛选双向构建体的结果。图3A示出对于所测试的每种组合，检测到不同水平的编辑。图3B和图3C示出了显著水平的编辑(如在特定靶位点的插入缺失形成)不一定导致转基因的更有效插入或表达。
图4A-4C示出hSERPINA1插入mA1bumin基因座中的体内研究的结果。图4A示出使用所测试gRNA(在x轴上指示)的编辑结果。图4B示出给药后1、2、和4周的血清hA1AT水平。图4C示出体外实验的给定指导以RLU为单位测得的表达水平与体内hA1AT转基因表达水平之间的正相关。
图5A-5D示出hSERPINA1 PiZ转基因的体内敲低和hSERPINA1插入mA1bumin基因座的结果。图5A概述用于每个测试组的编辑条件。图5B示出在第1阶段中靶向的hSERPINA1PiZ变体中的插入缺失形成。图5C示出在第2阶段中靶向的白蛋白基因座中的插入缺失形成。图5D示出如ELISA测量的各个时间点的血清中的hA1AT蛋白水平，以及如在人类血浆中测量的hA1AT水平。
图6示出来自基于荧光素酶的荧光检测测定的相对荧光素酶单位。
图7示出使用原代小鼠肝细胞中的各种sgRNA，跨靶位点在体外筛选双向构建体的结果。图7示出使用各种sgRNA检测到不同表达水平。
图8示出跨原代大鼠肝细胞中的靶位点，体外筛选双向构建体的结果。图8示出使用某些指导RNA的插入(相对荧光素酶单位)。
图9示出使用不同浓度的指导RNA的插入。
图10示出使用不同AAV构建体的AAT水平。
图11示出如ELISA测量的各个时间点的AAT水平。
图12示出白蛋白基因座中的插入缺失形成。
图13A示出如ELISA测量的各个时间点的AAT水平。图13B示出如LC-MS/MS测量的各个时间点的AAT水平。
图14A和图14B示出在各种浓度的LNP或AAV下的AAT的表达水平。图14C和图14D示出使用各种浓度LNP和AAV的插入缺失形成。
图15示出两个双向AAT AAV构建体的示意图。
具体实施方式
现在将详细参考本发明的某些实施方案，附图中示出了所述实施方案的实例。虽然本发明教导结合各种实施方案进行描述，但是并不意味着将本发明限于此类实施方案。相反，如本领域技术人员将理解，本发明教导涵盖各种替代、修改和等效物。
在详细描述本教导之前，应当理解，本公开不限于特定的组合物或处理步骤，因为它们可变化。应当指出的是，如本说明书和所附实施方案中所用，除非上下文另有规定，否则单数形式“一种/个(a/an)”和“(the)”包括复数指示物。因此，例如，对“缀合物”的引用包括多个缀合物，并且对“细胞”的引用包括多个细胞等。如本文所用，术语“包括”及其语法变体旨在是非限制性的，使得列表中项目的列举不排除可被替换或添加到所列项目的其他类似项目。
数值范围包括限定该范围的数值。考虑到有效数字和与测量相关的误差，将测量值和可测量值理解为近似值。此外，“包含(comprise/comprises/comprising)”、“含有(contain/contains/containing)”和“包括(include/includes和including)”的使用并不旨在是限制性的。应当理解，上述一般描述和详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本教导。
除非在说明书中特别指出，否则说明书中列举“包含”各种组件的实施方案也被设想为“由所列举的组件组成”或“基本上由所列举的组件组成”；说明书中列举“由各种组件组成”的实施方案也被设想为“包含”所列举的组件或“基本上由所列举的组件组成”；并且说明书中列举“基本上由各种组件组成”的实施方案也被设想为“由所列举的组件组成”或“包含”所列举的组件(这种可互换性不适用于实施方案中这些术语的使用)。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”以包括性含义使用，即等同于“和/或”。
术语“约”在列表之前使用时，修饰列表的每个成员。术语“约”或“大约”意指如通过本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分取决于如何测量或确定所述值。
本文所使用的小节标题仅出于组织性目的并且不解释为以任何方式限制所需主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中定义的任何术语或本说明书的任何其他明示内容矛盾，则以本说明书为准。
I.定义
除非另外说明，否则本文所使用的下列术语和措辞希望具有下列含义：
如本文所用，“多核苷酸”和“核酸”是指包含核苷或核苷类似物的多聚化合物，所述核苷或核苷类似物具有沿着骨架连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，包括常规RNA、DNA、混合RNA-DNA和作为其类似物的聚合物。核酸“骨架”可由多种键联构成，包括以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯键联、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT号WO 95/32305)、硫代磷酸酯键联、甲基膦酸酯键联或其组合。核酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有可选取代基(例如，2'甲氧基或2'卤化物取代基)的类似化合物。含氮碱基可为常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，修饰的尿苷，诸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮嘌呤或氮杂嘌呤、脱氮嘧啶或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、5或8位具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利号5,378,825和PCT号WO 93/13121)。一般性讨论参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams等人,编,第11版,1992)。核酸可包括一个或多个“脱碱基”残基，其中骨架在聚合物的一个或多个位置不包括含氮碱基(美国专利号5,585,481)。核酸可仅包含常规RNA或DNA糖、碱基和键联，或可包括常规组分和取代基(例如，具有2'甲氧基取代基的常规核苷，或含有常规核苷和一个或多个核苷类似物的聚合物)。核酸包括含有一种或多种LNA核苷酸单体的类似物“锁核酸”(LNA)，其中双环呋喃糖单元被锁定在模仿糖构象的RNA中，这增强了对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel,2004,Biochemistry43(42):13233-41)。RNA和DNA具有不同的糖部分，并且可因RNA中存在尿嘧啶或其类似物且DNA中存在胸腺嘧啶或其类似物而不同。
“指导RNA”、“gRNA”、和简称“指导”在本文中可互换使用以意指包含指导序列之指导，例如crRNA(也称为CRISPR RNA)、或crRNA和trRNA的组合(也称为tracrRNA crRNA(也称为CRISPR RNA)、或crRNA和trRNA的组合(也称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可作为单个RNA分子(单指导RNA，sgRNA)缔合或例如在两个单独的RNA分子(双指导RNA，dgRNA)中。“指导RNA”或“gRNA”是指每种类型。trRNA可为天然存在的序列，或可为与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。指导RNA，诸如sgRNA或dgRNA，可包括如本文所述的修饰的RNA。
如本文所用，“指导序列”是指在指导RNA内与靶序列互补并起到将指导RNA引导到靶序列以通过RNA指导的DNA结合剂结合或修饰(例如，裂解)的作用的序列。“指导序列”也可称为“靶向序列”或“间隔区序列”。指导序列的长度可为20个碱基对，例如在酿脓链球菌(即，Spy Cas9)和相关Cas9同源物/直向同源物的情况下。更短或更长的序列也可用作指导，例如，长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。举例来说，在一些实施方案中，指导序列包含选自SEQ ID NO：2-33的白蛋白指导序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸或选自SEQ ID NO：1000-1128的SERPINA1指导序列。在一些实施方案中，靶序列例如位于基因中或染色体上，并且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列与其相应的靶序列之间的互补性或同一性程度可为约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。举例来说，在一些实施方案中，指导序列包含与选自SEQ ID NO：2-33的白蛋白指导序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸或选自SEQ ID NO：1000-1128的SERPINA1指导序列具有约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可为100％互补或相同的。在其他实施方案中，指导序列和靶区域可含有至少一个错配。例如，指导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少15、16、17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可含有1至4个错配，其中指导序列包含至少15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。
RNA指导的DNA结合剂的靶序列包括基因组DNA的正链和负链(即给定的序列和序列的反向补体)，因为RNA指导的DNA结合剂的核酸底物为双链核酸。因此，在指导序列被称为“与靶序列互补”的情况下，应当理解，指导序列可引导指导RNA与靶序列的正义链或反义链(例如反向补体)结合。因此，在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向补体的情况下，指导序列与靶序列(例如，不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，除了在指导序列中用U取代T。
如本文所用，“RNA指导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此种复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性是序列特异性的并且取决于RNA的序列。术语RNA指导的DNA结合剂还包括编码此类多肽的核酸。示例性RNA指导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶。示例性RNA指导的DNA结合剂可包括其失活形式(“dCas DNA结合剂”)，例如如果那些剂被修饰以例如通过与FokI裂解酶结构域融合来允许DNA裂解。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶和Cas切口酶。Cas裂解酶和Cas切口酶包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的Cascade复合物、其Cas3亚基和2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，其还具有RNA指导的DNA裂解酶或切口酶活性，以及2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性失活”)，如果那些剂被修饰以允许DNA裂解。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白及其修饰。Cpf1蛋白，Zetsche等人,Cell.163:1-13(2015)也含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用的方式整体并入。参见例如，Zetsche，表S1和表S3。参见例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。如本文所用，RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶、Cas9核酸酶或酿脓链球菌Cas9核酸酶)的递送包括多肽或mRNA的递送。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指指导RNA与RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施方案中，指导RNA将RNA指导的DNA结合剂诸如Cas9指导到靶序列，并且指导RNA与靶序列杂交且所述剂与靶序列结合；在剂是裂解酶或切口酶的情况下，结合之后可以裂解或切口。
如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对显示第二序列整体上X％或更多的位置与第一序列匹配，则认为第一序列“包含与第二序列具有至少X％同一性的序列”。例如，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为比对将给出100％同一性，因为存在与第二序列的所有三个位置的匹配。RNA与DNA之间的差异(通常为尿苷与胸苷的交换，或反之亦然)以及核苷类似物(诸如修饰的尿苷)的存在不会导致多核苷酸之间的同一性或互补性差异，只要相关核苷酸(诸如胸苷、尿苷或修饰的尿苷)具有相同的补体(例如，对于所有的胸苷、尿苷或修饰的尿苷为腺苷；另一个实例为胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者均具有鸟苷或修饰的鸟苷作为补体)。因此，例如，序列5’-AXG(其中X为任何修饰的尿苷诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG 100％相同，因为两者与相同的序列(5'-CAU)完全互补。示例性比对算法是本领域众所周知的Smith-Waterman算法和Needleman-Wunsch算法。本领域技术人员将理解哪种算法和参数设置的选择适合于给定的一对待比对序列；对于长度一般相似且氨基酸的预期同一性>50％或核苷酸的预期同一性>75％的序列，使用EBI在www.ebi.ac.uk网页服务器上提供的Needleman-Wunsch算法界面的默认设置的Needleman-Wunsch算法通常是适当的。
如本文所用，如果第一序列X％的碱基与第二序列进行碱基配对，则第一序列被认为与第二序列“X％互补”。例如，第一序列5’AAGA3’与第二序列3’TTCT5’100％互补，并且第二序列与第一序列100％互补。在一些实施方案中，第一序列5’AAGA3’与第二序列3’TTCTGTGA5’100％互补，而第二序列与第一序列50％互补。
如本文所用，“mRNA”在本文中用于指多核苷酸，其全部或主要是RNA或修饰的RNA，并且包含可翻译成多肽的开放阅读框(即，可充当由核糖体和氨基酰化tRNA翻译的底物)。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物(例如2'-甲氧基核糖残基)的磷酸盐-糖骨架。在一些实施方案中，mRNA磷酸盐-糖骨架的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。
可用于本文所述的指导RNA组合物和方法的示例性指导序列在整个申请的表1、表2中示出。
如本文所用，“插入缺失”是指由在靶核酸中的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失的多个核苷酸组成的插入/缺失突变。
如在此使用，“异源α-1抗胰蛋白酶”与“异源AAT”或“异源A1AT”或“AAT/A1AT转基因”可互换地使用，其为相对于其插入位点呈异源的SERPINA1基因的基因产物。在一些实施方案中，SERPINA1基因为外源的。人野生型AAT蛋白序列可在NCBI NP_000286获得；基因序列可在NCBI NM_000295获得。人类野生型AAT cDNA已测序(参见，例如，Long等人,“Complete sequence of the cDNA for human alpha 1-antitrypsin and the gene forthe S variant,Biochemistry 1984)并且编码含有信号肽和成熟AAT肽的前体分子。所述肽的负责细胞内靶向、碳水化合物连接、催化功能、蛋白酶抑制活性等的结构域已得以表征(参见，例如，Kalsheker，“Alpha1-antitrypsin:structure,function and molecularbiology of the gene,”Biosci Rep.1989；Matamala等人,“Identification of NovelShort C-Terminal Transcripts of Human SERPINA1 Gene,”PLoS One 2017；Niemann等人,“Isolation and serine protease inhibitory activity of the44-residue,C-terminal fragment of alpha 1-antitrypsin from human placenta,”Matrix 1992)。如本文使用，异源AAT涵盖前体AAT、成熟AAT和其变体及片段，例如，功能片段，例如，保持蛋白酶抑制活性的片段(例如，与野生型AAT相比，至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、或100％，例如，如通过可购得蛋白酶抑制测定或人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)抑制测定来分析)。在一些实施方案中，功能片段为天然存在的，例如，较短C末端片段。在一些实施方案中，功能片段为遗传工程改造的，例如，活动过度的功能片段。本文描述AAT蛋白序列的实例(例如SEQ ID NO:700或SEQ ID NO:702)。如本文使用，异源AAT还涵盖AAT的变体，例如，与野生型AAT相比，具有增加的蛋白酶抑制剂活性的变体。如本文使用，异源AAT还涵盖与SEQ ID NO：70080％、85％、90％、93％、95％、97％、99％相同的变体，具有功能活性，例如，与野生型AAT相比，至少60％、70％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％或更大活性，例如，如通过HNE抑制来分析。如本文使用，异源AAT还涵盖具有功能活性的片段，例如，与野生型AAT相比，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％或更大活性，例如，如通过HNE抑制来分析。如本文使用，异源AAT是指适用于治疗AATD的AAT，例如功能性AAT，其可为适用于治疗AATD的野生型AAT或其变体。
如本文所用，“异源基因”是指已作为外部来源引入宿主细胞基因组内的位点(例如，在基因组基因座处，诸如包括白蛋白内含子1位点的安全港基因座处)的基因。由此种异源基因表达的多肽称为“异源多肽”。异源基因可为天然存在或工程改造的，并且可为野生型或变体。异源基因可包括除了编码异源多肽的序列以外的核苷酸序列。异源基因可为在宿主基因组中作为野生型或变体(例如，突变体)天然存在的基因。例如，尽管宿主细胞含有感兴趣的基因(作为野生型或作为变体)，但是可将相同的基因或其变体作为外部来源引入，以用于例如在高度表达的基因座处表达。异源基因也可为在宿主基因组中非天然存在的基因，或表达在宿主基因组中非天然存在的异源多肽的基因。“异源基因”、“外源基因”和“转基因”可互换使用。在一些实施方案中，异源基因或转基因包括外源核酸序列，例如对于受体细胞不是内源的核酸序列。在某些实施方案中，异源基因可包括不在受体细胞中天然存在的AAT核酸序列。例如，异源AAT相对于其插入位点和相对于其受体细胞可为异源的。
如本文使用，“突变型SERPINA1”或“突变型SERPINA1等位基因”是指与野生型序列(NCBI基因ID：5265；NCBI NM_000295；Ensembl：Ensembl:ENSG00000197249)相比，具有SERPINA1的核苷酸序列中的变化的SERPINA1序列。在一些实施方案中，突变型SERPINA1等位基因编码非功能性和/或非分泌AAT蛋白。
如本文使用，“AATD”或“A1AD”是指α-1抗胰蛋白酶缺乏症。AATD包括由SERPINA1中的各种不同的遗传突变导致的疾病和病症。AATD可意指以下疾病，其中表达减少水平的功能性AAT(例如，与对照样品相比，小于100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、或5％AAT基因或蛋白表达，例如，通过浊度测定或免疫比浊法，例如，血清中的AAT少于约100mg/dL、90mg/dL、80mg/dL、70mg/dL、60mg/dL、50mg/dL、40mg/dL、30mg/dL、20mg/dL、10mg/dL、或5mg/dL)，不表达功能性AAT，或表达突变型或非功能性AAT(例如，形成聚集体和/或不能够被分泌和/或具有减少的蛋白酶抑制剂活性)。参见例如Greulich andVogelmeier,Ther Adv Respir Dis 2016。在一些实施方案中，AATD是指其中AAT在细胞内，例如，在肝细胞中聚集和/或积聚，并且不被分泌至例如循环中的疾病，在所述循环中它可输送至肺部以便充当蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，AATD可通过肝脏组织切片的PASD染色，以便例如测量聚集来检测。在一些实施方案中，AATD可通过例如肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制减少来检测。
如本文所用，“靶序列”是指靶基因中与gRNA的指导序列具有互补性的核酸序列。靶序列和指导序列的相互作用引导RNA指导的DNA结合剂在靶序列内结合，并潜在地切口或裂解(取决于剂的活性)。
如本文使用，“正常”或“健康”个体包括不具有AATD相关等位基因的那些个体，例如，AATD相关等位基因为ZZ、MZ、或SZ。
如本文所用，“治疗”是指用于受试者中疾病或病症的治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制疾病、阻止其发展、减轻疾病的一种或多种症状、治愈疾病或防止疾病的一种或多种症状复发。AATD可能与肺部疾病和/或肝脏疾病；喘息或呼吸急促；肺部感染的风险增加；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；支气管炎，哮喘，呼吸困难；肝硬化；新生儿黄疸；脂膜炎；慢性咳嗽和/或痰；反复感冒；皮肤或眼睛的白色部分发黄；腹部或腿部肿胀有关。举例来说，AATD的治疗可包含减轻AATD的症状，例如，肝脏和/或肺部症状。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如保护性水平。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如正常范围内。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如高于40、50、60、70、80、90、或100mg/dL，例如，如使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准来测量。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，基线血清AAT的改善。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，AATD相关肝脏疾病的组织学分级得以改善例如1、2、3、或更多个点。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，Ishak纤维化评分的改善。在一些实施方案中，治疗是指基因型血清水平、AAT肺功能、肺活量检查、肺部胸部X线检查、肺部CT扫描、肝功能的血液检查和/或肝超声的改善。
如本文使用，“敲低”是指特定基因产物(例如，蛋白、mRNA、或两者)的表达减少。蛋白的敲低可通过例如检测由组织或细胞群(例如，在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白或通过检测来自所关注组织或细胞群的蛋白的总细胞量来测量。测量mRNA敲低的方法为已知的，并且包括对从所关注组织或细胞群分离的mRNA进行测序。在一些实施方案中，“敲低”可意指特定基因产物的表达的某些损失，例如转录mRNA的量减少或由细胞群(包括体内群体诸如存在于组织中的那些群体)表达或分泌的蛋白的量减少。在一些实施方案中，本公开的方法“敲低”一种或多种细胞(例如，在细胞群中，包括体内群体，诸如存在于组织中的那些群体)中的内源性AAT。相关细胞包括能够产生AAT的细胞。在一些实施方案中，本发明方法敲低内源性突变型SERPINA1等位基因，和/或内源性野生型SERPINA1等位基因(例如，在杂合MZ个体中)。
如本文使用，“敲除”是指细胞中的特定蛋白的表达的损失。敲除可通过检测来自组织或细胞群(例如，在血清或细胞培养基中)的蛋白分泌的量或通过检测组织或细胞群的蛋白的总细胞量来测量。相关细胞包括能够产生AAT的细胞。在一些实施方案中，本发明的方法“敲除”一种或多种细胞(例如，在细胞群中，包括体内群体，诸如存在于组织中的那些群体)中的内源性AAT。在一些实施方案中，本公开的方法敲除内源性突变型SERPINA1等位基因，和/或内源性野生型SERPINA1等位基因(例如，在杂合MZ个体中)。在一些实施方案中，敲除是细胞中的内源性AAT蛋白的表达的完全损失。
如本文所用，“多肽”是指野生型或变体蛋白(例如，突变体、片段、融合体或其组合)。变体多肽可具有野生型多肽的至少或约5％、10％、15％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的功能活性。在一些实施方案中，变体与野生型多肽的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在一些实施方案中，变体多肽可为活动过度的变体。在某些情况下，变体具有野生型多肽的约80％至约120％、140％、160％、180％、200％的功能活性。
如本文所用，“双向核酸构建体”(在本文中可互换地称为“双向构建体”)包含至少两个核酸区段，其中一个区段(第一区段)包含编码感兴趣的多肽的编码序列(编码序列在本文中可称为“转基因”或第一转基因)，而另一个区段(第二区段)包含其中所述序列的补体编码感兴趣的多肽的序列(或第二转基因)。也就是说，至少两个区段可编码相同或不同的多肽。当两个区段编码相同的多肽时，第一区段的编码序列不需要与第二区段的序列的补体相同。在一些实施方案中，第二区段的序列为第一区段的编码序列的反向补体。双向构建体可为单链或双链的。本文公开的双向构建体涵盖能够表达任何感兴趣的多肽的构建体。
如本文所用，“反向补体”是指作为参考序列的补体序列的序列，其中补体序列以反向方向写入。举例来说，对于假设的序列5'CTGGACCGA 3'(SEQ ID NO:500)，“完全”补体序列为3'GACCTGGCT 55(SEQ ID NO:501)，并且“完全”反向补体写为5'TCGGTCCAG 3'(SEQID NO:502)。反向补体序列不需要是“完美的”，并且仍可编码与参考序列相同的多肽或相似的多肽。由于密码子使用冗余，反向补体可与编码相同多肽的参考序列不同。如本文所用，“反向补体”还包括例如与参考序列的反向补体序列30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，双向核酸构建体包含第一区段，所述第一区段包含编码第一多肽的编码序列(第一转基因)，以及第二区段，所述第二区段包含其中所述序列的补体编码第二多肽的序列(第二转基因)。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽包含例如跨50、100、200、500、1000或更多个氨基酸残基的至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
“安全港”基因座是在基因组内的基因座，其中基因可被插入而不对宿主细胞(例如肝细胞)产生显著的有害影响，例如，不引起细胞凋亡、坏死和/或衰老，或不引起与对照细胞相比超过5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％的细胞凋亡、坏死和/或衰老。参见例如，Hsin等人,“Hepatocyte death in liver inflammation,fibrosis,andtumorigenesis,”2017。在一些实施方案中，安全港基因座允许外源基因过度表达而不对宿主细胞(例如肝细胞)产生显著的有害影响，例如，不引起细胞凋亡、坏死和/或衰老，或不引起与对照细胞相比超过5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％的细胞凋亡、坏死和/或衰老。在一些实施方案中，期望的安全港基因座可为其中插入的基因序列的表达不被来自邻近基因的通读表达干扰的基因。安全港可在白蛋白基因内，诸如人白蛋白基因内。安全港可在白蛋白内含子1区域内，例如人白蛋白内含子1内。安全港可为例如针对肝脏组织或肝细胞宿主细胞的人安全港。在一些实施方案中，安全港允许外源基因过度表达而不对宿主细胞或细胞群(诸如肝细胞或肝脏细胞)产生显著的有害影响，例如，不引起细胞凋亡、坏死和/或衰老，或不引起与对照细胞相比超过5％、10％、15％、20％、25％、30％或40％的细胞凋亡、坏死和/或衰老。
在一些实施方案中，基因可插入安全港基因座中并且使用安全港基因座的内源性信号序列，例如由外显子1编码的白蛋白信号序列。举例来说，AAT编码序列可插入人白蛋白内含子1中以使得它在人白蛋白外显子1的信号序列的下游并且与其融合。
在一些实施方案中，基因可包含其自身信号序列、可插入安全港基因座中、并且可进一步使用安全港基因座的内源性信号序列。举例来说，包含AAT信号序列的AAT编码序列可插入人白蛋白内含子1中以使得它在由外显子1编码的人白蛋白的信号序列的下游并且与其融合。
在一些实施方案中，基因可包含其自身信号序列和内部核糖体进入位点(IRES)、可插入安全港基因座中、并且可进一步使用安全港基因座的内源性信号序列。举例来说，包含AAT信号序列和IRES序列的AAT编码序列可插入人白蛋白内含子1中以使得它在由外显子1编码的人白蛋白的信号序列的下游并且与其融合。
在一些实施方案中，基因可包含其自身信号序列和IRES、可插入安全港基因座中，并且不使用安全港基因座的内源性信号序列。举例来说，包含AAT信号序列和IRES序列的AAT编码序列可插入人白蛋白内含子1中以使得它不融合至由外显子1编码的人白蛋白的信号序列。在这些实施方案中，蛋白从IRES位点转译并且并非嵌合的(例如融合至AAT蛋白的白蛋白信号肽)，其可有利地为非免疫原性或低免疫原性的。在一些实施方案中，蛋白不在细胞外分泌和/或运输。
在一些实施方案中，基因可插入安全港基因座中并且可包含IRES并且不使用任何信号序列。举例来说，包含IRES序列并且无AAT信号序列的AAT编码序列可插入人血白蛋白内含子1中以使得它不融合至由外显子1编码的人白蛋白的信号序列。在一些实施方案中，蛋白质从IRES位点转译而无需任何信号序列。在一些实施方案中，蛋白质不在细胞外运输。
如本文使用，不经历有丝分裂细胞分裂的细胞被称为“非分裂”细胞。“非分裂”细胞涵盖永不或很少经历有丝分裂细胞分裂的细胞类型，例如许多类型的神经元。A“非分裂”细胞还涵盖能够，但是未经历或将要经历有丝分裂细胞分裂的细胞，例如，静止细胞。例如，肝脏细胞保留分裂的能力(例如，当受伤或切除时)，但通常不分裂。在有丝分裂细胞分裂期间，同源重组是保护基因组并修复双链断裂的机制。在一些实施方案中，“非分裂”细胞是指这样的细胞，其中例如与对照分裂细胞相比，同源重组(HR)不是修复细胞中双链DNA断裂的主要机制。在一些实施方案中，“非分裂”细胞是指这样的细胞，其中例如与对照分裂细胞相比，非同源末端连接(NHEJ)是修复细胞中双链DNA断裂的主要机制。
非分裂细胞类型已例如通过活性NHEJ双链DNA断裂修复机制在文献中描述。参见例如Iyama,DNA Repair(Amst.)2013,12(8):620-636。在一些实施方案中，宿主细胞包括但不限于肝脏细胞、肌肉细胞或神经元细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为肝细胞，诸如小鼠、食蟹猴或人肝细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为肌细胞，诸如小鼠、食蟹猴或人肌细胞。在一些实施方案中，本文提供包含本文公开的双向构建体的如上所述宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞表达由本文公开的双向构建体编码的转基因多肽。在一些实施方案中，本文提供由本文公开的方法来制得的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞通过向宿主细胞施用或递送本文描述的双向核酸构建体，和基因编辑系统诸如ZFN、TALEN、或CRISPR/Cas9系统来制得。
II.组合物
A.包含安全港白蛋白指导RNA(gRNA)和/或SERPINA1指导RNA
(gRNA)的组合物
本文提供适用于在宿主细胞的基因组基因座诸如安全港基因内插入和表达异源AAT基因(例如，功能性或野生型AAT)的白蛋白指导RNA组合物、AAT模板组合物、和方法。特别地，如本文所例示，在白蛋白基因座(例如，在内含子1处)靶向并插入异源AAT基因允许使用白蛋白的内源启动子来驱动异源AAT基因的稳健表达。本公开部分地基于特异性靶向白蛋白基因的内含子1内的位点并且提供异源AAT基因的有效插入和表达的白蛋白指导RNA的鉴定。如实施例中所示并在本文中进一步描述，经鉴定的gRNA介导如通过插入缺失形成活性所测量的高水平编辑的能力出乎意料地不一定与使用相同的gRNA介导如通过例如转基因的表达所测量的异源基因的有效插入相关联。也就是说，能够实现高水平编辑的某些gRNA不一定能够介导有效插入，并且相反，显示出实现低水平编辑的某些gRNA可介导转基因的有效插入和表达。
在一些实施方案中，本文公开的组合物适用于例如使用本文公开的白蛋白指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)，和包含异源AAT核酸(“AAT转基因”)的构建体(例如，供体构建体或模板)，在宿主细胞的基因座诸如白蛋白基因座(例如，内含子1)内引入或插入异源AAT基因(例如，功能性或野生型AAT)。在一些实施方案中，本文公开的组合物可用于例如使用本文公开的白蛋白指导RNA与RNA指导的DNA结合剂以及包含异源AAT核酸的构建体(例如，供体)来在宿主细胞的白蛋白基因座处表达异源AAT基因。在一些实施方案中，本文公开的组合物可用于例如使用本文公开的白蛋白指导RNA与RNA指导的DNA结合剂以及包含异源AAT核酸的双向构建体来在宿主细胞的白蛋白基因座处表达异源AAT。在一些实施方案中，本文公开的组合物可用于例如使用本文公开的白基因指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)来诱导宿主细胞的白蛋白基因内的断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(SSB或切口))。所述组合物可在体外或体内用于例如治疗AATD。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA包含结合或能够结合在白蛋白基因座的内含子内的指导序列。在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA结合在SEQ IDNO:1的人白蛋白基因的内含子1的区域内。应当理解，并非白蛋白指导序列的每个碱基都必须结合在所述区域内。例如，在一些实施方案中，白蛋白指导RNA序列的15、16、17、18、19、20或更多个碱基结合在所述区域内。例如，在一些实施方案中，指导RNA序列的15、16、17、18、19、20或更多个连续碱基与所述区域结合。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA在人白蛋白内含子1(SEQ ID NO:1)内的位点处通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)介导靶特异性切割。应当理解，在一些实施方案中，指导RNA包含与所述区域结合或能够与所述区域结合的指导序列。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的指导序列。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA包含具有选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸的指导序列。
在一些实施方案中，白蛋白指导RNA(gRNA)包含选自以下的指导序列：a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列。在一些实施方案中,白蛋白指导RNA包含a选自由组成的组的序列SEQ ID NO:2,8,13,19,28,29,31,32,33.参见表1。
表1：白蛋白靶向人指导RNA序列和染色体坐标
Figure BDA0003114124080000231
Figure BDA0003114124080000241
本文公开的白蛋白指导RNA介导靶特异性切割，从而导致双链断裂(DSB)。本文公开的白蛋白指导RNA介导靶特异性切割，从而导致单链断裂(SSB或切口)。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA结合至原间隔子相邻基序(PAM)上游的区域。如本领域技术人员将理解的，PAM序列发生在与含有靶序列的链相反的链上。也就是说，PAM序列在靶链(含有指导RNA结合的靶序列的链)的补体链上。在一些实施方案中，PAM选自由NGG、NNGRRT、NNGRR(N)、NNAGAAW、NNNNG(A/C)TT和NNNNRYAC组成的组。在一些实施方案中，PAM是NGG。
在一些实施方案中，本文提供的指导RNA序列与邻近PAM序列的序列互补。
在一些实施方案中，指导RNA序列包含与根据人参考基因组hg38中的坐标选自本文表中的基因组区域内的序列互补的序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包含与包含选自本文表中的基因组区域内的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸的序列互补的序列。在一些实施方案中，指导RNA序列包含与包含跨越选自本文表中的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸的序列互补的序列。
本文公开的指导RNA介导靶特异性切割，从而导致双链断裂(DSB)。本文公开的指导RNA介导靶特异性切割，从而导致单链断裂(SSB或切口)。
在一些实施方案中，本文公开的白蛋白指导RNA介导通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶，如本文公开)的靶特异性切割，其中所得切割位点允许在白蛋白基因的内含子1内，插入异源AAT核酸(例如，功能性或野生型AAT)。在一些实施方案中，指导RNA和/或切割位点允许异源AAT基因的1％与5％之间、5％与10％之间、15％与20％之间、20％与25％之间、25％与30％之间、30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间、或95％与99％之间的插入。在一些实施方案中，指导RNA和/或切割位点允许异源AAT核酸的至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％插入。插入率可在体外或体内测量。例如，在一些实施方案中，可通过检测和测量细胞群中插入的异源AAT核酸，并计算含有插入的异源AAT核酸的群的百分比来确定插入率。测量插入率的方法是本领域已知且可用的。这类方法包括，例如，对插入位点进行测序或对从所关注组织或细胞群分离的mRNA进行测序。
在一些实施方案中，指导RNA允许异源AAT基因的5％与10％之间、10％与15％之间、15％与20％之间、20％与25％之间、25％与30％之间、30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间、95％与99％之间或更多增加的表达和/或分泌。例如，在一些实施方案中，可通过检测和测量AAT多肽水平并将所述水平与在例如处理细胞或施用于受试者之前的AAT多肽水平进行比较来确定增加的表达和/或分泌。异源AAT基因的增加的表达和/或分泌可在体外或体内测量。在一些实施方案中，AAT的分泌和/或表达通过使用例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、HPLC、质谱(例如，液体质谱(例如，LC-MS、LC-MS/MS)、或对于培养基和/或细胞或组织(例如，肝脏)提取物的蛋白质印迹测定，检测由组织或细胞群(例如，在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白或通过检测来自所关注组织或细胞群的蛋白的总细胞量来测量。在一些实施方案中，AAT的分泌和/或表达在原代人类肝细胞，例如培养基或细胞样品中测量。在一些实施方案中，AAT的分泌在HUH7细胞，例如培养基样品中测量。在一些实施方案中，所使用的细胞是HUH7细胞。在一些实施方案中，将AAT的量3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH(管家基因)的量进行比较以便控制细胞数目的变化。在一些实施方案中，AAT可通过肝脏组织切片的PASD染色，以便例如测量聚集来评估。在一些实施方案中，AAT可通过测量例如肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制来评估。
在一些实施方案中，指导RNA允许异源AAT基因(例如功能性或野生型AAT)的表达所引起的5％与10％之间、10％与15％之间、15％与20％之间、20％与25％之间、25％与30％之间、30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间、95％与99％之间或更多增加的活性。例如，可通过检测和测量蛋白酶抑制剂活性水平并将所述水平与在例如处理细胞或施用于受试者之前的活性水平进行比较来确定增加的活性。这类方法是本领域中可获得和已知的。参见例如Mullins等人,“Standardized automated assay for functional alpha1-antitrypsin,”1984；Eckfeldt等人,“Automated assay for alpha-1-antitiypsinwith N-a-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide as trypsin substrate andstandardized with p-nitrophenyl-p’-guanidinobenzoateastitrantfortrypsinactivesites,”1982。
在一些实施方案中，人白蛋白基因座的内含子1内的靶序列或区域(SEQ ID NO:1)可与白蛋白指导RNA的指导序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的指导序列与其相应的靶序列之间的互补性或同一性程度可为至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，靶序列和gRNA的指导序列可为100％互补或相同的。在其他实施方案中，靶序列和gRNA的指导序列可含有至少一个错配。例如，靶序列和gRNA的指导序列可含有1、2、3、4或20个错配，其中指导序列的总长度为约20或为20。在一些实施方案中，靶序列和gRNA的指导序列可含有1至4个错配，其中指导序列为约20或为20个核苷酸。
如在本文中描述和例示，白蛋白指导RNA可用于在白蛋白基因的内含子1处插入和表达异源AAT基因(例如，功能性或野生型AAT)，以及SERPINA1指导RNA，其用于敲低或敲除内源性SERPINA1基因(例如，突变型SERPINA1基因)。因此，在一些实施方案中，本公开包括组合物，其包含有包含指导序列的一或多个SERPINA1指导RNA(gRNA)，所述指导序列将RNA指导的DNA结合剂(例如.，Cas9)引导至SERPINA1中的靶DNA序列。gRNA可包含表2示出的一个或多个指导序列。在一些实施方案中，本文提供一或多个SERPINA1指导RNA，其包含SEQID NO：1000-1128中的任何一个的指导序列。
在一方面，本公开提供SERPINA1 gRNA，其包含与选自SEQ ID NO：1000-1128的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、或88％相同的指导序列。
在其他实施方案中，组合物包含至少两个SERPINA1 gRNA，其包含选自SEQ ID NO：1000-1128的任何两个或更多个指导序列的指导序列。在一些实施方案中，组合物包含至少两个gRNA，其各自与SEQ ID NO：1000-1128的任何核酸至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、或88％相同。
本发明的SERPINA1指导RNA组合物被设计来辨识SERPINA1基因中的靶序列。举例来说，SERPINA1靶序列可通过所提供的RNA指导的DNA结合剂来辨识和裂解。在一些实施方案中，Cas蛋白可通过SERPINA1指导RNA来引导至SERPINA1基因的靶序列，其中指导RNA的指导序列与靶序列杂交并且Cas蛋白裂解靶序列。
在一些实施方案中，一或多个SERPINA1指导RNA的选择基于SERPINA1基因内的靶序列来确定。
不受任何具体理论约束，与基因的非关键区域中的突变相比，基因的关键区域中的突变可能为不太可耐受的，因此DSB的位置是可产生的蛋白敲低或敲除的量或类型的重要因素。在一些实施方案中，与SERPINA1内的靶序列互补或具有互补性的SERPINA1 gRNA用于将Cas蛋白引导至SERPINA1基因中的特定位置。在一些实施方案中，SERPINA1 gRNA被设计来具有与SERPINA1的外显子2、3、4、或5中的靶序列互补或具有互补性的指导序列。
在一些实施方案中，SERPINA1 gRNA被设计来与SERPINA1的外显子中的编码AAT的N末端区域的靶序列互补或具有互补性。
表2：SERPINA1靶向和控制指导序列命名法、染色体坐标、和序列
Figure BDA0003114124080000281
Figure BDA0003114124080000291
Figure BDA0003114124080000301
Figure BDA0003114124080000311
Figure BDA0003114124080000321
Figure BDA0003114124080000331
分别在表1中SEQ ID NO:2-33处和表2中SEQ ID NO:1000-1128处所示的白蛋白指导序列和SERPINA1指导中的每个还可包含另外的核苷酸以形成crRNA和/或指导RNA，例如，其中以下示例性核苷酸序列在指导序列3’端之后：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:900)，呈5'至3'方向。在sgRNA的情况下，上述指导序列(分别在表1中的SEQ ID NO:2-33处和表2中的SEQ ID NO：1000-1128处示出的白蛋白指导序列和SERPINA1指导序列)可进一步包含另外核苷酸以形成sgRNA，例如，其中以下示例性核苷酸序列在指导序列3’端之后：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO：901)，呈5’至3’方向.
白蛋白和/或SERPINA1指导RNA可进一步包含trRNA。在本文所述的每个组合物和方法实施方案中，crRNA和trRNA可作为单个RNA(sgRNA)缔合或可在单独的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的情况下，crRNA和trRNA组分可例如通过磷酸二酯键或其他共价键共价连接。在一些实施方案中，sgRNA在核苷酸之间包含不是磷酸二酯键联的一个或多个键联。
在本文所述的组合物、用途和方法实施方案中的每个中，指导RNA可包含两个RNA分子作为“双指导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包含第一RNA分子，所述第一RNA分子包含含有例如表1和/或表2所示的指导序列的crRNA，以及第二RNA分子，所述第二RNA分子包含trRNA。第一RNA分子和第二RNA分子可以不共价连接，但是可通过crRNA和trRNA的部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在本文所述的组合物、用途和方法实施方案中的每个中，指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)可包含单个RNA分子作为“单指导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可包含crRNA(或其一部分)，其包含与trRNA共价连接的表1或表2所示的指导序列。sgRNA可包含表1或表2所示的指导序列的15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，crRNA和trRNA通过接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA通过crRNA和trRNA的部分之间的碱基配对形成茎-环结构。在一些实施方案中，crRNA和trRNA通过不是磷酸二酯键的一个或多个键共价连接。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID No:34-67或120-163中任一个所示的sgRNA。在一些实施方案中，指导RNA包含sgRNA，其包含SEQ ID NO：2-33、98-119、165-170、172、174-176、182-185、189-193、195-193、195、或196的指导序列中任一个和SEQ ID NO：901的核苷酸，其中SEQ ID NO：901的核苷酸在指导序列3’端，并且其中sgRNA可如表9、11、或13或SEQID NO：300显示来修饰。
在一些实施方案中，trRNA可包含衍生自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列的全部或部分。在一些实施方案中，trRNA包含截短的或修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，trRNA包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超过100个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，trRNA可包含某些二级结构，例如像一种或多种发夹或茎-环结构，或一种或多种凸起结构。
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如本文所述的Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas核酸酶的ORF的mRNA。
C.修饰的gRNA和mRNA
在一些实施方案中，本文公开的gRNA(例如，白蛋白或SERPINA1 gRNA)为化学修饰的。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA称为“修饰的”gRNA或“化学修饰的”gRNA，以描述一种或多种非天然和/或天然存在的组分或构型的存在，所述组分或构型用于替代或补充标准A、G、C和U残基。在一些实施方案中，用非标准核苷或核苷酸合成修饰的gRNA，在此称为“修饰的”。修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一种或多种：(i)改变，例如替换磷酸二酯骨架键联中的一种或两种非连接的磷酸氧和/或一种或多种连接的磷酸氧(示例性骨架修饰)；(ii)改变，例如替换核糖糖的成分，例如核糖糖上的2'羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头完全替换磷酸部分(示例性骨架修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括用非标准核碱基(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰核糖-磷酸骨架(示例性骨架修饰)；(vi)修饰寡核苷酸的3'端或5'端，例如去除、修饰或替换末端磷酸基团或使部分、帽或接头缀合(此类3'或5'帽修饰可包含糖和/或骨架修饰)；以及(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。
诸如上面列出的化学修饰可组合以提供包含可具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)的修饰的gRNA和/或mRNA。例如，修饰的残基可具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，修饰gRNA的每个碱基，例如，所有碱基均具有修饰的磷酸基团，诸如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的所有或基本上所有的磷酸基团被硫代磷酸酯基团替换。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的5'端或附近包含至少一个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的3'端或附近包含至少一个修饰的残基。
在一些实施方案中，gRNA包含一个、两个、三个或更多个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰gRNA中的至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％)的位置为修饰核苷或核苷酸。
未修饰的核酸可易于被例如细胞内核酸酶或血清中发现的核酸酶降解。例如，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，在一个方面，本文所述的gRNA可含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，以例如向细胞内或基于血清的核酸酶引入稳定性。在一些实施方案中，当在体内和离体引入到细胞群中时，本文所述的修饰的gRNA分子可表现出降低的先天免疫应答。术语“先天免疫应答”包括对包括单链核酸的外源核酸的细胞应答，其涉及诱导细胞因子特别是干扰素的表达和释放以及细胞死亡。
在骨架修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸基团可通过用不同的取代基替换一个或多个氧来修饰。此外，修饰的残基(例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基)可包括用如本文所述的修饰的磷酸基团完全替换未修饰的磷酸部分。在一些实施方案中，磷酸盐骨架的骨架修饰可包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷的接头的改变。
修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸(boranophosphate)、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子基团中的一个替换非桥联氧中的一个可赋予磷原子手性。立构磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。骨架也可通过用氮(桥联氨基磷酸酯)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸酯)替换桥联氧(即连接磷酸酯与核苷的氧)来修饰。替换可发生在连接氧或两个连接氧上。
在某些骨架修饰中，磷酸基团可被不含磷的连接器替换。在一些实施方案中，带电荷的磷酸基团可被中性部分替换。可替换磷酸基团的部分的实例可包括但不限于例如，膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸盐、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸盐、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼基、亚甲基二甲基肼基和亚甲氧基甲基亚氨基。
还可构建可模拟核酸的支架，其中磷酸接头和核糖糖被耐核酸酶的核苷或核苷酸替代物替换。此类修饰可包括骨架修饰和糖修饰。在一些实施方案中，核碱基可被替代骨架拴系。实例可包括但不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
修饰的核苷和修饰的核苷酸可包括对糖基的一个或多个修饰，即糖修饰。例如，可修饰2'羟基(OH)，例如用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。在一些实施方案中，对2'羟基的修饰可增强核酸的稳定性，因为羟基不再可脱质子化以形成2'-烷氧离子。
2'羟基修饰的实例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可为例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可为例如H或任选取代的芳基，并且n可为0至20(例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16和4至20)的整数。在一些实施方案中，2'羟基修饰可为2'-O-Me。在一些实施方案中，2'羟基修饰可为2'-氟修饰，其用氟化物替换2'羟基。在一些实施方案中，2'羟基修饰可包括“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基可例如通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接到相同核糖糖的4'碳，其中示例性桥可包括亚甲基、丙烯、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施方案中，2'羟基修饰可包括其中核糖环缺乏C2'-C3'键的“解锁”核酸(UNA)。在一些实施方案中，2’羟基修饰可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH2CH2OCH3，例如，PEG衍生物)。
“脱氧”2'修饰可包括氢(即脱氧核糖，例如在部分dsRNA的悬突部分处)；卤素(例如溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可为例如本文所述的)、-NHC(O)R(其中R可为例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可任选地被例如本文所述的氨基取代。
糖修饰可包含糖基，所述糖基还可含有具有与核糖中相应碳相反的立体化学构型的一个或多个碳。因此，修饰的核酸可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。修饰的核酸还可包括脱碱基糖。这些脱碱基糖也可在组成糖原子中的一个或多个处进一步修饰。修饰的核酸还可包括一种或多种L型糖，例如L-核苷。
可并入修饰的核酸中的本文所述的修饰的核苷和修饰的核苷酸可包括修饰的碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。这些核碱基可被修饰或被完全替换以提供可被并入修饰的核酸中的修饰的残基。核苷酸的核碱基可独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可包括例如碱基的天然存在的衍生物和合成的衍生物。
在采用双指导RNA的实施方案中，crRNA和tracr RNA各自可含有修饰。此类修饰可在crRNA和/或tracr RNA的一端或两端。在包含sgRNA的实施方案中，可对sgRNA的一端或两端处的一个或多个残基进行化学修饰、和/或可对内部核苷进行修饰和/或可对整个sgRNA进行化学修饰。某些实施方案包括5'端修饰。某些实施方案包括3'端修饰。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包括公开于2017年12月8日提交的标题为“Chemically Modified Guide RNAs”的WO2018/107028A1中的修饰模式中的一种，其内容特此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包括公开于US20170114334中的结构/修饰模式中的一种，其内容特此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包括公开于WO2017/136794、WO2017004279、US2018187186、US2019048338中的结构/修饰模式中的一种，其内容特此以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，经修饰的sgRNA包含以下序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，并且其中全部N包含如表1、10和12所述的白蛋白内含子1指导序列；和如表2所述的SERPINA1指导序列。例如，本文涵盖SEQ ID NO:300，其中N被表1(SEQID NO:2-33)和表2(SEQ ID NO:1000-1128)中本文公开的任何指导序列替换。
下文所述的任何修饰都可存在于本文所述的gRNA和mRNA中。
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可用于表示已被2'-O-Me修饰的核苷酸。
2’-O-甲基的修饰可描述如下：
Figure BDA0003114124080000401
已显示影响核苷酸糖环的另一种化学修饰为卤素取代。例如，核苷酸糖环上的2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。
在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”可用于表示已被2'-F取代的核苷酸。
2'-F的取代可描述如下：
Figure BDA0003114124080000411
硫代磷酸酯(PS)键联或键是指其中硫被磷酸二酯键联中(例如在核苷酸碱基之间的键中)一个非桥联磷酸氧取代的键。当使用硫代磷酸酯生成寡核苷酸时，修饰的寡核苷酸也可称为S-oligo。
可使用“*”来描述PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可用于表示通过PS键与下一个(例如3')核苷酸连接的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可用于表示已被2'-O-Me取代并通过PS键与下一个(例如3')核苷酸连接的核苷酸。
下图显示了将S-取代为非桥联磷酸氧，从而生成PS键代替磷酸二酯键：
Figure BDA0003114124080000421
脱碱基核苷酸是指缺乏含氮碱基的那些。下图描述了具有缺乏碱基的脱碱基(也称为脱嘌呤)位点的寡核苷酸：
Figure BDA0003114124080000422
反转碱基是指具有由正常的5'至3'键联反转的键联的那些碱基(即5'至5'键联或3'至3'键联)。例如：
Figure BDA0003114124080000423
脱碱基核苷酸可通过反转键联连接。例如，脱碱基核苷酸可通过5'至5'键联连接到末端5'核苷酸，或脱碱基核苷酸可通过3'至3'键联连接到末端3'核苷酸。在末端5'或3'核苷酸处的反转脱碱基核苷酸也可称为反转脱碱基端帽。
在一些实施方案中，修饰5'末端的前三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个以及3'末端的后三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个。在一些实施方案中，修饰为2'-O-Me、2'-F、反转脱碱基核苷酸、PS键或本领域中众所周知的其他核苷酸修饰，以增加稳定性和/或性能。
在一些实施方案中，5'末端的前四个核苷酸和3'末端的后四个核苷酸与硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的后三个核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的后三个核苷酸包含2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的后三个核苷酸包含反转脱碱基核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的任何指导RNA包含修饰sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA包含SEQ ID NO:200所示的修饰模式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，并且其中全部N包含将核酸酶引导到靶序列(例如在人白蛋白内含子1或SERPINA1中)的指导序列，例如，如表1或表2所示。
如上所述，在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如本文所述的Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas核酸酶的ORF的mRNA。如下所述，包含Cas核酸酶的mRNA可包含Cas9核酸酶，诸如具有裂解酶、切口酶和/或位点特异性DNA结合活性的酿脓链球菌Cas9核酸酶。在一些实施方案中，编码RNA指导的DNA核酸酶的ORF为“修饰的RNA指导的DNA结合剂ORF”或简单的“修饰的ORF”，其用作指示ORF被修饰的简写。
本文提供了Cas9 ORF，包括修饰的Cas9 ORF，并且其是本领域已知的。作为一个实例，可对Cas9 ORF进行密码子优化，使得编码序列包括一个或多个氨基酸的一个或多个替代密码子。如本文所用，“替代密码子”是指给定氨基酸的密码子使用的变化，并且对于给定的表达系统，可以是或可以不是优选或优化的密码子(密码子优化的)。优选的密码子使用或在给定的表达系统中良好耐受的密码子是本领域已知的。WO2013/176772、WO2014/065596、WO2016/106121和WO2019/067910的Cas9编码序列、Cas9 mRNA和Cas9蛋白序列特此以引用的方式并入。特别地，WO2019/067910第[0449]段的表中的ORF和Cas9氨基酸序列以及WO2019/067910第[0214]至[0234]段中的Cas9 mRNA和ORF特此以引用的方式并入。
在一些实施方案中，修饰的ORF可包含至少一个、多个或所有尿苷位置处的修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷是在5位例如被卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷是在1位例如被卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。
在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含5'帽，诸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常是通过5'-三磷酸将7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可被进一步修饰，如下面例如关于ARCA所讨论的)连接到mRNA的5'至3'链的第一个核苷酸的5’位置，即第一帽近端核苷酸。在Cap0中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-羟基。在Cap1中，mRNA的第一转录核苷酸和第二转录核苷酸的核糖分别包含2'-甲氧基和2'-羟基。在Cap2中，mRNA的第一帽近端核苷酸和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-甲氧基。参见例如Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc NatlAcad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核mRNA，包括哺乳动物mRNA诸如人mRNA，均包含Cap1或Cap2。Cap0和不同于Cap1和Cap2的其他帽结构可在哺乳动物诸如人中具有免疫原性，这是由于先天免疫系统的组分(诸如IFIT-1和IFIT-5)将其识别为“非自身”，这可能导致包括I型干扰素的细胞因子水平升高。先天免疫系统的组分(诸如IFIT-1和IFIT-5)也可能与eIF4E竞争，以便与具有Cap1或Cap2以外的帽的mRNA结合，从而可能抑制mRNA的翻译。
可共转录地包括帽。例如，ARCA(抗反向帽类似物；Thermo Fisher Scientific目录号AM8045)是帽类似物，其包含与可在起始时体外并入转录的鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位置连接的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸酯。ARCA产生Cap0帽，其中第一帽近端核苷酸的2'位置为羟基。参见例如Stepinski等人,(2001)“Synthesis and properties of mRNAscontaining the novel“anti-reverse”cap analogs7-methyl(3’-O-methyl)GpppG and7-methyl(3’deoxy)GpppGJ RNA7:1486-1495。ARCA结构如下所示。
Figure BDA0003114124080000451
CleanCapTM AG(m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于共转录地提供Cap1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化形式也可分别作为目录号N-7413和N-7433购自TriLink Biotechnologies。CleanCapTM AG结构如下所示。
Figure BDA0003114124080000461
替代地，可在转录后将帽添加到RNA上。例如，牛痘病毒加帽酶是可商购获得的(New England Biolabs目录号M2080S)，并且具有由其D1亚基提供的RNA三磷酸酶和鸟嘌呤基转移酶活性以及由其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶。因此，在S-腺苷甲硫氨酸和GTP存在的情况下，它可以将7-甲基鸟嘌呤添加到RNA，从而得到Cap0。参见例如Guo,P.和Moss,B.(1990)Proc.Natl.Acad.Set.USA 87,4023-4027；Mao,X和Shuman,S.(1994)7.Biol.Chem.269,24472-24479。
在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤，任选多至300个腺嘌呤。在一些实施方案中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100个腺嘌呤核苷酸。
D.供体构建体
本文所述的组合物和方法包括核酸构建体的用途，所述核酸构建体包含编码要插入到由本公开的指导RNA和RNA指导的DNA结合剂创建的切割位点中的异源AAT基因(例如功能性或野生型AAT)的序列。如本文所用，此种构建体有时称为“供体构建体/模板”。在一些实施方案中，构建体为DNA构建体。设计和对供体构建体进行各种功能/结构修饰的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，构建体可包含聚腺苷酸化尾序列、聚腺苷酸化信号序列、剪接受体位点或选择标记中的任何一个或多个。在一些实施方案中，聚腺苷酸化尾序列在编码序列的3'端被编码为例如“poly-A”段。设计合适的聚腺苷酸化尾序列和/或聚腺苷酸化信号序列的方法是本领域众所周知的。例如，聚腺苷酸化信号序列AAUAAA(SEQ ID NO:800)通常用于哺乳动物系统，尽管诸如UAUAAA(SEQ ID NO:801)或AU/GUAAA(SEQ ID NO:802)的变体已被鉴定。参见例如，NJ Proudfoot,Genes&Dev.25(17):1770-82,2011。
构建体的长度可根据要插入的基因的大小而变化，并且可为例如200个碱基对(bp)至约5000bp，诸如约200bp至约2000bp，诸如约500bp至约1500bp。在一些实施方案中，DNA供体模板的长度为约200bp、或为约500bp、或为约800bp、或为约1000个碱基对或为约1500个碱基对。在其他实施方案中，供体模板的长度为至少200bp、或为至少500bp、或为至少800bp、或为至少1000bp、或为至少1500bp、或至少2000、或至少2500、或至少3000、或至少3500、或至少4000、或至少4500或至少5000。
构建体可为单链、双链或部分单链和部分双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状(例如，小环)形式引入到宿主细胞中。参见例如，美国专利公布号2010/0047805、2011/0281361、2011/0207221。如果以线性形式引入，那么供体序列的末端可通过为本领域技术人员已知的方法来保护(例如，避免核酸外切降解)。例如，一种或多种双脱氧核苷酸残基添加至线型分子的3’端，并且/或者自互补寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见例如Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Set.USA 84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science272:886-889。用于保护外源多核苷酸免受降解的另外方法包括但不限于添加一个或多个末端氨基和使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。可将构建体引入到细胞中作为载体分子的一部分，所述载体分子具有另外的序列例如像复制起点、启动子和编码抗生素耐药性的基因。构建体可省略病毒元件。此外，供体构建体可作为裸露核酸、作为与剂(诸如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer))复合的核酸引入，或可通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒)来递送。
在一些实施方案中，可插入构建体，使得其表达由插入位点的内源启动子(例如，当供体整合到宿主细胞的白蛋白基因座中时为内源白蛋白启动子)驱动。在此类情况下，转基因可能缺乏驱动其表达的控制元件(例如，启动子和/或增强子)(例如，无启动子的构建体)。尽管如此，显而易见的是，在其他情况下，构建体可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或在整合时驱动功能蛋白表达的诱导型或组织特异性(例如，肝或血小板特异性)启动子。构建体可包含编码异源AAT蛋白的序列，所述序列在编码信号肽的信号序列的下游并且可操作地连接到所述信号序列。在一些实施方案中，信号肽为来自肝细胞分泌蛋白的信号肽。在一些实施方案中，信号肽为AAT信号肽。在一些实施方案中，信号肽为白蛋白信号肽。在一些实施方案中，信号肽为因子IX信号肽。构建体可包含编码异源AAT蛋白的序列，所述序列在编码AAT信号肽的信号序列的下游并且可操作地连接至所述信号序列，例如，SEQID NO：700。构建体可包含编码异源AAT蛋白的序列，所述序列在编码异源信号肽的信号序列的下游并且可操作地连接到所述信号序列。在各种实施方案中，所述方法包括编码异源AAT蛋白的序列，所述序列在编码白蛋白信号肽(SEQ ID NO：2000)的信号序列的下游并且可操作地连接至所述信号序列。在一些实施方案中，核酸构建体在同源非依赖性插入编码AAT蛋白的核酸中起作用。在一些实施方案中，核酸构建体在非分裂细胞中起作用，例如在其中NHEJ而不是HR是修复双链DNA断裂的主要机制的细胞中。核酸可为同源非依赖性供体构建体。
在一些实施方案中，供体构建体包含编码功能性AAT蛋白的异源AAT基因。在一些实施方案中，功能性AAT蛋白为根据SEQ ID NO：700的人类野生型AAT蛋白序列。在一些实施方案中，功能性AAT蛋白为根据SEQ ID NO：702的人类野生型AAT蛋白序列。本文还例示和公开编码AAT的核酸。在一些实施方案中，构建体包含编码AAT的功能变体的异源AAT基因，例如，与野生型AAT相比，具有增加的蛋白酶抑制剂活性的变体。在一些实施方案中，构建体包含编码功能变体的异源AAT基因，所述变体与SEQ ID NO：700 80％、85％、90％、93％、95％、97％、99％相同，具有与野生型AAT相比，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％、或更大活性的功能活性。在一些实施方案中，构建体包含编码功能变体的异源AAT基因，所述变体与SEQ ID NO：702 80％、85％、90％、93％、95％、97％、99％相同，具有与野生型AAT相比，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％、或更大活性的功能活性。在一些实施方案中，构建体包含编码AAT蛋白的片段的异源AAT基因，所述片段与野生型AAT相比，具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％、或更大活性的功能活性。
本文还描述了允许异源AAT基因的增强插入和表达的双向核酸构建体。简而言之，本文公开的各种双向构建体包含至少两个核酸区段，其中一个区段(第一区段)包含编码异源AAT的编码序列(有时在本文中可互换地称为“转基因”)，而另一区段(第二区段)包含其中序列的补体编码异源AAT的序列。双向构建体可包含顺式中的至少两个核酸区段，其中一个区段(第一区段)包含在一个方向上编码异源AAT的编码序列，而另一区段(第二区段)包含其中序列的补体在另一方向上编码异源AAT的序列。也就是说，第一区段是第二区段的补体(不一定是完全补体)；第二区段的补体是第一区段的反向补体(但不一定是完全反向补体，只要两者编码异源AAT)。双向构建体可包含编码与剪接受体连接的异源AAT的第一编码序列以及第二编码序列，其中补体以其他方向编码也与剪接受体连接的异源AAT。当与如本文所述的基因编辑系统(例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)系统)组合使用时，核酸构建体的双向性允许构建体在靶插入位点内的任一方向上插入(不限于在一个方向上插入)，从而允许从以下中的任一个表达异源AAT：a)一个区段的编码序列(例如，左侧区段编码图1左上方ssAAV构建体的“GFP”)或2)另一区段的补体(例如，右侧区段的补体编码左上方ssAAV构建体图1中倒转指示的“GFP”)，从而增强插入和表达效率，如本文所例示。各种已知的基因编辑系统可在本公开的实践中使用，所述基因编辑系统包括例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
可修饰本文公开的双向构建体，以包括任何特定用途所需的和/或赋予一种或多种所需功能的任何合适的结构特征。在一些实施方案中，本文公开的双向核酸构建体不包含同源臂。在一些实施方案中，本文公开的双向核酸构建体为同源非依赖性供体构建体。在一些实施方案中，部分由于核酸构建体的双向功能，双向构建体可以如本文所述的任一方向(取向)插入到基因组基因座中，以允许有效插入和/或表达感兴趣的多肽(例如，异源AAT)。
在一些实施方案中，双向核酸构建体不包含驱动异源AAT基因表达的启动子。例如，多肽的表达由宿主细胞的启动子(例如，当转基因整合到宿主细胞的白蛋白基因座中时为内源白蛋白启动子)驱动。在一些实施方案中，双向核酸构建体包括第一区段和第二区段，每个区段各自在转基因上游具有剪接受体。在某些实施方案中，剪接受体与宿主细胞的安全港位点的剪接供体序列相容，例如人白蛋白基因内含子1的剪接供体。
在一些实施方案中，双向核酸构建体包含第一区段，所述第一区段包含异源AAT的编码序列；以及第二区段，所述第二区段包含异源AAT的编码序列的反向补体。因此，第一区段中的编码序列能够表达异源AAT，而第二区段中的反向补体的补体也能够表达异源AAT。如本文所用，当提及包含反向补体序列的第二区段时，“编码序列”是指第二区段的互补(编码)链(即，第二区段中反向补体序列的补体编码序列)。
在一些实施方案中，第一区段中编码异源AAT的编码序列与也编码异源AAT的编码序列的反向补体小于100％互补。也就是说，在一些实施方案中，第一区段包含异源AAT的编码序列(1)，并且第二区段为异源AAT的编码序列(2)的反向补体，其中编码序列(1)与编码序列(2)不同。例如，可对编码异源AAT的编码序列(1)和/或编码序列(2)进行密码子优化，使得编码序列(1)和编码序列(2)的反向补体具有小于100％的互补性。在一些实施方案中，第二区段的编码序列使用由第一区段中的编码序列所编码的相同(即，相同氨基酸序列)异源AAT的一个或多个氨基酸的一个或多个替代密码子编码异源AAT。如本文所用，“替代密码子”是指给定氨基酸的密码子使用的变化，并且对于给定的表达系统，可以是或可以不是优选或优化的密码子(密码子优化的)。优选的密码子使用或在给定的表达系统中良好耐受的密码子是本领域已知的。
在一些实施方案中，第二区段包含反向补体序列，其采用与第一区段的编码序列不同的密码子使用，以减少发夹的形成。此种反向补体形成的碱基对具有少于第一区段中编码序列的所有核苷酸，但是它任选地编码相同的多肽。在此类情况下，例如第一区段的多肽A的编码序列可与例如双向构建体的后半部分的多肽A的编码序列同源但不相同。在一些实施方案中，第二区段包含与第一区段中的编码序列基本上不互补(例如，不超过70％互补)的反向补体序列。在一些实施方案中，第二区段包含与第一区段中的编码序列高度互补(例如，至少90％互补)的反向补体序列。在一些实施方案中，第二区段包含反向补体序列，其与第一区段中的编码序列具有至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％互补性。
在一些实施方案中，第二区段包含与第一区段中的编码序列具有100％互补性的反向补体序列。也就是说，第二区段中的序列为第一区段中的编码序列的完全反向补体。以举例的方式，第一区段包含假设序列5’CTGGACCGA 3’(SEQ ID NO:500)，并且第二区段包含SEQ ID NO:500的反向补体，即5’TCGGTCCAG 3’(SEQ ID NO:502)。
在一些实施方案中，双向核酸构建体包含有：第一区段，所述第一区段包含多肽或剂(例如第一多肽)的编码序列；和第二区段，所述第二区段包含多肽或剂(例如第二多肽)的编码序列的反向补体。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽相同，如上所述。在一些实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂相同，如上所述。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽不同。在一些实施方案中，第一治疗剂和第二治疗剂不同。举例来说，第一多肽为多肽A并且第二多肽为多肽B。作为进一步实例，第一多肽为多肽A并且第二多肽为多肽A的变体(例如，片段(诸如功能片段)、突变体、融合(包括在多肽末端处添加仅仅一个氨基酸)、或其组合)。
编码多肽的编码序列可任选地包含一个或多个另外的序列，诸如编码氨基或羧基末端氨基酸序列的序列，诸如信号序列、标记序列或与多肽连接的异源功能序列(例如核定位序列(NLS))。编码多肽的编码序列可任选地包含编码一个或多个氨基末端信号肽序列的序列。这些另外的序列中的每个在构建体的第一区段和第二区段中可为相同或不同的。
本文描述的双向构建体可用于表达如本文描述的AAT。
在一些实施方案中，双向核酸构建体为线性的。例如，第一区段和第二区段通过接头序列以线性方式连接。在一些实施方案中，包含反向补体序列的第二区段的5'端连接至第一区段的3'端。在一些实施方案中，第一区段的5'端连接至包含反向补体序列的第二区段的3'端。在一些实施方案中，接头序列的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、500、1000、1500、2000或更多个核苷酸。如本领域技术人员将理解的，除了接头序列之外或代替接头序列的其他结构元件可插入第一区段与第二区段之间。
可修饰本文公开的构建体，以包括任何特定用途所需的和/或赋予一种或多种所需功能的任何合适的结构特征。在一些实施方案中，本文公开的双向核酸构建体不包含同源臂。在一些实施方案中，部分由于核酸构建体的双向功能，双向构建体可以如本文所述的任一方向插入到基因组基因座中，以允许有效插入和/或表达感兴趣的多肽。
在一些实施方案中，第一区段和第二区段中的一个或两个包含开放阅读框下游的聚腺苷酸化尾序列和/或聚腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，聚腺苷酸化尾序列在第一区段和/或第二区段的3'端被编码为例如“poly-A”段。在一些实施方案中，由于在第一区段和/或第二区段的3'端处或附近编码的聚腺苷酸化信号序列的结果，共转录地提供聚腺苷酸化尾序列。设计合适的聚腺苷酸化尾序列和/或聚腺苷酸化信号序列的方法是本领域众所周知的。本文公开并例示了合适的剪接受体序列，包括小鼠白蛋白和人FIX剪接受体位点。在一些实施方案中，聚腺苷酸化信号序列AAUAAA(SEQ ID NO:800)通常用于哺乳动物系统，尽管诸如UAUAAA(SEQ ID NO:801)或AU/GUAAA(SEQ ID NO:802)的变体已被鉴定。参见例如NJ Proudfoot,Genes&Dev.25(17):1770-82,2011。在一些实施方案中，包括polyA尾序列。
在一些实施方案中，本文公开的构建体可为单链、双链或部分单链和部分双链的DNA或RNA。例如，构建体可为单链或双链DNA。在一些实施方案中，可以如本文所述修饰核酸(例如，使用核苷类似物)。
在一些实施方案中，本文公开的构建体包含构建体的任一端或两端上的剪接受体位点，例如，第一区段和/或第二区段中的开放阅读框的5'或一个或两个转基因序列的5'。在一些实施方案中，剪接受体位点包含NAG。在其他实施方案中，剪接受体位点由NAG组成。在一些实施方案中，剪接受体为白蛋白剪接受体，例如，用于将白蛋白的外显子1和2剪接在一起的白蛋白剪接受体。在一些实施方案中，剪接受体衍生自人白蛋白基因。在一些实施方案中，剪接受体衍生自小鼠白蛋白基因。在一些实施方案中，剪接受体为小鼠白蛋白剪接受体，例如，用于将白蛋白的外显子1和2剪接在一起的小鼠白蛋白剪接受体。在一些实施方案中，剪接受体衍生自人白蛋白基因。在真核生物中有用的另外的合适的剪接受体位点(包括人工剪接受体)是已知的，并且可从本领域得到。参见例如，Shapiro等人,1987,NucleicAcids Res.,15,7155-7174,Burset等人,2001,Nucleic Acids Res.,29,255-259。
在一些实施方案中，本文公开的构建体可在一端或两端上进行修饰，以根据需要包括一个或多个合适的结构特征，和/或赋予一个或多个功能益处。例如，结构修饰可根据用于将本文公开的构建体递送到宿主细胞的一个或多个方法而变化，例如，使用病毒载体递送或包装成脂质纳米颗粒以进行递送。此类修饰包括但不限于例如末端结构，诸如反向末端重复序列(ITR)、发夹、环和其他结构诸如螺旋管(toroid)。在一些实施方案中，本文公开的构建体包含一个、两个或三个ITR。在一些实施方案中，本文公开的构建体包含不超过两个ITR。结构修饰的各种方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，构建体的一端或两端可通过本领域已知的方法来保护(例如，免受核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3'末端和/或将自互补寡核苷酸连接至一端或两端。参见例如Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.ScLUSA84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272:886-889。用于保护构建体免受降解的另外方法包括但不限于添加一个或多个末端氨基和使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
在一些实施方案中，可将本文公开的构建体引入到细胞中作为载体的一部分，所述载体具有另外的序列例如像复制起点、启动子和编码抗生素耐药性的基因。在一些实施方案中，构建体可作为裸露核酸、作为与剂(诸如脂质体、聚合物或泊洛沙姆)复合的核酸引入，或可通过病毒载体(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒)来递送。
在一些实施方案中，虽然不为表达所需，但是本文公开的构建体还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码肽的序列和/或聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，包含所关注的多肽的编码序列的构建体可包括以下修饰中的一个或多个：密码子优化(例如，对人密码子进行的)和/或添加一个或多个糖基化位点。参见例如McIntosh等人(2013)Blood(17):3335-44。
E.基因编辑系统
各种已知的基因编辑系统可在本公开的实践中用于靶向插入异源AAT基因，所述基因编辑系统包括例如，CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；和转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。一般来说，基因编辑系统涉及使用工程改造的裂解系统来在靶DNA序列中诱导双链断裂(DSB)或切口(例如，单链断裂或SSB)。裂解或切口可通过使用特定的核酸酶(诸如工程改造的ZFN、TALEN)或使用CRISPR/Cas系统来发生，所述CRISPR/Cas系统具有工程改造的指导RNA来指导靶DNA序列的特异性裂解或切口。此外，已经或正在基于Argonaute系统开发靶向核酸酶和另外的核酸酶(例如，来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为“TtAgo”，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)，其也可具有用于基因组编辑和基因治疗的潜力。
应当理解，对于使用Cas核酸酶诸如本文公开的Cas核酸酶的指导RNA的方法，所述方法包括使用CRISPR/Cas系统(以及本文公开的包含编码异源AAT的序列的供体构建体中的任一个)。还应理解，本公开设想了使用本文公开的双向构建体靶向插入和表达异源AAT的方法，其可在有或没有本文公开的白蛋白指导RNA的情况下进行(例如，使用ZFN系统导致靶DNA序列中的断裂，从而创建插入双向构建体的位点)。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统(例如，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂)可用于在宿主基因组内的所需基因座处创建插入位点，在所述位点可插入包含本文公开的编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)来表达异源AAT。在一些实施方案中，异源AAT转基因可相对于其插入位点为异源的，例如插入如本文描述的安全港基因座。在一些实施方案中，靶向人白蛋白基因座(例如，内含子1)的本文描述的指导RNA(SEQ ID NO：2-33)可根据本发明方法与RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)一起使用以便建置插入位点，包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)可插入所述位点处以便表达异源AAT。包含用于将异源AAT基因靶向插入到人白蛋白基因座的内含子1中的指导序列的指导RNA在本文中例示和描述(参见例如，表1)。
使用各种RNA指导的DNA结合剂(例如核酸酶，诸如Cas核酸酶，例如Cas9)的方法在本领域中也是众所周知的。应当理解，根据上下文，可将RNA指导的DNA结合剂提供为核酸(例如，DNA或mRNA)或蛋白质。在一些实施方案中，本发明方法可在已经表达RNA指导的DNA结合剂的宿主细胞中实施。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas9核酸酶)具有裂解酶活性，其也可称为双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas9核酸酶)具有切口酶活性，其也可称为单链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶的实例包括酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其他原核生物的II型CRISPR系统的那些(参见例如，下一段中的列表)，以及它们的突变体(例如，工程改造的或其他变体)形式。参见例如US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。
Cas核酸酶可衍生自的非限制性示例性菌种包括酿脓链球菌、嗜热链球菌、链球菌某种、金黄色葡萄球菌、无害李斯特氏菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinellasuccinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形杆菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌、空肠弯曲杆菌、多杀巴斯德氏菌(Pasteurellamultocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达氏拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌、酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假真菌样芽胞杆菌(Bacillus pseudomycoides)、还原硒酸盐芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极地单胞菌某种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝杆藻某种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻某种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸降解菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色别样着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌某种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沐节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻某种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻某种、鞘丝藻某种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻某种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌某种(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)和深海单细胞蓝藻(Acaryochlorismarina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌某种的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶是来自土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、毛螺科菌、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门菌(Peregrinibacteria bacterium)、Parcubacteria门菌、史密斯氏菌属(Smithella)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、候选白蚁甲烷枝原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、犬口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)的Cpf1核酸酶。在某些实施方案中，Cas核酸酶是来自氨基酸球菌或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
在一些实施方案中，gRNA与RNA指导的DNA结合剂一起被称为核糖核蛋白复合物(RNP)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂为Cas核酸酶。在一些实施方案中，gRNA与Cas核酸酶一起被称为Cas RNP。在一些实施方案中，RNP包含I型、II型或III型组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶是来自II型CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白。在一些实施方案中，gRNA与Cas9一起被称为Cas9RNP。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解DNA的靶链。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含不止一个RuvC结构域和/或不止一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9蛋白为野生型Cas9。在组合物、用途和方法实施方案的每个中，Cas诱导靶DNA中的双链断裂。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区域被不同蛋白质的一部分替换。在一些实施方案中，可用来自不同核酸酶诸如Fok1的结构域替换Cas核酸酶结构域。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即，可切割一条DNA链以产生单链断裂，也称为“切口”。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶是在dsDNA中创建切口的酶，即切割DNA双螺旋的一条链而不切割另一条。在一些实施方案中，Cas切口酶是其中核酸内切活性位点例如通过催化结构域中的一个或多个改变(例如，点突变)而失活的Cas核酸酶(例如，上面讨论的Cas核酸酶)的形式。关于Cas切口酶和示例性催化结构域改变的讨论，参见例如美国专利号8,889,356。在一些实施方案中，Cas切口酶诸如Cas9切口酶具有失活的RuvC或HNH结构域。
在一些实施方案中，对RNA指导的DNA结合剂进行修饰以仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，可修饰剂蛋白，使得核酸酶结构域中的一个突变或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白)。参见例如Zetsche等人(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，将切口酶与分别与靶序列的正义链和反义链互补的一对指导RNA组合提供。在此实施方案中，指导RNA将切口酶引导到靶序列并通过在靶序列的相反链上产生切口(即，双切口)来引入DSB。在一些实施方案中，切口酶与靶向DNA的相反链的两个单独的指导RNA一起使用，以在靶DNA中产生双切口。在一些实施方案中，切口酶与选择为非常接近的两个单独的指导RNA一起使用，以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如，是或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可促进RNA指导的DNA结合剂转运到细胞核中。例如，异源功能结构域可为核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1至10个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1至5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与一个NLS融合。当使用一个NLS时，NLS可在RNA指导的DNA结合剂序列的N末端或C末端连接。也可将其插入到RNA指导的DNA结合剂序列中。在其他实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与不止一个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与2、3、4或5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可为相同(例如，两个SV40 NLS)或不同的。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂融合到在羧基末端连接的两个SV40 NLS序列。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合，一个在N末端连接，并且一个在C末端连接。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与3个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可为单分型序列(monopartite sequence)，例如像SV40 NLS，PKKKRKV(SEQ ID NO:600)或PKKKRRV(SEQ ID NO:601)。在一些实施方案中，NLS可为二分型序列(bipartite sequence)，诸如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK(SEQID NO:602)。在特定的实施方案中，单个PKKKRKV(SEQ ID NO:600)NLS可在RNA指导的DNA结合剂的C末端连接。融合位点任选地包括一个或多个接头。
III.递送方法
可使用本领域中可用的各种已知且合适的方法将本文公开的指导RNA(白蛋白gRNA；SERPINA1 gRNA)、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和核酸构建体(例如，双向构建体)在体内或离体递送至宿主细胞或受试者。可适当地使用相同或不同的递送方法将指导RNA、RNA指导的DNA结合剂和核酸构建体单独递送或以任何组合一起递送。
常规的基于病毒和非病毒的基因递送方法可用于在细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中引入本文公开的指导RNA以及RNA指导的DNA结合剂和供体构建体。如本文进一步提供的，非病毒载体递送系统核酸诸如非病毒载体、质粒载体和例如裸露核酸，以及与递送媒介物诸如脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)或泊洛沙姆复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒。
用于非病毒递送核酸的方法和组合物包括电穿孔、脂质体转染、显微注射、基因枪(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、LNP、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸露核酸(例如裸露DNA/RNA)、人工病毒体和DNA的剂增强的摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的超声穿孔也可以用于核酸递送。
另外的示例性核酸递送系统包括由AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Md.)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,Ma.)和Copernicus Therapeutics Inc.提供的那些(参见例如美国专利号6,008,336)。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355)中，并且脂质转染试剂在商业上销售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)。脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，诸如免疫脂质复合物)的制备是本领域众所周知的，并且如本文所述。
也可单独或组合地将含有指导RNA、RNA指导的DNA结合剂和供体构建体的各种递送系统(例如，载体、脂质体、LNP)施用到生物体以体内递送至细胞或将其离体施用到细胞或细胞培养物。通过通常用于使分子与血液、液体或细胞最终接触的任何途径进行施用，所述途径包括但不限于注射、输注、局部应用和电穿孔。施用此类核酸的合适方法是可用的，并且是本领域技术人员众所周知的。
在某些实施方案中，本公开提供编码本文公开的组合物中的任何一个或多个的DNA或RNA载体，例如，指导RNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)，其包含本文描述的指导序列中的任何一个或多个；构建体(例如.，双向构建体)，其包含编码异源AAT的序列；或编码RNA指导的DNA结合剂的序列。在某些实施方案中，本发明包括编码本文所述的组合物中的任何一种或多种或以任何组合的DNA或RNA载体。在一些实施方案中，载体还包含例如启动子、增强子和调节序列.在一些实施方案中，包含含有编码异源AAT的序列的双向构建体的载体不包含驱动异源AAT表达的启动子。在一些实施方案中，包含含有本文所述的指导序列(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)中的任何一个或多个的指导RNA的载体还包含编码如本文所公开的crRNA、trRNA或crRNA和trRNA的一个或多个核苷酸序列。
在一些实施方案中，载体包含本文描述的编码指导RNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含指导RNA的一个拷贝。在其他实施方案中，载体包含指导RNA的不止一个拷贝。在具有不止一个指导RNA的实施方案中，指导RNA可为不同的，使得它们靶向不同的靶序列，或可为相同的，因为它们靶向相同的靶序列。在载体包含不止一个指导RNA的一些实施方案中，每个指导RNA可具有其他不同的性质，诸如在与RNA指导的DNA核酸酶的复合物(诸如Cas RNP复合物)内的活性或稳定性。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列，诸如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实施方案中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNALys3或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic AcidsRes.2007 35:2620-2628。在一些实施方案中，启动子可被RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人U6启动子。在其他实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可以可操作地连接到小鼠或人H1启动子。在具有不止一个指导RNA的实施方案中，用于驱动表达的启动子可为相同或不同的。在一些实施方案中，编码指导RNA的crRNA的核苷酸和编码指导RNA的trRNA的核苷酸可提供在同一载体上。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸和编码trRNA的核苷酸可由相同的启动子驱动。在一些实施方案中，crRNA和trRNA可转录成单个转录物。例如，crRNA和trRNA可从单个转录物中加工以形成双分子指导RNA。替代地，crRNA和trRNA可转录成单分子指导RNA(sgRNA)。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可由它们在相同载体上的相应启动子驱动。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可由不同的载体编码。
在一些实施方案中，编码指导RNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)的核苷酸序列可位于相同的载体上，所述载体包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，一或多个白蛋白gRNA和/或一或多个SERPINA1 gRNA可定位于相同载体上。在一些实施方案中，一或多个白蛋白gRNA和/或一或多个SERPINA1 gRNA可与编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白的核苷酸序列一起定位在相同载体上。在一些实施方案中，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白的表达可由它们自己的相应启动子驱动。在一些实施方案中，指导RNA的表达可由与驱动RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白的表达相同的启动子驱动。在一些实施方案中，指导RNA和RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白转录物可包含在单个转录物中。例如，指导RNA可在RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白转录物的非翻译区(UTR)内。在一些实施方案中，指导RNA可在转录物的5'UTR内。在其他实施方案中，指导RNA可在转录物的3'UTR内。在一些实施方案中，可通过在其3'UTR中包含指导RNA来减少转录物的细胞内半衰期，从而缩短其3'UTR的长度。在另外的实施方案中，指导RNA可在转录物的内含子内。在一些实施方案中，可在指导RNA位于其中的内含子处添加合适的剪接位点，使得指导RNA被适当地从转录物中剪接出来。在一些实施方案中，来自同一载体的RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas蛋白)和指导RNA在时间上非常接近的表达可促进更有效地形成CRISPR RNP复合物。
在一些实施方案中，编码指导RNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)和/或RNA指导的DNA结合剂的核苷酸序列可位于同一载体上，所述载体包含含有异源AAT基因的构建体。在一些实施方案中，包含AAT基因的构建体和指导RNA(和/或RNA指导的DNA结合剂)在同一载体上的接近性可促进将构建体更有效地插入到由指导RNA/RNA指导的DNA结合剂创建的插入位点中。
在一些实施方案中，载体包含编码sgRNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA结合剂(其可为Cas蛋白，诸如Cas9或Cpf1)的mRNA。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA结合剂(其可为Cas蛋白，诸如Cas9或Cpf1)的mRNA。在一个实施方案中，Cas9来自酿脓链球菌(即Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可为sgRNA)的核苷酸序列包含侧接来自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分重复序列的指导序列或由其组成。包含crRNA、trRNA或crRNA和trRNA或由其组成的核酸还可包含载体序列，其中载体序列包含不与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起天然存在的核酸或由其组成。
在一些实施方案中，crRNA和trRNA由一个载体内的非连续核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和trRNA可由连续核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和trRNA由单个核酸的相反链编码。在其他实施方案中，crRNA和trRNA由单个核酸的相同链编码。
在一些实施方案中，载体包含含有如本文所公开的编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向核酸构建体)。在一些实施方案中，除了本文公开的供体构建体(例如，双向核酸构建体)之外，载体还可包含编码本文所述的白蛋白指导RNA的核酸和/或编码RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶诸如Cas9)的核酸。在一些实施方案中，编码白蛋白指导RNA的核酸和/或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸各自或两者都在与包含本文公开的供体构建体(例如，双向构建体)的载体分开的载体上。在任何实施方案中，载体可包括其他序列，其包括但不限于如本文所述的启动子、增强子、调节序列。在一些实施方案中，启动子不驱动供体构建体(例如，双向构建体)的异源AAT的表达。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码sgRNA的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA核酸酶(其可为Cas核酸酶(例如，Cas9))的mRNA。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA核酸酶(其可为Cas核酸酶诸如Cas9)的mRNA。在一些实施方案中，Cas9来自酿脓链球菌(即Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA和trRNA(其可为sgRNA)的核苷酸序列包含侧接来自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分重复序列的指导序列或由其组成。包含crRNA、trRNA或crRNA和trRNA或由其组成的核酸还可包含载体序列，其中载体序列包含不与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起天然存在的核酸或由其组成。
在一些实施方案中，载体可为环状。在其他实施方案中，载体可为线性的。在一些实施方案中，载体可被包封在脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制性示例性载体包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体、微型染色体、转座子、病毒载体和表达载体。
在一些实施方案中，载体可为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可从其野生型对应物进行遗传修饰。例如，病毒载体可包含一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代以促进克隆或使得载体的一个或多个特性改变。此类特性可包括包装能力、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录和翻译。在一些实施方案中，可删除病毒基因组的一部分，使得病毒能够包装具有较大尺寸的外源序列。在一些实施方案中，病毒载体可具有增强的转导效率。在一些实施方案中，由病毒在宿主中诱导的免疫应答可降低。在一些实施方案中，可使促进病毒序列整合到宿主基因组中的病毒基因(例如像整合酶)突变，使得病毒变为非整合。在一些实施方案中，病毒载体可为复制缺陷的。在一些实施方案中，病毒载体可包含外源转录或翻译控制序列，以驱动编码序列在载体上的表达。在一些实施方案中，病毒可为辅助依赖型。例如，病毒可能需要一个或多个辅助病毒来提供将载体扩增并包装成病毒颗粒所需的病毒组分(例如像病毒蛋白)。在此种情况下，可将一个或多个辅助组分(包括编码病毒组分的一个或多个载体)连同本文所述的载体系统一起引入到宿主细胞中。在其他实施方案中，病毒可为无辅助的。例如，病毒可能能够在没有辅助病毒的情况下扩增并包装载体。在一些实施方案中，本文所述的载体系统还可编码病毒扩增和包装所需的病毒组分。
非限制性示例性病毒载体包括腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助依赖型腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体和逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可为AAV载体。在其他实施方案中，病毒载体可为慢病毒载体。
在一些实施方案中，“AAV”是指所有血清型、亚型和天然存在的AAV以及重组AAV。"AAV”可用于指病毒本身或其衍生物。术语“AAV”包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂交体、鸟类AAV、牛AAV、犬科AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV。AAV的各种血清型的基因组序列，以及天然末端重复序列(TR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。此类序列可在文献中或在诸如GenBank的公共数据库中找到。如本文所用，“AAV载体”是指包含非AAV来源的异源序列(即，与AAV异源的核酸序列)的AAV载体，其通常包含编码感兴趣的异源多肽(例如AAV)的序列。构建体可包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10及其杂交体、鸟类AAV、牛AAV、犬科AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV衣壳序列。一般来讲，异源核酸序列(转基因)侧接至少一个、至少两个或至少三个AAV反向末端重复序列(ITR)。AAV载体可为单链(ssAAV)或自互补的(scAAV)。
在一些实施方案中，慢病毒可为非整合的。在一些实施方案中，病毒载体可为腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒可为高克隆能力或“无肠”腺病毒，其中从病毒中删除除5'和3'反向末端重复序列(ITR)和包装信号('I')之外的所有编码病毒区域以增加其包装能力。在其他实施方案中，病毒载体可为HSV-1载体。在一些实施方案中，基于HSV-1的载体为辅助依赖型，而在其他实施方案中，它不依赖辅助。例如，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有用于包装的结构组分的辅助病毒，而去除非必需病毒功能的删除30kb的HSV-1载体则不需要辅助病毒。在另外的实施方案中，病毒载体可为噬菌体T4。在一些实施方案中，当排空病毒头时，噬菌体T4可能能够包装任何线性或环状DNA或RNA分子。在其他实施方案中，病毒载体可为杆状病毒载体。在其他实施方案中，病毒载体可为逆转录病毒载体。在使用具有较小克隆能力的AAV或慢病毒载体的实施方案中，可能需要使用不止一个载体来递送如本文公开的载体系统的所有组分。例如，一个AAV载体可含有编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白(例如，Cas9)的序列，而第二AAV载体可含有一个或多个指导序列。
在一些实施方案中，载体系统可能能够驱动细胞中一种或多种编码序列的表达。在一些实施方案中，一旦载体整合到细胞中(例如，诸如当在白蛋白基因座的内含子1处插入时使用宿主细胞的内源启动子，如本文所例示)，则载体不包含驱动一个或多个编码序列的表达的启动子。在一些实施方案中，细胞可为原核细胞，诸如，例如细菌细胞。在一些实施方案中，细胞可为真核细胞，例如像酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为啮齿动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为人细胞。驱动不同类型的细胞中表达的合适启动子是本领域已知的。在一些实施方案中，启动子可为野生型。在其他实施方案中，可修饰启动子以更有效或更有功效地表达。在其他实施方案中，启动子可被截短但仍保留其功能。例如，启动子可具有适合将载体适当包装成病毒的正常大小或减小的大小。
在一些实施方案中，载体可包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如本文所述的Cas蛋白(例如，Cas9)的核苷酸序列。在一些实施方案中，由载体编码的核酸酶可为Cas蛋白。在一些实施方案中，载体系统可包含编码核酸酶的核苷酸序列的一个拷贝。在其他实施方案中，载体系统可包含编码核酸酶的核苷酸序列的不止一个拷贝。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可以可操作地连接到至少一个启动子。
在一些实施方案中，载体可包含含有本文所述的异源AAT基因的构建体中的任何一种或多种。在一些实施方案中，异源AAT基因可以可操作地连接到至少一个转录或翻译控制序列。在一些实施方案中，异源AAT基因可以可操作地连接到至少一个启动子。在一些实施方案中，异源基因不与驱动异源基因表达的启动子连接。
在一些实施方案中，启动子可为组成型、诱导型或组织特异性的。在一些实施方案中，启动子可为组成型启动子。非限制性示例性组成型启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、猿猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期(MLP)启动子、劳斯(Rous)氏肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子-α(EF1a)启动子、泛素蛋白启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能片段或任何前述的组合。在一些实施方案中，启动子可为CMV启动子。在一些实施方案中，启动子可为截短的CMV启动子。在其他实施方案中，启动子可为EF1a启动子。在一些实施方案中，启动子可为诱导型启动子。非限制性示例性诱导型启动子包括可由热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的那些。在一些实施方案中，诱导型启动子可为具有低基础(非诱导)的表达水平的启动子，例如像
Figure BDA0003114124080000701
启动子(Clontech)。
在一些实施方案中，启动子可为组织特异性启动子，例如，对于在肝中表达特异的启动子。
在一些实施方案中，组合物包含载体系统。在一些实施方案中，载体系统可包含一个单一载体。在其他实施方案中，载体系统可包含两个载体。在另外的实施方案中，载体系统可包含三个载体。当使用不同的指导RNA进行多路复用时，或当使用指导RNA的多个拷贝时，载体系统可包含多于三个载体。
在一些实施方案中，载体系统可包含诱导型启动子，以仅在将其递送至靶细胞后才开始表达。非限制性示例性诱导型启动子包括可由热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的那些。在一些实施方案中，诱导型启动子可为具有低基础(非诱导)的表达水平的启动子，例如像
Figure BDA0003114124080000711
启动子(Clontech)。
在另外的实施方案中，载体系统可包含组织特异性启动子，以仅在将其递送到特异性组织中后才开始表达。
单独地或以任何组合来包含指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)、RNA结合的DNA结合剂或包含编码异源AAT蛋白的序列的供体构建体的载体可通过脂质体、纳米颗粒、外来体或微囊泡来递送。载体也可通过脂质纳米颗粒(LNP)来递送。一个或多个指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)、RNA结合的DNA结合剂(例如mRNA)或包含编码异源AAT蛋白的序列的供体构建体可单独地或以任何组合通过脂质体、纳米颗粒、外来体或微囊泡来递送。一个或多个指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1gRNA)、RNA结合的DNA结合剂(例如mRNA)或包含编码异源AAT蛋白的序列的供体构建体可单独地或以任何组合通过LNP来递送。
脂质纳米颗粒(LNP)是众所周知的用于递送核苷酸和蛋白质货物的手段，并且可用于递送本文公开的指导RNA(例如白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)、RNA指导的DNA结合剂和/或供体构建体(例如，双向构建体)中的任一种。在一些实施方案中，LNP适当地以核酸(例如，DNA或mRNA)或蛋白质(例如，Cas核酸酶)或者核酸与蛋白质一起的形式递送组合物。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于将本文所述的任何指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)和/或本文公开的供体构建体(例如，双向构建体)单独或组合地递送到宿主细胞或受试者中的方法，其中任何一种或多种组分与LNP缔合。在一些实施方案中，方法还包括RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas9或编码Cas9的序列)。
在一些实施方案中，本文提供了包含单独的本文所述的任何指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)和/或本文公开的供体构建体(例如，双向构建体)或与LNP组合的组合物。在一些实施方案中，组合物还包含RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas9或编码Cas9的核酸序列)。
在一些实施方案中，LNP包含可生物降解的可电离脂质。在一些实施方案中，LNP包含十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)或另一种可电离的脂质。参见例如，PCT/US2018/053559(2018年9月28日提交)、WO/2017/173054、WO2015/095340和WO2014/136086以及本文提供的参考文献的脂质。在一些实施方案中，在LNP脂质的上下文中，术语阳离子的和可电离的是可互换的，例如，其中可电离的脂质根据pH是阳离子的。
在一些实施方案中，与本文公开的双向构建体相关的LNP用于制备用于治疗疾病或病症的药物。疾病或病症可为与α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)相关的疾病。
在一些实施方案中，无论是裸露的或作为载体的一部分，将本文描述的指导RNA、本文描述的RNA指导的DNA结合剂和/或本文公开的供体构建体(例如，双向构建体)中的任一种单独或组合地在脂质纳米颗粒中配制或通过脂质纳米颗粒施用；参见例如，WO/2017/173054，其内容特此以引用的方式整体并入。
显而易见的是，本文公开的指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的核酸)和包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如双向构建体)中的任何一种或多种可使用相同或不同的系统来递送。举例来说，指导RNA、RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)、和构建体可由相同载体(例如，AAV)来携带。或者，RNA指导的DNA结合剂诸如Cas核酸酶(如蛋白或mRNA)和/或gRNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)可由质粒或LNP来携带，而供体构建体可由载体诸如AAV来携带。各种组合中的任何一个的使用由例如其使用的实用性和效率来指导。此外，可通过相同或不同的途径(例如，通过输注；通过注射，诸如肌肉内注射、尾静脉注射或其他静脉内注射；通过腹膜内施用和/或肌肉内注射)来施用不同的递送系统。
不同的递送系统可同时或以任何相继次序在体外或体内递送。在一些实施方案中，供体构建体、指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)和Cas核酸酶可同时在体外或体内递送，例如在一个载体、两个载体、三个载体、单独的载体、一个LNP、两个LNP、单独的LNP或其组合中。在一些实施方案中，供体构建体可在递送单独作为载体和/或与LNP缔合或一起作为核糖核蛋白(RNP)的白蛋白指导RNA和/或Cas核酸酶(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)之前作为载体和/或与LNP缔合在体内或在体外递送。在一些实施方案中，供体构建体可以多次施用递送，例如每天、每两天、每三天、每四天、每周、每两周、每三周或每四周。在一些实施方案中，供体构建体可以一周的间隔递送，例如，在第1周、第2周和第3周等。作为进一步的实例，白蛋白指导RNA和Cas核酸酶可在递送作为载体和/或与LNP缔合的构建体(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)之前单独作为载体和/或与LNP缔合或一起作为核糖核蛋白(RNP)在体内或在体外递送。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA可以多次施用递送，例如每天、每两天、每三天、每四天、每周、每两周、每三周或每四周。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA可以一周的间隔递送，例如，在第1周、第2周和第3周等。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以多次施用递送，例如，可以每天、每两天、每三天、每四天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以一周的间隔递送，例如，在第1周、第2周和第3周等。
在一些实施方案中，本公开还提供了用于施用本文公开的指导RNA(白蛋白gRNA和/或SERPINA1 gRNA)中的任一种的药物制剂。在一些实施方案中，药物制剂包括RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)和包含异源AAT的编码序列的供体构建体，如本文所公开的。适合递送到受试者(例如，人受试者)中的药物制剂是本领域众所周知的。
IV.使用方法
编码AAT的基因定位在染色体14q32.1和蛋白酶抑制剂(Pi)基因座的一部分上。正常AAT可被称为PiM。PiZ突变可导致肝脏和/或肺部症状，包括在纯合(ZZ)和杂合(MZ或SZ)个体中。PiS突变可导致血清AAT的较轻微减少和肺病的较低风险。许多其他等位基因突变在本领域中为已知的。参见例如Greulich等人"Alpha-1-antitrypsin deficiency:increasing awareness and improving diagnosis,"Ther Adv Respir Dis.2016。
AATD可通过在本领域中已知的方法，例如，存在一或多种生理症状、血液测试、和/或迄今为止所报告的150+已知AAT突变中的一个或多个的遗传测试来诊断。参见，例如，同上。血液和/或测试的实例包括但是不限于测定血清AAT水平、通过聚合酶链反应(PCR)和/或下一代测序(NGS)来检测突变、使用或不使用免疫印迹的情况下的等电聚焦(IEF)、AAT基因座测序、和血清分离卡(检测Z蛋白的侧流测定)。
在一些实施方案中，使用免疫扩散方法(所述方法可能将血清水平评价过高)，AAT血清水平在150-350mg/dL范围内可被认为是正常的。在这些实施方案中，尽管80mg/dL的水平低于正常范围，但是其可被视为保护性的，例如，减少一或多种症状例如肺气肿的风险。
在一些实施方案中，使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准，AAT血清水平在90-200mg/dL范围内可被认为是正常的。在这些实施方案中，尽管50mg/dL的水平低于正常范围，但是其可被视为保护性的，例如，减少一或多种症状例如肺气肿的风险。
在一些实施方案中，小于约130mg/dL、125mg/dL、120mg/dL、115mg/dL、110mg/dL、105mg/dL、或100mg/dL的AAT血清水平指示纯合AAT突变的低可能性并且可能不需要进一步遗传测试。在一些实施方案中，约104mg/dL的AAT血清水平指示纯合PiS的低可能性，并且113mg/dL指示纯合PiZ的低可能性。在一些实施方案中，AAT血清水平可提供杂合带基因者的有限排除信息，并且进一步遗传测试可为必需的，因为约150mg/dL的AAT血清水平指示杂合带基因者PiMZ的低可能性，并且约220mg/dL的AAT血清水平指示杂合带基因者piMS的低可能性。
可检测生理症状的实例包括但不限于肺部疾病和/或肝脏疾病；喘息或呼吸急促；肺部感染的风险增加；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；支气管炎，哮喘，呼吸困难；肝硬化；新生儿黄疸；脂膜炎；慢性咳嗽和/或痰；反复感冒；皮肤或眼睛的白色部分发黄；腹部或腿部肿胀。在一些实施方案中，如果个体是COPD患者，无反应性哮喘患者，病因不明的支气管扩张患者，患有隐源性肝硬化/肝脏疾病、肉芽肿伴多血管炎、坏死性脂膜炎的个体和/或AATD患者/带基因者的一级亲属，则个体可经受血液和/或基因测试。在一些实施方案中，可执行肺功能测试(PFT)、机能残气量(RFC)、和/或肺总气量(TLC)下的肺密度损失。
在一些实施方案中，待治疗的受试者包括AAT血清低于正常范围的个体。在一些实施方案中，待治疗的受试者包括具有任何等位基因突变组合的个体，例如，ZZ、MZ、MS。在一些实施方案中，待治疗的受试者包括支气管扩张剂后FEV1为预测正常值的至少30％、40％、50％、60％的个体。在一些实施方案中，待治疗的受试者包括适合于支气管镜检查的个体。在一些实施方案中，待治疗的受试者包括具有足够肝和肾功能的个体，不吸烟者，未进行肺或肝叶切除术、移植的个体，未进行肺减容手术的个体，即将在治疗前未经历急性呼吸道感染或发生COPD恶化的个体，和/或没有不稳定肺心病的个体。
如本文描述，本公开提供在人类安全港位点，诸如白蛋白安全港位点处表达异源AAT(例如，功能性或野生型AAT)以便允许分泌蛋白的组合物和方法。在一些实施方案中，所述方法由此减轻肺部中的AATD的不利影响。本公开还提供剔除内源性SERPINA1基因，从而消除与肝细胞中的AAT蛋白聚合和聚集相关的突变体形式的AAT的产生的组合物和方法，所述AAT蛋白聚合和聚集导致AATD患者中的肝脏症状。参见WO/2018/119182，其全部以引用方式并入。因此，本文公开的组合物和方法通过减轻肺部以及肝脏中的病症的不利影响来治疗AATD。
AAT主要由肝细胞合成和分泌，并且用来抑制肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性。在没有足够数量的运作AAT的情况下，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶不受控制并且破坏肺部中的肺泡。因此，SERPINA1中的导致AAT水平减少、或正确地运作AAT的水平减少的突变导致肺部病状，包括例如慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管炎、或哮喘。
本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码功能性异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂可用于在体内或活体外将异源AAT核酸引入宿主细胞。在一些实施方案中，本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂可用于在宿主细胞中，或在有需要的受试者中表达功能性异源AAT。在一些实施方案中，本文所述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)和RNA指导的DNA结合剂可用于治疗有此需要的受试者的AATD。在一些实施方案中，通过在白蛋白基因座处表达异源AAT来治疗AATD可增强功能性(例如，野生型)AAT的分泌，并且减轻AATD的一或多个症状，例如，对于肺部的不利影响。举例来说，异源AAT表达可减轻肺部疾病和/或肝脏疾病；喘息或呼吸急促；肺部感染的风险增加；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；支气管炎，哮喘，呼吸困难；肝硬化；新生儿黄疸；脂膜炎；慢性咳嗽和/或痰；反复感冒；皮肤或眼睛的白色部分发黄；腹部或腿部肿胀施用本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA的指导DNA结合剂中的任何一个或多个导致功能性(例如，野生型)AAT基因表达、AAT蛋白水平(例如循环、血清、或血浆水平)和/或AAT活性水平(例如，胰蛋白酶抑制)增加(例如通过浊度测定或免疫比浊法，例如与未治疗的对照相比，大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％AAT基因表达或蛋白水平，例如，血清中的AAT大于约40mg/dL、45mg/dL、50mg/dL、60mg/dL、70mg/dL、80mg/dL、90mg/dL、100mg/dL、或110mg/dL)。在一些实施方案中，可通过测量血清或血浆AAT活性来评估治疗的有效性，其中受试者的血清或血浆水平和/或AAT的活性的增加指示治疗的有效性。在一些实施方案中，可通过测量血清或血浆AAT蛋白和/或活性水平来评估治疗的有效性，其中受试者的血清或血浆水平和/或AAT的活性的增加指示治疗的有效性。在一些实施方案中，治疗的有效性可通过肝脏组织切片的PASD染色，以便例如测量聚集来评估。在一些实施方案中，治疗的有效性可通过测量例如肺部中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制来评估。在一些实施方案中，治疗的有效性可通过基因型血清水平、AAT肺功能、肺活量检查、肺部胸部X线检查、肺部CT扫描、肝功能的血液检查和/或肝超声来评估。
在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如保护性水平。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如正常范围内。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如高于40、50、60、70、80、90、或100mg/dL，例如，如使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准来测量。
在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如保护性水平。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如正常范围内。在一些实施方案中，治疗是指将血清AAT水平增加至例如高于40、50、60、70、80、90、或100mg/dL，例如，如使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准来测量。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，基线血清AAT的改善。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，AATD相关肝脏疾病的组织学分级得以改善例如1、2、3、或更多个点。在一些实施方案中，治疗是指与例如治疗前后的对照相比，Ishak纤维化评分的改善。
在正常或健康个体(例如，不具有ZZ、MZ、或SZ等位基因的个体)中，血清中的AAT水平在约500μg/ml至约3000μg/ml之间变化。临床上，循环AAT的水平可通过酶促和/或免疫测定(例如，ELISA)来测量，所述方法在本领域中是熟知的。参见例如Stoller,J.andAboussouan,L.(2005)Alphal-antitrypsin deficiency.Lancet365:2225-2236；Kanakoudi F,Drossou V,Tzimouli V等人Serumconcentrations of 10acute-phaseproteins in healthy term and pre-term infants from birth to age 6months.ClinChem 1995；41:605-608；Morse JO:Alpha-1-antitrypsin deficiency.N Engl J Med1978；299:1045-1048,1099-1105；Cox DW:Alpha-1-antitrypsin deficiency.In TheMetabolic and Molecular Basis of Inherited Disease.第3卷第7版CR Seri ver,ALBeaudet,WS Sly,D Valle.编New York,McGraw-Hill Book Company,1995,第4125页至第4158页。
因此，在一些实施方案中，在患有AATD(例如具有ZZ、MZ、或SZ等位基因的个体)或处于患上AATD的风险(例如，具有ZZ、MZ、或SZ等位基因的个体)的受试者中，本文公开的组合物和方法可用于将AAT(例如，功能性AAT或野生型AAT)的血清或血浆水平增加至约500μg/ml、或更多。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于将AAT蛋白水平增加至约1500μg/ml。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于将AAT蛋白水平增加至约1000μg/ml至约1500μg/ml、约1500μg/ml至约2000μg/ml、约2000μg/ml至约2500μg/ml、约2500μg/ml至约3000μg/ml或更高。举例来说，本文公开的组合物和方法可用于将患有AATD的受试者中的AAT的血清或血浆水平增加至约500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000μg/ml、或更多。
在一些实施方案中，在患有AATD(例如具有ZZ、MZ、或SZ等位基因的个体)或处于患上AATD的风险(例如，具有ZZ、MZ、或SZ等位基因的个体)的受试者中，与施用之前的受试者AAT血清或血浆水平相比，本文公开的组合物和方法可用于将AAT的血清或血浆水平增加约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、或更多。
在一些实施方案中，与施用到宿主细胞前的AAT水平(例如，正常水平)相比，本文公开的组合物和方法可用于将宿主细胞中异源功能性AAT蛋白和/或AAT活性增加约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更高。在一些实施方案中，细胞为肝脏细胞。
在一些实施方案中，细胞(宿主细胞)或细胞群能够表达AAT，例如，来源于肝脏、肺部、胃器官、肾、胃、近端和远端小肠、胰腺、肾上腺或大脑中的任何一种或多种的组织的细胞。
在一些实施方案中，方法包括在LNP中施用指导RNA和RNA指导的DNA结合剂(诸如编码Cas9核酸酶的mRNA)。在其他实施方案中，方法包括施用编码AAT蛋白的AAV核酸构建体，诸如双向AAT构建体。包含指导RNA和编码Cas9的mRNA的CRISPR/Cas9LNP可静脉内施用。AAV AAT供体构建体可静脉内施用。CRISPR/Cas9 LNP的示例性给药包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8或10mpk(RNA)。单位mg/kg和mpk在本文中可互换使用。包含编码AAT蛋白的核酸的AAV的示例性给药包括约1011、1012、1013、和1014vg/kg的MOI，任选地MOI可为约1x1013至1x 1014vg/kg。
在一些实施方案中，方法包括表达治疗有效量的AAT蛋白。在一些实施方案中，方法包括在个体中达到治疗有效水平的循环AAT活性。在特定的实施方案中，方法包括达到至少约5％至约50％正常值的AAT活性。方法可包括达到至少约50％至约150％正常值的AAT活性。在某些实施方案中，方法包括使AAT活性相对于患者基线AAT活性增加至少约1％至约50％的正常AAT活性、或至少约5％至约50％的正常AAT活性或至少约50％至约150％的正常AAT活性。
在一些实施方案中，方法还包括达到持久效果，例如至少1个月、2个月、6个月、1年或2年效果。在一些实施方案中，方法还包括以持久和持续的方式达到治疗效果，例如至少1个月、2个月、6个月、1年或2年效果。在一些实施方案中，循环AAT活性和/或水平的水平稳定至少1个月、2个月、6个月、1年或更长时间。在一些实施方案中，达到AAT蛋白的稳态活性和/或水平至少7天、至少14天或至少28天。在另外的实施方案中，方法包括在单次给药后维持AAT活性和/或水平至少1、2、4或6个月，或至少1、2、3、4或5年。
在涉及插入白蛋白基因座的另外的实施方案中，个体的循环白蛋白水平是正常的。方法可包括将个体的循环白蛋白水平维持在正常循环白蛋白水平的±5％、±10％、±15％、±20％或±50％之内。在某些实施方案中，与未经治疗的个体的白蛋白水平相比，个体的白蛋白水平至少在第4周、第8周、第12周或第20周没有变化。在某些实施方案中，个体的白蛋白水平瞬时下降，然后恢复正常水平。特别地，方法可包括检测血浆白蛋白水平无显著改变。
在一些实施方案中，本发明包括一种修饰白蛋白基因(诸如人白蛋白基因)(例如，在其中创建双链断裂)的方法或用途，所述方法或用途包括将本文所述的gRNA、供体构建体(例如，包含编码AAT的序列的双向构建体)和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种施用或递送至宿主细胞或宿主细胞群。在一些实施方案中，本发明包括一种修饰白蛋白内含子1区域(诸如人白蛋白内含子1区域)(例如，在其中创建双链断裂)的方法或用途，所述方法或用途包括将本文所述的gRNA、供体构建体(例如，包含编码AAT的序列的双向构建体)和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种施用或递送至宿主细胞或宿主细胞群。在一些实施方案中，本发明包括一种修饰人安全港(诸如肝脏组织或肝细胞宿主细胞)(例如，在其中创建双链断裂)的方法或用途，所述方法或用途包括将本文所述的gRNA、供体构建体(例如，包含编码AAT的序列的双向构建体)和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种施用或递送至宿主细胞或宿主细胞群。插入安全港基因座(诸如白蛋白基因座)中允许SERPINA1基因过度表达，而不会对宿主细胞或细胞群(诸如肝细胞或肝脏细胞)产生显著的有害影响。
在一些实施方案中，本发明包括一种修饰人白蛋白基因座的内含子1(例如，在其中创建双链断裂)的方法或用途，所述方法或用途包括将本文所述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种施用或递送至宿主细胞。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA包含含有能够结合人白蛋白基因座的内含子1(SEQ ID NO:1)内区域的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA包含选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有SEQ ID NO:4、13、17、19、27、28、30、或31中任何一个的序列的指导序列。在一些实施方案中，所述施用在体外进行。在一些实施方案中，所述施用在体内进行。在一些实施方案中，供体构建体是包含编码异源AAT的序列的双向构建体。在一些实施方案中，宿主细胞为肝脏细胞。
在一些实施方案中，本公开提供将异源AAT核酸(例如，功能性或野生型AAT)引入宿主细胞的方法或用途，其包括施用或递送本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有能够结合人白蛋白基因座的内含子1(SEQ ID NO:1)内区域的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA包含选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，白蛋白指导RNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有SEQ ID NO:4、13、17、19、27、28、30、或31中任何一个的序列的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自以下的序列：a)与选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、或33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、或33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96或97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，所述施用在体外进行。在一些实施方案中，所述施用在体内进行。在一些实施方案中，供体构建体是包含编码异源AAT(例如，功能性或野生型AAT)的序列的双向构建体。在一些实施方案中，宿主细胞为肝脏细胞。
在一些实施方案中，本公开提供在宿主细胞中表达异源AAT(例如，功能性或野生型AAT)的方法或用途，其包括施用或递送本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，有需要的受试者在出生与2岁龄之间；2至12岁龄之间；或12至21岁龄之间。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有能够结合人白蛋白基因座的内含子1(SEQ ID NO:1)内区域的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有SEQ ID NO:4、13、17、19、27、28、30、或31中任何一个的序列的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自以下的指导序列：a)与选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、或33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、或33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96或97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标内或跨越所述基因组坐标的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸互补的序列。在一些实施方案中，所述施用在体外进行。在一些实施方案中，所述施用在体内进行。在一些实施方案中，供体构建体是包含编码异源AAT的序列的双向构建体。在一些实施方案中，宿主细胞为肝脏细胞。
在一些实施方案中，本公开提供治疗AATD的方法或用途，其包括施用或递送本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有能够结合小鼠或人白蛋白基因座的内含子1(SEQ ID NO:1)内区域的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自由SEQ IDNO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有SEQ ID NO:4、13、17、19、27、28、30、或31中任何一个的序列的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自以下的序列：a)与选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；b)选自由SEQID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19、或20个邻接核苷酸；f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；和g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列。2-33.在一些实施方案中，供体构建体是包含编码异源AAT的序列的双向构建体。在一些实施方案中，宿主细胞为肝脏细胞。
在一些实施方案中，本公开提供增加来自肝细胞的功能性AAT分泌的方法或用途，其包括施用或递送本文描述的白蛋白gRNA、供体构建体(例如，包含编码异源AAT的序列的双向构建体)、和RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)中的任何一种或多种。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有能够结合小鼠或人白蛋白基因座的内含子1(SEQ ID NO:1)内区域的至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的指导序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列的至少15、16、17、18、19、或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含与选自由SEQ ID NO：2-33组成的组的序列至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％或88％相同的序列。在一些实施方案中，白蛋白gRNA包含含有SEQ ID NO:4、13、17、19、27、28、30、或31中任何一个的序列的指导序列。在一些实施方案中，所述施用在体外进行。在一些实施方案中，所述施用在体内进行。在一些实施方案中，供体构建体是包含编码异源AAT的序列的双向构建体。在一些实施方案中，宿主细胞为肝脏细胞。
如本文所述，可使用本领域已知的任何合适的递送系统和方法来递送包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA和RNA指导的DNA结合剂。组合物可同时或以任何相继次序在体外或体内递送。在一些实施方案中，供体构建体、白蛋白gRNA和Cas核酸酶可同时在体外或体内递送，例如在一个载体、两个载体、单独的载体、一个LNP、两个LNP、单独的LNP或其组合中。在一些实施方案中，供体构建体可在递送单独作为载体和/或与LNP缔合或一起作为核糖核蛋白(RNP)的白蛋白gRNA和/或Cas核酸酶(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)之前作为载体和/或与LNP缔合在体内或在体外递送。作为进一步的实例，指导RNA和Cas核酸酶可在递送作为载体和/或与LNP缔合的构建体(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天)之前单独作为载体和/或与LNP缔合或一起作为核糖核蛋白(RNP)在体内或在体外递送。在一些实施方案中，指导RNA和Cas核酸酶与LNP缔合并且在递送供体构建体之前递送至宿主细胞。
在一些实施方案中，供体构建体包含编码异源AAT的序列，其中AAT序列为野生型AAT，例如，SEQ ID NO：700或702。在一些实施方案中，所述序列编码AAT的功能变体。举例来说，与野生型AAT相比，变体具有增加的胰蛋白酶抑制活性。在一些实施方案中，所述序列编码的AAT变体与SEQ ID NO：702 80％、85％、90％、93％、95％、97％、99％相同，具有与野生型AAT相比，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％、或更大活性的功能活性。在一些实施方案中，所述序列编码AAT的功能片段，其中所述片段与野生型AAT相比具有至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％、99％、100％或更多的活性。
在一些实施方案中，供体构建体(例如，双向构建体)在核酸载体(诸如AAV载体，例如AAV8)中施用。在一些实施方案中，供体构建体不包含同源臂。
在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者是人类。在一些实施方案中，受试者为奶牛、猪、猴、绵羊、狗、猫、鱼或家禽。
在一些实施方案中，静脉内施用包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA和RNA指导的DNA结合剂。在一些实施方案中，将包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA和RNA指导的DNA结合剂施用到肝循环中。
在一些实施方案中，单次施用包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA和RNA指导的DNA结合剂足以使AAT的表达和分泌增加至所需水平。在其他实施方案中，不止一次施用包含含有编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA和RNA指导的DNA结合剂的组合物可有益于最大化治疗效果。
在一些实施方案中，多次施用包含编码异源AAT的序列的供体构建体(例如，双向构建体)、白蛋白gRNA、和RNA指导的DNA结合剂用于将AAT的表达和分泌增加至需要水平和/或经由累积效应来使编辑达到最大值。在一些实施方案中，多次施用白蛋白指导RNA用于增加表达和分泌AAT需要水平和/或经由累积效应来使编辑达到最大值。在一些实施方案中，多个施用Cas核酸酶用于将AAT的表达和分泌增加至需要水平和/或经由累积效应来使编辑达到最大值。在一些实施方案中，供体构建体、白蛋白指导RNA和/或Cas核酸酶可以每天、每两天、每三天、每四天、每周、每两周、每三周或每四周递送。在一些实施方案中，治疗AATD的方法进一步包括施用包含SEQ ID NO：1000-1128的指导序列中的任何一种或多种的SERPINA1指导RNA。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO：1000-1128的指导序列中的任何一种或多种的SERPINA1 gRNA来治疗AATD。SERPINA1指导RNA可与Cas蛋白或编码Cas蛋白例如像Cas9的mRNA或载体一起施用。
在一些实施方案中，治疗AATD的方法包括减少或预防在受试者的血清、肝脏、肝脏组织、肝脏细胞、和/或肝细胞中的AAT(例如，突变型、非功能性AAT)的积累，提供包含施用包含SEQ ID NO：1000-1128的指导序列中的任何一种或多种的SERPINA1指导RNA。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO：1000-1128的指导序列中的任何一种或多种的SERPINA1gRNA来减少或防止AAT(例如，突变型、非功能性AAT)在肝脏、肝脏组织、肝脏细胞、和/或肝细胞中的积累。gRNA可与RNA指导的DNA结合剂诸如Cas蛋白或编码Cas蛋白例如像Cas9的mRNA或载体一起施用。
在一些实施方案中，包含表3的指导序列的SERPINA1 gRNA与Cas蛋白一起诱导DSB，并且在修复期间的非同源末端连接(NHEJ)导致SERPINA1基因的突变。在一些实施方案中，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入，从而诱导SERPINA1基因中的读框移位或无义突变。在一些实施方案中，包含表2的指导序列的gRNA与Cas蛋白一起诱导DSB，并且NHEJ修复介导模板核酸构建体的插入。在一些实施方案中，模板核酸的插入增加分泌的AAT蛋白水平。在一些实施方案中，模板核酸的插入增加分泌的异源AAT蛋白水平。在一些实施方案中，模板核酸的插入增加血液、血清、和/或血浆AAT蛋白水平。
在一些实施方案中，施用本文公开的SERPINA1指导RNA减少由受试者产生的突变α-1抗胰蛋白酶(AAT)的水平，并且由此防止AAT在肝脏中的积累和聚集。
在一些实施方案中，单次施用本文公开的SERPINA1指导RNA足以敲低突变体蛋白的表达。在一些实施方案中，单次施用本文公开的SERPINA1指导RNA足以敲低或剔除突变体蛋白的表达。在其他实施方案中，一次以上施用本文公开的SERPINA1指导RNA可有利于经由累积效应来使编辑达到最大值。
在一些实施方案中，施用本文公开的插入指导RNA增加由受试者产生的循环α-1抗胰蛋白酶(AAT)的水平，并且由此防止与高嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性相关的破坏。
在一些实施方案中，单次施用或多次施用本文公开的插入指导RNA足以增加功能性AAT蛋白的表达。在一些实施方案中，单次施用或多次施用本文公开的插入指导RNA足以补充或恢复AAT蛋白活性的表达。在一些实施方案中，插入指导RNA导致AAT血清水平增加至例如保护性水平(例如，如通过免疫扩散来测量，等于或高于80mg/dL，如使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准来测量，等于或高于50mg/dL)。在一些实施方案中，插入指导RNA导致AAT血清水平增加至例如正常水平(例如，如通过免疫扩散来测量，150-350mg/dL，如使用浊度测定或免疫比浊法和纯化标准来测量，90-200mg/dL)。在一些实施方案中，插入指导RNA导致与例如治疗前后的对照相比，AATD相关肝脏疾病的组织学分级得以改善例如1、2、3、或更多个点。在一些实施方案中，插入指导RNA导致与例如治疗前后的对照相比，Ishak纤维化评分的改善。在一些实施方案中，单次施用改善肺病度量，例如如通过肺功能测试(PFT)、机能残气量(RFC)、和/或肺总气量(TLC)下的肺密度损失来测定。在其他实施方案中，一次以上施用本文公开的插入指导RNA可有利于经由累积效应来使编辑达到最大值。
在一些实施方案中，用本文提供的组合物的治疗的功效在递送之后1年、2年、3年、4年、5年、或10年观察到。
在一些实施方案中，治疗减慢或终止与AATD相关的肺病进展。在一些实施方案中，治疗改善肺病度量。在一些实施方案中，肺病通过肺结构、肺功能、或受试者的症状的变化来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过受试者的增加的存活时间来测量。
在一些实施方案中，治疗的功效通过减缓肺部适应症的发展来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过任何一种或多种COPD、肺气肿、或呼吸困难的临床改善来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过咳嗽、痰产生、或喘息中的任何一种或多种的改善来测量。
在一些实施方案中，治疗减缓或终止肝脏疾病进展。在一些实施方案中，治疗改善肝脏疾病度量。在一些实施方案中，肝脏疾病通过肝脏结构、肝脏功能、或受试者的症状的变化来测量。
在一些实施方案中，治疗的功效通过延迟或避免受试者的肝移植的能力来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过受试者的增加的存活时间来测量。
在一些实施方案中，治疗的功效通过血液中的肝脏酶的减少来测量。在一些实施方案中，肝脏酶是丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)。
在一些实施方案中，治疗的功效通过基于活检结果，减缓肝脏中的瘢痕组织的发展或减少瘢痕组织来测量。
在一些实施方案中，治疗的功效使用患者报告的结果诸如疲劳、虚弱、痒、食欲损失、食欲损失、体重损失、恶心、或腹胀来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过水肿、腹水、或黄疸减少来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过门静脉高血压降低来测量。在一些实施方案中，治疗的功效通过肝癌率降低来测量。
在一些实施方案中，治疗的功效使用成像方法来测量。在一些实施方案中，成像方法是超声波、计算机断层摄影术、磁共振成像、或弹性成像。
在一些实施方案中，如与施用组合物之前的血清和/或肝脏AAT水平(例如，突变型、非功能性AAT)相比，血清和/或肝脏AAT水平(例如，突变型、非功能性AAT)减少40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、95-98％、98-99％、或99-100％。
在一些实施方案中，SERPINA1基因的编辑百分比在30与99％之间。在一些实施方案中，编辑百分比在30与35％、35与40％、40与45％、45与50％、50与55％、55与60％、60与65％、65与70％、70与75％、75与80％、80与85％、85与90％、90与95％、或95与99％之间。
在一些实施方案中，提供包含表1或表2、或表3中的任何一种或多种指导序列的任何一种或多种指导RNA(白蛋白gRNA；和/或SERPINA1 gRNA)(例如，在本文提供的组合物中)的用途，用于制备供治疗患有AATD的人类受试者的药物。
在一些实施方案中，本公开提供包含有包含表1或表2中公开的任何一种或多种指导序列的任何一种或多种gRNA的组合疗法以及适合于减轻AATD的肺部症状的增强疗法。在一些实施方案中，肺病的增强疗法是使用从人类血浆纯化的AAT的静脉内疗法，如在Turner,BioDrugs 2013Dec；27(6):547-58中所描述。在一些实施方案中，增强疗法是使用
Figure BDA0003114124080000911
或
Figure BDA0003114124080000912
在一些实施方案中，组合疗法包含有包含表1或表2中公开的任何一种或多种指导序列的任何一种或多种gRNA，以及靶标ATT或突变型ATT的siRNA。在一些实施方案中，siRNA是能够进一步减少或消除野生型或突变型AAT的表达的任何siRNA。在一些实施方案中，siRNA在包含表1或表2中公开的任何一种或多种指导序列的任何一种或多种gRNA之后施用。在一些实施方案中，在用本文提供的任何gRNA组合物来治疗之后，定期施用siRNA。
在一些实施方案中，组合疗法包含有包含表1或表2中公开的任何一种或多种指导序列的任何一种或多种gRNA2以及一种或多种用于戒烟的治疗，预防接种，支气管扩张剂，必要时补充氧气和与针对吸烟相关的COPD患者设计的程序类似的程序中的身体康复。
此描述和示例性实施方案不应被视为限制性的。为了本说明书和所附实施方案的目的，除非另外指出，否则在所有情况下，就没有被术语“约”修饰来说，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和实施方案中使用的其他数值理解为由所述术语修饰。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附实施方案中所阐述的数值参数为近似值，其可根据要寻求获得的所需性质而变化。在最低限度并且不试图限制对实施方案范围的等同原则的应用，每个数值参数均应当至少根据报道的有效数字的数值和通过应用普通四舍五入技术来解读。
人AAT蛋白质序列(SEQ ID NO:700)NCBI Ref:NP_000286:
Figure BDA0003114124080000921
人AAT核苷酸序列(SEQ ID NO:701)NCBI Ref:NM_000295):
Figure BDA0003114124080000931
Figure BDA0003114124080000941
由P00450(SEQ ID NO:702)编码的α1-抗胰蛋白酶多肽：
Figure BDA0003114124080000942
人AAT蛋白信号序列(SEQ ID NO:1129)
Figure BDA0003114124080000943
实例
提供以下实施例来例示某些公开的实施方案，并且不应以任何方式解释为限制本公开的范围。
实施例1-材料和方法
克隆和质粒制备
合成由AAV2 ITR侧接的双向插入构建体，并由商业供应商将其克隆到pUC2-Kan中。将所得构建体(P00147)用作其他载体的亲本克隆载体。其他插入构建体(不含ITR)也被商业合成并克隆到pUC57中。用BglII限制酶(New England BioLabs，目录号R0144S)消化纯化的质粒，并将插入构建体克隆到亲本载体中。质粒在Stbl3TM化学感受态大肠杆菌(ThermoFisher，目录号C737303)中繁殖。
AAV产生
HEK293细胞中的三重转染用于用感兴趣的用于AAV8和AAV-DJ生产的构建体包装基因组，并且通过碘克沙醇梯度超速离心法从裂解的细胞和培养基中纯化所得载体(参见例如，Lock等人.,Hum Gene Ther.2010年10月；21(10):1259-71)。在三重转染中使用的质粒含有具有感兴趣的构建体的基因组，在实施例中通过“PXXXX”号引用，也参见例如表14。将分离的AAV在储存缓冲液(含0.001％Pluronic F68的PBS)中透析。使用位于ITR区域内的引物/探针通过qPCR确定AAV滴度。
核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)
使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶通过体外转录产生含有N1-甲基假U的加帽和聚腺苷酸化酿脓链球菌(“Spy”)Cas9mRNA。一般来讲，通过在37℃下与XbaI孵育以完全消化，之后在65℃下对XbaI进行热灭活20min，将含有T7启动子和100nt聚(A/T)区的质粒DNA线性化。从酶和缓冲盐中纯化线性化质粒。将产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应在以下条件下于37℃孵育4小时：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)各自为2mM；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。添加TURBO RNA酶(ThermoFisher)至最终浓度为0.01U/μL，并将反应再孵育30分钟以去除DNA模板。根据制造商的方案(ThermoFisher)，使用MegaClear转录清洁试剂盒纯化Cas9 mRNA。替代地，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀或使用LiCl沉淀方法之后通过切向流过滤进一步纯化来纯化Cas9mRNA。通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)来确定转录物浓度，并且通过借助Bioanlayzer(Agilent)的毛细管电泳来分析所述转录物。
下面的Cas9包含Cas9 ORF SEQ ID NO:288或PCT/US2019/053423(其特此以引用的方式并入)的表24的序列。
SEQ ID NO:288:
Figure BDA0003114124080000971
Figure BDA0003114124080000981
用于递送Cas9 mRNA和gRNA的脂质制剂
利用脂质制剂将Cas9 mRNA和gRNA递送至细胞和动物，所述脂质制剂包含可电离的脂质十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯(也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。
对于利用预混合脂质制剂(在本文中称为“脂质包”)的实验，将组分以50:38:9:3的可电离脂质:胆固醇:DSPC:PEG2k-DMG的摩尔比在100％乙醇中重构，之后将其以约6.0的脂质胺与RNA磷酸(N:P)摩尔比与RNA货物(例如，Cas9 mRNA和gRNA)混合，如本文进一步所述。
对于利用配制为脂质纳米颗粒(LNP)的组分的实验，将所述组分以各种摩尔比溶于100％乙醇中。将RNA货物(例如，Cas9 mRNA和gRNA)溶解在25mM柠檬酸盐、100mM NaCl，pH5.0中，导致RNA货物的浓度为大约0.45mg/mL。
使用交叉流技术制备LNP，所述技术利用将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液和一体积的水冲击喷射混合。通过混合十字管将乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液混合。将第四股水流通过内联三通与十字管的出口流混合(参见WO2016010840，图2)。将LNP在室温下放置1小时，并且用水(大约1:1体积/体积)进一步稀释。使用切向流过滤在平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上浓缩稀释的LNP，然后通过渗滤将缓冲液交换到50mM Tris、45mM NaCl、5％(重量/体积)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。替代地，用PD-10脱盐柱(GE)完成将最终缓冲液交换到TSS中。如果需要，通过用Amicon 100kDa离心过滤器(Millipore)浓缩制剂。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直至进一步使用。以50:38:9:3的可电离的脂质:胆固醇:DSPC:PEG2k-DMG的摩尔比配制LNP，其中脂质胺与RNA磷酸酯(N:P)摩尔比为约6.0，并且gRNA与mRNA的重量比为1:1。
Cas9 mRNA、gRNA和插入构建体的细胞培养和体外递送原代肝细胞
将原代小鼠肝细胞(PMH)、原代大鼠肝细胞(PRH)和原代人肝细胞(PHH)解冻，并重悬于含补充剂(ThermoFisher)的肝细胞解冻培养基中，之后进行离心。丢弃上清液，并将沉淀的细胞重悬于肝细胞平板培养基加补充包(ThermoFisher)中。对细胞计数，并将其以对于PHH为33,000个细胞/孔、对于PCH为50,000个细胞/孔、对于PRH为35,000个细胞/孔、和对于PMH为15,000个细胞/孔的密度接种于Bio-coat胶原蛋白I包被的96孔板上。使接种的细胞在37℃和5％CO2气氛下的组织培养箱中沉降并粘附6小时。孵育后，检查细胞的单层形成，并用先前的肝细胞维持液洗涤三次，并在37℃下孵育。
对于使用MessengerMax递送的实验，将100ng Cas9 mRNA和25nM gRNA各自单独地在Opti-MEM培养基中稀释。将MessengerMAX试剂在Opti-MEM中稀释并且孵育10min，然后添加至含有Cas9 mRNA或gRNA的每个管。孵育5min，然后用肝细胞维持培养基来调整至50ul。从细胞吸出培养基，然后将50ul MessengerMAX/Cas9 mRNA混合物和MessengerMAX/gRNA混合物转染至细胞，随后对于PMH，以le5的MOI或对于PRH，以le6的MOI，添加AAV(在维持培养基中稀释)。如本文所述，在处理后72小时收集培养基以进行分析，并收获细胞以进行进一步的分析。
对于使用LNP递送的实验，含有所需浓度Cas9/sgRNA的不同体积的LNP用补充有3％FBS的肝细胞维持培养基来稀释并且在37℃下孵育10min。从细胞吸出培养基，然后将100ul LNP/培养基混合物添加至细胞，随后对于PMH，以le5的MOI或对于PRH，以le6的MOI，添加AAV(在维持培养基中稀释)。如本文所述，在处理后72小时收集培养基以进行分析，并收获细胞以进行进一步的分析。对于利用脂质包递送的实验，分别将Cas9 mRNA和gRNA在维持培养基中各自稀释至2mg/ml，并将各自的2.9μl添加到含有12.5μl的50mM柠檬酸盐、200mM氯化钠，pH 5和6.9μl的水的孔(96孔Eppendorf板中)中。然后添加12.5μl脂质包制剂，之后添加12.5μl水和150μl TSS。使用肝细胞维持培养基将每个孔稀释至20ng/μl(相对于总RNA含量)，然后用6％的新鲜小鼠血清稀释至10ng/μl(相对于总RNA含量)。转染前从细胞中吸出培养基，并将40μl脂质包/RNA混合物添加到细胞中，之后以1e5的MOI添加AAV(在维持培养基中稀释)。如本文所述，在处理后72小时收集培养基以进行分析，并收获细胞以进行进一步的分析。
萤光素酶测定
对于涉及细胞培养基中NanoLuc检测的实验，将一体积的
Figure BDA0003114124080001011
荧光素酶测定底物与50体积的
Figure BDA0003114124080001012
荧光素酶测定缓冲液组合。使用50ul样品或1:10稀释的样品(50μl试剂+40μl水+10μl细胞培养基)在Promega Glomax运行器上以0.5秒的积分时间进行测定。对于涉及检测细胞培养基中HiBit标签的实验，将LgBiT蛋白和Nano-GloR HiBiT细胞外底物分别在室温下的Nano-GloR HiBiT细胞外缓冲液中以1:100和1:50稀释。使用1:10稀释的样品(50μl试剂+40μl水+10μl细胞培养基)在Promega Glomax运行器上以1.0秒的积分时间进行测定。
LNP和/或AAV的体内递送
通过侧尾静脉向小鼠和大鼠给药AAV、LNP、AAV和LNP、或媒介物(对于AAV媒介物为PBS+0.001％Pluronic，对于LNP媒介物为TSS)。以每只动物0.1mL的体积施用AAV，其量(载体基因组/只小鼠，“vg/ms”)如本文所述。将LNP在TSS中稀释，并以本文指出的量以约5μl/克体重施用。通常，如果适用，首先给小鼠注射AAV，然后注射LNP。在治疗后的各个时间点，收集血清和/或肝脏组织用于某些分析，如下文进一步所述。
下一代测序(“NGS”)和中靶裂解效率分析
利用深度测序来鉴定由基因编辑例如在白蛋白内含子1内引入的插入和缺失的存在。在靶位点周围设计PCR引物，并扩增感兴趣的基因组区域。引物序列设计是按照本领域的标准进行的。
根据制造商的方案(Illumina)进行另外的PCR，以添加用于测序的化学物质。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量得分的那些读段之后，将读段与参考基因组比对。将含有读段的所得文件映射到参考基因组(BAM文件)，其中选择与感兴趣的靶区域重叠的读段，并对野生型读段的数量与含有插入或缺失(插入缺失)的读段的数量进行计算。
编辑百分比(例如，“编辑效率”或“百分比编辑”)被定义为相对于包括野生型的序列读段总数的具有插入或缺失(“插入缺失”)的序列读段总数。
人α1-抗胰蛋白酶(hA1AT)ELISA分析
对于体内研究，如所示收集血液并分离血清。总人α1-抗胰蛋白酶水平使用α1-抗胰蛋白酶ELISA试剂盒(人)(Aviva Biosystems，目录号OKIA00048或Abeam，目录号ab108799)根据制造商方案来确定。使用4参数对数拟合将血清hA1ATFIX水平从标准曲线上定量，并表示为μg/mL血清。
人α1-抗胰蛋白酶(hA1AT)LC-MS/MS分析
对于体内研究，如所示收集血液并分离血清。总hA1AT水平使用液相层析串联质谱法(LC-MS/MS)来确定。衍生自人类血浆的纯化冻干原生hA1AT获自Athens Research&Technology。将冻干hA1AT以适合浓度溶解于胎牛血清中以获得标准和质量控制。将血清样品在胎牛血清中稀释10倍。10μL的1900ng/mL稳定标记内部标准添加至10μL的胎牛血清稀释样品、标准、和质量控制。然后，样品用25μL三氟乙醇来变性，用25μL 50mM碳酸氢铵稀释，然后立即添加5μL的200mM DTT并且在55℃下孵育30min。还原样品用10μL的200mM碘乙酰胺处理并且在室温下、在黑暗中、伴以振荡来孵育一小时。样品用400μL的50mM碳酸氢铵稀释并且用20μL的1g/L胰蛋白酶处理，并且在37℃下孵育过夜。消化用10μL甲酸终止。
鉴定野生型或突变型hA1AT肽：
纯A1AT消化物通过LC-MS/MS来分析并且鉴定包含突变型和野生型等位基因的信号肽。具体地说，突变型hA1AT(Glu342Lys)使用重标记突变型特定肽
Figure BDA0003114124080001031
来检测，并且野生型hA1AT使用不同重标记野生型特定肽
Figure BDA0003114124080001032
Figure BDA0003114124080001033
来检测。合并的野生型和突变型hA1AT浓度使用第三重标记肽
Figure BDA0003114124080001034
来检测。这些肽中的每个通过在SEQ ID NO：1130-1132中的粗体下划线表示的位置处并入单一13C615N-亮氨酸来合成。
使用质谱法来确定血清hA1AT的水平：
血清根据如上所述的方法来消化。消化之后，将消化血清负载至管柱上并且如下所述，通过LC-MS/MS来分析。野生型和合并的野生型加上突变型hA1AT水平的鉴定通过与校准曲线比较来获得。突变型hA1AT水平通过单点内部校准来获得。
LC-MS/MS条件：
LC-MS/MS分析用2.1x 50mm C8管柱来执行。流动相A由水中的0.1％甲酸组成并且流动相B由乙腈中的0.1％甲酸组成。针洗由甲醇:
水(35:65)中的0.1％甲酸、1％二甲亚砜组成。在具有以下参数的质谱仪上对A1AT消化物进行分析：(a)离子源:涡轮喷雾离子驱动器；(b)气帘气：35.0；(c)碰撞气体：中等；(d)离子喷雾电压：5500；(e)温度：500℃；(f)离子源气体1：50；和(g)离子源气体2：50。
实施例2-原代小鼠肝细胞中跨靶位点的双向构建体的体外筛选
在此实施例中描述的实验测试使用靶向原代小鼠肝细胞(PMH)中的鼠科白蛋白的内含子1的20个不同gRNA、在一组靶位点上插入hSERPINA1。
如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和脂质包递送材料并将其递送至PMH，其中AAV的MOI为1e5。处理后，分别收集分离的基因组DNA和细胞培养基用于编辑和转基因表达分析。报告载体包含可通过如实施例1中所述的基于萤光素酶的荧光检测来测量的NanoLuc ORF(除了GFP以外)，在图1C中绘制为相对荧光素酶单位(“RLU”)。所测试载体的示意图提供于图1A中。测试的gRNA显示在图1B和图1C中，对于表11中列出的那些使用缩短的数字(例如，其中省略前导零，例如其中“G551”对应于表11中的“G000551”)。
如图1B和表31示出，检测到不同水平的编辑。然而，如图1C和表31示出，高水平编辑不一定导致转基因的更有效表达。
表31-在mAlbumin基因座处的插入缺失形成和NanoLuc GFP表达
Figure BDA0003114124080001041
Figure BDA0003114124080001051
实施例3-原代食蟹猴和原代人肝细胞中跨靶位点的双向构建体的体外筛选
在本实施例中，利用分别靶向原代cyno(PCH)和原代人肝细胞(PHH)中食蟹猴(“cyno”)和人白蛋白的内含子1的gRNA，在一组靶位点上测试包含双向构建体的ssAAV载体。
如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和脂质包递送材料并将其递送至PCH和PHH。处理后，分别收集分离的基因组DNA和细胞培养基用于编辑和转基因表达分析。每个载体包含可通过如实施例1中所述的基于萤光素酶的荧光检测来测量的报告基因(衍生自质粒P00415)，在图2B和图3B中绘制为相对萤光素酶单位(“RLU”)。例如，AAV载体含有NanoLuc ORF(除了GFP)。图2B和图3B中提供了所测试的载体的示意图。表9和表13中列出的gRNA均使用缩短的数字显示在每个图中。
如针对PCH的图2A和针对PHH的图3A所示，对于所测试的每种组合，检测到不同水平的编辑(由于用于基于扩增子的测序的某些引物对的失败，在PCH实验中测试的一些组合的编辑数据未在图2A和表3中报告)。以图形显示在图2A和图3A中的编辑数据在下表3和表4中以数字再现。然而，如图2B、图2C以及图3B和图3C所示，高水平的编辑不一定导致转基因的更有效表达，这指示编辑和分别在PCH和PHH中双向构建体的插入/表达之间几乎没有相关性。
Figure BDA0003114124080001061
Figure BDA0003114124080001062
Figure BDA0003114124080001071
实例4-在体内将hSERPINA1插入mAlbumin基因座中
测试各种指导序列在促进将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的有效性。如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和LNP并将其递送至小鼠。获得在给药后第1周和第2周收集的血清来测量人类α1抗胰蛋白酶(hA1AT)血清表达。给药后四周，对动物实施安乐死，并收集肝脏组织和血清分别用于编辑和hA1AT血清表达。血清中的人类A1AT水平通过ELISA(Aviva Biosystems，目录号OKIA00048)来确定。
将含有8种不同的靶向白蛋白内含子1的gRNA的8种不同的LNP制剂与衍生自P00450的ssAAV一起递送到小鼠。分别以1e12vg/小鼠和1.0mg/kg(相对于总RNA货物含量)递送AAV和LNP。在此实验中测试的gRNA使用表11列出的缩短数字在图4A和图4B中示出。小鼠白蛋白基因座处的编辑结果在图4A和表5中示出。给药后第1周、第2周、和第4周的血清hA1AT水平在图4B和表6中示出。图4C示出相关性图表，所述图表将如实施例1的体外实验的给定指导以RLU为单位来测量的表达水平与在此实验中使用相同指导在体内检测的hA1AT转基因表达水平进行比较。0.71的R2值展示原代细胞筛选与体内治疗之间的正相关。
表5：小鼠白蛋白基因座处的编辑
Figure BDA0003114124080001081
表6：血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001082
实例5–在体内敲低hSERPINA1 PiZ转基因和将hSERPINA1插入mAlbumin基因座中
在此实施例中，在敲低来自hSERPINA PiZ变体转基因的A1AT的表达的第一轮编辑(阶段1)之后进行将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的第二轮编辑(阶段2)。如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和LNP并将其递送至小鼠，雄性NSG-PiZ小鼠(组A、B、和C)和C57B1/6雄性小鼠(组D)(Jackson Laboratory)。NSG-PiZ小鼠是在免疫缺陷NOD scid伽玛(NSG)背景下容纳人类SERPINA1PiZ变体(Glu342Lys)的拷贝的转基因小鼠。
在此实验的阶段1，向小鼠给予0.3mg/kg(相对于总RNA货物含量)的LNP，所述LNP携带Cas9 mRNA和靶向hSERPINA1转基因的sgRNA G000409。阶段1给药之后两周，收集血清以便测量血清hA1AT水平。此实验中的阶段2编辑在阶段1给药之后3周执行。在阶段2给药中，向来自阶段1的小鼠给予1mg/kg(相对于总RNA货物含量)的携带Cas9 mRNA和sgRNAG000668(靶向小鼠白蛋白)的LNP，以及1e12 vg/小鼠的衍生自P00450的ssAAV。图5A概述用于在此实验中的每个测试组的编辑条件。血清中的人类A1AT水平在阶段2给药之后一周、两周和三周、通过ELISA(Aviva Biosystems，目录号OKIA00048)来确定。阶段2给药后五周，对动物实施安乐死，并收集肝脏组织和血清分别用于编辑和hA1AT血清表达。
图5B和表7示出在阶段1中靶向的hSERPINA1 PiZ变体中的插入缺失形成。图5C和表7示出在阶段2中靶向的白蛋白基因座中的插入缺失形成。图5D和表8示出如ELISA测量的各个时间点的血清中的hA8AT蛋白水平，以及如在人类血浆中测量的hA1AT水平。
表7-hSERPINA1处的插入缺失形成和
Figure BDA0003114124080001091
表8-血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001101
实例6-使用各种dgRNA或sgRNA、跨原代小鼠肝细胞中的靶位点的双向构建体的体 外筛选
在此实施例中描述的实验测试使用靶向原代小鼠肝细胞(PMH)中的鼠科白蛋白的内含子1的41个不同双重指导RNA(dgRNA)或4个单一指导RNA(sgRNA)，在一组靶位点上插入双向ssAAV构建体(P00415)。
如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV构建体(P00415)和MessengerMAX或LNP递送材料并将其递送至PMH，其中AAV的MOI为1e5。处理后，分别收集分离的基因组DNA和细胞培养基用于编辑和转基因表达分析。报告载体包含可通过如实施例1中所述的基于萤光素酶的荧光检测来测量的NanoLuc ORF(除了GFP以外)，在图6中绘制为相对荧光素酶单位(“RLU”)。所测试载体的示意图提供于图1A中。测试的dgRNA显示在图6中，对于表15中列出的那些使用缩短的数字(例如，其中省略前导零，例如其中“CR5545”对应于表15中的“CR005545”)。某些dgRNA具有在圆括号中列出的对应sgRNA(例如，G551是包含dgRNACR5542的crRNA和trRNA的sgRNA)。sgRNA构建体未在图6中测试。
如图6和表32示出，检测到不同水平的表达。
导致高转基因表达的某些dgRNA(例如，CR5574、CR5580、CR5576、和CR5579)作为sgRNA针对其在PMH中的鼠科白蛋白内含子1位点中插入hSERPINA1的能力来进行测试。具体地说，dgRNA CR5574、dgRNA CR5580、dgRNA CR5576、和dgRNA CR5579分别对应于sgRNAG013018、sgRNA G013018、sgRNA G667、和sgRNA G670。将50ng或100ng Cas9 mRNA和15nM或30nM的每个sgRNA递送至PMH。将图7中的数据以相对于
Figure BDA0003114124080001111
(CTG)来正规化的RLU来绘制。所测试的sgRNA在图7中示出，并且进一步描述于表11中。如图7和表33示出，检测到不同水平的表达。
表32-使用AAV-P00415的NanoLuc表达
Figure BDA0003114124080001112
Figure BDA0003114124080001121
表33：mAlbumin SERPINA1插入
Figure BDA0003114124080001122
表15.小鼠白蛋白指导dgRNA和修饰模式
Figure BDA0003114124080001131
Figure BDA0003114124080001141
Figure BDA0003114124080001151
Figure BDA0003114124080001161
实施例7-跨原代大鼠肝细胞中的靶位点的双向构建体的体外筛选
在此实施例中描述的实验测试使用靶向原代大鼠肝细胞(PRH)中的鼠科白蛋白的内含子1的32个不同gRNA、在一组靶位点上插入双向ssAAV构建体(P00415)。
如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV构建体(P00415)和MessengerMAX材料并将其递送至PRH，其中AAV的MOI为1e5，每个样品的Cas9 mRNA为100ng，并且sgRNA的浓度为25nM。处理后，分别收集分离的基因组DNA和细胞培养基用于编辑和转基因表达分析。报告载体包含可通过如实施例1中所述的基于萤光素酶的荧光检测来测量的NanoLucORF(除了GFP以外)。数据在图8中以相对于
Figure BDA0003114124080001162
(“NanoLuc/CTG”)来正规化的相对荧光素酶单位来绘制。所测试载体的示意图提供于图1A中。
如图8示出，检测到不同水平的编辑(插入缺失形成)。然而，高水平编辑不一定导致转基因的更有效表达。
使用图8测试的特异性gRNA在各个靶位点处插入双向ssAAV构建体(P00415)在浓度范围内评估(Cas9：3.125ng、6.25ng、12.5ng、25ng、50ng、或100ng；sgRNA：0.78nM、1.56nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、或25nM)。如图9示出，在大鼠白蛋白基因座处插入双向ssAAV构建体(P00415)为剂量依赖性的，也就是说，插入率随着Cas9/sgRNA剂量增加而调节。
表16.大鼠白蛋白指导sgRNA和修饰模式
Figure BDA0003114124080001171
Figure BDA0003114124080001181
Figure BDA0003114124080001191
Figure BDA0003114124080001201
Figure BDA0003114124080001211
Figure BDA0003114124080001221
Figure BDA0003114124080001231
实例8-使用各种gRNA、跨原代食蟹肝细胞中的靶位点的双向构建体的体外筛选
在此实施例中描述的实验测试使用靶向原代cyno肝细胞(PCH)中的食蟹猴("cyno")白蛋白的内含子1的34个不同gRNA、在一组靶位点上插入双向ssAAV构建体(P00415)。使用34个不同gRNA的筛选执行两次以便评估个别实验之间的变异。
如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和脂质包递送材料并将其递送至PCH。处理后，分别收集分离的基因组DNA和细胞培养基用于编辑和转基因表达分析。每个载体包含可通过如实施例1中所述的基于萤光素酶的荧光检测来测量的报告基因(衍生自质粒P00415)。对于此实例，AAV载体含有NanoLuc ORF(除了GFP)。所测试的每个gRNA和转基因的对应编辑数据和表达在表17和表18中示出。转基因的表达以相对于
Figure BDA0003114124080001242
(CTG)来正规化的RLU来测量。
如表17示出，对于所测试的每种组合，检测到不同水平的编辑。然而，如图18所示，高水平的编辑不一定导致转基因的更有效表达，这指示编辑和分别在PCH中双向构建体的插入/表达之间几乎没有相关性。
Figure BDA0003114124080001241
Figure BDA0003114124080001251
Figure BDA0003114124080001252
Figure BDA0003114124080001261
实施例9-使用包含P2A序列的双向构建体，在体内将hSERPINA1插入mAIbumin基因 座中
测试具有和没有P2A序列的各种双向构建体在促进将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的有效性。如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和LNP并将其递送至小鼠(每组n＝5)。获得在给药后第1周、第2周、第3周、第4周和第5周收集的血清来测量人类α1抗胰蛋白酶(hA1AT)血清表达。
将两种不同构建体，P00450和P00451，与含有靶向白蛋白的内含子1的G000670的LNP制剂一起递送至小鼠。P00450和P00451构建体的载体成分和序列在表19中示出。分别以1e12 vg/小鼠和1.0mg/kg(相对于总RNA货物含量)递送AAV和LNP。给药后第1周、第2周、第4周和第5周的血清hA1AT水平在图10和表20和表21中示出。如表20和表21示出，包含P2A不一定导致转基因的更有效表达，指示hA1AT可在包含或不包含2A自裂解肽诸如P2A的情况下表达。
表19：载体组分和序列
Figure BDA0003114124080001262
Figure BDA0003114124080001271
表20：血清中的hA1AT水平(第1周和第2周)
Figure BDA0003114124080001272
表21：血清中的hA1AT水平(第3周和第4周)
Figure BDA0003114124080001273
实施例10-体内敲低hSERPINAl PiZ转基因和将hSERPINA1插入mAIbumin基因座
在此实施例中，评估敲低hSERPINA1转基因和将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的能力。所述实验存在两个阶段：(1)敲低来自hSERPINA PiZ变体转基因的A1AT的表达的第一轮编辑(阶段1)；和(2)将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的第二轮编辑(阶段2)。如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和LNP并将其递送至雄性NSG-PiZ小鼠(组1、2、和3)(Jackson Laboratory)。
在此实验的阶段1，向小鼠给予0.3mg/kg(相对于总RNA货物含量)的LNP或媒介物对照，所述LNP携带Cas9 mRNA和靶向hSERPINA1转基因的sgRNA G000409。阶段1给药之后两周，收集血清以便测量血清hA1AT水平。此实验中的阶段2给药在阶段1给药之后3周执行。在阶段2给药中，向来自阶段1的小鼠给予1mg/kg(相对于总RNA货物含量)的携带Cas9 mRNA和sgRNA G000668(靶向小鼠白蛋白)的LNP，以及1e12 vg/小鼠的衍生自P00450的ssAAV，并且对照组仅接受媒介物。表22概述此实验中的每个测试组的编辑条件。血清中的人类A1AT水平在阶段2给药之后一周、两周和三周、通过ELISA来确定。阶段2给药后五周，对动物实施安乐死，并收集肝脏组织和血清以便确定hA1AT血清表达水平。
图11和表23示出如ELISA测量的各个时间点的血清中的hA1AT蛋白水平。
表22：每个测试组的编辑条件
治疗组 背景 阶段1 阶段2
1 NGS-PiZ 媒介物 媒介物
2 NGS-PiZ G000409 仅G000668
3 NGS-PiZ G000409 G000668+P00450
表23-血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001281
实施例11-在敲低hSERPINA1 PiZ转基因和将hSERPINA1插入mAIbumin基因座中之 后的体内hA1AT表达的持久性
在本实施例中评估了hA1AT表达在经治疗的动物中随时间的持久性。为此，作为15周持久性研究的一部分，在给药后在治疗的动物血清中测量hA1AT。
对于此实例，在敲低来自hSERPINA PiZ变体转基因的A1AT的表达的第一轮编辑(阶段1)之后进行将hSERPINA1插入小鼠白蛋白基因座中的第二轮编辑(阶段2)。如实施例1所描述，制备在此实施例中测试的ssAAV、LNP、和对照并且将其递送至小鼠，雄性NSG-PiZ小鼠(组1、2、3、4、5、和6)。
在此实验的阶段1，向组2、3、4、和6中的小鼠给予0.3mg/kg(相对于总RNA货物含量)的LNP，所述LNP携带Cas9 mRNA和靶向hSERPINA1转基因的sgRNA G000409。此实验中的阶段2编辑在阶段1给药之后3周执行。在阶段2给药中，向来自组4、5和6的小鼠给予1mg/kg(相对于总RNA货物含量)的携带Cas9 mRNA和sgRNAG000666或sgRNA G13019(靶向小鼠白蛋白)的LNP，以及1e12 vg/小鼠的衍生自P00450的ssAAV。表24概述用于此实验中的每个测试组的编辑条件。血清中的人类A1AT水平在阶段2给药之后四周、八周和十二周、通过ELISA来确定。在阶段2给药之后一周、两周、四周、八周和十二周，还通过LC-MS/MS来确定血清中的人类A1AT(野生型和突变型)水平。阶段2给药后十二周，对动物实施安乐死，并收集肝脏组织和血清分别用于编辑和hA1AT血清表达。
图12和表25示出在阶段2中靶向的白蛋白基因座中的插入缺失形成。图13A和表26示出如ELISA(Abcam，目录号ab108799)测量的各个时间点的血清中的hA1AT蛋白水平。如图13A示出，在阶段2给药之后的12周中，在对于组1、4、5、6、和7评估的每个时点，维持hA1AT表达。图13B和表29示出如通过LC-MS/MS测量的各个时间点的血清中的hA1AT(野生型和突变型)蛋白水平。如图13B示出，在阶段1给药期间给予携带Cas9 mRNA和靶向hSERPINA1转基因的sgRNA G000409的LNP的每个组(例如，组2、3、4、和6)中，hA1AT水平减少。同时，在阶段2给药期间给予携带Cas9 mRNA和sgRNA的LNP与ssAAV的每个组展示血清hA1AT水平的后续增加。
表24：每个测试组的编辑条件
Figure BDA0003114124080001301
表25-mAlbumin处的插入缺失形成
Figure BDA0003114124080001302
表26-如通过ELISA测量的血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001303
Figure BDA0003114124080001311
表29-如通过LC-MS/MS测量的血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001312
BQL＝低于定量限制25μg/mL
对于平均值和标准差计算忽略BQL值
实施例12-使用各种LNP或AAV剂量的体内hA1AT的表达水平
在此实施例中评估用不同剂量的LNP或AAV来治疗的小鼠的hA1AT表达水平。如实施例1中所述制备本实施例中测试的ssAAV和LNP并将其递送至小鼠。给药后两周，对动物实施安乐死，并收集肝脏组织和血清分别用于编辑和hA1AT血清表达。
向小鼠给予(1)不同剂量的(例如，1mg/kg、0.3mg/kg、或0.1mg/kg，相对于总RNA货物含量)携带Cas9 mRNA和sgRNA G000666(靶向小鼠白蛋白)的LNP或(2)不同剂量的衍生自P00450的ssAAV(例如，3e12 vg/小鼠、1e12 vg/小鼠、3e11 vg/小鼠、或1e11 vg/小鼠)。
血清中的人类A1AT水平在给药之后一周、通过ELISA(Aviva Biosystems，目录号OKIA00048)来确定。图14A、图14B、和表27示出具有不同浓度的LNP和AAV的血清中的hA1AT蛋白水平，如通过ELISA来测量。作为参考，人类血浆中的hA1AT水平是大约3450.9ug/ml。小鼠白蛋白基因座处的编辑结果在图14C、图14D、和表28中示出。如图14、图14B、图14C、和图14D示出，hA1AT表达和插入缺失形成分别以剂量依赖性方式随着LNP或AAV剂量增加而增加。此外，使用ssAAV和不同剂量(例如，3mg/kg、1mg/kg、或0.3mg/kg，相对于总RNA货物含量)的携带Cas9 mRNA和sgRNA G013019(靶向大鼠白蛋白)的LNP，在Wistar大鼠中插入hSERPINA1展示LNP的剂量增加导致在2周内的血清中的hA1AT的表达增加(数据未展示)。
表27：血清中的hA1AT水平
Figure BDA0003114124080001331
表28：小鼠白蛋白基因座处的编辑
Figure BDA0003114124080001332
实施例13-白蛋白人指导的脱靶分析
生物化学方法(参见例如Cameron等人,Nature Methods.6，600-606；2017)用于确定通过靶向白蛋白的Cas9来裂解的潜在脱靶基因组位点。在此实验中，使用分离的HEK293基因组DNA筛选了13种靶向人白蛋白的sgRNA和具有已知脱靶特征的两个对照指导。表30示出了在生化分析中使用16nM指导浓度检测到的潜在脱靶位点的数量。所述测定识别所测试的sgRNA的潜在脱靶位点。
表30-脱靶分析
Figure BDA0003114124080001341
在已知的脱靶检测分析(诸如上面使用的生化方法)中，通常通过设计回收大量潜在的脱靶位点，以便为可在其他情况下(例如在感兴趣的原代细胞中)验证的潜在位点“广泛撒网”。例如，生化方法通常过多地表示潜在的脱靶位点数量，因为所述测定利用纯化的高分子量基因组DNA(不含细胞环境)，并且取决于所用的Cas9 RNP剂量。因此，可使用所鉴定的潜在脱靶位点的靶向测序来验证通过这些方法鉴定的潜在脱靶位点。
人白蛋白内含子1：(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0003114124080001351
表9：人类sgRNA和修饰模式
Figure BDA0003114124080001352
Figure BDA0003114124080001361
Figure BDA0003114124080001371
Figure BDA0003114124080001381
表10.小鼠白蛋白指导RNA
Figure BDA0003114124080001382
Figure BDA0003114124080001391
表11.小鼠白蛋白指导sgRNA和修饰模式
Figure BDA0003114124080001392
Figure BDA0003114124080001401
Figure BDA0003114124080001411
表12.食蟹猴白蛋白指导RNA
Figure BDA0003114124080001412
Figure BDA0003114124080001421
以上用“*”标记的SEQ ID NO指示所指示的gRNA可同时适用于食蟹猴和人类。
表13：食蟹猴sgRNA和修饰模式
Figure BDA0003114124080001422
Figure BDA0003114124080001431
Figure BDA0003114124080001441
Figure BDA0003114124080001451
以上用“*”标记的SEQ ID NO指示所指示的sgRNA可同时适用于食蟹猴和人类。
表14：载体组分和序列
Figure BDA0003114124080001452
5’ITR序列(SEQ ID NO:263):
Figure BDA0003114124080001453
小鼠白蛋白剪接受体(第1方向)(SEQ ID NO:264):
Figure BDA0003114124080001461
人类SERPINA1，第1方向(SEQ ID NO:265):
Figure BDA0003114124080001462
bGH Poly-A(第1方向)(SEQ ID NO:266):
Figure BDA0003114124080001463
SV40 Poly-A(第2方向)(SEQ ID NO:267):
Figure BDA0003114124080001464
人类SERPINA1，第2方向(SEQ ID NO:268):
Figure BDA0003114124080001471
小鼠白蛋白剪接受体(第2方向)(SEQ ID NO:269):
Figure BDA0003114124080001472
3’ITR序列(SEQ ID NO:270):
Figure BDA0003114124080001473
Nluc-P2A-GFP(第1方向)(SEQ ID NO:275):
Figure BDA0003114124080001481
Nluc-P2A-GFP(第2方向)(SEQ ID NO:276):
Figure BDA0003114124080001491
P00415全序列(从ITR到ITR)：(SEQ ID NO:279)
Figure BDA0003114124080001492
Figure BDA0003114124080001501
Figure BDA0003114124080001511
P00450 SEQ ID NO:289
Figure BDA0003114124080001512
Figure BDA0003114124080001521
白蛋白信号肽序列SEQ ID NO:2000
Figure BDA0003114124080001522

Claims (123)

1.一种将SERPINA1核酸引入细胞或细胞群的方法，所述方法包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而将所述SERPINA1核酸引入所述细胞或细胞群。
2.一种在有需要的受试者中表达AAT的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而在有需要的受试者中表达AAT。
3.一种治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而治疗所述受试者的AATD。
4.一种增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌的方法，其包括施用：
i)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
ii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iii)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而增加从所述肝细胞或细胞群的AAT分泌。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述内源性SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)。
6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法还包括修饰所述内源性SERPINA1基因。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中在施用所述包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体、所述RNA指导的DNA结合剂和所述白蛋白gRNA之前或之后，在所述内源性SERPINA1基因内诱导所述DSB且/或对所述内源性SERPINA1基因进行修饰。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用SERPINA1指导RNA，所述RNA与存在于所述内源性人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中的靶序列至少部分互补。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述SERPINA1指导RNA包含选自SEQ ID NO:1000-1128的指导序列或与选自SEQ ID NO：1000-1128的序列的17、18、19、和/或20个连续核苷酸至少95％、90％、85％、80％或75％相同的指导序列。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述方法还包括与所述SERPINA1指导RNA一起施用RNA指导的DNA结合剂。
11.如权利要求8所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，非同源末端连接(NHEJ)导致突变。
12.如权利要求11所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入。
13.如权利要求12所述的方法，其中核苷酸的缺失或插入诱导所述内源性SERPINA1基因中的读框移位或无义突变。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述施用是在体外。
15.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述施用是在体内。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述白蛋白gRNA包含指导序列，所述指导序列包括选自以下的序列：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述核酸构建体。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或白蛋白gRNA。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或SERPINA1 gRNA。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其中所述核酸载体为病毒载体。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10和其杂交体。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中以任何次序和/或以任何组合顺序施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1 gRNA。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中单独或以任何组合同时施用所述核酸构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1 gRNA。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中在施用所述核酸构建体之前施用所述RNA指导的DNA结合剂、或RNA指导的DNA结合剂和白蛋白gRNA的组合。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中在施用所述白蛋白gRNA和/或RNA指导的DNA结合剂之前施用所述核酸构建体。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂是2类Cas核酸酶。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述Cas9核酸酶为酿脓链球菌Cas9核酸酶。
30.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为裂解酶。
31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为切口酶。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为双向核酸构建体。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链或双链的。
34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体为单链DNA或双链DNA。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述双向构建体不包含驱动所述异源AAT蛋白表达的启动子。
36.如权利要求21至35中任一项所述的方法，其中所述受试者的功能性AAT水平增加到至少约500μg/ml。
37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中与施用之前的所述受试者的功能性AAT水平相比，所述受试者的功能性AAT水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中测量在血清、血浆、血液、脑脊髓液和/或痰中的所述AAT水平。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中与施用之前的水平相比，所述细胞或细胞群表达功能性AAT的水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
40.如权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群能够表达AAT。
41.如权利要求40所述的方法，其中能够表达AAT的所述细胞或细胞群来源于肝脏、肺部、胃器官、肾、胃、近端和远端小肠、胰腺、肾上腺或大脑中的任何一种或多种的组织。
42.如权利要求4、5、8至37、或41中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群包括肝脏细胞(例如，肝细胞)或肺部细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述肝脏细胞为肝细胞。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述肝脏中的AAT积累得以减少。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码野生型AAT蛋白或其功能片段的序列。
46.一种在有需要的受试者中表达AAT的方法，其包括向所述受试者施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述受试者中表达AAT。
47.一种治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，其包括施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而治疗所述受试者的AATD。
48.一种在细胞或细胞群中表达AAT的方法，所述方法包括向所述细胞或细胞群施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而在所述细胞或细胞群中表达AAT表达。
49.一种增加从肝细胞或细胞群的AAT分泌的方法，其包括向所述细胞或细胞群施用包含异源AAT蛋白编码序列的双向核酸构建体，从而增加从所述肝细胞或细胞群的AAT分泌。
50.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含异源AAT的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含所述异源AAT的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述异源AAT表达的启动子。
51.如权利要求46至49中任一项所述的方法，其中所述双向核酸构建体包含：
a)第一区段，所述第一区段包含异源AAT的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含第二多肽的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述异源AAT和/或所述第二多肽表达的启动子。
52.如权利要求46至51中任一项所述的方法，其还包括施用RNA指导的DNA结合剂。
53.如权利要求46至52中任一项所述的方法，其还包括施用白蛋白gRNA。
54.如权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在所述内源性SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)。
55.如权利要求46至54中任一项所述的方法，其中所述方法还包括修饰所述内源性SERPINA1基因。
56.如权利要求46至55中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用SERPINA1指导RNA，所述RNA与存在于所述内源性人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中的靶序列至少部分互补。
57.如权利要求8所述的方法，其中所述SERPINA1指导RNA包含选自SEQ ID NO:1000-1128的指导序列或与选自SEQ ID NO：1000-1128的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的指导序列。
58.如权利要求54至57中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用RNA指导的DNA结合剂。
59.如权利要求54至58中任一项所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，非同源末端连接(NHEJ)导致突变。
60.如权利要求59所述的方法，其中在修复所述内源性SERPINA1基因中的DSB期间，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入。
61.如权利要求60所述的方法，其中核苷酸的缺失或插入诱导所述内源性SERPINA1基因中的读框移位或无义突变。
62.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述施用是在体外。
63.如权利要求46至61中任一项所述的方法，其中所述施用是在体内。
64.如权利要求46至63中任一项所述的方法，其中所述白蛋白gRNA包含指导序列，所述指导序列包括选自以下的序列：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32、33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列。
65.如权利要求46至64中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述双向构建体。
66.如权利要求46至65中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或白蛋白gRNA。
67.如权利要求46至66中任一项所述的方法，其中在核酸载体和/或脂质纳米颗粒中施用所述RNA指导的DNA结合剂和/或SERPINA1 gRNA。
68.如权利要求46至67中任一项所述的方法，其中所述核酸载体为病毒载体。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体选自由以下组成的组：腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10和其杂交体。
71.如权利要求46至70中任一项所述的方法，其中以任何次序和/或以任何组合顺序施用所述双向构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1 gRNA。
72.如权利要求46至70中任一项所述的方法，其中单独或以任何组合同时施用所述双向构建体、RNA指导的DNA结合剂、白蛋白gRNA和SERPINA1 gRNA。
73.如权利要求46至70中任一项所述的方法，其中在施用所述核酸构建体之前施用所述RNA指导的DNA结合剂、或RNA指导的DNA结合剂和白蛋白gRNA的组合。
74.如权利要求46至70中任一项所述的方法，其中在施用所述白蛋白gRNA和/或RNA指导的DNA结合剂之前施用所述双向构建体。
75.如权利要求46至74中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的DNA结合剂是2类Cas核酸酶。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述Cas核酸酶为酿脓链球菌Cas9核酸酶。
78.如权利要求75至77中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为裂解酶。
79.如权利要求75至77中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为切口酶。
80.如权利要求46至79中任一项所述的方法，其中所述双向构建体为单链DNA。
81.如权利要求46至80中任一项所述的方法，其中所述双向构建体为双链DNA。
82.如权利要求46、47或50至81中任一项所述的方法，其中所述受试者的功能性AAT水平增加到至少约500ug/ml。
83.如权利要求46、47或50至81中任一项所述的方法，其中与施用之前的所述受试者的功能性AAT水平相比，所述受试者的功能性AAT水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
84.如权利要求82或83所述的方法，其中测量在血清、血浆、血液、脑脊髓液和/或痰中的所述AAT水平。
85.如权利要求48至81中任一项所述的方法，其中与施用之前的水平相比，所述细胞或细胞群表达功能性AAT的水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
86.如权利要求48至81、或85中任一项所述的方法，其中所述细胞或细胞群包括肝脏细胞。
87.如权利要求46至86中任一项所述的方法，其中所述肝脏中的AAT积累得以减少。
88.如权利要求46至87中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体包含编码野生型AAT蛋白或其功能片段的序列。
89.一种治疗需要AAT蛋白的受试者的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，其包括施用：
i)能够减少SERPINA1的内源性表达的基因编辑系统；
ii)包含异源AAT蛋白编码序列的核酸构建体；
iii)RNA指导的DNA结合剂；以及
iv)包含选自以下的序列的白蛋白指导RNA(gRNA)：
a)与选自由SEQ ID No:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
b)选自由SEQ ID NO:2、8、13、19、28、29、31、32和33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
c)选自由SEQ ID NO:34、40、45、51、60、61、63、64、65、66、72、77、83、92、93、95、96和97组成的组的序列；
d)与选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的序列；
e)选自由SEQ ID NO:2-33组成的组的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸；
f)选自由SEQ ID NO:34-97组成的组的序列；以及
g)与SEQ ID NO:2-33列出的基因组坐标的15个连续核苷酸+/-10个核苷酸互补的序列，
从而治疗所述受试者的AATD。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述基因编辑系统包含SERPINA1指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:1000-1128的指导序列或与选自SEQ ID NO：1000-1128的序列至少95％、90％、85％、80％或75％相同的指导序列。
91.一种双向核酸构建体，其包含：
a)第一区段，所述第一区段包含AAT多肽的编码序列；以及
b)第二区段，所述第二区段包含所述AAT多肽的编码序列的反向补体，
其中所述构建体不包含驱动所述AAT多肽表达的启动子。
92.如权利要求91所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段在所述第一区段的3’。
93.如权利要求91至92中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段中的反向补体的编码序列采用与所述第一区段的编码序列的密码子使用不同的密码子使用以便减少发夹形成。
94.所述双向构建体，其中所述反向补体：
a.与所述第一区段的编码序列基本上不互补；
b.与所述第一区段的编码序列的片段基本上不互补；
c.与所述第一区段的编码序列高度互补；
d.与所述第一区段的编码序列的片段高度互补；
e.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少60％相同；
f.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少70％相同；
f.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少90％相同；
g.与所述第一区段的编码序列的反向补体至少50-80％相同；和/或
h与所述第一区段的编码序列的反向补体至少60-100％相同。
95.如权利要求91至93中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段包含核苷酸序列，其与所述第一区段中的编码序列具有约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约99％互补性。
96.如权利要求91至94中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段的编码序列使用由所述第一区段中的编码序列所编码的一个或多个氨基酸的一个或多个替代密码子来编码所述AAT多肽。
97.如权利要求91至96中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第二区段的序列为所述第一区段的编码序列的反向补体。
98.如权利要求91至97中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体不包含同源臂。
99.如权利要求91至98中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第一区段通过接头来连接至所述第二区段。
100.如权利要求99所述的双向核酸构建体，其中所述接头的长度是5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、500、1000、1500、2000个核苷酸。
101.如权利要求91至100中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述第一和第二区段中的每一个包含聚腺苷酸化尾序列。
102.如权利要求91至101中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含剪接受体位点。
103.如权利要求102所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含所述第一区段上游的第一剪接受体位点和所述第二区段下游的第二(反向)剪接受体位点。
104.如权利要求1至103中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体是双链的，任选地双链DNA。
105.如权利要求1至104中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体是单链的，任选地单链DNA。
106.如权利要求1至105中任一项所述的双向核酸构建体，其中编码所述AAT多肽的序列是密码子优化的。
107.如权利要求1至106中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含以下末端结构中的一种或多种：发夹、环、反向末端重复序列(ITR)或螺旋管。
108.如权利要求1至107中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含一个、两个或三个反向末端重复序列(ITR)。
109.如权利要求1至108中任一项所述的双向核酸构建体，其中所述构建体包含不超过两个ITR。
110.一种载体，其包含如权利要求91至109中任一项所述的构建体。
111.如权利要求110所述的载体，其中所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。
112.如权利要求110所述的载体，其中所述AAV包含单链基因组(ssAAV)或自互补基因组(scAAV)。
113.如权利要求112所述的载体，其中所述AAV载体选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAV-DJ、AAV2/8、AAVrh10、AAVLK03、AV10、AAV11、AAV12、rh10和其杂交体。
114.一种病毒载体，其包含自互补(或双链)核酸构建体，所述构建体包含编码AAT多肽的核苷酸序列，其中所述载体不包含驱动所述AAT多肽表达的启动子。
115.如权利要求114所述的载体，其中所述载体不包含同源臂。
116.一种脂质纳米颗粒，其包含如权利要求91至109中任一项所述的构建体。
117.一种宿主细胞，其包含如权利要求91至109中任一项所述的构建体。
118.一种宿主细胞，其通过如前述权利要求中任一项所述的方法来制成。
119.如权利要求117所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为肝脏细胞。
120.如权利要求117至119所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为非分裂细胞类型。
121.如权利要求117至120中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达由所述双向构建体编码的AAT多肽。
122.如权利要求117至121中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为肝细胞。
123.如任一先前权利要求所述的方法、构建体或宿主细胞，其中所述gRNA包含SEQ IDNO:901。
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