CN113195538B

CN113195538B - 抗tim-3抗体及其用途

Info

Publication number: CN113195538B
Application number: CN201980082655.9A
Authority: CN
Inventors: 聂思惟; 郑勇; 潘隽; 徐建清; 李竞
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2018-12-12
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: TW202039562A; EP3894442A1; JP2022514832A; US20210340252A1; WO2020119719A1; EP3894442A4; CN113195538A; JP7196311B2; KR20210104094A

Abstract

本公开提供了抗TIM‑3抗体，杂交瘤生成的方法，编码抗TIM‑3抗体的核酸分子，用于表达抗TIM‑3抗体的载体和宿主细胞。本公开进一步提供了体外验证抗体功能和体内验证抗体功效的方法。本公开的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗癌症的非常有效的药剂。

Description

抗TIM-3抗体及其用途

优先权信息

本申请要求2018年12月12日提交的PCT国际专利申请PCT/CN2018/120631的优先权，其通过提述完整并入本文。

序列表

本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请一般而言涉及抗体。更具体地，本申请涉及针对TIM-3的完全人单克隆抗体、其制备方法及其用途。

背景技术

来自临床前和临床结果的越来越多的证据表明，靶向免疫检查点正成为治疗癌症患者的最有前景的方法之一。T细胞免疫球蛋白粘蛋白3(TIM-3)是TIM家族的成员，其优先在激活的Th1细胞和分泌IFNγ的细胞毒性CD8 T细胞、树突细胞(DC)、单核细胞和NK细胞上表达[1]。它是一种激活诱导的抑制性分子，诱导Th1细胞凋亡，导致慢性病毒感染和癌症中的T细胞衰竭[2，3]。已经表明TIM-3可能是肿瘤诱导的免疫抑制中的关键免疫检查点[4]。

TIM-3是I型跨膜蛋白，具有V型的N末端Ig结构域，随后是含有糖基化潜在位点的粘蛋白结构域[5]。有四个分子被报道为是TIM-3的配体，包括癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)，磷脂酰丝氨酸(PtdSer)，高迁移率族蛋白1(HMGB1)，和galectine-9(Gal-9)[6，7，8，9]。在这些配体中，据报道CEACAM1，HMGB1和Gal-9是负调节免疫应答的[6、8和10]。

已知在活化的T细胞上表达并参与T细胞抑制的CEACAM1可以与TIM-3形成顺式和反式相互作用，从而抑制抗肿瘤T细胞反应[6]。HMGB1与经历坏死的细胞释放的DNA结合，并通过晚期糖基化末端受体(RAGE)产物和/或toll样受体介导先天细胞的活化。通过与HMGB1结合，TIM-3阻止了HMGB1与DNA结合，因此干扰了HMGB1激活肿瘤组织中先天免疫应答的功能[8]。尽管Gal-9在人T细胞上的作用尚存争议，但已证明Gal-9与小鼠TIM-3结合并负调节Th-1免疫应答。另外，最近报道了白细胞免疫球蛋白样受体子家族B成员2(LILRB2)与TIM-3相互作用以调节DC，巨噬细胞和T细胞的功能。阻断TIM-3/LILRB2相互作用可以增强巨噬细胞的激活；增强T细胞应答和增殖(美国专利申请号US20160200815A1)。

一种观点是，TIM-3可能是肿瘤诱导的免疫抑制中的关键免疫检查点，因为在实体和血液恶性肿瘤的临床前模型中以及患有晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)或滤泡性B细胞非霍奇金淋巴瘤的患者中，TIM-3都在最受抑制或功能缺陷的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)上表达[11、12]。在多个临床前肿瘤模型中，使用抗TIM-3治疗可以显着抑制肿瘤生长[13]。

目前没有商业可获得的调节TIM-3信号传导的治疗性抗体。针对TIM-3的抗体作为治疗剂尚有待改进。

在本公开中，生成了针对TIM-3的完全人抗体。本公开的抗体以高亲和力结合人TIM-3蛋白；对人TIM-1或TIM-4没有交叉反应；阻断PtdSer与人TIM-3之间的结合；并且有效调节体外和体内的免疫反应。

发明概述

广义而言，本公开涉及提供具有改善功效的抗体的化合物、方法、组合物和制品。本公开提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域，并且可以与能够与各种靶标反应的抗体联合使用。

本公开提供了针对TIM-3的全人单克隆抗体。还提供了使用OMT大鼠(由OpenMonoclonal Technology公司开发)产生杂交瘤的方法，编码抗TIM-3抗体的核酸分子，用于表达抗TIM-3抗体的载体和宿主细胞。本公开进一步提供了体外和体内验证抗体功能的方法。本公开的抗体提供了通过调节人免疫功能治疗多种癌症的非常有效的药剂。

在一些方面，本公开包含分离的抗体或其抗原结合部分。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个选自下组的重链CDR(HCDR)：

(i)HCDR1，其包含SEQ ID NO：1；(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：2和7的氨基酸序列之一；和(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：3；

B)一个或多个选自下组的轻链CDR(LCDR)：(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO：4；(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO：5；和(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO：6；或

C)A)的一个或多个HCDR和B)的一个或多个LCDR。

A)一个或多个选自下组的重链CDR(HCDR)：(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；(ii)如选自SEQ ID NO：2和7的氨基酸序列之一中所示的HCDR2；和(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

B)一个或多个选自下组的轻链CDR(LCDR)：(i)如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；(ii)如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和(ⅲ)如SEQ ID NO：6所示的LCDR3；或

C)A)的一个或多个HCDR和B)的一个或多个LCDR。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)所述重链可变区包含：(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；(ii)如SEQ ID NO：2所示的HCDR2；(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(b)所述轻链可变区包含：(i)如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；(ii)如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和(iii)如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)所述重链可变区包含：(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；(ii)如SEQ ID NO：7所示的HCDR2；(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(A)重链可变区(VH)，其(i)包含选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列；(ii)包含与选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列至少85％，90％或95％相同的氨基酸序列；或(iii)包含与选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的添加，缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区(VL)，其(i)包含选自SEQ ID NO:10和12的氨基酸序列；(ii)包含与选自SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列至少85％，至少90％，或至少95％相同的氨基酸序列；或(iii)包含与选自SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的添加，缺失和/或取代的氨基酸序列。

(a)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区；

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区；或

(c)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：8所示的重链可变区和如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：8所示的重链可变区和如SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明的分离的抗体或其抗原结合部分与如上文所限定的分离的抗体或其抗原结合部分竞争结合相同的表位。

在一些实施方案中，如本文公开的分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下特性：

(a)特异性结合人TIM-3蛋白和食蟹猴TIM-3蛋白，例如以不超过0.5nM的EC50结合细胞表面人TIM-3，如通过FACS测定的；

(b)阻断TIM3对PtdSer的结合；

(c)增强TCR信号传导；

(d)诱导人CD4⁺T细胞中细胞因子(例如IL-2或IFN-γ)的产生；和

(e)在表达人TIM-3的细胞上不介导ADCC或CDC活性。

在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。优选地，所述抗体是完全人单克隆抗体。

在一些方面，本公开涉及分离的核酸分子，其包含如本文中所公开的分离的抗体的编码重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

在一些方面，本公开涉及包含编码如本文公开的抗体或其抗原结合部分的核酸分子的载体。

在一些方面，本公开涉及包含如本文公开的表达载体的宿主细胞。

在一些方面，本公开涉及药物组合物，其包含如本文公开的至少一种抗体或其抗原结合部分以及药学上可接受的载体。

在一些方面，本公开涉及制备抗TIM-3抗体或其抗原结合部分的方法，该方法包括在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分，并从宿主细胞分离所述抗体或抗原结合部分。

在一些方面，本公开涉及在受试者中调节免疫应答的方法，其包括向受试者施用如本文所公开的抗体或其抗原结合部分，从而调节受试者中的免疫应答。

在一些方面，本公开涉及用于治疗受试者中异常细胞生长的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分或如本文公开的药物组合物。

在一些方面，本公开涉及抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一些方面，本公开涉及用于减少受试者中肿瘤细胞转移的方法，其包括向受试者施用有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一些方面，本公开涉及用于在受试者中治疗或预防疾病的方法，所述疾病包括增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或感染性疾病，该方法包括向受试者施用有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分或药物组合物。

在一些方面，本公开涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，所述疾病包括增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或感染性疾病。

在一些方面，本公开涉及如本文所公开的抗体或其抗原结合部分在制备用于诊断疾病的诊断剂中的用途，所述疾病包括增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或感染性疾病。

在一些方面，本公开涉及如本文公开的抗体或其抗原结合部分用于治疗或预防疾病，所述疾病包括增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或感染性疾病。

在一些方面，本公开涉及试剂盒或装置以及相关方法，其采用如本文公开的抗体或其抗原结合部分以及如本文公开的药物组合物。所述试剂盒或装置以及相关方法可用于治疗包括增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或感染性疾病在内的疾病。

以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和/或装置和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。提供概述以简化地介绍一些选择的概念，这些概念将在下面的详细描述中进一步描述。本概述不旨在确定所要求保护的主题的关键特征或基本特征，也不旨在用作确定所要求保护的主题的范围的辅助手段。此外，贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用整体并入本文。

附图简述

图1显示了抗体W3405-2.61.21-uAb-hIgG4K的SDS-PAGE分析图。

图2显示了设计为改进表达的突变体的非还原性SDS-PAGE分析图。

图3显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”对人TIM-3结合的曲线图。

图4显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与CD4⁺T细胞结合的图。图4A示出了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”在活化和未活化的CD4⁺T细胞上的结合的柱状图。图4B示出了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”在活化的CD4⁺T细胞上的结合曲线。

图5显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与TIM-3的结合特异性的图。抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与人TIM-3特异性结合(图5A)，而与人TIM-1(图5B)或TIM-4(图5C)无交叉反应结合。

图6显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与食蟹猴TIM-3的结合的图。

图7显示了通过抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”产生的对PtdSer-TIM-3相互作用的剂量依赖性阻断。

图8显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与TIM-3结合对Jurkat细胞的IL-2产生的影响。

图9显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”对CD4⁺T细胞的IFN-γ产生的影响。

图10显示了通过抗体“W3405-2.61.21-UAB-P1-hIgG4.SPK”防止THP-1细胞诱导的人CD4⁺T细胞耗竭。

图11显示了表位分仓(binning)的结果。抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”与WBP340-BMK8竞争对人TIM-3的结合(图11A)，但不与BMK6竞争(图11B)。

图12显示了抗体对转染TIM-3的CHO-K1细胞的ADCC效应的图。

图13显示了抗体对转染TIM-3的CHO-K1细胞的CDC效应的图。

图14显示了抗体“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”在人血清中的稳定性的图。

图15显示了在NOG小鼠HCC827 MiXeno^TM模型中的功效研究结果的图。

发明详述

虽然本发明可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。

除非在此另外定义，否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。

通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,第6版,W.B.Saunders Company(2010)；SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000)；Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998)；和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学，合成有机化学和药物和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。

定义

为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。氨基酸在各种区域或结构域中的分布遵循Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991))或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,(1989)Nature342:878-883中的定义。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，其可以在本申请的上下文中互换使用，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。一般而言，参见FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.编,第二版,Raven Press,N.Y.(1989)，其出于所有目的通过引用并入本文。抗体的抗原结合片段可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。在一些条件下，抗原结合片段包括Fab,Fab',F(ab')₂,Fd,Fv,dAb和互补决定区(CDR)片段，单链抗体(例如scFv)，嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的单克隆抗人TIM-3抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“mAb”是指单分子成分的抗体分子制剂。单克隆抗体显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。

如本文所用，术语“人抗体”或“完全人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经嫁接到人框架序列上的抗体。

如本文所用，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。

术语“人源化抗体”旨在指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中可变区序列来自一个物种并且恒定区序列来自另一物种，例如其中可变区序列源自小鼠抗体和恒定区序列来源于人抗体。

如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从就另一物种的免疫球蛋白基因而言是转基因的动物分离的抗体，使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体或通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。

如本文所用，术语“抗TIM-3抗体”或“TIM-3抗体”或“针对TIM-3的抗体”是指能够结合TIM-3受体例如人TIM-3受体的如本文所定义的抗体。

术语“TIM-3”、“TIM-3受体”、“TIM-3蛋白”在本文中可互换使用，是TIM家族的成员，并偏向于在活化的Th1细胞和分泌IFNγ的细胞毒性CD8+T细胞、树突细胞(DC)、单核细胞和NK细胞上表达。“TIM-3”是I型跨膜蛋白，其具有V型的N-末端Ig结构域，随后是包含糖基化潜在位点的粘蛋白结构域。

如本文所用，术语“Ka”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而本文所用的术语“Kd”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离速率。抗体的Kd值可以使用本领域良好建立的方法来确定。如本文所用，术语“K_D”旨在表示特定抗体-抗原相互作用的解离常数，其从Kd与Ka的比率(即，Kd/Ka)获得并且表示为摩尔浓度(M)。确定抗体Kd的优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如

系统。

如本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指针对靶抗原(例如TIM-3受体)具有1×10^-7M或更低，更优选5×10^-8M或更低，甚至更优选1×10^-8M或更低，甚至更优选5×10^-9M或更低，和甚至更优选1×10^-9M或更低的K_D的抗体。

如本文所用的术语“EC₅₀”，也被称为“半数有效浓度”，是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50％的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中，EC₅₀的单位为“nM”。

如本文所用，术语“竞争结合”是指两种抗体在与其结合靶标结合上的相互作用。如果第一抗体与其同源表位的结合在第二抗体存在时与在不存在第二抗体时第一抗体的结合相比可检测地降低，则第一抗体与第二抗体竞争结合。在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合可以但不一定也可检测地降低。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其各自表位的结合。然而，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位的结合的情况下，无论是相同、更大还是更小程度地，抗体均被称为彼此“交叉竞争”结合它们各自的表位。

如本文所用，“抑制结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段抑制两个分子的结合至任何可检测水平。在某些实施方案中，两个分子的结合可以被抗体或其抗原结合片段抑制至少50％。在某些实施方案中，这种抑制作用可以大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。

如本文所用，术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成，并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如，表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸，其可以是“线性”或“构象”表位。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methodsin Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性，可以筛选抗体。例如，可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如RSV融合蛋白)的抗体。在国际专利申请WO 03/48731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法，其基于它们的交叉竞争。

如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然发生变化，或者物质与天然分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。

如本文所用，术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合TIM-3蛋白的分离的抗体基本上不含特异性结合除TIM-3蛋白以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人TIM-3蛋白的分离的抗体对其他抗原如来自其他物种的TIM-3蛋白可能具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。

如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报道基因。另外，载体可以包含复制起点。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人体组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。

如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informaticsand Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；ComputerAnalysis of Sequence Data,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,NewJersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in MolecularBiology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。

如本文所用，术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质，还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素：抗原的性质，宿主的反应性和免疫手段。

如本文所用，术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染和化学和物理方法如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的并且在本文中公开。参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456；Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,同上；Davis等人,1986,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu et al,1981,Gene 13:197。在本发明的一个具体实施方案中，将人TIM-3基因转染入293F细胞。

如本文所用，术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”可以互换使用。当提及术语“杂交瘤”和术语“杂交瘤细胞系”时，它们也包括杂交瘤的亚克隆和后代细胞。

如本文所用，术语“SPR”或“表面等离子体共振”是指并且包括允许通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。关于详细描述，参见实施例和

U.,等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；

U.,等人(1991)Biotechniques 11:620-627；Johnsson,B.,等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131；和Johnnson,B.,等人(1991)Anal.Biochem.198:268-277。

如本文所用，术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且可以对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City，CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah，FL)的EpicsC和来自Cytomation(Colorado Springs，Colorado)的MoFlo。

如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指其中与某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页的表3中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的测定。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地，感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估，例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。

术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与结合其同源抗原的抗体(适当的亚类)结合而启动。为了评估补体活化，可以执行CDC测定，例如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)中所述的。

术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。

如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤如白血病。

本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。

如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量形式的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。例如，当与治疗TIM-3相关疾病或病症联合使用时，“有效量”是指抗体或其抗原结合部分有效治疗所述疾病或病症的量或浓度。

如本文所用，关于哺乳动物中的某种疾病状况的术语“预防”、“防止”或“阻止”是指预防或延迟疾病的发作或预防其临床或亚临床症状的表现。

如本文所用，术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容，并且与接受者在生理学上相容。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂，其在本领域中是公知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR，第19版.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于pH调节剂，表面活性剂，佐剂和离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

如本文所用，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至有机体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。存在多种佐剂，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)，短小棒状杆菌，脂多糖，细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。

抗TIM-3抗体

在一些方面，本发明包括分离的抗体或其抗原结合部分。

在本申请的上下文中，“抗体”可以包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化和灵长类动物化抗体，CDR移植抗体，人抗体，重组产生的抗体，胞内抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，单价抗体，多价抗体，抗独特型抗体，合成抗体，包括其突变蛋白及变体；及其衍生物(包括Fc融合蛋白和其他修饰)，以及任何其他免疫反应性分子，只要其表现出与TIM-3蛋白的优先结合或缔合。此外，除非上下文另外规定，否则该术语还包括所有类别的抗体(即IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。在一个优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。在更优选的实施方案中，抗体是人源化或全人单克隆抗体。

单克隆抗体可以使用本领域已知的多种技术来制备，包括杂交瘤技术，重组技术，噬菌体展示技术，转基因动物(例如

)或其一些组合。例如，可以使用杂交瘤和本领域公认的生物化学和遗传工程技术来生产单克隆抗体，如详细描述于An,Zhigiang(编)Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,John Wileyand Sons,第1版.2009；Shire等(编)Current Trends in Monoclonal AntibodyDevelopment and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC,第1版.2010；Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版.1988；Hammerling,等人,于:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681(Elsevier,N.Y.,1981)，每篇文献在此全部引入作为参考。应该理解，可以进一步改变选定的结合序列，例如以提高对靶的亲和力、使靶结合序列人源化、改善其在细胞培养物中的产生、降低其体内免疫原性、产生多特异性抗体等，并且包含改变的靶结合序列的抗体也是本发明的抗体。在一个优选的实施方案中，通过使用杂交瘤来制备抗人TIM-3单克隆抗体。杂交瘤的产生在本领域中是众所周知的。参见例如Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York。

具有某些特性的抗TIM-3抗体

本公开的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分具有一种或多种以下特性：

(a)特异性结合人TIM-3蛋白和食蟹猴TIM-3蛋白；

(b)阻断TIM3对PtdSer的结合；

(c)增强TCR信号传导；和

(d)诱导人CD4⁺T细胞中细胞因子(例如IL-2或IFN-γ)的产生。

本公开的抗体以高亲和力结合人和食蟹猴TIM-3。本发明的抗体与TIM-3的结合可以使用本领域中确立的一种或多种技术，例如ELISA来评估。本发明抗体的结合特异性也可以通过例如流式细胞术监测抗体与表达TIM-3蛋白的细胞的结合来确定。例如，抗体可以通过流式细胞术测定来测试，其中抗体与表达人TIM-3的细胞系例如已经转染以在其细胞表面上表达TIM-3的CHO细胞反应。用于流式细胞术测定的其他合适的细胞包括表达天然TIM-3的抗CD3-刺激的CD4⁺活化的T细胞。另外或可选地，可以在BIAcore结合测定中测试抗体的结合，包括结合动力学(例如Kd值)。其他合适的结合分析包括ELISA分析，例如使用重组TIM-3蛋白。例如，本公开的抗体以1x10^-9M或更低的K_D结合人TIM-3，以5×10^-10M或更低的K_D结合人TIM-3，以2×10^-10M或更低的K_D结合人TIM-3，以1×10^-10M或更低的K_D结合人TIM-3，以5×10^-11M或更低的K_D结合人TIM-3蛋白，以3×10^-11M或更低的K_D结合人TIM-3蛋白，或以2×10^-11M或更低的K_D结合人TIM-3蛋白。

此外，本公开的抗体可以阻断TIM3与PtdSer的结合。已知TIM-3与PtdSer相互作用，PtdSer倾向于暴露于凋亡细胞的表面，并可能引起免疫抑制。使用例如本文所述的抗TIM-3抗体来阻断PtdSer-TIM-3相互作用可改善或克服免疫抑制。

包含CDR的抗TIM-3抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

A)一个或多个选自下组的重链CDR(HCDR)：

(i)HSEQ1，其包含SEQ ID NO：1；(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：2和7的氨基酸序列之一；和(iii)HCDR3，其包含SEQ ID NO：3；

B)一个或多个选自下组的轻链CDR(LCDR)：

(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO：4；(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO：5；和(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO：6；或

C)A)的一个或多个HCDR和B)的一个或多个LCDR。

抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述，例如Kabat编号系统)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org，如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列，其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据，参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual(Ed.:Duebel,S.和Kontermann,R.,Springer-VerTIM-3,Heidelberg,ISBN-13:978-3540413547，也可在网站bioinforg.uk/abs上获得)。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。除非另有说明，否则本文所述的所有CDR均根据Kabat编号系统获得。

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

C)A)的一个或多个HCDR和B)的一个或多个LCDR。

在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)VH包含：(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；(ii)如SEQ ID NO：2所示的HCDR2，和(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(b)VL包含：(i)如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；(ii)如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和(iii)如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

在另一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)VH包含：(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；(ii)SEQ ID NO：7所示的HCDR2；和(iii)SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(b)VL包含：(i)SEQ ID NO：4所示的LCDR1；(ii)SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和(iii)SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

包含重链可变区和轻链可变区的抗TIM-3抗体

在一些实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区(VH)：

(i)包含选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列；

(ii)包含与选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列至少85％，90％或95％相同的氨基酸序列；或

(iii)包含与选自SEQ ID NO：8和14的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列；和/或

(B)轻链可变区：

(i)包含选自SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列；

(ii)包含与选自SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列至少85％，至少90％，或至少95％相同的氨基酸序列；或

(iii)包含与选自SEQ ID NO：10和12的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。

两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定，其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。

另外地或可选地，本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可使用空位BLAST，如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各个程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由其组成。

在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或由其组成。

在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由其组成。

在一个特定的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分包含：重链可变区，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列或由其组成；和轻链可变区，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列或由其组成。

在其他实施方案中，重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列可以与上述各个序列至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，具有93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％相同。

在一些进一步的实施方案中，分离的抗体或其抗原结合部分可以包含重链和/或轻链的可变区中的一个或多个(如1-10个，1-5个，1-3个，1、2、3、4或5个)氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是，可以进行某些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如Brummell等人(1993)Biochem 32:1180-8；de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10:835-41；Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870；Hall等人(1992)J.Immunol.149:1605-12；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35；Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。

本文使用的术语“保守取代”是指氨基酸取代，其不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人,ProteinEng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

表位分仓(binning)和表位作图

将进一步理解的是，所公开的抗体将与由所选择的靶或其片段呈递的离散表位或免疫原性决定簇缔合或结合。在一些实施方案中，表位或免疫原性决定簇包括分子的化学活性表面分组，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在一些实施方案中，表位可以具有特定的三维结构特征和/或特异性电荷特性。因此，如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，抗体被认为特异性结合(或免疫特异性结合或反应)抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数(K_D)小于或等于10^-6M或小于或等于10^-7M时，更优选当K_D小于或等于10^-7M时，称抗体与抗原特异性结合等于10^-8M，甚至更优选当K_D小于或等于10^-9M时，抗体被认为特异性结合抗原。

由连续氨基酸形成的表位(有时称为“线性”或“连续”表位)通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。在任何情况下，抗体表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，更通常地至少5或8-10个氨基酸。

在这方面，应该理解的是，在一些实施方案中，表位可以与例如TIM-3蛋白的一个或多个区域、结构域或基序结合或位于其中。类似地，本领域公认的术语“基序”将根据其通用含义使用，并且通常应该是指通常十至二十个连续氨基酸残基的蛋白质的短保守区域。

无论如何，一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如通过使用本发明中描述的技术用包含表位的肽免疫。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明关于位于特定结构域或基序中的期望表位的信息。从这些信息中，可以竞争性筛选与相同表位的结合的抗体。实现这一点的方法是进行竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即抗体竞争结合抗原。在WO 03/48731中描述了基于其交叉竞争对抗体进行竞争结合的高通量方法。竞争结合或结构域水平或表位作图包括抗体竞争或在酵母上的抗原片段表达的其他方法在本领域中是公知的。

如本文所用，术语“竞争结合”是指用于基于抗原结合特征和竞争对抗体进行分组或分类的方法。尽管这些技术对于定义和分类本发明的抗体是有用的，但是这些仓(bin)并不总是直接与表位结合，并且表位结合的这种初始测定可以通过本领域中和如本文所述的其他公认的方法进一步改进和确认。然而，可以理解的是，将抗体凭经验性地分配至各个仓提供了可以指示所公开的抗体的治疗潜力的信息。

更具体地，可以通过使用本领域已知和本文实施例中所示的方法确定选定的参考抗体(或其片段)是否结合相同的表位或与第二测试抗体交叉竞争结合(即，在相同的仓内)。

其他相容的表位作图技术包括丙氨酸扫描突变体，肽印迹(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(特别地通过引用整体并入本文)或肽切割分析。另外，可以使用抗原的表位切除，表位提取和化学修饰等方法(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)(特别地通过引用整体并入本文)。

编码本公开的抗体的核酸分子

在一些方面，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列。

本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤表达的抗体(例如，如下文进一步描述的由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。

通过将编码VH的核酸可操作地连接至编码重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的另一DNA分子，可将编码VH区的分离的核酸转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat等(1991)，同上)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区域的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区，但更优选是IgG1或IgG4恒定区。

通过将编码VL的DNA可操作地连接至编码轻链恒定区CL的另一DNA分子，可将编码VL区的分离的核酸转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat等，同上)，并且可以通过标准PCR扩增获得包含这些区域的DNA片段。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VL或VH的DNA片段与编码另一种蛋白质的另一DNA片段例如抗体恒定区或柔性接头可操作地连接。在本文中使用的术语“可操作地连接”旨在表示两个DNA片段连接成使得两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。

在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的重链可变区的核酸序列。

在一些具体的实施方案中，编码分离的抗体的重链可变区的分离的核酸分子包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：8或14所示的重链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：9或15所示的核酸序列；或

(C)在高度严格条件下与(A)或(B)的核酸序列的互补链杂交的核酸序列。

在一些实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含编码如本文所公开的分离的抗体的轻链可变区的核酸序列。

在一些具体的实施方案中，编码分离的抗体的轻链可变区的分离的核酸分子包含选自以下的核酸序列：

(A)编码SEQ ID NO：10或12所示的轻链可变区的核酸序列；

(B)SEQ ID NO：11或13所示的核酸序列；或

例如，核酸分子由SEQ ID NO：9或15组成。或者，核酸分子与SEQ ID NO：9或15具有至少80％(例如至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)的序列同一性。在一些具体的实施方案中，同一性的百分比源自遗传密码的简并性，并且编码的蛋白质序列保持不变。

示例性的高度严格条件包括在45℃下在5X SSPE和45％甲酰胺中杂交，并在65℃在0.1X SSC中进行最终洗涤。在本领域中应该理解，可以通过如Ausubel等人(编),Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1994),第6.0.3至6.4.10页所述的温度和缓冲液或盐浓度的变化来实现等同严格条件。杂交条件下的修饰可凭经验确定或根据探针的鸟苷/胞嘧啶(GC)碱基配对的长度和百分比精确计算。杂交条件可以如Sambrook等人(编),Molecular Cloning:A laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress:Cold Spring Harbor,New York(1989)，第9.47至9.51页中所述进行计算。

宿主细胞

本公开内容中公开的宿主细胞可以是适合于表达本公开的抗体的任何细胞，例如哺乳动物细胞。用于表达本公开的抗体的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr CHO细胞，如Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.ScL USA 77:4216-4220所述，与DHFR选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)J.MoI.Biol.159:601-621中所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，对于与NSO骨髓瘤细胞一起使用，另一种表达系统是WO 87/04462、WO 89/01036和EP 338,841中公开的GS基因表达系统。当将编码抗体的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间从而允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌到培养宿主细胞的培养基中来产生抗体。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

药物组合物

在一些方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所公开的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

组合物的组分

药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分，例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用，使得抗TIM-3抗体增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体，凝胶或固体载体，水性介质，非水性介质，抗微生物剂，等渗剂，缓冲剂，抗氧化剂，麻醉剂，悬浮/分散剂，螯合剂，稀释剂，佐剂，赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的各种组分的组合或更多。

合适的组分可以包括例如抗氧化剂，填充剂，粘合剂，崩解剂，缓冲剂，防腐剂，润滑剂，调味剂，增稠剂，着色剂，乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸，抗坏血酸，EDTA，硫代硫酸钠，铂，过氧化氢酶，柠檬酸，半胱氨酸，巯基甘油，巯基乙酸，巯基山梨糖醇，丁基甲基苯甲醚，丁基化羟基甲苯和/或丙基砷酸盐。如本发明所公开的，在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中，其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低，从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法，其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而，抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化，以延长其保质期和/或增加活性。

为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如含水载体，例如氯化钠注射液，林格氏注射液，等渗右旋糖注射液，无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液，非水性载体如植物来源的固定油，棉籽油，玉米油，芝麻油或花生油，抑细菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂，等渗剂如氯化钠或葡萄糖，缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，抗氧化剂如硫酸氢钠，局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因，悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠，羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80)，隔绝剂或螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，氢氧化钠，盐酸，柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水，盐水，右旋糖，甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂，溶解度增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。

施用、制剂和剂量

本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者，所述途径包括但不限于口服，静脉内，动脉内，皮下，肠胃外，鼻内，肌内，颅内，心内，心室内，气管内，口腔，直肠，腹膜内，皮内，局部，经皮和鞘内，或者通过植入或吸入。本发明组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂；包括但不限于片剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，软膏剂，溶液剂，栓剂，灌肠剂，注射剂，吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。

用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊，丸剂，片剂，包括包衣片剂，酏剂，混悬剂，糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。

适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如，在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液，混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分，例如抗氧化剂，缓冲剂，防腐剂，稳定剂，抑菌剂，悬浮剂，增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水，醇，多元醇，甘油，植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液，林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地，特定剂量方案(包括剂量，时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期，清除率等)的经验考虑。

施用频率可以在治疗过程中确定和调整，并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量，维持这种肿瘤细胞的减少，减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中，施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者，本发明治疗组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。

本领域技术人员将会理解，合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括但不限于特定化合物的活性，施用，施用时间，化合物清除速率，治疗持续时间，其他联合使用的药物、化合物和/或材料，病症的严重程度，以及物种，患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定，但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度，而不会导致实质性的有害或不利副作用。

通常，本发明的抗体或其抗原结合部分可以以各种范围施用。这些包括每剂量约5μg/kg体重至约100mg/kg体重；每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重；每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重。其他范围包括每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重和每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重。在一些实施方案中，剂量为至少约100μg/kg体重，至少约250μg/kg体重，至少约750μg/kg体重，至少约3mg/kg体重，至少约5mg/kg体重，至少约10mg/kg体重。

无论如何，本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率，例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。

在某些优选的实施方案中，涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说，本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天，每两天，每四天，每周，每十天，每两周，每三周，每月，每六周，每两个月，每十周或每三个月施用。就此而言，可以理解的是，可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。

在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的治疗组合物的剂量和方案。例如，可给予个体增量剂量的如本文所述产生的治疗组合物。在选定的实施方案中，剂量可分别根据经验确定或观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少或减轻。为了评估所选择的组合物的功效，可以如前所述跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症，这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小，通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小；通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善；测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原，疼痛或麻痹的减轻；与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善；食欲增加；或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白，剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。

用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂将包含浓度为约10μg/ml至约100mg/ml的本文公开的抗体或其抗原结合部分。在某些选定的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml或1mg/ml。在其他优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分的浓度将包括2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，8mg/ml，10mg/ml，12mg/ml，14mg/ml，16mg/ml，18mg/ml，20mg/ml，25mg/ml，30mg/ml，35mg/ml，40mg/ml，45mg/ml，50mg/ml，60mg/ml，70mg/ml，80mg/ml，90mg/ml或100mg/ml。

本发明的应用

本发明的抗体、抗体组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如TIM-3的检测或免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。

例如，受试者包括需要增强免疫应答的人患者。所述方法特别适用于治疗具有可通过增强免疫应答(例如T细胞介导的免疫应答)治疗的病症的人患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫的抗原特异性增强，可以将抗TIM-3抗体与感兴趣的抗原一起施用，或者抗原可能已经存在于待治疗的受试者中(例如携带肿瘤或病毒的受试者)。当TIM-3的抗体与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。

本发明进一步提供了用于检测样品中人TIM-3抗原的存在或测量人TIM-3抗原的量的方法，包括在允许抗体或其部分与人TIM-3之间形成复合物的条件下使样品和对照样品与特异性结合人TIM-3的人单克隆抗体或其抗原结合部分接触。然后检测复合物的形成，其中与对照样品相比，样品之间的差异复合物形成表明样品中存在人TIM-3抗原。此外，本发明的抗TIM-3抗体可用于通过免疫亲和纯化来纯化人TIM-3。

治疗包括癌症在内的病症

在一些方面，本发明提供了治疗哺乳动物中病症或疾病的方法，其包括向需要治疗的患者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的抗体或其抗原结合部分。所述病症或疾病包括但不限于，增生性病症(例如癌症)、免疫病症、炎性疾病或传染性疾病。例如，所述病症可以是癌症。

可以使用本公开提供的方法治疗或预防涉及TIM-3的多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是原发性的还是继发性的。癌症可以是实体瘤或血液恶性癌。这些癌症的实例包括肺癌如支气管癌(例如非小细胞肺癌，鳞状细胞癌，小细胞癌，大细胞癌和腺癌)，肺泡细胞癌，支气管腺瘤，软骨性错构瘤(非癌性)和肉瘤(癌性)；心脏癌如粘液瘤、纤维瘤和横纹肌瘤；骨癌例如骨软骨瘤，软骨瘤，软骨母细胞瘤，软骨粘液样纤维瘤，骨样骨瘤，巨细胞瘤，软骨肉瘤，多发性骨髓瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，尤因氏肿瘤(尤因氏肉瘤)和网织细胞肉瘤；脑癌例如神经胶质瘤(例如多形性成胶质细胞瘤)，间变性星形细胞瘤，星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，成神经管细胞瘤，脊索瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，脑膜瘤，垂体腺瘤，松果体瘤，骨瘤，血管母细胞瘤，颅咽管瘤，脊索瘤，生殖细胞瘤，畸胎瘤，皮样囊肿和血管瘤；消化系统中的癌症如结肠癌，平滑肌瘤，表皮样癌，腺癌，平滑肌肉瘤，胃腺癌，肠脂肪瘤，肠神经纤维瘤，肠纤维瘤，大肠息肉和结肠直肠癌；肝癌如肝细胞腺瘤，血管瘤，肝细胞癌，纤维板层癌，胆管癌，肝母细胞瘤和血管肉瘤；肾癌如肾腺癌，肾细胞癌，肾上腺样瘤和肾盂的移行细胞癌；膀胱癌；血液系统癌症如急性淋巴细胞(成淋巴细胞)白血病，急性骨髓性(髓细胞性，骨髓，成髓细胞性，骨髓单核细胞性)白血病，慢性淋巴细胞性白血病(例如Sezary综合征和毛细胞性白血病)，慢性髓细胞性(髓性，骨髓性，粒细胞性)白血病，霍奇金氏淋巴瘤，非霍奇金氏淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，蕈样霉菌病和骨髓增殖性病症(包括骨髓增生性病症如真性红细胞增多症，骨髓纤维化，血小板增多症和慢性粒细胞白血病)；皮肤癌如基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，卡波西肉瘤和佩吉特氏病；头和颈癌；与眼相关的癌症，如视网膜母细胞瘤和眼内黑素癌；男性生殖系统癌症如良性前列腺增生，前列腺癌和睾丸癌(例如精原细胞瘤，畸胎瘤，胚胎癌和绒毛膜癌)；乳腺癌；女性生殖系统癌症如子宫癌(子宫内膜癌)，宫颈癌(宫颈肿瘤)，卵巢癌(卵巢肿瘤)，外阴癌，阴道癌，输卵管癌和葡萄胎；甲状腺癌(包括乳头状，滤泡状，间变性或髓样癌)；嗜铬细胞瘤(肾上腺)；甲状旁腺的非癌性生长；胰腺癌；和血液学癌症例如白血病，骨髓瘤，非霍奇金氏淋巴瘤和霍奇金氏淋巴瘤。在一个具体的实施方案中，癌症是结肠癌。在另一个具体的实施方案中，癌症是NSCLC。

在一些实施方案中，癌症的实例包括但不限于，B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级别/滤泡性NHL；中级别扩散性NHL；高级别免疫母细胞NHL；高级别淋巴母细胞NHL；高级别小型非裂核性细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；Waldenstrom巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性粒细胞白血病；和移植后淋巴增生性病症(PTLD)，以及与瘢痣病相关的异常血管增生，水肿(例如与脑肿瘤相关的)，B细胞增殖性病症和Meigs'综合征。更具体的例子包括但不限于复发或难治性NHL，前线低级别NHL，III/IV期NHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结外边缘区-MALT淋巴瘤，淋巴结边缘区淋巴瘤，毛细胞白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞骨髓瘤，低级/滤泡性淋巴瘤，中级/滤泡性NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)，中级弥漫性NHL，弥漫大B细胞淋巴瘤，侵袭性NHL(包括侵袭性前线NHL和侵袭性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或难治的NHL，原发性纵隔大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性淋巴瘤，高级别免疫母细胞NHL，高级成淋巴细胞性NHL，高级别小型非裂核性细胞NHL，大块病NHL，伯基特淋巴瘤，前体(外周)大颗粒淋巴细胞白血病，蕈样霉菌病和/或Sezary综合征，皮肤(皮肤的)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。

在一些实施方案中，癌症的实例进一步包括但不限于，B细胞增殖性病症，其进一步包括但不限于，淋巴瘤(例如B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL))和淋巴细胞白血病。这种淋巴瘤和淋巴细胞白血病包括例如a)滤泡性淋巴瘤，b)小的未裂核性细胞淋巴瘤/伯基特淋巴瘤(包括地方性伯基特淋巴瘤，散发性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特淋巴瘤)，c)边缘区淋巴瘤(包括结外边缘区B细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织淋巴瘤，MALT)，结节边缘区B细胞淋巴瘤和脾边缘区淋巴瘤)，d)套细胞淋巴瘤(MCL)，e)大细胞淋巴瘤(包括B细胞弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，弥漫性混合细胞淋巴瘤，免疫母细胞性淋巴瘤，原发性纵隔B细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B细胞淋巴瘤)，f)毛细胞白血病，g)淋巴细胞淋巴瘤，Waldenstrom巨球蛋白血症，h)急性淋巴细胞白血病(ALL)，慢性淋巴细胞白血病CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，B细胞幼淋巴细胞性白血病，i)浆细胞赘生物，浆细胞性骨髓瘤，多发性骨髓瘤，浆细胞瘤和/或j)霍奇金氏病。

在一些其他实施方案中，病症是自身免疫性疾病。可以用抗体或其抗原结合部分治疗的自身免疫性疾病的实例包括自身免疫性脑脊髓炎，红斑狼疮和类风湿性关节炎。抗体或其抗原结合部分也可用于治疗或预防感染性疾病，炎症性疾病(例如变应性哮喘)和慢性移植物抗宿主病。

对免疫应答的刺激

在一些方面，本发明还提供增强(例如刺激)受试者的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，以使受试者的免疫应答增强。例如，受试者是哺乳动物。在具体的实施方案中，受试者是人。

术语“增强免疫应答”或其语法变化意味着刺激、诱发、增加、改善或增强哺乳动物免疫系统的任何反应。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或体液应答(即抗体介导的应答)，并且可以是主要或次要免疫应答。增强免疫应答的实例包括增加的CD4⁺辅助T细胞活性和细胞溶解性T细胞的产生。可以使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量来评估免疫应答的增强，所述测量包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定，细胞因子释放(例如IL-2产生或IFN-γ产生)，肿瘤消退，携带肿瘤的动物的存活，抗体产生，免疫细胞增殖，细胞表面标记的表达和细胞毒性。典型地，本公开内容的方法与未治疗的哺乳动物或没有使用本文公开的方法治疗的未治疗的哺乳动物的免疫应答相比，增强了哺乳动物的免疫应答。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对微生物病原体(例如病毒)的免疫应答。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分用于增强人对疫苗的免疫应答。在一个实施方案中，该方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。在另一个实施方案中，细胞免疫应答是T辅助细胞应答。在又一个实施方案中，免疫应答是细胞因子产生，特别是IFN-γ产生或IL-2产生。抗体或其抗原结合部分可用于增强人对微生物病原体(如病毒)或疫苗的免疫应答。

抗体或其抗原结合部分可以作为单一疗法单独使用，或者可以与化学疗法或放射疗法组合使用。

与化疗组合使用

抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。

术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂，并且包括但不限于细胞毒性剂，细胞抑制剂，抗血管生成剂，放射疗法和放射治疗剂，靶向抗癌剂，BRM，治疗性抗体，癌症疫苗，细胞因子，激素疗法，放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是，在如上所述的选定实施方案中，此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言，在一些实施方案中，将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此，这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中，所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。

如本文所用，术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中，该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如，白喉毒素，假单胞菌内毒素和外毒素，葡萄球菌肠毒素A)，真菌(例如α-八叠球菌素，局限曲霉素)，植物(相思豆毒蛋白，蓖麻毒素，蒴莲根毒素，槲寄生素，美洲商陆抗病毒蛋白，皂草素，白树毒素，momoridin，天花粉蛋白，大麦毒素，油桐(Aleurites fordii)蛋白，石竹素蛋白，Phytolacca mericana蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒素，石碱草抑制剂，白树毒素，mitegellin，局限曲霉素，酚霉素，新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶，如胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。

为了本发明的目的，“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程，因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如，长春新碱使微管解聚，从而抑制细胞进入有丝分裂。通常，化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的，并且通常是最有效的，例如，在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。

可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、倍癌霉素、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌素、色霉素类、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、

多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinicacid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、

多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；卡西托欣(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；

吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱，

长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(Camptosar，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素；卡培他滨；考布他汀；甲酰四氢叶酸；奥沙利铂；PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖)，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括的是用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂，抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，和抗雄激素；以及曲沙他滨(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗，

rIL-2；

拓扑异构酶1抑制剂；

rmRH；长春瑞滨和埃斯波霉素，以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

与放射疗法组合使用

本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即，用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制，例如γ-照射，X-射线，UV-照射，微波，电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法，并且所公开的缀合物可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常，放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地，放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。

诊断

本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展，包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触，并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中，抗体将包含如本文所述的可检测标记或报道分子。

在一些实施方案中，抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞，从而表明具有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。

可以通过多种测定法分析样品，例如放射免疫测定法，酶免疫测定法(例如ELISA)，竞争结合测定法，荧光免疫测定法，免疫印迹测定法，Western印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术，例如本领域技术人员已知的磁共振成像，计算机化断层摄影(例如CAT扫描)，正电子断层扫描(例如PET扫描)，放射线照相术，超声波等。

药物包装和试剂盒

还提供了包含含有一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中，提供单位剂量，其中单位剂量含有预定量的组合物，所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分，具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案，这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中，单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物；缓冲液，如磷酸盐等；和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者，在一些实施方案中，缀合物组合物可以作为冻干粉末提供，其可以在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。在某些优选的实施方案中，组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质，包括但不限于蔗糖和精氨酸。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的缀合物组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。

本发明还提供了用于产生位点特异性缀合物以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，小瓶，注射器等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料，并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的缀合物。在其他优选实施例中，容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂，并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂，用于诊断或组合治疗。例如，除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外，这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂，例如化学治疗剂或放射治疗剂；抗血管生成剂；抗转移剂；靶向抗癌剂；细胞毒性剂；和/或其他抗癌剂。

更具体地说，试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器，其含有或不含另外的组分，或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。在提供用于缀合的组合治疗剂的情况下，可以按摩尔当量组合或一种组分多于另一种的方式预混合单一溶液。或者，试剂盒的缀合物和任何任选的抗癌剂可以在施用于患者之前分开保存在不同的容器中。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。

当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时，液体溶液优选为水溶液，特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而，试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。

如上简要所述，所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具，例如一种或多种针，I.V.袋或注射器，或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置，通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件，例如注射或吹塑塑料容器，其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。

序列表概述

本申请附带有包含许多核酸和氨基酸序列的序列表。下表A、B和C提供了所包含的序列的概述。

如本文所公开的三种说明性抗体是抗TIM-3单克隆抗体，分别被命名为“W3405-2.61.21”、“W3405-2.61.21(V87E)”(也称为“W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK(V87E)”或“W3405”)和“W3405-2.61.21-uAb-p1”(也称为“W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK”)。“W3405-2.61.21”充当亲本抗TIM-3抗体，“W3405-2.61.21(V87E)”是在亲本抗体基础上的表达优化的抗体，而“W3405-2.61.21-uAb-p1”是最终的去除了PTM(“翻译后修饰”)的抗体。

表A CDR氨基酸序列

表B可变区氨基酸序列

表C可变区核苷酸序列

实施例

通过参考以下实施例将更容易地理解本文一般地描述的本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。这些实施例不旨在表示下面的实验是全部或仅进行的实验。

实施例1

材料、基准抗体和细胞系的准备

1.1材料的准备

表1提供了实施例中使用的商品化材料的信息。

表1

1.2抗原的产生

编码人TIM-3(GenBank登录号NM_032782.3)，小鼠TIM-3(GenBank登录号NM_134250.2)和食蟹猴TIM-3(GenBank登录号EHH54703.1)的截短或全长型式的DNA序列在Sangon Biotech(中国上海)中合成，然后亚克隆到具有不同标签(例如6xhis，AVI-6xhis，人Fc或小鼠Fc)的经修饰的pcDNA3.3表达载体中。将表达载体纯化以供使用。

用纯化的表达载体转染Expi293细胞。将细胞培养5天，并收集上清液使用Ni-NTA柱、蛋白A柱或蛋白G柱进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析获得的人TIM-3.ECD.MBPAVIHIS和小鼠TIM-3.ECD.mFc，然后保存在-80℃。

1.3基准抗体的产生

产生了两种基准抗体，并在实施例中用作阳性对照。一种基准抗体是在美国专利号US9605070B2中被称为“ABTIM3-hum11”的抗体，在本公开中被称为“WBP340-BMK8”或“W340.BMK8”或“W340.BMK8.uIgG4”。第二种基准抗体是在美国专利申请号US20160200815A1中被称为“mAb15”的抗体，其在本公开中被称为“WBP340-BMK6”或“WBP340-BMK6.IgG4”。在Sangon Biotech(中国上海)合成了编码ABTIM3-hum11(WBP340-BMK8)和mAb15(WBP340-BMK6)的可变区的DNA序列，然后亚克隆到具有人IgG4恒定区(S228P)的经修饰的质粒pcDNA3.3表达载体中。

将含有VH和VL基因的质粒共转染到Expi293细胞中。将细胞培养5天，并收集上清液使用蛋白A柱或蛋白G柱进行蛋白纯化。通过SDS-PAGE和SEC分析获得的抗体，然后保存在-80℃。

1.4细胞池/细胞系的产生

使用Lipofectamine 2000，用含有编码全长人TIM-3，小鼠TIM-3或食蟹猴TIM-3的基因的表达载体转染CHO-K1或293F细胞。在含有适当选择标志物的培养基中培养细胞。在有限稀释后选出人TIM-3高表达稳定细胞系(在本文称为“W340-CHO-K1.hPro1.G2”)、低表达稳定细胞系(在本文称为“W340-CHO-K1.hPro1.H1”)和小鼠TIM-3高表达稳定细胞系(在本文称为“WBP340.CHO-K1.mPro1.D3”)，食蟹猴TIM-3高表达稳定细胞系(在本文称为“W340-293F.cynoPro1.FL-17”)、低表达稳定细胞系(在本文称为“W340-293F.cynoPro1.FL-4”)。

根据制造商的方案，通过SE细胞系

X试剂盒用质粒IL-2PLuc转染Jurkat E6-1细胞。转染后48小时，将潮霉素添加到细胞培养物中以选择用IL-2PLuc稳定转染的Jurkat E6-1细胞(在本文中称为“Jurkat E6-1.IL-2P细胞”)。然后使用相同方法将含有全长人TIM-3(“hTIM-3”)的质粒转染至Jurkat E6-1.IL-2P细胞。转染后48小时，将杀稻瘟素S加入细胞培养物中以建立Jurkat E6-1.IL-2P.hTIM-3的稳定细胞池。通过有限稀释获得稳定细胞株。

实施例2

抗体杂交瘤的产生

2.1免疫

将10到11周龄的OMT大鼠(具有重组免疫球蛋白基因座的转基因大鼠，如US8,907,157B2中所述和产生的)通过足垫和皮下注射稀释于佐剂中的hTIM-3.ECD.mFc或mTIM-3.ECD.hFc(均为25μg/动物)每周交替进行免疫。

2.2血清滴度检测

第四次免疫后，每两周收集来自经免疫的OMT大鼠的血清样品并进行检查。通过ELISA测定血清样品中的抗hTIM-3和抗mTIM-3抗体滴度。简言之，将包被有hTIM-3.ECD.His或mTIM-3.ECD.His的平板与稀释的大鼠血清(先按体积1：100，然后在2％BSA/PBS中3倍稀释)共同孵育两小时。将山羊抗大鼠IgG-Fc-HRP用作二抗。通过加入100μL TMB底物显色，然后用100μL 2N HCl停止显色。使用微孔板分光光度计读取450nM处的吸光度。

表2和表3分别显示了经免疫的OMT大鼠对人TIM-3和小鼠TIM-3的血清滴度。

表2.OMT大鼠对人TIM-3的血清滴度

表3.OMT大鼠对小鼠TIM-3的血清滴度

1号大鼠在第7次采血后安乐死并收集淋巴结用于融合。

2.3杂交瘤的产生

当血清抗体滴度足够高时，对OMT大鼠给予最终的追加免疫，其采用的是无佐剂的D-PBS中的人和小鼠TIM-3ECD蛋白。在融合的当天，在无菌条件下从免疫的OMT大鼠中取出淋巴结，并制备成单细胞悬液。然后将分离的细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以1：1的比例混合。根据制造商的说明，使用BTX 2001电促细胞操纵器实施电促细胞融合。然后将细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并在37℃、5％CO₂培养，直至准备好进行筛选。

2.4抗体筛选

人TIM-3结合ELISA被用作测试杂交瘤上清液与人TIM-3蛋白结合的第一筛选方法。简言之，将杂交瘤上清液样品、阳性对照和阴性对照加入预先用hTIM-3.ECD.His包被的平板中，并培养2小时。将山羊抗大鼠IgG-Fc-HRP用作二抗，以检测大鼠抗体在板上的结合。通过加入50μL TMB底物显色，然后用50μL 2N HCl终止。使用微板分光光度计读取450nM处的吸光度。A450≥0.2的样品被认为是阳性hTIM-3结合物(NC：

)。

为了确认最初的结合结果，使用WBP340.CHO-K1.hPro1.G2通过FACS进一步测试了阳性杂交瘤细胞系，方法如下：将杂交瘤细胞上清液添加到细胞中，并通过用Alexa647标记的山羊抗大鼠抗体检测大鼠抗体对细胞表面的结合。通过流式细胞仪评估MFI，并通过FlowJo分析。将抗体与亲本CHO-K1细胞的结合用作阴性对照。

通过初步和二次结合筛选，选择了10个阳性细胞系进行亚克隆。

2.5杂交瘤亚克隆

一旦通过首次和确认筛选验证了特异性结合，就可以使用半固体培养基方法将阳性杂交瘤细胞亚克隆，以获得单克隆抗hTIM-3抗体。如上所述，通过针对人TIM-3的ELISA和FACS结合来确认阳性克隆。收集选定的单个克隆的全部上清液用于杂交瘤抗体纯化。

2.6杂交瘤测序

使用RNeasy Plus迷你试剂盒从杂交瘤细胞中分离总RNA，并如下制备第一链cDNA：

cDNA扩增反应(20μL)

cDNA扩增反应条件

	步骤1	步骤2	步骤3	步骤4
					温度(℃)	25	50	85	4
时间	10秒	50秒	5秒	∞

使用与Ig可变序列的上游信号序列—编码区互补的3'-恒定区简并引物和5'-简并引物组从cDNA扩增抗体VH和VL基因。PCR反应如下：

PCR反应系统(50μL)

组分	量
		cDNA	2.0μL
Premix Ex Taq	25μL
		5’-简并引物组(10pM)	2.5μL
3’-恒定区简并引物(10pM)	1μL
		ddH<sub>2</sub>O	19.5μL

PCR反应条件

将PCR产物(10μL)连接到pMD18-T载体中，并将10μL的连接产物转化到Top10感受态细胞中。将转化的细胞铺在2-YT+Cab平板上，并在37℃孵育过夜。随机挑取了15个阳性克隆进行测序(上海Biosune Biotech Co.,Ltd)。

通过一系列筛选试验，选出了一种杂交瘤前导抗体“W3405-2.61.21”，并将其用作亲本抗体进行以下优化。

实施例3

抗体优化

3.1全人抗体构建

用含有适当限制性位点的克隆引物重新扩增W3405-2.61.21VH和VL基因。将编码WBP3405-2.61.21的轻链可变区和C末端人IgG4轻链的DNA序列克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体中。将编码WBP3405-2.61.21的重链可变区和C末端人IgG4重链恒定区(S228P)的DNA序列克隆到经修饰的pcDNA3.3表达载体中，以表达全人抗体，在本文中称为“W3405-2.61.21-uAb-hIgG4K”或“W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK”。

3.2优化以改进表达水平

当在Expi293细胞中瞬时表达时，抗体W3405-2.61.21-uAb-hIgG4K表现出明显低的表达水平。图1显示了在350mL Expi293细胞中瞬时表达的W3405-2.61.21-uAb-hIgG4K上清液的SDS-PAGE结果，其中仅观察到正确分子量的非常弱的条带。蛋白A纯化后抗体的产量仅为12mg/L，远低于Expi293瞬时表达产生的常规单克隆抗体(>100mg/L)。

为了提高抗体W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK的表达水平，分析了W3405-2.61.21的VH和VL氨基酸序列。通过使用由Discovery Studio软件策划的抗体数据库，对每个残基位置的所有20种氨基酸类型的倾向进行统计分析。确定了非常罕见的氨基酸类型的位置。其中两个位于重链可变区：A7(Kabat：7)和P11(Kabat：11)。一个在轻链可变区：V87(Kabat：81)。通过诱变引物将不常见的氨基酸突变为高倾向类型。轻链中的Val 87(kabat：81)被Glu取代，重链中的Ala 7(kabat：7)和Pro 11(kabat：11)分别被Ser和Leu取代。

设计了三个变体，突变体_1，突变体_2和突变体_3。突变体_1将所有3个残基用其相应的常见氨基酸类型(A7S，P11L和V87E)替换，突变体_2替换了重链中的两个残基(A7S和P11L)，而突变体_3仅替换了轻链中的一个残基(V87E)。使用W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK的可变基因作为模板。通过测序验证了突变。根据制造商的说明，使用Expi293表达系统试剂盒将突变质粒、经密码子优化的质粒和亲本质粒共转染到Expi293细胞中。转染后五天，收集上清液并通过非还原性SDS-PAGE进行分析。同比例进行高达100-300mL的大规模转染。

具体而言，这三个突变体以及野生型抗体W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK均以5mL规模在Expi293细胞中瞬时表达，以进行并排比较。如图2的上清液SDS-PAGE所示，突变体_1和突变体_3表现出明显的表达滴度增强，而突变体_2修饰的重链则无影响。这些结果证实了轻链V87(Kabat：81)是阻止抗体正确产生的唯一关键残基。大规模生产实验(瞬时转染120mL Expi293细胞)中的数据进一步证实了这一发现，其中蛋白A纯化后，突变体_3的产量达到252.5mg/L。与早先生产的野生型抗体相比，这增加了约21倍。

3.3 PTM移除

在VH-CDR2区域中鉴定了潜在的PTM位点“NG”。根据制造商的规程使用QuickChange诱变试剂盒(Agilent Genomics)，通过定点诱变引入了去除PTM位点的突变。设计反义诱变核苷酸以引入以下突变：N→Q，G→A，将W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK(V87E)的可变区基因作为模板。通过测序验证突变。表达、纯化去除了PTM的变体；通过SPR检测与人TIM-3的结合亲和力。

p1变体(N→Q)对人TIM-3的亲和力与W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK(V87E)相当(表4)，因此被选作进一步测试体外表征的抗体。PTM去除后的最终W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK的序列显示在表A，B和C中。

表4.W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK(V87E)和W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK的人TIM-3亲和力

3.4人TIM-3亲和力(SPR)

使用Biacore 8K通过SPR分析检测了W3405-2.61.21-uAb-hIgG4.SPK(V87E)或W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK与人TIM-3的结合亲和力。将每种抗体捕获在固定有抗人IgG Fc抗体的CM5传感器芯片上。以30μL/min的流速将稀释有各种浓度的hTIM-3.ECD.MBPHis的运行缓冲液(含0.9mM CaCl2)注入传感器芯片，结合阶段持续120s，然后是3600s的解离。从测试传感器图中减去空白表面和缓冲液通道的传感器图。使用Langmuir分析通过1：1模型拟合实验数据。

实施例4

体外表征

4.1对人TIM-3的结合(FACS)

将各种浓度的W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1、阳性和阴性对照添加到表达hTIM-3的转染细胞中，然后通过PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测抗体与细胞表面的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。

W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK在用人TIM-3转染的细胞上的结合如图3所示。该抗体以0.13nM的EC₅₀强烈结合至细胞表面人TIM-3。

4.2对静息和活化的人CD4⁺T细胞的结合

已知在体外活化后可以在人CD4⁺T细胞上诱导TIM-3表达[14]。为了确定W3405前导抗体是否可以结合天然人TIM-3，将新鲜纯化的人CD4⁺T细胞活化以诱导TIM-3表达。

使用Ficoll-Paque PLUS梯度离心从健康供体中新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商的方案使用人CD4⁺T细胞富集试剂盒分离人CD4⁺T细胞。将纯化的人CD4⁺T细胞用PHA刺激或保持不刺激达三天。将各种浓度的前导抗体以及阴性对照添加到静息或活化的人CD4⁺T细胞中，然后通过PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测抗体与人CD4⁺T细胞表面的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo进行分析。

如图4所示，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK与活化的而非静息的CD4⁺T细胞结合。图4A显示了该前导抗体在活化和静息的CD4⁺T细胞上的结合图。该前导抗体在活化的CD4⁺T细胞上的结合曲线如图4B所示。

4.3旁系同源物特异性(ELISA)

为了测试它是否特异性结合人TIM-3而不与其他TIM家族成员交叉反应，通过ELISA测定了W3405前导抗体与人TIM-1和TIM-4的结合。将前导抗体、阳性和阴性对照抗体添加到预先用人TIM-1或TIM-4包被的平板中。通过相应的缀合有HRP的二抗检测抗体与平板的结合。

如图5所示，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK与人TIM-3特异性结合(图5A)，而与人TIM-1(图5B)或TIM-4(图5C)无交叉反应性结合。

4.4种间交叉结合(FACS)

通过FACS测定前导抗体与食蟹猴TIM-3的结合。将各种浓度的前导抗体、阳性和阴性对照添加到表达食蟹猴TIM-3的转染细胞中，然后用PE标记的山羊抗人IgG-Fc抗体检测抗体与细胞表面的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo分析。

W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK与食蟹猴TIM-3的结合结果如图6所示。该抗体显示与食蟹猴TIM-3的强烈结合，EC50为0.99nM。

4.5对食蟹猴TIM-3的亲和力(SPR)

使用Biacore 8K通过SPR分析检测W3405-2.61.21-uAb-p1-IgG4.SPK与食蟹猴TIM-3的结合亲和力。将CM5传感器芯片(GE)用食蟹猴TIM-3.ECD.Fc固定。将不同浓度的测试抗体以30uL/min的流速注入传感器芯片，持续200s的结合阶段，然后是2400s的解离。从测试传感器图中减去空白表面和缓冲液通道的传感器图。使用Langmuir分析通过1：1模型拟合实验数据。

结果示于表5。

表5.抗体对食蟹猴TIM-3的亲和力

4.6PtdSer(磷脂酰丝氨酸)竞争测定法

Sabatos-Peyton等人提出，对PtdSer的阻断是抗TIM-3抗体的共同特性，且具有已证实的功能效果[15]。为了确定W3405前导抗体是否能阻断人TIM-3和PtdSer之间的结合，通过诱导Jurkat E6-1细胞凋亡，在各种浓度的W3405前导抗体存在下，检查了凋亡Jurkat细胞表面上的对人TIM-3的结合。

用紫杉醇处理Jurkat E6-1细胞2天以诱导凋亡。将各种浓度的前导抗体、阳性和阴性对照与带有mFc标签的人TIM-3预混合，然后添加到凋亡的Jurkat细胞中。通过PE标记的抗小鼠IgG Fc抗体检测在凋亡Jurkat细胞表面对人TIM-3的结合。通过流式细胞仪测量细胞的MFI，并通过FlowJo分析PE阳性细胞的百分比。

如图7所示，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK表现出对PtdSer-TIM-3相互作用的剂量依赖性阻断，IC50为20nM。

4.7报告基因检测

Ferris等人提出，至少在急性条件下，TIM-3可能通过增强TCR信号传导而有助于T细胞衰竭[16]。为了测试W3405前导抗体是否可以在功能上抵消TIM-3在调节T细胞反应中的作用，转染稳定整合表达IL-2荧光素酶报告基因的Jurkat E6-1细胞以表达人TIM-3。在各种浓度的测试抗体存在下，在37℃、5％CO2通过抗CD28抗体和抗CD3抗体激活TIM-3⁺Jurkat细胞。孵育后，加入重构的荧光素酶底物，并通过微板分光光度计测量荧光素酶强度。

与Ferris的发现一致，过表达TIM-3的Jurkat细胞在抗CD3/CD28抗体刺激后显示IL-2报告基因信号的升高。如图8所示，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK能以剂量依赖性方式阻断TIM-3对Jurkat细胞IL-2产生的影响。

4.8同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)

如上所述分离和纯化PBMC和人CD4+T细胞。根据制造商的说明，使用CD14微珠分离单核细胞。将细胞在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养5至7天，以产生树突细胞(DC)。将纯化的CD4+T细胞与同种异体成熟DC(mDC)以及各种浓度的前导抗体在96孔板中共培养。在第5天，收获培养物上清液进行IFNγ测试。

图9所示结果表明，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK能以剂量依赖性方式增强人CD4+T细胞的IFNγ产生。

4.9 T细胞衰竭防止的测定

如Ozkazanc D.等人所报道，与髓细胞性白血病细胞共培养导致人CD4+T细胞功能衰竭[17]。为了确定W3405前导抗体是否可以防止THP-1诱导的CD4+T细胞衰竭，将新鲜分离的人CD4+T细胞与THP-1细胞在抗CD3抗体存在下共培养4-5天以诱导衰竭。将各种浓度的前导抗体或同种型对照添加到培养物中以防止T细胞衰竭。在第5天，收获细胞并用PMA/离子霉素和Golgi-stop刺激6小时。通过细胞内染色测定IL-2的产生。

结果显示在图10中。W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK能以剂量依赖性方式防止THP-1细胞共培养诱导的CD4⁺T细胞的IL-2分泌能力的降低。

4.10表位分仓

根据美国专利号US 9,605,070B2和美国专利申请号US20160200815A1分别公开的序列生成抗人TIM-3参考抗体WBP340-BMK8和WBP340-BMK6。将各种浓度的测试抗体分别与一定量的生物素化的WBP340-BMK8和W340-BMK6混合。然后将混合物加入预先用人TIM-3蛋白包被的板上。通过SA-HRP检测BMK8和BMK6与板的结合。

如图11所示，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK与WBP340-BMK8竞争与人TIM-3的结合(图11A)，而不与BMK6竞争(图11B)。

4.11 ADCC测定

根据制造商的方案使用人CD56微珠分离NK细胞。将表达人TIM-3的CHO细胞和各种浓度的测试抗体在96孔板中预孵育30分钟，然后以效应细胞/靶细胞比例5：1加入NK细胞。将该板在5％CO2培养箱中在37℃孵育4-6小时。通过基于LDH的细胞毒性检测试剂盒测定靶细胞裂解。将赫赛汀诱导的对SKBR-3细胞的ADCC作用作为阳性对照。

4.12 CDC测定

在96孔板中混合表达人TIM-3的CHO细胞和各种浓度的测试抗体。以1:50的最终稀释度添加人补体。将板在5％CO2培养箱中在37℃保持2-3小时。通过CellTiter-Glo测定靶细胞裂解。将

诱导的Raji细胞裂解用作阳性对照。

ADCC(图12)和CDC(图13)的结果表明，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1在表达hTIM-3的细胞上不介导ADCC或CDC活性，这可以避免用于治疗患者时对TIM-3阳性细胞的潜在损伤。

4.13血清稳定性

将测试抗体以1:10的比例在新鲜收集的人血清中稀释，等分并在5％CO2培养箱中于37℃培养。在指示的时间点，从培养箱中取出测试抗体的等分试样，速冻，然后保存在-20℃，并通过如前所述的FACS方法检测与人TIM-3的结合。

图14表明，W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK在人血清中在37℃稳定至少14天。

实施例5

体内表征

5.1 NOG小鼠HCC827 MiXeno^TM模型中的功效研究

使用NOG小鼠在HCC827 MiXeno^TM模型中评估W3405前导抗体W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK的治疗效果。在第0天，将5x10⁶个人非小细胞肺癌HCC-827细胞皮下植入NOG小鼠(6-8周龄，雌性，Beijing Vital River)中。当肿瘤达到至少280mm³时，将动物随机化并用2.5×10⁶个活化的人T细胞静脉内输注。在T细胞输注后，给小鼠注射(每周腹膜内注射，共4周)W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK或同种型对照抗体(10mg/kg)。使用卡尺每周两次测量肿瘤大小，并使用以下公式以mm³表示体积：V＝0.5a x b²其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。使用以下公式计算各组的TGI：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是治疗组在给定日的平均肿瘤体积，T0是开始治疗当天治疗组的平均肿瘤体积，Vi是同种型对照组在Ti同一天的平均肿瘤体积，V0是开始治疗当天的同种型对照组的平均肿瘤体积。

如图15所示，从第0天到第16天，与用同种型对照治疗的动物相比，用W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK治疗的动物显示出肿瘤进展的延迟。在第3剂治疗后，接受W3405-2.61.21-uAb-p1-hIgG4.SPK治疗的动物开始显示出显著且持久的肿瘤消退。在第28天，即最后一次给药后7天，治疗组中的动物平均TGI达到131.4％，其中7/10的动物从治疗开始显示出至少40％的肿瘤减少。

本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

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[17]Ozkazanc D,等人Functional exhaustion of CD4⁺T cells induced byco-stimulatory signals from myeloid leukaemia cells.Immunology.2016；149:460-71.

序列表

<110> 上海药明生物技术有限公司

<120> WBP3405

<130> 抗TIM-3抗体及其用途

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR1氨基酸序列

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2氨基酸序列

<400> 2

Ser Ile Ser Asp Asn Gly Gly Thr Ala Tyr His Ala Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR3氨基酸序列

<400> 3

Asp Phe Gly Asp Ser Pro Gly Tyr

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR1氨基酸序列

<400> 4

Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Phe Lys Asn Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR2氨基酸序列

<400> 5

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CDR3氨基酸序列

<400> 6

Gln Gln Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CDR2氨基酸序列

<400> 7

Ser Ile Ser Asp Gln Gly Gly Thr Ala Tyr His Ala Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ala Gly Gly Gly Pro Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Asn Gly Gly Thr Ala Tyr His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Phe Gly Asp Ser Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH核酸序列

<400> 9

gaggtgcagt tgttggaggc tgggggaggc ccggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag ccgctggatt cacctttagc aactatgcca tgagctgggt ccggcaggct 120

ccagggaagg ggctggaatg ggtctcaagt attagtgaca atggtgggac cgcataccac 180

gcagactccg tgcagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240

ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagacttc 300

ggtgactccc cgggctactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL氨基酸序列

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Phe Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Val Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 11

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL核酸序列

<400> 11

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagcttca agaataagaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctgt agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagttct 300

ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL氨基酸序列

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser

20 25 30

Phe Lys Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 13

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL核酸序列

<400> 13

gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60

atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagcttca agaataagaa ctacttagct 120

tggtaccagc agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacccgg 180

gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240

atcagcagcc tgcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttatagttct 300

ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg gagatcaaa 339

<210> 14

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH氨基酸序列

<400> 14

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ala Gly Gly Gly Pro Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asp Gln Gly Gly Thr Ala Tyr His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Phe Gly Asp Ser Pro Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH核酸序列

<400> 15

gaggtgcagt tgttggaggc tgggggaggc ccggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag ccgctggatt cacctttagc aactatgcca tgagctgggt ccggcaggct 120

ccagggaagg ggctggaatg ggtctcaagt attagtgacc agggtgggac cgcataccac 180

gcagactccg tgcagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagag cacgctgtat 240

ctacaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagacttc 300

ggtgactccc cgggctactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351

Claims

1.一种分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；

如选自SEQ ID NO：7和2的氨基酸序列之一所示的HCDR2；

如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；

如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和

如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

2.权利要求1的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)所述重链可变区包含：

(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；

(ii)如SEQ ID NO：7所示的HCDR2；和

(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(b)所述轻链可变区包含：

(i)如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；

(ii)如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和

(iii)如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

3.权利要求1的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)所述重链可变区包含：

(i)如SEQ ID NO：1所示的HCDR1；

(ii)如SEQ ID NO：2所示的HCDR2；和

(iii)如SEQ ID NO：3所示的HCDR3；和

(b)所述轻链可变区包含：

(i)如SEQ ID NO：4所示的LCDR1；

(ii)如SEQ ID NO：5所示的LCDR2；和

(iii)如SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

4.前述权利要求中任一项的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(A)重链可变区(VH)：

(i)包含选自SEQ ID NO：14和8的氨基酸序列；或

(ii)包含与选自SEQ ID NO：14和8的氨基酸序列相比具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；和

(B)轻链可变区(VL)：

(i)包含选自SEQ ID NO：12和10的氨基酸序列；或

(ii)包含与选自SEQ ID NO：12和10的氨基酸序列相比具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。

5.权利要求4的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：

(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区；或

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区；或

(c)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

6.权利要求5的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：14所示的重链可变区和如SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。

7.权利要求5的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：8所示的重链可变区和如SEQ ID NO：10所示的轻链可变区。

8.权利要求5的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述分离的抗体或其抗原结合部分包含：如SEQ ID NO：8所示的重链可变区和如SEQ ID NO：12所示的轻链可变区。

9.权利要求1-3中任一项的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中轻链是kappa轻链。

10.权利要求1-3中任一项的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。

11.权利要求1-3中任一项的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体是完全人单克隆抗体。

12.权利要求1-3中任一项的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含人IgG的恒定区。

13.权利要求12的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含含有S228P突变的人IgG4的恒定区。

14.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-13中任一项所定义的分离的抗TIM-3抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区的核酸序列。

15.权利要求14的分离的核酸分子，其包含选自下组的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO：14或8所示的重链可变区的核酸序列；或

(B)如SEQ ID NO：15或9所示的核酸序列。

16.权利要求14的分离的核酸分子，其包含选自下组的核酸序列：

(A)编码如SEQ ID NO：12或10所示的轻链可变区的核酸序列；或

(B)如SEQ ID NO：13或11所示的核酸序列。

17.一种载体，其包含权利要求14-16中任一项的核酸分子。

18.一种宿主细胞，其包含权利要求17的载体。

19.一种药物组合物，其包含至少一种权利要求1-13中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

20.制备权利要求1-13中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的方法，包括以下步骤：

-在权利要求18的宿主细胞中表达权利要求1-13中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分；和

-从宿主细胞分离所述抗体或其抗原结合部分。

21.权利要求1-13中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

22.权利要求21的用途，其中所述癌症是结肠癌或肺癌。

23.权利要求22的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。

24.一种试剂盒，其包含含有至少一种权利要求1-13中任一项所定义的抗体或其抗原结合部分的容器。