CN113186208A - 一种真核重组质粒及其在提高番茄果实色素积累中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种调控番茄果实色素积累的基因及应用。一种真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：3替换真核表达载体pBI121中的35S，得到改造后的真核表达载体pBITFM7；由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和真核表达载体构成，所述基因片段是位于起始密码子下游115bp至524bp的核苷酸序列，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向与反向插入的基因片段间存在有150bp的内含子。本发明发现SlCMTL下调表达后番茄绿色果实中叶绿素含量、叶绿体体积及数目均增加，且红果中类胡萝卜素含量增加；实验表明，所述真核重组质粒可在提高番茄果实色素积累中应用。

Description

一种真核重组质粒及其在提高番茄果实色素积累中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，特别涉及一种真核重组质粒及其在调控番茄果实色素积 累中的应用。

背景技术

番茄红素是植物中所含的一种天然色素，具有清除活性氧自由基、促进细胞间隙连 接通讯、防癌抗癌等多种生理功能。番茄是番茄红素的主要来源，同时也是人类食物中类胡 萝卜素的重要贡献者。番茄红素是成熟番茄中最丰富的类胡萝卜素，占其色素组成的80％－ 90％。McCallum(1995)研究发现番茄红素和其他类胡萝卜素主要存在于番茄的外果皮中 (McCollum JP.Distribution of carotenoids in the tomato.Food Res.,1995,20:55-59)。在细胞水平 上，研究发现番茄红素定位于番茄果实的叶绿体以及光合色素蛋白复合体的类囊体膜中 (Bouvier F,Bachaus RA,Camara B.Induction and control ofchromoplast-specific carotenoid genes by oxidative stress.J Biol Chem,1998,273:30651-9；Akhtar MS,Goldschmidt EE,John I, Rodoni S,Matile P,and GriesonD.Altered patterns of senescence and ripening in gf,a stay-green mutant oftomato(lycopersicon esculentum Mill.).J Exp Bot,1999,50:1115-22)。在番茄果实成熟的早期，叶绿体中的主要色素是叶绿素；当叶绿素降解后，果实颜色由绿变白；叶绿体中的叶绿素减少后，番茄红素开始形成并伴随着果实超微结果的改变，导致果实颜色由白变红 (Matienco BT,Yedalty EM.Ultrastructure of carotenoidoplasts.AcademicPress,New York,1973)。 番茄中番茄红素和其他类胡萝卜素的生物合成过程已经研究的非常详细。为了改良番茄品质、 增加其番茄红素以及其他类胡萝卜素的含量，研究者们对番茄红素合成途径中结构基因的遗 传操作进行了广泛的尝试，Kato等将PSY基因反义导人番茄，导致转基因株系中类胡萝卜素 含量大大下降，表明PSY基因在番茄类胡萝卜素生物合成中起限速作用(Kato M,Ikoma Y, Matsumoto H,et al.Accumulation ofcarotenoids and expression of carotenoid biosynthetic genes during maturationin citrus fruit[J].Plant physiol,2004,134(2):824-837)。Fraser等将crtB基因 与特异性启动子PG结合转入番茄中，发现转基因番茄中的番茄红素的含量与对照相比提高 了2.4倍(Fraser PD,Schuch W,BramLey PM.Regulation of carotenoid biosynthesis andaccumulation in plants[J].Planta,2002(11):361-369)。Ganga等利用RNAi技术使番茄红素β- 环化酶(lycopeneβ-cyclase)基因(β-Lcy)沉默，很大程度上提高了转基因番茄中番茄红素的 含量(Ganga RD,Ageeth VT,Paul DF,et al.Fruit-specific RNAi-mediatedsuppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes[J].Nature

biotechnology,2005,23(7):890-895)。Enfissi等将大肠杆菌的DXS基因导入番茄中，结 果发现转基因植株的八氢番茄红素和β-胡萝卜素含量均有显著提高(EnfissiEMA,Fraser PD, Lois LM,et al.BramLey PM Metabolic for the production ofbealth promoting isoprenoids[J].Plant biotech J,2005(3):17-27)。

综上所述，现有技术中虽然公开了一些用于调控番茄果实色素积累的基因，但通过基因 工程技术克隆和筛选出更多的调节基因，对提高番茄果实色素积累，培育品质优良的番茄仍 然有着重要的作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新型的真核重组质粒及其制备方法，本发明的目的之二是 将所述真核重组质粒在调控番茄果实色素积累中应用，以提高番茄果实色素的积累，培育出 品质更好的番茄。

本发明的技术方案如下：

根据GenBank上公布的EST序列(登录号：AK319284)，利用引物设计软件PrimerPremier 5.0设计了PCR特异引物，从番茄成熟叶片中提取总RNA，利用反转录PCR(RT-PCR)技 术从番茄中分离得到一个2891bp的cDNA序列，分析得到一个2802bp的开发阅读框，命名为SlCMTL基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。该基因编码一个具有DNA 甲基转移酶结构域的假定蛋白，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和 改造后的真核表达载体构成，所述改造后的真核表达载体是用序列表中SEQ ID NO：3所述 核苷酸序列替换原始真核表达载体(现有真核表达载体)中的35S启动子而形成的真核表达 载体；所述基因片段是SEQ ID NO：1中115bp至524bp的核苷酸序列，所述基因片段正向 和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的 内含子。

本发明所述真核重组质粒的制备方法，其步骤如下：

(1)根据GeneBank数据库中的基因序列(X95261.1)设计PCR特异引物，从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个果实特异性启动子，所述启动子 的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述；

(2)将步骤(1)获得的果实特异性启动子替换原始真核表达载体(现有真核表达载体) 中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体；

(3)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片 段是SEQ ID NO：1中115bp至524bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；

(4)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部 段，然后连接到改造后的真核表达载体上，即获真核重组质粒。

本发明所述真核重组质粒及其制备方法中，所述真核表达载体为pHB、pMON1772、pBE12、 pBC7、YFP-pBA、pBI121中的一种。

将上述真核重组质粒转化番茄，获得转基因番茄植株。实验表明：所述转基因番茄植株 的未成熟果实颜色明显深于野生型番茄植株的未成熟果实(见图6)；对于成熟番茄果实， 转基因番茄的番茄红素含量也较野生型番茄有明显的提高(图10)。由此可见，本发明所述 真核重组质粒能够调控番茄果实色素的积累，可在提高番茄果实色素积累中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为提高番茄果实色素积累提供了一种新的真核重组质粒，有利于番茄品质的改 良。

2、本发明所用的基因为番茄本身自有的基因，所以转基因番茄的安全性能高。

3、本发明所述基因的克隆和番茄转基因均为常规方法，所需材料易于获取。

附图说明

图1是SlCMTL基因的扩增电泳图，图中，M泳道为DNA标注分子marker；1泳道为SlCMTL基因的PCR扩增结果。

图2是本发明所述真核重组质粒(pBITFM7::SlCMTLRNAi)的一种示意图，其中，sense 为正向基因片段，anti-sense为反向基因片段。

图3转基因植株的PCR鉴定，1泳道为DNA标注分子Marker；2泳道为阳性对照；3 泳道为以野生型番茄DNA为模板的阴性对照；4-10泳道为转基因番茄植株DNA为模板的 PCR产物。

图4SlCMTL基因的表达模式；Root：根，Stem：茎，Leaf：叶片，Flower：花，Fruit： 果实

图5pBITFM7::SlCMTLRi转基因植株的半定量和荧光定量分析结果；上：半定量PCR分析野生型和转基因植株中SlCMTL的表达情况；下：荧光定量PCR分析野生型和转基因植株中SlCMTL的表达情况。

图6pBITFM7::SlCMTLRi对番茄果实色素积累的影响；WT为野生型， TFM7::SlCMTLRi为pBITFM7::SlCMTLRi

图7pBITFM7::SlCMTLRi对成熟绿果叶绿素含量的影响；WT为野生型，a，b，c为pBITFM7::SlCMTLRi转基因植株的3个不同株系。

图8pBITFM7::SlCMTLRi对成熟绿果质体的影响；a分别为野生型和pBITFM7::SlCMTLRi 的成熟绿果果皮细胞，标尺＝100μm；b为野生型及pBITFM7::SlCMTLRi的成熟绿果果皮细 胞中质体平均容积和每个细胞中的质粒容积情况。

图9番茄红素和β-胡萝卜素的标品浓度和峰面积的标准曲线。

图10pBITFM7::SlCMTLRi对番茄红素和β-胡萝卜素含量的影响；左边为野生型以及三 个不同pBITFM7::SlCMTLRi转基因株系(1、2、3)中番茄果实的番茄红素含量情况；右边 为野生型以及三个不同pBITFM7::SlCMTLRi转基因株系(1、2、3)中番茄果实的β-胡萝卜素含量情况。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施事例中，凡未注明具体实验条件的， 均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook,Russell的分子克隆：实验室手册 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。

实施例1：SlCMTL基因的克隆

1、试剂

限制性内切酶：Hind III，Xho I，Xba I，EcoR I，Sac I；Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，PrimeStar热启动高保真DNA聚合酶，大肠杆菌(E.coli DH5α)菌株等购自大连宝 生物工程公司，pEASY-Blunt载体购自全式金生物技术公司；Trizol试剂购自北京天为时代科技有限公司；质粒提取及DNA回收试剂盒购自OMEGA公司；PCR引物由上海英俊生物 公司合成；其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和植物材料

大肠杆菌克隆菌株为E.coli DH5α，购自生工生物工程股份有限公司。番茄野生型种子 为AC⁺，可通过市场购买。

3、培养基和溶液

LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高 压灭菌。

SOB培养基:胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

SOC培养基:SOB+20mM葡萄糖。

TB buffer(临用前配置):1M KCl 4mL，0.45M MnCl₂ 2.4mL，0.50M CaCl₂ 0.6 mL，0.50M K-MES 0.5mL，ddH₂O 12.5mL(总体积20 mL)。

100×Mg²⁺溶液:20.33g MgCl₂.6H₂0和24.65g MgSO₄.7H₂0定容于100mL H₂O，高压灭 菌。

20％葡萄糖溶液:20g葡萄糖定容于100mL H₂O，过滤除菌。

1M KCl溶液:7.45g KCl定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.45M MnCl₂溶液:8.9g MnCl₂.4H₂0定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M CaCl₂溶液:7.35g CaCl₂.2H₂0定容于100mL H₂O，高压灭菌。

0.50M K-MES溶液:9.76g MES定容于100mL H₂O，用KOH调pH至6.3，过滤除 菌，分装成0.5mL每管，-20℃储存。

DMSO:分装200μl新鲜DMSO，-20℃储存。

4、实验方法

4.1质粒微量提取

1)将带有克隆载体pEASY-Blunt(购自全式金生物技术公司)的E.coli DH5α接种于 裝有5ml LB培养液(含适量抗生素)的试管中，37℃搖床培养12～16hr，以扩增质粒。

2)取1.5～5ml的菌液，于室温下10,000xg离心1min。倒净培养基，往沉淀中加入250μl的solution I/RNaseA(购自OMEGA公司)混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬 浮。

3)往重悬混和液中加入250μl solution II(购自OMEGA公司)，轻轻翻转试管4～6次 混和溶液，以获得澄清的裂解液。

4)往上述混和液中加入350ul solution III(购自OMEGA公司)，并温和地上下颠倒离 心管数次，直至形成白色絮狀沉淀。于室温下10,000xg离心10min。

5)取干净的质粒微量分离柱置于2ml收集试管上(已备)。小心将上清转至质粒微量分 离柱內，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下10,000xg离心1min，使裂 解液完全流过柱子。

6)弃去离心甩出液，加入500μl的solution HB缓冲液(购自OMEGA公司)到柱子上，室温下10,000xg离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需 的高质量DNA。

7)弃去收集液，加入700μl用无水乙醇稀释的wash buffer缓冲液洗涤柱子，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。

8)可选做步骤：重复步骤7，用700μl wash buffer缓冲液再洗涤柱子一次。

9)室温下10,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。

10)把柱子置于干净的1.5ml离心管上，直接加入30～50μl灭菌去离子水或TE缓冲液 液到柱子基质上(所加的量取决于预期终产物浓度)，10,000xg离心1min以洗脱出DNA。

4.2DNA回收方案

1)处理琼脂糖凝胶-EB电泳混和物以分离DNA片段。任何类型或等级的琼脂糖都可以 使用。

2)在紫外灯上小心的把所需的DNA片段切下来。这样就能保证把含DNA的凝胶尽量多的取出来。

3)通过把凝胶薄片装在1.5ml小离心管中称其重量的方法，近似地确定其体积。例如 其密度为1g/ml，于是凝胶的体积便可通过如下方法得到：凝胶薄片的重量为0.2g则其体积 为0.2ml。加入体积为凝胶体积3～4倍的XP2缓冲液(购自OMEGA公司)，把混和物置于55～65℃水浴中温浴7min，或至凝胶完全融化。

4)把DNA-琼脂糖溶液加到一个HiBind DNA回收纯化柱上，并把柱子装在一个干凈的 2ml收集管内，室温下于10,000xg离心1min，弃去液体。

5)用750μl无水乙醇稀释的SPW洗涤缓冲液(购自OMEGA公司)洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。

6)弃去流出液，重复第6步一次。

7)弃去液体，把空柱10,000xg离心2min以甩干柱基质残余的液体。

8)把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上，室温风干5-10min，使乙醇挥发殆尽。

9)加入30～50μl(具体取决于预期的终产物浓度)的灭菌去离子水(或者PH8.0的TE 缓冲液)到柱基质上，10,000xg离心1min以洗脱DNA。

4.3番茄叶片RNA的提取

1)液氮迅速研磨野生型番茄叶片，按50-100mg组织/ml Trizol(购自北京天为时代科技 有限公司)加入Trizol，剧烈震荡，室温放置5min。

2)12,000rpm离心5min。

3)取上清，按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min。

4)4℃12,000g离心15min。

5)取上清，按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min。

6)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

7)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

8)4℃8,000g离心5min，尽量弃上清。

9)室温干燥5-10min(RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。)。

10)用50ul DEPC-H₂O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min。

4.4RT-PCR

1)引物合成

上海invitrogen生物技术有限公司合成：

SlCMTL-F：5’-GCTGCGACCTACTACTTCATC-3’

SlCMTL-R：5’-CCCATACAGAGGGTGAAAGAT-3’

2)RT

冰上在一个200μl EP管中加入以下组分：

按以下程序进行反转录：42℃30min(反应)；99℃5min(酶变性)；4℃5min(保 存)。

2)PCR

PCR反应体系：

按以下程序进行扩增：95℃3min(预变性)；95℃10s(变性)，55℃30s(复性)， 72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

通过上述操作，获得了用于构建目的重组质粒的SlCMTL基因(图1)。

4.5目的基因与克隆载体pEASY-Blunt连接

PCR产物与克隆载体pEASY-Blunt按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下：

PCR产物(～150μg/μl) 1μl

pEASY-Blunt 4μl

25℃连接20min。

4.6大肠杆菌转化

1)感受态细胞的制备

a)接种大肠杆菌单菌落于2mL SOB培养液中，37℃过夜培养；

b)转接0.5mL过夜培养物至50mL SOB培养液中，18℃剧烈震荡18～24h至A₆₀₀≈0.55；

c)将培养液转入50mL离心管中，冰浴10min,4℃4,000rpm离心10min；

d)去上清，加16mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞(注意：轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀)，冰浴10min，4℃4,000rpm离心10min；

e)去上清，加4mL预冷的TB缓冲液悬浮细胞，加入280μl的DMSO，轻缓混匀，冰 浴10min；

f)分装于预冷得1.5mL EP管中，液氮冻存。

2)转化

a)从液氮中取出感受态细胞冰浴解冻；

b)将10μl连接产物与感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

c)42℃热冲击90s，立即冰浴1-2min；

d)加0.8mL的SOC，混匀，37℃温和摇床1h。

e)室温13,000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μl的上清液，用枪头将上清液与细胞混匀，涂布LB+amp(50μg/ml)平板，37℃培养过夜。

4.7细胞快速裂解法鉴定重组质粒

1)挑取单个转化子接种于500μl含相应抗生素的LB培养液中，37℃振荡培养至A₆₀₀为0.6～0.8。

2)取200μl菌液至0.5ml EP管中，13,000rpm离心1min，去上清，留约20μl上清。

3)加20μl 2×快速裂解液[0.2mol/L NaOH 50mL+SDS 0.5g,蔗糖27.2g，加双蒸水至 200ml]，剧烈振荡。

4)13,000rpm离心15min。

5)取5μl上清直接电泳。与对照比，电泳带滞后的即可能是重组质粒。

4.8菌落PCR鉴定重组质粒

经过快速裂解法鉴定的重组质粒再做菌落PCR以确定插入片段是目标片段，反应体系 如下：

反应条件：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，56℃30s(复性)，72℃2 min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)。

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果进行比对和拼接，所得序列为序列表 中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：真核重组质粒的构建及其功能验证

1、材料

1.1实验材料

番茄野生型种子为AC⁺，可通过市场购买。

1.1.1主要试剂

1)菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5а，购自生工生物工程股份有限公司。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，购自生工生物工程股份有限公司。

2)质粒

pMD18-T载体：衍生自pUC18，2.692Kb，Ampr，为克隆PCR产物(TA Cloning)的 专用载体，插入位点为EcoRV的酶切位点，购自TaKaRa。

质粒pSKint(以下简写pSK)：Amp抗性，具有两处多克隆位点。

植物表达载体pBI121：含有选择标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因及β-葡萄糖 苷酸酶(GUS)基因。

3)植物激素

吲哚乙酸(Indoleacetic Acid,IAA)；激动素(Kinetin，Kt)；6-苄氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)；乙酰丁香酮(Acetosyringone，ACE)；2,4-二氯苯氧基乙酸 (2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D)。

4)抗生素

羧卞青霉素(Carbenicillin)；硫酸卡那霉素(Kanamycin)

5)植物DNA提取缓冲液

100mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，50mmol/L EDTA(pH8.0)，500mmol/L NaCl，10mmol/Lα- 巯基乙醇，10％或20％SDS。

6)培养基与溶液

酵母提取物1g/L，胰蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgS0₄.7H₂O 0.5g/L。用NaOH调pH 至7.0，高压灭菌。

番茄转化过程中所用培养基如下：(表1)

表1番茄组织培养所用培养基

注：植物激素及抗生素均待培养基冷却到40－50℃时加入。

2、方法

2.1提取番茄幼果的DNA

(1)取100mg新鲜番茄幼果，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1.5mL离心管中，每管加入500μL 65℃预热的2×CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(100mmol/LTris-HCl pH 8.0，20mmol/L乙二胺四乙酸pH8.0，1.4mol/L NaCl，40mmol/L 2-巯基乙醇，2％CTAB)混匀。

(2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。

(3)5,000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。

(4)12,000g离心10min，弃上清留沉淀，用70％乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。

(5)将沉淀溶于200μL TE中，加入RNase A(10mg/mL)，37℃保温30min，加入等 体积的酚/氯仿，混匀。

(6)12,000g离心10min，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min。

(7)12,000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于20μL灭菌ddH₂O中。

2.2真核表达载体的改造

根据GeneBank中的序列X95261设计PCR特异引物，以本实施例2.1提取的番茄幼果的 DNA为模板进行PCR扩增。果实特异性启动子的PCR特异引物如下：

TFM7-F：TCTAAGCTTAATTAACTTGATTTTGAGTCCATG(HindIII)

TFM7-R：GACTCTAGAGGGCAATGAACAAAGTTCCAA(XbaI)

按以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃复性30s，72℃延伸2min，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃终延伸5min。

高保真PCR产物经电泳回收后，然后进行普通Taq酶加尾。再把加尾的片段与pMD18-T 克隆载体连接，然后转化大肠杆菌(DH5α)，挑取单克隆，提阳性克隆质粒后，送测序公司 测序，得到SEQ ID NO：3所述核苷酸序列，命名为果实特异性启动子TFM7。

用限制酶HindIII和XbaI酶切果实特异性启动子TFM7，用相同限制酶酶切pBI121真核 表达载体，然后将酶切后的TFM7和pBI121载体进行连接(连接位点：HindIII和XbaI)，从 而得到改造后的真核表达载体——pBITFM7。

2.3真核重组质粒的构建

2.3.1基因片段的获得

根据SEQ ID NO：1所示核苷酸序列115bp至524bp的基因片段设计构建真核重组质粒 的引物如下：

SlCMTL-F1:5'CTCGAGTCTAGAGTTGAAAGACCAGATCCAGTAG 3'

SlCMTL-R1:5'AAGCTTTTAACTTTCTCAGCCCTCTTA 3'

SlCMTL-F2:5'GAGCTCGTTGAAAGACCAGATCCAGTAG 3'

SlCMTL-R2:5'GAATTCTTAACTTTCTCAGCCCTCTTA 3'

以SlCMTL-F1和SlCMTL-R1为正向基因片段的扩增引物，以SlCMTL-F2和SlCMTL-R2为反向基因片段的扩增引物，按下面的PCR反应体系以及以下程序进行扩增：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火温度55℃30s延伸72℃40s。

2.3.2琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小

反应结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，通过与DNA marker的比对来判断 PCR产物的大小

2.3.3PCR产物胶回收纯化

DNA片段的回收纯化参照OMEGA公司的凝胶回收试剂盒提取说明书，具体步骤如下：

1)用琼脂糖凝胶电泳目的片段，在长波紫外灯下切取目的片段放入预先称重的1.5mL 的EP管中，称量胶的重量。按重量比1:3的比例加入溶胶/结合液XP2。

2)65℃水浴10min，胶完全融化即可，其间可震荡助融2-3次，待融化之后置室温加入150μL异丙醇，充分混匀。

3)将上一步所得溶液加入吸附柱HiBind DNA柱中，12,000rpm离心1min，弃废液。

4)加入700μL漂洗液SPW，12,000rpm离心1min，弃废液。

5)加入500μL漂洗液SPW，12,000rpm离心1min，弃废液。

6)12,000rpm离心3min，弃废液。

7)向离心柱中间白膜中滴入50μL EB(65℃预热)室温放置2min。

8)12,000rpm离心2min，产物置于-20℃条件下保存。

2.3.4目的基因片段与克隆载体pMD18-T的连接

目的DNA片段与克隆载体pMD18-T按摩尔分子数比3/1连接，反应体系如下：

16℃连接12小时。

2.3.5连接产物的转化(操作步骤见实施例1的4.6)

2.3.6菌落PCR鉴定重组质粒(操作步骤见实施例1的4.8)

对菌落PCR确定的重组质粒进行测序，对测序结果与基因片段进行比对，确定所扩增片 段为目的基因片段。

2.3.7正向基因片段与PSK中间载体的连接

将测序正确的正向基因片段和PSK中间载体，分别以Xho I、Hind III进行双酶切，反应 体系如下：

37℃反应3小时后，跑凝胶电泳回收正向基因片段和PSK载体，具体步骤见本实施例中 的2.3.3。

正向基因片段与PSK中间载体的连接反应体系(20μl)：

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化

1)将连接产物加入至50μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。

2)42℃加热30s后，再在冰中放置1min。

3)加入800μl LB培养基，37℃振荡培养60min。

4)在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上倒置培养。

5)挑选白色单菌落，利用PCR法筛选阳性克隆。

2.3.8反向基因片段与已连有正向基因片段的PSK中间载体的连接

将测序正确的反向基因片段和已连接正向基因片段的PSK载体，分别以Sac I、EcoR I进 行双酶切，反应体系如下：

37℃反应3小时后，跑凝胶电泳回收反向基因片段和PSK载体，具体步骤见实例2的2.3.3。

反向基因片段与已连接正向基因片段的PSK载体的连接反应体系(20μl)：

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化

1)将连接产物加入至50μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。

2)42℃加热30s后，再在冰中放置1min。

3)加入800μl LB培养基，37℃振荡培养60min。

4)在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上倒置培养。

5)挑选白色单菌落，利用PCR法筛选阳性克隆。

2.3.9真核重组质粒的获得

将含有正向基因片段和反向基因片段的PSK中间载体用Xba I和Sac I酶切，同时将改造后 的pBITFM7真核载体用Xba I和Sac I酶切，切除载体中GUS基因，回收切除GUS基因的 大片段载体部分。酶切反应的反应体系如下：

37℃反应3小时后，跑凝胶电泳回收含有正向和反向基因片段的部段以及改造后的 pBITFM7真核载体，回收的具体步骤见实例2的2.3.3。

正向和反向基因片段的部段与pBITFM7载体的连接反应体系(20μl)：

混匀，16℃温育12小时。

连接产物的转化

1)将连接产物加入至50μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30min。

2)42℃加热30s后，再在冰中放置1min。

3)加入800μl LB培养基，37℃振荡培养60min。

4)在含有硫酸卡那霉素的LB琼脂平板培养基上倒置培养。

5)挑选白色单菌落，利用PCR法筛选阳性克隆。

通过以上操作，获得真核重组质粒，命名为pBITFM7::SlCMTLRNAi(如图2所示)。

2.2农杆菌感受态细胞的制备

1)挑取农杆菌单菌落于2m1的YEB液体培养基(含Rif 50μg/ml)中，28℃振荡培养过 夜；

2)取过夜培养液500μl转接于50m1 YEB(含Rif 50μg/ml)液体培养基中，28℃振荡培养 至OD₆₀₀＝0.5；

3)4℃5000rpm离心5min收集菌体，加l0 ml 0.15M的NaCl溶液悬浮菌体，冰浴10min；

4)4℃5000rpm离心5min收集菌体，用l ml预冷的20mM CaCl₂溶液悬浮菌体，冰浴10min；

5)制备好的细胞立即使用，或分装成200μ1/管，液氮中速冻l min，置-70℃保存备用。

2.3农杆菌的转化

1)取200μ1感受态细胞，冰上解冻；

2)加lμg构建好的pBITFM7::SlCMTLRNAi真核重组质粒，轻弹混匀，冰浴30min；

3)液氮中速冻l min，37℃水浴5min，然后加入1m1 YEB培养基，28℃慢速振荡培养4h；

4)将培养物涂布于含50μg/ml硫酸卡拉霉素和50μg/ml利福平的YEB平板上，28℃培养约48h。

2.4农杆菌阳性克隆的鉴定

挑取平板上长出的单菌落，接种于含50μg/ml Kan和50μg/ml Rif的YEB液体培养基 中，28℃振荡培养过夜，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

2.5农杆菌介导法转化番茄

将构建好的真核重组质粒pBITFM7::SlCMTLRNAi转入农杆菌中备用。

用10％次氯酸钠浸泡番茄种子10min，再用无菌水清洗4～5次，用无菌滤纸吸干种子 表面水分后于1/2MS培养基上培养，25℃，暗培养4d左右，露白后转置于光照下，光照1500 lx，16h/d，在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2d。转化法采用叶盘法。 将带有目的基因的农杆菌28℃过夜培养，5000r/min，5min，室温下离心，去除上清液，用 诱导培养基将农杆菌稀释至OD＝0.1，将预培养2d的子叶浸入其中10～15min，倒掉菌液将 子叶置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后转到共培养基上培养3d。然后转入再生培养基上继代 筛选培养，每3周换一次培养基，待不定芽长到3cm左右时，切下转移至生根培养基上生根。 等根发育好后，移出，温室盆栽。在转基因植株在生根培养基上生根的同时，培育一些野生 型番茄植株，作为转基因番茄植株的对照。

2.6转基因植株的鉴定

2.6.1转基因番茄的基因组DNA的提取

(1)取100mg新鲜的转基因番茄叶片，在添加液氮状况下研成细粉，分装于1.5mLeppendorf管中，每管加入500μL 65℃预热的2×CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，1.4mol/L NaCl，40mmol/L 2-巯基乙醇，2％CTAB)混匀。

(2)65℃水浴保温60min，冷却至室温，加入等体积的氯仿。

(3)5000g离心10min，取上清液，加入等体积的异丙醇，室温放置15min，沉淀DNA。

(4)12000g离心10min，弃上清留沉淀，用70％乙醇至少洗两遍，吹干沉淀。

(5)将沉淀溶于200μL TE中，加入RNase A(10mg/mL)，37℃保温30min，加入等 体积的酚/氯仿，混匀。

(6)12000g离心10min，取上清，加入1/10体积3mol/L NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，室温放置10min。

(7)12000g离心10min，弃上清，用70％乙醇冲洗后吹干沉淀，溶于20μL灭菌双蒸水中。

2.6.2野生型番茄的基因组DNA的提取

操作步骤同2.6.1

2.6.3转基因番茄基因组DNA的PCR检测

为了确定重组质粒的T-DNA区已经整合到番茄基因组中，以野生型番茄和转基因番茄 基因组DNA为模板，对番茄卡那霉素抗性标记基因(NPTII)进行了PCR扩增。卡那霉素抗性基因特异引物为NPTII-F1和NPTII-R1。

NPTII-F1：5’-TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC-3’

NPTII-R1：5’-GTCACCGACTTGAGCCATTTG-3’

按以下程序进行扩增：94℃5min(预变性)；94℃40s(变性)，60℃40s(复 性)，72℃1min(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(终延伸)；电泳 检测PCR结果。

2.7SlCMTL基因的组织特异性分析

分别从野生型番茄植株的根、茎、叶、花、不同发育时期的果皮(授粉后7天、14天、35天、变色期、成熟期)中提取总RNA，反转录合成cDNA，以这些cDNA为模板， 以CMTLRT-F：CACACCCTCATTTGAAAGTAACAGA、CMTLRT-R： CCATAACCTCTCCAGCGAACC为引物，利用荧光实时定量PCR的方法分析不同组织 中SlCMTL基因的表达情况。

2.8叶绿素含量的测定

取田间栽培野生型和转基因番茄植株的绿色果实的果皮和植株叶片0.2～0.5g，加入液氮 后充分研磨，用1mL 80％的丙酮充分萃取，萃取液离心后用分光光度计检测，读取645nm 和663nm下的光吸收值A645和A663。按照MacKinney常数计算出叶绿素a和b的含量： chlorophyll a＝12.7(A663)-2.69(A645)和chlorophyll b＝22.9(A645)-4.48(A663)，采 用数据统计软件SPSS12进行统计学分析。

2.9番茄果实和叶片细胞质体大小和数量的显微观察

测定质体容积的大小主要是通过对固定的完整细胞进行质体数目的统计和质体大小的测 量(Pyke KA,Leech M.Rapid Image Analysis Screening Procedure forIdentifying Chloroplast Number Mutants in Mesophyll Cells of Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.Plant Physiol,1991,96: 1193-5)。首先将需要观察的叶片和果实的果皮组织切割成5mm左右的方块，取同一时期的 叶片和果实，取相同部位的组织细胞，用F.A.A固定液(福尔马林5ml，冰醋酸5ml，50％ 酒精90ml)黑暗中浸泡固定1天。镜检前，绿色的果实和叶片需要在0.1M Na₂-EDTA溶液 中60℃加热2小时，成熟果实的果皮组织可以放在4℃下处理10-30min，以此破坏细胞壁 之间的连接，使细胞更容易分离便于观察。处理完的样品即可放入载玻片中，加盖玻片后轻 轻敲打，细胞分散后，即可显微镜LeicaDMI6000B microscope进行观察。每个细胞和其中 质粒的表面积通过与图像分析软件image pro plus 6.0分析得到。每个细胞质体的总面积＝质 体的平均表面积×每个细胞中质体的数目。质体的空间大小用一个比值(细胞指数)来表示： 每个细胞质体的总面积/细胞平均表面积。

2.10番茄果实番茄红素的提取和测定

参照文献分析类胡萝卜素含量的方法，进行了部分修改(Ronen G,Carmel-GorenL,Zamir D,Hirschberg J.An alternative pathway to beta-carotene formation inplant chromoplasts discovered by map-based cloning of Beta and old-gold colormutations in tomato.Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97:1102-7)。取成熟的番茄果实0.5g，液氮充分研磨，加2mL丙酮室温下萃取10min。 再加入2ml的二氯甲烷震荡静止10min，短瞬离心后，吸取带有颜色的上清低温保存。注意 整个过程中，样品要避光，防止色素成分的分解。

萃取的样品使用Akasil-C18色谱柱(250mm*4.6mm,5um)进行HPLC分析。每个萃 取的样品吸取20μl上柱，流动相的组成是乙睛:甲醇:二氯甲烷(7:7:2)，流速1ml/min。使用二极管检测器(PDA-100)在472nm波长处检测光的吸收峰，记录所有的峰图。同时，用番 茄红素和β-胡萝卜素的标准样品进行HPLC分析，作为阳性对照，将其特征光谱与保留时间 与待测样品进行比较，变色龙工作站软件(Chromeleon Version 6.50workstation)分析算出样品 中番茄红素和β-胡萝卜素的含量。

3、结果

3.1转基因植株的鉴定

通过对转基因番茄基因组DNA进行PCR分析可知，转基因番茄植株的DNA经PCR扩增得到与预期大小一致的857bp的条带，而非转基因番茄则无目标条带出现，如图3所示。说明真核重组质粒已经整合到番茄植株的基因组DNA中。

3.2SlCMTL基因的表达模式

为了研究番茄DNA甲基转移酶SlCMTL基因表达的组织特异性，我们采用了荧光实时 定量PCR的方法对野生型番茄植株的根、茎、叶、花、不同发育时期的果皮(授粉后7天、14天、35天、变色期、成熟期)中SlCMTL基因的表达情况作了分析，结果如图4所示。在 检测的所有组织中，SlCMTL基因均有表达，只是在红果中SlCMTL基因的表达水平较低。 说明DNA甲基转移酶SlCMTL基因在番茄中是普遍表达。

3.2转pBITFM7::SlCMTLRNAi番茄的结果及分析

3.2.1转基因植株的鉴定

提取野生型和3株以上独立的转基因番茄的绿色果实中的RNA，以此为模板进行半定量 RT-PCR分析。结果如图5所示，转基因植株果实中SlCMTL基因的表达水平均显著下降。说明转入pBITFM7::SlCMTLRi植物表达载体后，番茄果实中SlCMTL基因受到了一定程度的抑制效果。

3.2.2转基因番茄植株的果实色素加深

我们对T1及T2代的转基因植株进一步进行表型分析，结果表明，转基因番茄植株的果 实绿肩颜色比野生型番茄植株果实更绿(见图6)。由于番茄红素主要在果实的质体和叶绿体 中合成，故果实成熟后，且转基因番茄植株红果也比野生型番茄果实更红，番茄红素含量明 显增加(图6)。

3.2.3SlCMTL基因的下调引起叶绿素含量的增加

因为pBITFM7::SlCMTLRi转基因植株的成熟绿果颜色深于野生型，我们对转基因植株以 及野生型成熟绿果进行叶绿素含量的测定。结果如图7所示，在转基因植株中成熟绿果的叶 绿素含量显著高于野生型，其中转基因b植株的成熟绿果的叶绿素含量是野生型的2.5倍。 叶绿素的增加可能来源于质体或者叶绿体数目的增加，故利用微分干涉差显微镜分析转基因 植株以及野生型的成熟绿果质体数目和体积的变化。相对于对照野生型，我们可以明显地观 察出转基因植株的质体数目明显多于野生型(图8a)，经过软件统计其面积，结果也表明转 基因番茄的绿果中的质体体积大于野生型(图8b)。

3.2.4果实类胡萝卜素含量的HPLC分析

按照实例2中2.9介绍的方法，首先对番茄红素和β-胡萝卜素标准样品进行了HPLC分 析。两种标品混合后经HPLC检测到两条特异的峰。我们再将标品稀释6个浓度梯度，进行HPLC分析，建立了样品浓度与峰面积的标准曲线，如图9所示。番茄红素的相关系数是0.9898， β-胡萝卜素相关系数是0.9989。以此线性关系，对三株转基因植株和野生型的番茄果实的类 胡萝卜素含量进行了定量分析，结果如图10所示，转基因植株的果实番茄红素含量比野生型 的高出1～3倍，β-胡萝卜素的含量比野生型的高出1倍。测定结果表明，在转pBITFM7::SlCMTLRNAi基因的番茄果实中，番茄红素的含量明显增加，因而说明本发明所述真核重组质粒可在提高番茄果实色素积累中应用。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种真核重组质粒及其在提高番茄果实色素积累中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2891

<212> DNA

<213> 番茄(tomato)

<400> 1

gctgcgacct actacttcat cttttcagat atcccaatgc caagcaaacg gaaatcttct 60

ccggctacaa agccagagtc ttcatccggc agcaggaagt cgaagagact tgtagttgaa 120

agaccagatc cagtagtagc tcaaccatct gattccgatt ttgaaccgga acctgtttta 180

tcatcaaaga agaaatccac gagacgaaca acagctgaaa gttcagtggt agcttgtcaa 240

tcggaaagca ataacaagaa gttgaagaag ccaactgttg aaaaggcaga atctggtgta 300

gcttcaccag ctgatagaga tttcgtatct gagtctgatt cggagacgcc gagcaagaaa 360

tccacgaggc gagctgcagt aaaggtggaa cctttggtgg attctgtagc tgggagtgat 420

tttgtggaag aggaagaagt agatggaatg gagctaggga gtctgaagaa gagcttgtcg 480

atttcacctt ccaaaaggaa gcctaagagg gctgagaaag ttaaagatga agagtgtgta 540

cttgccggtg accctgttcc ggatgcagaa gctagactga agtggcctca tcgctataat 600

aaagggaaag aaaatggtac caagagctta aatggtcaag atgatccgga ccagttaatt 660

caagctaagt gccattttag tcgagcagat gttgatggtc agatatatta tctcgaggat 720

gatgcacatg tgaaggctgc tgatggtgag gacgattaca tttgcaagat tgttgaattc 780

tttgaagcag ttgacggagt gcagtatttt acagctcagt ggttttacag agctaaggat 840

actgttatta aaagccatga tcagttcatt gacaaaaaac gtgtattcct ttctgaaatc 900

aaggatgaca atcctcttga ttgccttgtg accaaactaa agattgttcc tgtgccctca 960

aatgcaactt cacagttcaa ggaaaatgta aaatcaaatt gtgatttcta ctatgacatg 1020

aagtacttgc ttccatactc ttccttcatt agcttgcctc ctgatactac aagtccagtt 1080

agttcatctt ctactatatc aagtgacatt gatgctggtg aggtcaaaga acacaatctg 1140

gaaaagaagc tcttggatct atattcagga tgtggagcaa tgtccacagg gttatgcttg 1200

ggtgccaata gcaaaggcgt taaacttgtt actaaatggg ctgttgacct taacaaacat 1260

gcatgtgaca gtttgagatt gaaccaccct gagactcagg tgaggaatga gtatgccagt 1320

gatttcctat cacttctgaa ggagtgggta cagctctgtg tctcttgttc cttgataaaa 1380

ggcagtgttc ctccacaccc tcatttgaaa gtaacagatg aagttgatga agatgaagaa 1440

aatgatgatg aaggtgaaga ttctggtgat gataaagaag gtgaaatttt tgaggtcgaa 1500

gaactcctag aagtttgtta tggagatcca aaagagaata acaaacctgg actttacttc 1560

aaggttcgct ggagaggtta tggtccagag gaagacacct gggagccaat agatggctta 1620

agtgactgcc cgaagaaaat cagtgagttt gtggtgaaag gcttcaaagc aaatcttttg 1680

ccgttgcctg gtgatgttga tgttgtatgc ggtggaccac cttgccaagg aatcagtggg 1740

ttcaatcgtt ttaggaataa agaaaatccg atgcaggatc ccaaaaataa acaacttgat 1800

gtctacatgg acattgtgga tttcttgaaa cccaggtttg tattaatgga gaatgtggtg 1860

gaccttgtca aattctccaa tggtttcctt gggcgatatg cattgagcag acttgtaggg 1920

atgaactacc aagcacggat gggaatgatg gcagctggtg cgtatggtct tccacaattt 1980

cgtatgcgtg ttttcatgtt tggagctctt tcatcagaga agttgccaca atatccattg 2040

cccacacata aagttattgt gaggggtgtt attcccgtag aatttgagtc aaacacagtt 2100

gcgtatgatt cagtcaggga tctcgagtta aagaaagaac tctttcttgg tgatgcactt 2160

tctgatctcc ctttggtgga gaacaatgag ccaagagatg aaatgcctta cactgatgag 2220

cctaaatctg atttccagca ttttataaga atggggaggg atgggttgtt gggaagcgta 2280

ctatatgatc atcgtcctct tcagttgaac gaagatgatc atcagcgtgt atgtcaaatt 2340

ccaaagcgga agggtgcaaa cttcagggac ttgcccggag ttcgtgttcg gccagataat 2400

aaagttgaat gggacccaga cgtggagaga gtaaagctac cttctgggaa gcctttggtc 2460

cctgactatg cgatgagctt cgttggtggt agttcctcaa aaccatttgg tcgtttgtgg 2520

tgggatgaaa ctgtcccaac agttgtgacg agagctgaac cccataatca gaccatagta 2580

catccactac aagatagagt gctcacaatt cgtgaaaatg caaggctcca aggttttcct 2640

gactactaca agttgatagg tccaataaaa gaaaggtaca tgcaagtagg taatgcagtt 2700

gcagttccag ttgcccgagc attgggctat tctttggcca tgtcaataaa gggattatct 2760

ggagaaacac cattgttcac cttgccaaaa aatttccctt ctcatgagga tcagaattgt 2820

aatgaagtgt cacaataatt taaacattaa ctaattgaga ttaccaaact atctttcacc 2880

ctctgtatgg g 2891

<210> 2

<211> 933

<212> PRT

<213> 番茄(tomato)

<400> 2

Met Pro Ser Lys Arg Lys Ser Ser Pro Ala Thr Lys Pro Glu Ser Ser

1 5 10 15

Ser Gly Ser Arg Lys Ser Lys Arg Leu Val Val Glu Arg Pro Asp Pro

20 25 30

Val Val Ala Gln Pro Ser Asp Ser Asp Phe Glu Pro Glu Pro Val Leu

35 40 45

Ser Ser Lys Lys Lys Ser Thr Arg Arg Thr Thr Ala Glu Ser Ser Val

50 55 60

Val Ala Cys Gln Ser Glu Ser Asn Asn Lys Lys Leu Lys Lys Pro Thr

65 70 75 80

Val Glu Lys Ala Glu Ser Gly Val Ala Ser Pro Ala Asp Arg Asp Phe

85 90 95

Val Ser Glu Ser Asp Ser Glu Thr Pro Ser Lys Lys Ser Thr Arg Arg

100 105 110

Ala Ala Val Lys Val Glu Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Gly Ser Asp

115 120 125

Phe Val Glu Glu Glu Glu Val Asp Gly Met Glu Leu Gly Ser Leu Lys

130 135 140

Lys Ser Leu Ser Ile Ser Pro Ser Lys Arg Lys Pro Lys Arg Ala Glu

145 150 155 160

Lys Val Lys Asp Glu Glu Cys Val Leu Ala Gly Asp Pro Val Pro Asp

165 170 175

Ala Glu Ala Arg Leu Lys Trp Pro His Arg Tyr Asn Lys Gly Lys Glu

180 185 190

Asn Gly Thr Lys Ser Leu Asn Gly Gln Asp Asp Pro Asp Gln Leu Ile

195 200 205

Gln Ala Lys Cys His Phe Ser Arg Ala Asp Val Asp Gly Gln Ile Tyr

210 215 220

Tyr Leu Glu Asp Asp Ala His Val Lys Ala Ala Asp Gly Glu Asp Asp

225 230 235 240

Tyr Ile Cys Lys Ile Val Glu Phe Phe Glu Ala Val Asp Gly Val Gln

245 250 255

Tyr Phe Thr Ala Gln Trp Phe Tyr Arg Ala Lys Asp Thr Val Ile Lys

260 265 270

Ser His Asp Gln Phe Ile Asp Lys Lys Arg Val Phe Leu Ser Glu Ile

275 280 285

Lys Asp Asp Asn Pro Leu Asp Cys Leu Val Thr Lys Leu Lys Ile Val

290 295 300

Pro Val Pro Ser Asn Ala Thr Ser Gln Phe Lys Glu Asn Val Lys Ser

305 310 315 320

Asn Cys Asp Phe Tyr Tyr Asp Met Lys Tyr Leu Leu Pro Tyr Ser Ser

325 330 335

Phe Ile Ser Leu Pro Pro Asp Thr Thr Ser Pro Val Ser Ser Ser Ser

340 345 350

Thr Ile Ser Ser Asp Ile Asp Ala Gly Glu Val Lys Glu His Asn Leu

355 360 365

Glu Lys Lys Leu Leu Asp Leu Tyr Ser Gly Cys Gly Ala Met Ser Thr

370 375 380

Gly Leu Cys Leu Gly Ala Asn Ser Lys Gly Val Lys Leu Val Thr Lys

385 390 395 400

Trp Ala Val Asp Leu Asn Lys His Ala Cys Asp Ser Leu Arg Leu Asn

405 410 415

His Pro Glu Thr Gln Val Arg Asn Glu Tyr Ala Ser Asp Phe Leu Ser

420 425 430

Leu Leu Lys Glu Trp Val Gln Leu Cys Val Ser Cys Ser Leu Ile Lys

435 440 445

Gly Ser Val Pro Pro His Pro His Leu Lys Val Thr Asp Glu Val Asp

450 455 460

Glu Asp Glu Glu Asn Asp Asp Glu Gly Glu Asp Ser Gly Asp Asp Lys

465 470 475 480

Glu Gly Glu Ile Phe Glu Val Glu Glu Leu Leu Glu Val Cys Tyr Gly

485 490 495

Asp Pro Lys Glu Asn Asn Lys Pro Gly Leu Tyr Phe Lys Val Arg Trp

500 505 510

Arg Gly Tyr Gly Pro Glu Glu Asp Thr Trp Glu Pro Ile Asp Gly Leu

515 520 525

Ser Asp Cys Pro Lys Lys Ile Ser Glu Phe Val Val Lys Gly Phe Lys

530 535 540

Ala Asn Leu Leu Pro Leu Pro Gly Asp Val Asp Val Val Cys Gly Gly

545 550 555 560

Pro Pro Cys Gln Gly Ile Ser Gly Phe Asn Arg Phe Arg Asn Lys Glu

565 570 575

Asn Pro Met Gln Asp Pro Lys Asn Lys Gln Leu Asp Val Tyr Met Asp

580 585 590

Ile Val Asp Phe Leu Lys Pro Arg Phe Val Leu Met Glu Asn Val Val

595 600 605

Asp Leu Val Lys Phe Ser Asn Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Ala Leu Ser

610 615 620

Arg Leu Val Gly Met Asn Tyr Gln Ala Arg Met Gly Met Met Ala Ala

625 630 635 640

Gly Ala Tyr Gly Leu Pro Gln Phe Arg Met Arg Val Phe Met Phe Gly

645 650 655

Ala Leu Ser Ser Glu Lys Leu Pro Gln Tyr Pro Leu Pro Thr His Lys

660 665 670

Val Ile Val Arg Gly Val Ile Pro Val Glu Phe Glu Ser Asn Thr Val

675 680 685

Ala Tyr Asp Ser Val Arg Asp Leu Glu Leu Lys Lys Glu Leu Phe Leu

690 695 700

Gly Asp Ala Leu Ser Asp Leu Pro Leu Val Glu Asn Asn Glu Pro Arg

705 710 715 720

Asp Glu Met Pro Tyr Thr Asp Glu Pro Lys Ser Asp Phe Gln His Phe

725 730 735

Ile Arg Met Gly Arg Asp Gly Leu Leu Gly Ser Val Leu Tyr Asp His

740 745 750

Arg Pro Leu Gln Leu Asn Glu Asp Asp His Gln Arg Val Cys Gln Ile

755 760 765

Pro Lys Arg Lys Gly Ala Asn Phe Arg Asp Leu Pro Gly Val Arg Val

770 775 780

Arg Pro Asp Asn Lys Val Glu Trp Asp Pro Asp Val Glu Arg Val Lys

785 790 795 800

Leu Pro Ser Gly Lys Pro Leu Val Pro Asp Tyr Ala Met Ser Phe Val

805 810 815

Gly Gly Ser Ser Ser Lys Pro Phe Gly Arg Leu Trp Trp Asp Glu Thr

820 825 830

Val Pro Thr Val Val Thr Arg Ala Glu Pro His Asn Gln Thr Ile Val

835 840 845

His Pro Leu Gln Asp Arg Val Leu Thr Ile Arg Glu Asn Ala Arg Leu

850 855 860

Gln Gly Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Leu Ile Gly Pro Ile Lys Glu Arg

865 870 875 880

Tyr Met Gln Val Gly Asn Ala Val Ala Val Pro Val Ala Arg Ala Leu

885 890 895

Gly Tyr Ser Leu Ala Met Ser Ile Lys Gly Leu Ser Gly Glu Thr Pro

900 905 910

Leu Phe Thr Leu Pro Lys Asn Phe Pro Ser His Glu Asp Gln Asn Cys

915 920 925

Asn Glu Val Ser Gln

930

<210> 3

<211> 2535

<212> DNA

<213> 番茄(tomato)

<400> 3

aattaacttg attttgagtc catgtattta gagatacatg tatctggaca tatcaaagtc 60

tgataaaatt cataatatta aaacatagag tgtctttaag taattagctc atacactaga 120

atgatttttg taagttacac ttaaataaat tgttttggcc catgagccaa ctgaccccaa 180

tcaagcctca agggcttata tgaatcgagt ttataagccc tagtttcaaa tgagcttgaa 240

aaattctatc tcaactatat ccaaataata gattggattg gatcgaatcc catgggctac 300

gcattttgat agctctagtt gtaaccctaa ctaatgatga aaatattttt gacatgatat 360

ttattttatt accacaatta ttttaatatt tattttatac ataatatatt tcttataaaa 420

ttactacaca taattgtctg atgactgtag aagagtagtt gacaaaatat tatcgcaatg 480

tcattgttat tataggtaca aattattaag tgaaagtaga atataacgtg aaatcgaatt 540

aaaaaaataa tcagattgta atgaaatatt attagagaga agtattaaag tacctataaa 600

cttggcacaa attattagtt ttatttctgt actattgaca accttaaaaa ctacttgact 660

aactaaactt agatacacct aattttttgt aggagcatga aactcttaat gaatggccaa 720

gagaagtgtt gaaagcaccc ccaaacttga tgagaattta gagtgtattt cacccatatt 780

gcaagattgt aagtgtattt aaatttagtt aatcaattaa ataaatgtat tttgaattcc 840

aataattcaa ggatgaaaca aatagttcat attgaattta aatgtttttt gaatacttct 900

ttttttctca atattgacta actagtacaa ccaggtttga ttatgattta gatttgtacc 960

acataagatt attaaagaga aaaacattct ttgatgattc atcttttaaa ttctcaaagc 1020

tcgaatacgt aaaatctaat taatatcagc ataatctcat tcagaggcgg agctagcctt 1080

gtgttagggg gtattcaaac cttctttgac tgaaaatttt attatttata catgtttaaa 1140

attacttttt aatgtatata taatagatat caaattcttt aatttgtatt taattctata 1200

aatattaaat tactttatta aaaattctaa ttctgtcact cgttcatttc atcacattct 1260

tgacggtgat ggtagtgata attacattga ttggagccac atgggccgct actttttaaa 1320

aaggatgaaa ccttggaatg tagtgaatgt tgagtctcaa tagctcaatc acggactcaa 1380

cagcaaaggt aagtgccaaa aatctgtcct ctttttccct tctccaattg gagatactgt 1440

caccttggac aaataatatt tgaaaatttt ggcctaaaag ttaggtttgg agccgtatgg 1500

taatttgata acacaaatta ttatataatt gatatatcaa gtatatatat ccaaagttgt 1560

cgcattcttc gtttcaattt gtttctctca ctaaaatttt caattcactt tttaaaaaat 1620

cgataaattt ttaatataac tttacataac atattcaaaa ttacaaaaat aaaggatatt 1680

tttatatgtt tatttttaat gtaagattaa atatttagaa ttctttttaa gaacggtaca 1740

agcaaattaa aagagagaag gtatattagt gggcctatgt atctttgtat acatatgcct 1800

ctcaaagagc tacctgatga gtctatatat ctttgttgat agtgatttaa caatttatgt 1860

atgtacgtac taagacatgt taaataagta cctagagaaa gatttttgga aaagtgaaaa 1920

cagcaataaa gaaaagtcat ttaaacactt tccaacaaac atttggtaat cgattttaat 1980

tacccactta aacaaaacta tttgtacgta aaatgtttaa gtagaaaaga gatttttttt 2040

taaaaaaaaa agaaggcaag aggtcatata tctgaccctt ccttaaatcc ccgcgtataa 2100

cactttcttt ttttttgtgt gtgtatgttc aggaacattt atattttcta tttgaaattt 2160

ctcattaagt caaattcgaa atcttttaaa taatgtagaa aaatctcatt atatttaaca 2220

atcccacttg atgaattcct aaacattttc tataaaataa cactaaatct ttaattatac 2280

atattacata cctaactcaa gcatcttgtc ggtaaaaatc attagaaaag aattggaaat 2340

agggaaattc atagacatat tttggttagt atctttgtct ataagaatgg gtgtgttaaa 2400

gagctagtgc catagtgtac cattctattg gtagcatttg gcaagagtta ttccctctct 2460

ccataccaat ggagaagttt aatcttgcta gagtcttatt gttgcttctt caacttggaa 2520

ctttgttcat tgccc 2535

Claims (5)

1.一种果实特异性表达的启动子，其特征在于，所述驱动果实特异性表达的启动子的DNA为SEQ ID NO：3。

2.一种利用权利要求1所述果实特异性启动子构建的真核表达载体pBITFM7，其特征在于，所述真核表达载体的构建方法包括:

(1)从番茄幼果中提取总DNA，利用PCR技术从番茄中分离得到一个果实特异性启动子TFM7，所述启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述；

(2)将步骤(1)获得的果实特异性启动子TFM7替换原始真核表达载体(如现有真核表达载体pBI121)中的35S启动子，得到改造后的真核表达载体pBITFM7。

3.一种真核重组质粒，其特征在于由序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的基因片段和权利要求2中的真核表达载体构成，所述基因片段是SEQ ID NO：1中115bp至524bp的核苷酸序列，所述真核表达载体为权利要求2的改造后真核表达载体pBITFM7，所述基因片段正向和反向插入真核表达载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子。

4.一种真核重组质粒的制备方法，其特征在于步骤如下：

(1)在序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中选择一段基因片段，所选择的基因片段是SEQ ID NO：1中115bp至524bp的核苷酸序列，将所述基因片段正向插入到质粒pSK载体上形成中间载体，再将该基因片段反向插入已含正向插入基因片段的pSK中间载体，正向插入的基因片段与反向插入的基因片段之间存在有150bp的内含子；

(2)利用限制性内切酶切下pSK中间载体上含有正向插入与反向插入的基因片段的部分，然后连接到权利要求2获得的真核表达载体pBITFM7上，即获真核重组质粒。

5.权利要求3所述真核重组质粒在提高番茄果实色素积累中的应用。

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