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CN113167714A - 用于颗粒分析的系统和方法 - Google Patents

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CN113167714A
CN113167714A CN201980067757.3A CN201980067757A CN113167714A CN 113167714 A CN113167714 A CN 113167714A CN 201980067757 A CN201980067757 A CN 201980067757A CN 113167714 A CN113167714 A CN 113167714A
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CN
China
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cell
cells
images
sorting
channel
Prior art date
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Application number
CN201980067757.3A
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马赫多赫特·马赛利
马赫亚尔·萨拉克
周厚朴
索罗什·卡赫凯沙尼
普拉莎斯特·科汉德沃
赛义德·塔里克·沙法阿特
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Dipsey Co
Original Assignee
Dipsey Co
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Abstract

本公开提供了用于分拣细胞的系统和方法。所述系统可以包括流动通道，流动通道被配置为通过通道运输细胞。所述系统可以包括成像装置，成像装置被配置为当通过流动通道运输细胞时，从多个不同角度捕获细胞的图像。所述系统可以包括处理器，处理器被配置为使用深度学习算法分析图像以实现细胞的分拣。

Description

用于颗粒分析的系统和方法
交叉引用
本申请要求于2018年8月15日提交的美国临时专利申请号62/764,965和2018年11月16日提交的美国专利申请号16/194,269的权益，其均通过引用整体并入本文。
背景技术
细胞的物理和形态特性可用于研究细胞类型和细胞状态以及诊断疾病。细胞形状是细胞周期的标志之一。真核细胞显示出依赖于细胞周期的形状的物理变化，诸如经历出芽或裂变的酵母细胞。形状也是细胞状态的指示物，并且可以成为用于临床诊断的指示。由于许多临床病况、疾病和药物，血细胞的形状可能会发生变化，例如由寄生虫感染引起的红细胞形态的变化。诸如细胞膜特征、核-细胞质比、核膜形态和染色质结构的其他参数也可用于识别细胞类型和疾病状态。例如，在血液中，不同的细胞类型通过诸如细胞大小、细胞形状和核形状等因素来区分。
生物学家和细胞病理学家使用细胞大小和形态来识别细胞类型并诊断疾病。这主要是通过某种显微成像和图像的手动分析来完成。结果，现有方法耗时、主观、定性并且易于出错。例如，细胞病理学家使用光学显微镜检查从不同组织制备的载玻片，并寻找类似于疾病特性的特征。该过程耗时且结果是主观的，并且可能受到诸如染色细胞的取向、载玻片的制备方式以及细胞病理学家的专业知识等因素的影响。尽管最近已经进行了细胞学涂片分析自动化的努力，但仍然存在挑战。涂片分析的主要问题之一是存在难以避免的污染物细胞，并使得难以检测稀有细胞或疾病的特定特征特性。其他问题是染色或涂片细胞的角度，角度可能会模糊用于识别细胞类型或状态的重要信息。因此，仍然需要用于细胞分析的改进方法和/或系统。
发明内容
在一方面，本公开提供了一种分拣(sort)细胞的方法，包括：(a)通过流动通道运输细胞；(b)当通过所述流动通道运输所述细胞时，从多个不同角度捕获所述细胞的多个图像；以及(c)使用深度学习算法对所述多个图像进行分析以分拣对所述细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括当通过所述流动通道运输所述细胞时，旋转所述细胞。在一些实施方案中，所述方法在所述细胞上施加速度梯度以旋转所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞以第一速度在第一缓冲液中流动，并且其中所述在所述细胞上施加所述速度梯度包括使第二缓冲液以第二速度共流。在一些实施方案中，所述细胞进行所述旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴不同。在一些实施方案中，所述细胞进行所述旋转的所述轴与所述细胞沿所述流动通道进行所述迁移的所述附加轴垂直。
在一些实施方案中，所述方法还包括当通过所述流动通道运输所述细胞时，将所述细胞在所述流动通道内的一定高度处聚焦成流线。在一些实施方案中，所述聚焦包括使所述细胞经受惯性升力，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数(Reynolds number)大于1。在一些实施方案中，所述惯性升力的特征在于雷诺数至少20。
在一些实施方案中，以约10帧/秒至约500,000帧/秒的速率捕获所述多个图像。
在一些实施方案中，所述多个角度围绕所述细胞或在所述细胞的一部分上延伸。
在一些实施方案中，从(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧或(6)所述细胞的右侧捕获所述细胞的所述多个图像。在一些实施方案中，从选自由以下组成的组的至少两侧捕获所述细胞的所述多个图像：(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧和(6)所述细胞的右侧。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过将所述细胞引导至所述流体通道下游的多个通道中的选定通道，基于所分析的多个图像来分拣所述细胞。在一些实施方案中，在将所述细胞引导至所述选定通道之前，关闭除所述选定通道之外的所述多个通道。在一些实施方案中，使用压力、电场、磁场或其组合关闭除所述选定通道之外的所述多个通道。在一些实施方案中，所述方法还包括使用光对所述细胞的所述分拣进行验证(validate)。在一些实施方案中，所述验证包括使用所述光的阻挡或散射来确定与所述细胞相关的信息。在一些实施方案中，与所述细胞相关的所述信息包括所述细胞的大小、形状、密度、纹理或速度。在一些实施方案中，所述验证包括(i)通过将至少两束光导向所述选定通道，在所述选定通道上提供至少两个光斑，以及(ii)确定所述细胞在所述至少两个光斑之间的行进时间，其中所述至少两个光斑的间隔为约10微米至约1,000微米。在一些实施方案中，所述光是激光。在一些实施方案中，所述分拣包括(i)将第一细胞引导至所述多个通道中的第一通道，以及(ii)将第二细胞引导至所述多个通道中的第二通道，其中所述第一细胞和所述第二细胞具有或疑似具有一个或多个不同特征。
在一些实施方案中，所述方法还包括以至少10个细胞/秒的速率分拣多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括使用分类器来分拣包含所述细胞的多个细胞；以及将来自所述分拣的数据反馈至所述分类器，以训练所述分类器以用于将来的分拣。在一些实施方案中，所述分类器包括神经网络。在一些实施方案中，所述分类器被配置为基于与所述多个细胞的多个所分析的多个图像相对应的分类概率，来执行多个细胞中的每个的分类。
在一些实施方案中，所述细胞来自受试者的生物样品，并且其中所述方法还包括基于所分析的多个图像来确定所述受试者是否存在病症或属性。在一些实施方案中，所述受试者的所述生物样品选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、粪便、唾液、精液、羊水、脑脊液、胆汁、汗液、眼泪、痰、滑液、呕吐物、骨、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾脏、肾脏、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼、脑、感染组织、患病组织、恶性组织、钙化组织和健康组织。在一些实施方案中，所述恶性组织包括肿瘤、肉瘤、血癌或其衍生物。
在一些实施方案中，所述捕获包括用闪光灯以小于1毫秒的曝光时间照射所述细胞，其中所述闪光灯包括选自由以下组成的组的波长：470纳米(nm)、530nm、625nm和850nm的波长。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)使用深度学习算法的集合(ensemble)对所述多个图像中的每个进行分析，以在所述多个不同角度的每个角度处、对所述多个不同图像中的每个图像的所述细胞进行分类；以及(ii)从所述分析中聚合所述细胞的多种分类以确定所述细胞的最终分类。
在一些实施方案中，所述细胞来自母体血清。在一些实施方案中，所述方法还包括识别有核红细胞(RBC)，其中所述有核RBC的存在指示胎儿异常状况。在一些实施方案中，所述胎儿异常情况是胎儿非整倍性(fetal aneuploidy)。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)预测所述细胞到达分拣汇接点的到达时间，以及(ii)如果所述细胞的预测到达时间(1)在步骤(c)完成之前或(2)在所述分拣汇接点处的一个或多个阀门的致动完成之前，则调节所述细胞的速度以改变所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。在一些实施方案中，所述方法还包括确定所述细胞在所述预测到达时间到达所述分拣汇接点的概率。在一些实施方案中，调节所述细胞的速度包括降低所述细胞的速度。在一些实施方案中，调节所述细胞的速度以延迟所述细胞到达所述分拣汇接点的到达时间。在一些实施方案中，所述方法还包括(iii)检测所述细胞到达所述分拣汇接点的实际到达时间，以及(iv)基于所述预测到达时间与所述实际到达时间的比较，修改一个或多个细胞分析算法和/或所述一个或多个阀门的致动信号。在一些实施方案中，实时地执行(iv)。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)提供包含所述细胞的细胞群，(ii)对所述细胞群的亚群进行第一次分析以检测靶细胞，(iii)如果所述亚群中的所述靶细胞的数量第一次预定阈值数量，则收集所述亚群，以及(iv)对所述亚群进行第一次分析。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(ii)中，捕获所述亚群中的每个细胞的一个或多个图像。在一些实施方案中，所述方法还包括从单个角度捕获每个细胞的单个图像。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少1个靶细胞。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少2个靶细胞。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少5个靶细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约10个细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约50个细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约100个细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括，在(iv)中，(1)捕获所述亚群中的每个细胞的多个图像，(2)对所述多个图像中的每个图像进行分析，(3)对所述亚群中的每个细胞进行分类，以及(4)对所述亚群中的每个细胞进行分拣。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)捕获经分拣的细胞中的至少一个细胞的一个或多个图像，以及(ii)使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。在一些实施方案中，所述方法还包括基于对所述至少一个经分拣的细胞的所述分析来修改一个或多个细胞分析算法。在一些实施方案中，所述方法还包括实时地执行所述修改。
在一方面，本公开提供了一种用于对细胞进行分拣的系统，包括：流动通道，所述流动通道被配置为通过所述流动通道运输细胞；成像装置，所述成像装置被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，从多个不同角度捕获所述细胞的多个图像；以及处理器，所述处理器被配置为使用深度学习算法对所述多个图像进行分析以分拣所述细胞。
在一些实施方案中，所述系统还被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，旋转所述细胞。在一些实施方案中，所述系统还被配置为在所述细胞上施加速度梯度以旋转所述细胞。在一些实施方案中，所述流动通道被配置为通过所述流动通道以第一速度在第一缓冲液中运输所述细胞，并且其中所述系统还被配置为通过所述流体通道使第二缓冲液以第二速度共流，从而在所述细胞上施加所述速度梯度。在一些实施方案中，所述细胞进行所述旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴不同。在一些实施方案中，所述细胞进行所述旋转的所述轴与所述细胞沿所述流动通道进行所述迁移的所述附加轴垂直。
在一些实施方案中，所述系统还被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，将所述细胞在所述流动通道内的一定高度处聚焦成流线。在一些实施方案中，所述系统被配置为使所述细胞经受惯性升力以聚焦所述细胞，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数大于1。在一些实施方案中，所述惯性升力的特征在于雷诺数至少20。
在一些实施方案中，所述流动通道的宽度或高度沿所述流动通道的轴是不均匀的。在一些实施方案中，所述流动通道的所述宽度或所述高度沿通过所述流动通道运输所述细胞的方向逐渐增加。
在一些实施方案中，所述流动通道包括壁，该壁形成为将所述细胞聚焦成流线。
在一些实施方案中，以约10帧/秒至约500,000帧/秒的速率捕获所述多个图像。
在一些实施方案中，所述多个角度围绕所述细胞或在所述细胞的一部分上延伸。
在一些实施方案中，从(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧或(6)所述细胞的右侧捕获所述细胞的所述多个图像。在一些实施方案中，从选自由以下组成的组的至少两侧捕获所述细胞的所述多个图像：(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧和(6)所述细胞的右侧。
在一些实施方案中，所述多个图像中的每个图像包括二维图像或三维图像。
在一些实施方案中，所述流动通道被配置为通过所述流动通道运输多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞，并且其中所述成像装置还被配置为当通过所述流动通道运输所述多个细胞时，捕获所述多个细胞的一个或多个图像。在一些实施方案中，所述成像装置被配置为捕获所述多个细胞的单个图像。在一些实施方案中，所述成像装置被配置为分别捕获所述多个细胞中的每个细胞的一个或多个图像。在一些实施方案中，所述成像装置被配置为从相对于所述多个细胞中的每个细胞的多个不同角度捕获所述多个细胞的所述一个或多个图像。
在一些实施方案中，所述流动通道在所述流动通道的下游分支成多个通道，并且其中所述系统被配置为通过将所述细胞引导至所述多个通道中的选定通道，基于所分析的多个图像分拣所述细胞。在一些实施方案中，所述多个通道中的一个或多个通道包含阀门，所述阀门被配置为调节通过所述多个通道中的一个或多个通道的流量。在一些实施方案中，所述阀门是压力阀、电场阀或磁场阀。在一些实施方案中，在将所述细胞引导至所述选定通道之前，关闭除所述选定通道以外的所述多个通道。在一些实施方案中，所述系统还包括验证模块，所述验证模块被配置为在将所述细胞分拣之后、对所述细胞进行检测，并基于所述检测对所述细胞的所述分拣进行验证。在一些实施方案中，所述验证模块被配置为向所述细胞提供光以确定与所述细胞相关的信息，其中所述检测基于所述细胞对所述光的散射的阻挡。在一些实施方案中，与所述细胞相关的所述信息包括所述细胞的大小、形状、密度、纹理或速度。在一些实施方案中，所述验证模块被配置为(i)通过将至少两束光导向所述选定通道，在所述选定通道上提供至少两个光斑，以及(ii)确定所述细胞在所述至少两个光斑之间的行进时间，其中所述至少两个光斑的间隔为约10微米至约1,000微米。在一些实施方案中，所述光是激光。在一些实施方案中，所述系统被配置为通过以下步骤对所述细胞进行分拣：(i)将第一细胞引导至所述多个通道中的第一通道，以及(ii)将第二细胞引导至所述多个通道中的第二通道，其中所述第一细胞和所述第二细胞具有或疑似具有一个或多个不同特征。
在一些实施方案中，所述处理器被配置为以至少10个细胞/秒的速率分拣多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞。
在一些实施方案中，所述处理器被配置为(i)使用分类器来分拣包含所述细胞的多个细胞，以及(ii)将来自所述分拣的数据反馈至所述分类器，以训练所述分类器以用于将来的分拣。在一些实施方案中，所述分类器包括神经网络。在一些实施方案中，所述分类器被配置为基于与所述多个细胞的多个所分析的多个图像相对应的分类概率，来执行所述多个细胞中的每个的分类。
在一些实施方案中，所述细胞来自受试者的生物样品，并且其中所述方法还包括基于所分析的多个图像来确定所述受试者是否存在病症或属性。在一些实施方案中，所述受试者的所述生物样品选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、外淋巴液、粪便、唾液、精液、羊水、脑脊液、胆汁、汗液、眼泪、痰、滑液、呕吐物、骨、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾脏、肾脏、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼、脑、感染组织、患病组织、恶性组织、钙化组织和健康组织。在一些实施方案中，所述恶性组织包括肿瘤、肉瘤、血癌或其衍生物。
在一些实施方案中，所述成像装置被配置为通过用闪光灯以小于1毫秒的曝光时间照射所述细胞来捕获所述多个图像，其中所述闪光灯包括选自由以下组成的组的波长：470纳米(nm)、530nm、625nm和850nm的波长。
在一些实施方案中，所述处理器还被配置为(i)使用深度学习算法的集合对所述多个图像中的每个进行分析，以在所述多个不同角度的每个角度处、对所述多个不同图像中的每个图像的所述细胞进行分类；以及(ii)从所述分析中聚合所述细胞的多种分类以确定所述细胞的最终分类。
在一些实施方案中，所述细胞来自母体血清。在一些实施方案中，所述处理器被配置为基于所述分析识别有核红细胞(RBC)，其中所述有核RBC的存在指示胎儿异常状况。在一些实施方案中，所述胎儿异常情况是胎儿非整倍性。
在一些实施方案中，所述系统还被配置为(i)预测所述细胞到达分拣汇接点的到达时间，以及(ii)如果所述细胞的预测到达时间(1)在所述分析完成之前或(2)在所述分拣汇接点处的一个或多个阀门的致动完成之前，则调节所述细胞的速度以改变所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。在一些实施方案中，所述系统还被配置为确定所述细胞在所述预测到达时间到达所述分拣汇接点的概率。在一些实施方案中，调节所述细胞的所述速度包括降低所述细胞的速度。在一些实施方案中，调节所述细胞的速度以延迟所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。在一些实施方案中，所述系统还被配置为(iii)检测所述细胞到达所述分拣汇接点的实际到达时间，以及(iv)基于所述预测到达时间与所述实际到达时间的比较，修改一个或多个细胞分析算法和/或所述一个或多个阀门的致动信号。在一些实施方案中，实时地执行(iv)。
在一些实施方案中，所述系统被配置为还包括(i)对细胞群的亚群进行第一次分析以检测靶细胞，(ii)如果所述亚群中的所述靶细胞的数量高于预定阈值数量，则收集所述亚群，以及(iii)对所述亚群进行第二次分析。在一些实施方案中，所述成像装置被配置为捕获所述亚群中的每个细胞的一个或多个图像。在一些实施方案中，所述成像装置被配置为从单个角度捕获每个细胞的单个图像。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少1个靶细胞。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少2个靶细胞。在一些实施方案中，所述预定阈值数量为至少5个靶细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约10个细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约50个细胞。在一些实施方案中，所述亚群包含至少约100个细胞。在一些实施方案中，所述系统被配置为通过以下步骤对所述亚群进行所述再次分析：(1)捕获所述亚群中的每个细胞的多个图像，(2)对所述多个图像中的每个图像进行分析，(3)对所述亚群中的每个细胞进行分类，以及(4)对所述亚群中的每个细胞进行分拣。
在一些实施方案中，所述系统还被配置为(i)捕获经分拣细胞中的至少一个细胞的一个或多个图像，以及(ii)使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。在一些实施方案中，所述成像装置或附加的成像装置被配置为捕获所述经分拣的细胞中的所述至少一个细胞的所述一个或多个图像。在一些实施方案中，所述处理器或附加的处理器被配置为使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。在一些实施方案中，所述系统还被配置为基于所述至少一个经分拣的细胞的所述分析来修改一个或多个细胞分析算法。在一些实施方案中，实时地执行所述修改。
本公开内容的另一方面提供了一种包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，当所述机器可执行代码由一个或多个计算机处理器执行时，实现以上或本文其他地方所述的任何方法。
本公开内容的另一方面提供了一种包括一个或多个计算机处理器和耦合到其上的计算机存储器的系统。所述计算机存储器包含机器可执行代码，当所述机器可执行代码由所述一个或多个计算机处理器执行时，实现以上或本文其他地方所述的任何方法。
通过以下详细描述，本公开内容的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。将会认识到，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本公开内容。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
援引加入
本说明书中提及的所有出版物、专利、专利申请和NCBI登记号均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利、专利申请或NCBI登记号通过引用而并入。在通过引用而并入的出版物和专利、专利申请或NCBI登记号与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况下，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考以下阐述了其中利用本公开的原理的说明性实施方案的详细描述和附图(本文中也称为“图”)，将会获得对本公开的特征和优点的更好理解，在这些附图中：
图1A概念性地示出了根据本公开的一个实施方案的分类和/或分拣系统。
图1B概念性地示出了根据本公开的一个实施方案的流动池的微流体设计。
图2概念性地示出了具有可控长度的示例性长流动通道，以确保系统中的物体在作出决定并完成阀门致动时准确到达分叉点。
图3概念性地示出了示例性的三分支通道设计。
图4概念性地示出了当颗粒移动通过通道时旋转的颗粒。
图5概念性地示出了使用基于惯性的z聚焦的离焦细胞和对焦细胞。
图6A至图6D概念性地图示了共流设计的非限制性实施例。
图7概念性地示出了适应性标记框架。
图8概念性地示出了对残差网络50(Resnet50)所作的修改，其中早期层被拉长以换取后期层的收缩，以便增强它并增加其准确性。
图9概念性地示出了多视图集成推断框架。
图10概念性地示出了多视图到多通道数据框架。
图11概念性地示出了非限制性分拣设计。
图12概念性地示出了使用压电致动器的非限制性分拣设计。
图13概念性地示出了使用磁致动的非限制性分拣设计。
图14A概念性地示出了本公开的系统的两个激光以紧密接近的方式重新组合的技术。
图14B和图14C概念性地示出了聚焦两光束聚焦系统的实施例。
图15概念性地示出了包括反向通道设计的验证技术。
图16示出了被编程或以其他方式配置为实现本文提供的方法的计算机系统。
具体实施方式
尽管本文已经示出和描述了本公开内容的各种实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可能想到多种变化、改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在发生冲突的情况下，以包括定义的本申请为准。同样，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
分类和/或分拣系统
在一方面，本公开描述了一种细胞分拣系统。细胞分拣系统可以包括流动通道，流动通道被配置为通过通道运输细胞。细胞分拣系统可以包括成像装置，成像装置被配置为当通过流动通道运输细胞时，从多个不同角度捕获细胞的图像。细胞分拣系统可以包括处理器，处理器被配置为使用深度学习算法对图像进行分析以实现细胞的分拣。细胞分拣系统可以是细胞分类系统。在一些情况下，流动通道可以被配置为运输不含任何细胞的溶剂(例如，液体、水、介质、醇等)。细胞分拣系统可以具有用于相对于通道移动成像装置的一个或多个机构(例如，马达)。这样的移动可以是相对移动，因此移动部件可以是成像装置、通道或两者。处理器还可以被配置为控制这样的相对移动。
在一些实施方案中，本公开提供了如图1A所示的分类和/或分拣系统，图1A示出了具有流动池设计(例如，微流体设计)的细胞分拣系统的示意性图示，其进一步细节在图1B示出。操作时，制备样品102并通过泵104(例如，注射泵)将其注射到流动池105或流动装置中。在一些实施方案中，流动池105是微流体装置。尽管图1A示出了利用注射泵的分类和/或分拣系统，但是可以使用多种灌注系统中的任何一种，诸如(但不限于)重力供给、蠕动或多种压力系统中的任何一种。在一些实施方案中，通过固定和染色制备样品。在一些实施例中，样品包含活细胞。容易理解的是，制备样品的具体方式在很大程度上取决于具体应用的要求。
在一些实施方案中，以1×104-5×106个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×104-5×104个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以5×104-1×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×105-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以5×105-1×106个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×106-5×106个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以5×104-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×104-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以5×104-1×106个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以2×105-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以3×105-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以4×105-5×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×105-4×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以2×105-4×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以3×105-4×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×105-3×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以2×105-3×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。在一些实施方案中，以1×105-2×105个细胞/mL的浓度范围制备细胞悬浮液样品。
在一些实施方案中，以约1×104个细胞/mL、约5×104个细胞/mL、约1×105个细胞/mL、约2×105个细胞/mL、约3×105个细胞/mL、约4×105个细胞/mL、约5×104个细胞/mL、约5×105个细胞/mL、约1×106个细胞/mL或约5×106个细胞/mL的浓度制备细胞悬浮液样品。
在给定的分类和/或分拣系统中使用的具体浓度通常取决于系统的能力。可以固定细胞并用有色染料染色(例如，Papanicolaou和Wright Giemsa方法)。根据本公开的各种实施方案的分类和/或分拣系统可以对活的、固定的和/或Wright Giemsa染色的细胞进行操作。染色可以帮助增加核细胞器的对比度并提高分类准确性。在一些实施方案中，样品中的细胞未标记和/或染色。制备后，可以使用诸如(但不限于)管道的导管和诸如(但不限于)流动单元的灌注系统将细胞悬浮液样品注射到微流体装置中。
流动单元的实施例可以是但不限于注射泵、真空泵、致动器(例如，线性的、气动的、液压的等)、压缩机或者任何合适的装置，以向可包含或可不包含一个或多个颗粒(例如，待分类、分拣和/或分析的一个或多个细胞)的流体施加压力(例如，正的、负的、交替的等)。流动单元可以被配置为将流体升高、压缩、移动和/或转移到微流体通道中或从微流体通道中转移出来。在一些实施例中，流动单元可以被配置为输送正压、交替的正压和真空压力、负压、交替的负压和真空压力、和/或仅真空压力。本公开的流动池可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个流动单元。流动池可以包括至多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个流动单元。
每个流动单元可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多流体源流体连通。每个流动单元可以与至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个流体流体连通。流体可以包含颗粒(例如，细胞)。或者，流体可以不含颗粒。流动单元可以被配置为维持、增加和/或减小流动单元的微流体通道内流体的流动速度。因此，流动单元可以被配置为维持、增加和/或减小颗粒的流动速度(例如，在微流体通道的下游)。流动单元可以被配置为使流动单元的微流体通道内流体的流动速度加速或减速，从而使颗粒的流动速度加速或减速。
流体可以是液体或气体(例如，空气、氩气、氮气等)。液体可以是水溶液(例如，水、缓冲液、盐水等)。或者，液体可以是油。在一些情况下，可以仅引导一种或多种水溶液通过微流体通道。或者，可以仅引导一种或多种油通过微流体通道。另一个替代方案中，可以引导溶液和油均通过微流体通道。在一些实施例中，(i)水溶液可以形成悬浮在油中的液滴(例如，含有颗粒的乳液)，或者(ii)油可以形成悬浮在水溶液中的液滴(例如，含有颗粒的乳液)。
在一些实施方案中，注射泵以约10μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约50μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约100μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约150μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约200μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约250μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约500μL/分钟注射样品。在一些实施方案中，注射泵以约10μL/分钟至约500μL/分钟，例如，以约10μL/分钟至约50μL/分钟、约10μL/分钟至约100μL/分钟、约10μL/分钟至约150μL/分钟、约10μL/分钟至约200μL/分钟、约10μL/分钟至约250μL/分钟、约10μL/分钟至约300μL/分钟、约10μL/分钟至约350μL/分钟、约10μL/分钟至约400μL/分钟、或约10μL/分钟至约450μL/分钟注射样品。
容易理解的是，可以利用适合于给定的分类和/或分拣系统的任何灌注系统，包括但不限于蠕动系统和重力供给。
如上所述，流动池105可被实现为流体装置，其将来自样品的细胞聚焦成被连续成像的单个流线。在所示实施方案中，细胞线由光源106(例如，灯，诸如弧光灯)和光学系统110照射，该光学系统110将光引导到流动池105的成像区域138上。物镜系统112通过将光引导向高速相机系统114的传感器来放大细胞。
在一些实施方案中，使用10×、20×、40×、60×、80×、100×或200×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用10×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用20×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用40×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用60×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用80×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用100×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用200×物镜放大细胞。在一些实施方案中，使用10×至200×物镜放大细胞，例如使用10x-20x、10x-40x、10x-60x、10x-80x或10x-100x物镜放大细胞。
本领域普通技术人员容易理解的是，所利用的具体放大倍率可以变化很大，并且在很大程度上取决于给定成像系统和感兴趣的细胞类型的要求。
在一些实施方案中，可以使用一个或多个成像装置来捕获细胞的图像。在一些方面，成像装置是高速相机。在一些方面，成像装置是具有微秒曝光时间的高速相机。在一些情况下，曝光时间为1毫秒。在一些情况下，曝光时间为1毫秒(ms)至0.75毫秒。在一些情况下，曝光时间为1ms至0.50ms。在一些情况下，曝光时间为1ms至0.25ms。在一些情况下，曝光时间为0.75ms至0.50ms。在一些情况下，曝光时间为0.75ms至0.25ms。在一些情况下，曝光时间为0.50ms至0.25ms。在一些情况下，曝光时间为0.25ms至0.1ms。在一些情况下，曝光时间为0.1ms至0.01ms。在一些情况下，曝光时间为0.1ms至0.001ms。在一些情况下，曝光时间为0.1ms至1微秒(μs)。在一些方面，曝光时间为1μs至0.1μs。在一些方面，曝光时间为1μs至0.01μs。在一些方面，曝光时间为0.1μs至0.01μs。在一些方面，曝光时间为1μs至0.001μs。在一些方面，曝光时间为0.1μs至0.001μs。在一些方面，曝光时间为0.01μs至0.001μs。
在一些情况下，流动池105可以包括在成像区域138上或附近的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个成像装置(例如，高速相机系统114)。在一些情况下，流动池可以包括在成像区域138上或附近的至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个成像装置。在一些情况下，流动池105可以包括多个成像装置。多个成像装置中的每个成像装置可以使用来自相同光源的光。或者，多个成像装置中的每个成像装置可以使用来自不同光源的光。多个成像装置可以相对于彼此并联和/或串联配置。多个成像装置可以被配置在流动池105的一个或多个侧面(例如，两个相邻侧面或两个相对侧面)上。多个成像装置可以被配置为相对于(i)流动池105的长度(例如，流动池105的直通道的长度)或(ii)流动池105中一个或多个颗粒(例如，一个或多个细胞)的迁移方向，沿相同轴或不同轴查看成像区域138。
在对一个或多个细胞进行成像时(例如，在成像区域138)，本公开内容的一个或多个成像装置可以是静止的。或者，在对一个或多个细胞进行成像时，一个或多个成像装置可以相对于流动通道移动(例如，沿流动通道的长度、朝向和/或远离流动通道、沿流动通道的圆周切向移动等)。在一些实施例中，一个或多个成像装置可以可操作地耦合至一个或多个致动器，例如步进致动器、线性致动器、液压致动器、气动致动器、电动致动器、电磁致动器和机械致动器(例如，齿条和齿轮、链条等)。
在一些情况下，流动池105可以包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个成像区域(例如，成像区域138)。在一些情况下，流动池105可以包括至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个成像区域。在一些实施例中，流动池105可以包括多个成像区域，并且多个成像区域可以相对于彼此并联和/或串联配置。多个成像区域可以彼此流体连通，或者可以彼此不流体连通。在一个实施例中，第一成像区域和第二成像区域可以并联配置，使得通过第一成像区域的第一流体不通过第二成像区域。在另一实施例中，第一成像区域和第二成像区域可以串联配置，使得通过第一成像区域的第一流体也通过第二成像区域。
在一些实施方案中，以约10帧/秒至约10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以至少约10帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以至多约10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以约10帧/秒至约100帧/秒、约10帧/秒至约1,000帧/秒、约10帧/秒至约10,000帧/秒、约10帧/秒至约100,000帧/秒、约10帧/秒至约1,000,000帧/秒、约10帧/秒至约10,000,000帧/秒、约100帧/秒至约1,000帧/秒、约100帧/秒至约10,000帧/秒、约100帧/秒至约100,000帧/秒、约100帧/秒至约1,000,000帧/秒、约100帧/秒至约10,000,000帧/秒、约1,000帧/秒至约10,000帧/秒、约1,000帧/秒至约100,000帧/秒、约1,000帧/秒至约1,000,000帧/秒、约1,000帧/秒至约10,000,000帧/秒、约10,000帧/秒至约100,000帧/秒、约10,000帧/秒至约1,000,000帧/秒、约10,000帧/秒至约10,000,000帧/秒、约100,000帧/秒至约1,000,000帧/秒、约100,000帧/秒至约10,000,000帧/秒、或约1,000,000帧/秒至约10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以约10帧/秒、约100帧/秒、约1,000帧/秒、约10,000帧/秒、约100,000帧/秒、约1,000,000帧/秒或约10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像。
在一些实施方案中，使用高速相机以10,000-10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列，高速相机可以是彩色的、单色的和/或使用包括(但不限于)近红外光谱的多种成像方式中的任何一种来进行成像的。在一些实施方案中，以50,000-5,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以50,000-100,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以100,000-1,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以100,000-500,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以500,000-1,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。在一些实施方案中，以1,000,000-5,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。
在一些实施方案中，以约50,000帧/秒、约100,000帧/秒、约200,000帧/秒、约300,000帧/秒、约400,000帧/秒、约500,000帧/秒、约750,000帧/秒、约1,000,000帧/秒、约2,500,000帧/秒、约5,000,000帧/秒或约10,000,000帧/秒的速率记录来自细胞的图像序列。
在一些实施方案中，本公开内容中使用的成像装置是超高速相机，其中以高达25,000,000帧/秒的速率记录图像。在一些情况下，超高速相机以每秒20,000转运行。在一些情况下，高速相机具有616x920像素的分辨率。
成像系统的成像装置(例如，高速相机)可以包括电磁辐射传感器(例如，IR传感器、颜色传感器等)，该电磁辐射传感器检测由流动池或流动池中的任何内容物(例如，细胞)反射和/或透射的电磁辐射的至少一部分。成像装置可以与一个或多个电磁辐射源(例如，至少1、2、3、4、5或更多个)可操作地通信。电磁辐射可以包括来自电磁光谱的一个或多个波长，包括但不限于X射线(约0.1纳米(nm)至约10.0nm；或约1018赫兹(Hz)至约1016Hz)、紫外(UV)射线(约10.0nm至约380nm；或约8×1016Hz至约1015Hz)、可见光(约380nm至约750nm；或约8×1014Hz至约4×1014Hz)、红外(IR)光(约750nm至约0.1厘米(cm)；或约4×1014Hz至约5×1011Hz)和微波(约0.1cm至约100cm；或约108Hz至约5×1011Hz)。在一些情况下，电磁辐射源可以是环境光，因此细胞分拣系统可以没有附加的电磁辐射源。
成像装置可以被配置为拍摄细胞的二维图像(例如，一个或多个像素)和/或细胞的三维图像(例如，一个或多个体素)。
在一些实施方案中，使用曝光时间小于1毫秒(msec)的高功率发光二极管(LED)照射成像区域，以助于防止细胞的运动模糊。在一些实施方案中，使用曝光时间小于1微秒(μsec)的高功率LED照射成像区域，以助于防止细胞的运动模糊。在一些实施方案中，成像装置包括闪光灯和相机的组合。闪光灯(strobe light)、频闪观测器(strobe)、频闪灯(stroboscopic lamp)和闪烁灯(strobing light)可以可互换地使用。在一些情况下，闪光灯是用于产生规则闪光的装置。在一些实施方案中，高速闪光灯与一个或多个相机结合使用。在一些情况下，高速闪光灯能够高达2500次/秒频闪。在一些情况下，高速闪光灯能够高达5000次/秒频闪。在一些情况下，高速频闪灯具有电能储库以脉冲驱动LED，其中当LED处于活动状态时，能量可高达2000瓦。在一些情况下，高速闪光灯以高达180安培的DC电流脉冲驱动LED。在一些情况下，闪光灯为白色。在一些情况下，闪光灯为蓝色，波长为470nm。在一些情况下，闪光灯为绿色，波长为530nm。在一些情况下，闪光灯为红色，波长为625nm。在一些情况下，闪光灯为红外光，波长为850nm。在一些实施方案中，成像装置包括闪光灯和一个或多个相机的组合，其中相机是高速相机。在一些实施方案中，成像装置包括高速闪光灯和一个或多个相机的组合，其中相机是高速相机。
容易理解的是，曝光时间可以在不同系统之间不同，并且在很大程度上取决于给定应用的要求或给定系统的限制，诸如但不限于流速。获取图像并且可以使用图像分析算法来分析图像。
在一些实施方案中，在捕获后获取图像并分析图像。在一些方面，连续实时获取图像并分析图像。使用对象跟踪软件，可以在相机的视场中检测和跟踪单个细胞。然后可以进行背景减法。在多个实施方案中，流动池106使细胞在成像时旋转，并且每个细胞的多个图像被提供给计算系统116以用于分析。在一些实施方案中，多个图像包括来自多个细胞角度的图像。
如本文可互换使用的，术语“实时”或“即时”通常是指使用最近获得(例如，收集或接收)的数据执行的事件(例如，操作、过程、方法、技术、运算、计算、分析、优化等)。事件的实施例可以包括，但不限于，分析细胞的一个或多个图像以对细胞进行分类、更新用于分类和分拣的一个或多个深度学习算法(例如，神经网络)、在分拣分叉点控制一个或多个阀门的致动等。在一些情况下，实时事件几乎可以立即执行，或者可以在足够短的时间跨度内执行，诸如在至少0.0001ms、0.0005ms、0.001ms、0.005ms、0.01ms、0.05ms、0.1ms、0.5ms、1ms、5ms、0.01秒、0.05秒、0.1秒、0.5秒、1秒或更长的时间跨度内执行。在一些情况下，实时事件几乎可以立即执行，或者可以在足够短的时间跨度内执行，诸如在至多1秒、0.5秒、0.1秒、0.05秒、0.01秒、5ms、1ms、0.5ms、0.1ms、0.05ms、0.01ms、0.005ms、0.001ms、0.0005ms、0.0001ms或更短的时间跨度内执行。
可以确定流速和通道尺寸以从多个不同角度(即，多个细胞角度)获得同一细胞的多个图像。一个角度与下一角度之间的旋转度数可以是均匀的或不均匀的。在一些实施例中，捕获细胞的完整360°视图。在一些实施方案中，提供细胞在连续帧之间旋转90°的4个图像。在一些实施方案中，提供细胞在连续帧之间旋转45°的8个图像。在一些实施方案中，提供细胞在连续帧之间旋转15°的24个图像。在一些实施方案中，提供至少三个或更多个图像，其中细胞在第一帧与第二帧之间以第一角度旋转，并且细胞在第二帧与第三帧之间以第二角度旋转，其中第一与第二角度不同。在一些实施例中，可以捕获小于细胞的完整360°视图，并且同一细胞的得到的多个图像可足以对细胞进行分类(例如，确定细胞的具体类型)。
细胞可以具有多个侧面。细胞的多个侧面可以相对于细胞通过通道运输(流动)的方向来限定。在一些情况下，细胞可以包括顶侧、与顶侧相对的底侧、前侧(例如，朝向细胞流动方向的一侧)、与前侧相对的后侧、左侧和/或与左侧相对的右侧。在一些情况下，细胞的图像可以包括从多个角度捕获的多个图像，其中多个图像包括：(1)从细胞的顶侧捕获的图像，(2)从细胞的底侧捕获的图像，(3)从细胞的前侧捕获的图像，(4)从细胞的后侧捕获的图像，(5)从细胞的左侧捕获的图像和/或(6)从细胞的右侧捕获的图像。
在一些实施方案中，可以通过叠加单个细胞的多个图像生成细胞的二维“全息图”。可以对“全息图”进行分析，以基于包括，但不限于，细胞的形态特征在内的特征对细胞的特性进行自动分类。
在一些实施方案中，为每个细胞捕获1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获5或更多个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获5至10个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获10或更多个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获10至20个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获20或更多个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获20至50个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获50或更多个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获50至100个图像。在一些实施方案中，为每个细胞捕获100或更多个图像。在一些情况下，可以在多个不同角度下为每个细胞捕获至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个图像。在一些情况下，可以在多个不同角度下为每个细胞捕获至多50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2个图像。
在一些实施方案中，移动成像装置以便从多个角度捕获细胞的多个图像。在一些方面，以与水平轴成0至90度之间的角度捕获图像。在一些方面，以与水平轴成90至180度之间的角度捕获图像。在一些方面，以与水平轴成180至270度之间的角度捕获图像。在一些方面，以与水平轴成270至360度之间的角度捕获图像。
在一些实施方案中，使用多个成像装置(例如，多个相机)，其中每个装置从特定的细胞角度捕获细胞的图像。在一些方面，使用2、3、4、5、6、7、8、9或10个相机。在一些实施方案中，使用多于10个相机，其中每个相机从特定的细胞角度对细胞进行成像。
容易理解的是，所捕获的图像的数量取决于给定应用的要求或给定系统的限制。在若干实施方案中，流动池具有不同的区域以聚焦、排序和/或旋转细胞。尽管聚焦区域、排序区域和细胞旋转区域被讨论为以特定顺序影响样品，但是本领域普通技术人员将理解，可以不同地布置各个区域，其中样品中细胞的聚焦、排序和/或旋转可以以任何顺序来执行。图1B示出了根据本公开的实施方案实现的微流体装置内的区域。流动池105可以包括过滤区域130，以防止通道因团聚体/碎屑或灰尘而堵塞。细胞通过聚焦区域132，聚焦区域132将细胞聚焦成细胞的单个流线，然后细胞的单个流线由排序区域134隔开。在一些实施方案中，聚焦区域利用“惯性聚焦”形成细胞的单个流线。在一些实施方案中，聚焦区域利用“流体动力聚焦”将细胞聚焦成细胞的单个流线。任选地，在成像之前，可以通过旋转区域136旋转细胞。任选地，旋转的细胞然后可以通过成像区域138，在成像区域138中、在离开流动池之前，照明细胞以用于成像。这些不同的区域将在下面更详细地描述和讨论。在一些情况下，旋转区域136可以位于成像区域138之前。在一些情况下，旋转区域136可以是成像区域138的一部分(例如，相对于流动池内细胞迁移的开始部分、中间部分和/或结束部分)。在一些情况下，成像区域138可以是旋转区域136的一部分。
在一些实施方案中，在成像装置(例如，相机)的视场中对单个细胞进行成像。在一些实施方案中，在成像装置的同一视场中对多个细胞进行成像。在一些方面，在成像装置的同一视场中对1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个细胞进行成像。在一些方面，在成像装置的同一视场中对高达100个细胞进行成像。在一些方面，在成像装置的同一视场中对10至100个细胞进行成像，例如，在成像装置的同一视场中对10至20个细胞、10至30个细胞、10至40个细胞、10至50个细胞、10至60个细胞、10至80个细胞、10至90个细胞、20至30个细胞、20至40个细胞、20至50个细胞、20至60个细胞、20至70个细胞、20至80个细胞、20至90个细胞、30至40个细胞、40至50个细胞、40至60个细胞、40至70个细胞、40至80个细胞、40至90个细胞、50至60个细胞、50至70个细胞、50至80个细胞、50至90个细胞、60至70个细胞、60至80个细胞、60至90个细胞、70至80个细胞、70至90个细胞、90至100个细胞进行成像。
在一些情况下，仅允许将单个细胞运输跨过垂直于流动通道的轴线的流动通道的横截面。在一些情况下，允许将多个细胞(例如，至少2、3、4、5或更多个细胞；至多5、4、3、2或1个细胞)同时运输跨过垂直于流动通道的轴线的流动通道的横截面。在这样的情况下，成像装置(或可操作地连接至成像装置的处理器)可以被配置为当多个细胞沿流动通道运输时，跟踪多个细胞中的每个细胞。
在一些实施方案中，根据本公开的各种实施方案的分类和/或分拣系统消除了依赖于操作者的专业知识的手动准备载玻片所涉及的可变性。此外，可以避免图像分割。分类和/或分拣系统使得能够实现高流速和高通量。
在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少100个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少100个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少500个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少500个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少1000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少1000个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少2000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少2000个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少5000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少5000个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以至少10,000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以至少10,000个细胞/秒的速率进行分类的计算系统。
在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达100个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达100个细胞/秒进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达500个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达500个细胞/秒进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达1000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达1000个细胞/秒进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达2000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达2000个细胞/秒进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达5000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达5000个细胞/秒进行分类的计算系统。在一些实施方案中，分类和/或分拣系统包括可以以高达10,000个细胞/秒的速率捕获图像的成像系统和可以以高达10,000个细胞/秒进行分类的计算系统。
成像系统尤其可以包括相机、物镜系统和光源。在多个实施方案中，可以使用标准的2D微流体制造技术制造与上述流动池类似的流动池，所需的制造时间和成本最少。
尽管上文关于图1A和图1B描述了特定的分类和/或分拣系统、流动池以及微流体装置，但是，分类和/或分拣系统可以以适合于根据本公开的各种实施方案的具体应用要求的各种方式中的任何一种来实现。下文进一步讨论了根据本公开的一些实施方案的可以用于分类和/或分拣系统的微流体装置的具体元件。
微流体装置制造
可以使用各种方法来制造根据本公开的若干种实施方案的微流体装置。在一些实施方案中，使用光刻和模铸造的组合来制造微流体装置。常规的光刻通常涉及使用光致抗蚀剂和图案化光(patterned light)来产生模具，该模具在衬底(通常是硅晶片)的顶部上包含所需的微流体图案的正浮雕(positive relief)。光致抗蚀剂是可光固化的材料，其可用于光刻以产生特征尺寸为微米级(μm)的结构。在制造期间，可以将光致抗蚀剂沉积到衬底上。可以旋转衬底以产生具有目标所需高度的光致抗蚀剂层。然后可以通过图案化掩模将光致抗蚀剂层暴露于光、通常是UV光(取决于光致抗蚀剂的类型)，以产生光致抗蚀剂的固化图案。其余的未固化部分可以被显影掉，留下可以用于制造微流体装置的正浮雕模具。
从模具中可以浇铸材料，以产生包含负浮雕图案(negative relief pattern)的层。可以在适当的区域形成入口孔和出口孔，然后可以将该装置结合到背衬上以产生具有流动通道(例如，微流体通道)的流通装置或流动池。流动通道的横截面可以具有宽度和高度。横截面可以垂直于流动通道的轴线(例如，在流动通道内、具有或不具有细胞的溶剂的流动方向)。流动通道的宽度和高度可以彼此垂直。流动通道的宽度和/或高度沿着流动通道的轴线可以是均匀的或不均匀的。在一些情况下，流动通道的宽度或高度可以沿着流动通道的、运输细胞的方向来增加或减小(例如，逐渐地或迅速地)。在一些情况下，流动通道的宽度或高度可以沿着流动通道的部分(section)增加，以及沿着流动通道的不同的部分减小。
流动通道的横截面的宽度或高度可以为约1μm至约500μm。流动通道的横截面的宽度或高度可以是至少约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm或更大。流动通道的横截面的宽度或高度可以是至多约500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、90μm、0μm、0μm、60μm、50μm、40μm、30μm、20μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小。
通道的宽度或高度可以沿流动通道的方向以约0.01％/μm(％/μm)至约1000％/μm来增加或减少。通道的宽度或高度沿流动通道的方向的增加或减少可以为至少约0.01％/μm、0.05％/μm、0.1％/μm、0.5％/μm、1％/μm、5％/μm、10％/μm、50％/μm、100％/μm、500％/μm、1000％/μm或更多。通道的宽度或高度沿流动通道的方向的增加或减少可以为至多约1000％/μm、500％/μm、100％/μm、50％/μm、10％/μm、5％/μm、1％/μm、0.5％/μm、0.1％/μm、0.05％/μm、0.01％/μm或更少。
本公开的流动池的一个或多个流动通道可以具有各种形状和尺寸。例如，流动通道的至少一部分(例如，聚焦区域132、排序区域134、旋转区域136、成像区域138、其间的连接区域等)可以具有圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形或其任何部分形状或形状组合的横截面。
在一些实施方案中，本公开的系统包括具有矩形或正方形横截面的直通道。在一些方面，本公开的系统包括具有圆形横截面的直通道。在一些方面，系统包括具有半椭圆形横截面的直通道。在一些方面，系统包括螺旋通道。在一些方面，系统包括具有矩形横截面的圆形通道。在一些方面，系统包括具有圆形横截面的矩形通道的圆形通道。在一些方面，系统包括具有半椭圆形横截面的圆形通道。在一些方面，系统包括在宽度上扩展和收缩的、具有矩形横截面的通道。在一些方面，系统包括在宽度上扩展和收缩的、具有圆形横截面的通道。在一些方面，系统包括在宽度上扩展和收缩的、具有半椭圆形横截面的通道。
在利用旋转部分的一些实施方案中，可以使用两层制造工艺来定向旋转部分，使得当细胞旋转时、细胞的成像将提供不同角度的细胞的图像，其具有更准确的细胞特征表示。
如容易理解的，微流体装置可以使用适合于给定应用的要求的各种材料来制造。在成像应用中，微流体装置通常由光学透明材料，诸如(但不限于)聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。在一些实施方案中，微流体装置由硅制成。在一些实施方案中，微流体装置由低温共烧陶瓷(LTCC)制成。在一些实施方案中，微流体装置由热固性聚酯(TPE)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚苯乙烯(PS)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚碳酸酯(PC)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚氟聚醚二醇甲基丙烯酸酯(PFPE-DMA)制成。在一些实施方案中，微流体装置由聚氨酯(PU)制成。
尽管讨论了微流体装置制造的具体定方法，但是可以按照适合于给定应用的要求实现多种方法中的任何一种来制造根据本公开的各种实施方案使用的微流体装置。
微流体过滤器
根据本公开的若干种实施方案的微流体装置可以在微流体装置的入口处或更下方包括一个或多个微流体过滤器，以防止通道阻塞。在其他实施方案中，过滤可以在装置外进行。过滤器和微流体通道的具体尺寸和图案可以变化，并且在很大程度上取决于感兴趣细胞的大小和给定应用的要求。按照适合于给定流动应用的要求，可以在根据本公开的各种实施方案种使用的微流体装置上实现多种微流体过滤器系统中的任何一个。
聚焦区域
流动通道可以包括一个或多个壁，其形成为将一个或多个细胞聚焦到流线。流动通道可以包括聚焦区域，聚焦区域包括一个或多个壁以将细胞聚焦到流线。微流体装置上的聚焦区域可以捕获无序的细胞流，并利用各种力(例如，惯性升力(壁效应和剪切梯度力)或流体动力)将流体内的细胞聚焦成细胞的流线。在一些实施方案中，将细胞聚焦在单个流线中。在一些实例中，将细胞聚焦在多个流线，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个流线中。
聚焦区域经由上游部分接收随机排列的细胞流。细胞流入收缩和扩展部分区域，在收缩和扩展部分中，随机排列的细胞聚焦成细胞的单个流线。聚焦由在雷诺数>1时作用于细胞上的惯性升力(壁效应和剪切梯度力)的作用驱动，其中通道雷诺数的定义如下：Rec＝ρUmW/μ，其中Um是最大流体速度，ρ是流体密度，μ是流体粘度，并且W是通道尺寸。在一些实施方案中，可以使用大约20-30的雷诺数以聚焦约10μm至约20μm的颗粒。在一些实施方案中，雷诺数使得在微流体通道内发生层流。可以容易地理解，特定通道雷诺数可以变化，并且很大程度上取决于微流体装置设计所针对的细胞的特征(characteristic)、微流体通道的尺寸以及由灌注系统控制的流速。本公开的流动通道的雷诺数可以取决于或可以不取决于流过流动通道的颗粒(例如，细胞)的一个或多个尺寸参数(例如，半径、直径、横截面积、体积等)。
在一些实施方案中，聚焦区域形成有曲线壁，该曲线壁形成周期性图案。在一些实施方案中，图案形成一系列方形扩展和收缩。在其他实施方案中，图案是正弦曲线的。在进一步的实施方案中，正弦曲线图案倾斜以形成不对称图案。聚焦区域可以在宽的流速范围内有效地聚焦细胞。在所图示的实施方案中，使用了不对称的正弦曲线结构，而不是方形扩张和收缩。这有助于防止颗粒流动流后面形成二次涡旋和二次流动。以这种方式，图示的结构允许更快且更准确地将细胞聚焦到单个横向平衡位置。螺旋形和弯曲形通道也可以用于惯性状态；但是，这些可能会使与其他模块的集成变得复杂。最后，通道宽度大于通道高度的直通道也可以用于将细胞聚焦到单个横向位置上。然而，在这种情况下，由于在z平面中将存在多于一个的平衡位置，因此成像可能成为问题，因为成像焦平面优选地是固定的。如可以容易理解的，可以按照适合于特定应用的要求，可以利用种结构中的任何一种，该结构提供沿微流体通道的长度扩展和收缩的横截面或能够聚焦细胞。
细胞分拣系统可以被配置为在流动通道内、沿流动通道的轴线在宽度和/或高度处聚焦细胞。细胞可以聚焦到流动通道的横截面的中心或偏离该中心。细胞可以聚焦到流动通道的横截面的侧面(side)(例如，壁)。当细胞通过通道输送时，细胞在通道的横截面内的聚焦位置可以是均匀的或不均匀的。
尽管上文描述了微流体通道内的聚焦区域的具体实现方式，但是根据本公开的各种实施方案，按照适合于特定应用的要求，可以利用将细胞聚焦成单个流线的各种通道配置中的任何一种。
排序区域
根据本公开的若干种实施方案，可以设计微流体通道以对聚焦区域形成的细胞的单个流线施加排序。根据本公开的一些实施方案的微流体通道包括具有夹持(pinching)区域和弯曲通道的排序区域。排序区域对细胞排序，并使单个细胞彼此隔开，以促进成像。在一些实施方案中，通过形成微流体通道以在细胞上施加惯性升力和迪安(Dean)拖曳力来实现排序。迪安流是由流体惯性引起的旋转流。可以形成微流体通道以产生二次流，该二次流施加与二次流的速度成比例的迪安拖曳力。迪安拖曳力与约ρUm 2αDh 2/R成比例，其中ρ是流体密度，Um是最大流体速度，Dh＝2WH/(W+H)是通道水力直径，α是颗粒尺寸，以及R是曲率半径。惯性升力与迪安拖曳力之间的力平衡决定了颗粒平衡位置。
取决于颗粒大小，可以确定通道的相对内部和外部曲率半径(R1in,out)和微流体通道的通道高度(HC)以在期望的位置达到平衡。弯曲和夹持区域的不同组合(及其参数)可以用于实现颗粒之间的所需的距离。可以调整夹持区域中的通道宽度，使得细胞不会被挤压通过通道，导致对细胞膜的可能的损害(然而，在穿过夹持区域行进时，细胞在不接触通道壁的情况下可能轻微变形)。此外，挤压可能会导致在通道壁上残留的来自细胞膜的碎片/残留物，这将改变通道的特性。夹持区域中的排序是由细胞/颗粒到达时、通道流体阻力的瞬时变化驱动。由于此区域中的通道宽度接近于细胞/颗粒尺寸，当细胞到达夹持区域时，通道阻力增加。由于整个系统都是压力调节的(恒定压力)，这可能会导致流速瞬时下降，以及因此导致细胞的间隔。可以调节夹持区域的长度和宽度，以达到细胞之间所需的间隔。弯曲的通道结构还可以帮助细胞聚焦到单个z位置，从而促进成像。
可以使用不同的几何形状、顺序和/或组合。在一些实施方案中，在不使用弯曲通道的情况下，可以将夹持区域放置在聚焦通道的下游。添加弯曲通道有助于更快速且受控的排序，以及增加颗粒在向下游迁移时遵循单个横向位置的可能性。可以容易理解的，排序区域的具体配置很大程度上由给定应用的要求决定。
细胞旋转区域和成像区域
可以控制(例如，修改、优化等)本公开的流动池的微流体通道的架构以调整沿微流体通道的细胞流动。细胞流动的实例可以包括(i)细胞聚焦(例如，成为单个流线)和(ii)当细胞沿微流体通道的长度向下迁移(例如，在单个流线内)时一个或多个细胞的旋转。在一些实施方案中，根据本公开的许多实施方案，微流体通道可以被配置为对排序细胞施加旋转。根据本公开的一些实施方案的微流体通道的一个或多个细胞旋转区域(例如，细胞旋转区域136)使用无颗粒缓冲液的共流以通过使用共流在细胞之间施加差速梯度来诱导细胞旋转。在一些情况下，细胞旋转区域可以引入至少1、2、3、4、5或更多种缓冲液(例如，无颗粒或包含一种或多种颗粒，诸如聚合物或磁性颗粒)的共流以对通道内的一个或多个细胞施加旋转。在一些情况下，细胞旋转区域可以引入至多5、4、3、2或1种缓冲液的共流以对通道内的一个或多个细胞施加旋转。在一些实例中，可以使多种缓冲液在沿细胞旋转区域的长度的相同位置处共流，或者在沿细胞旋转区域的长度的不同位置处顺序流动。在一些实例中，多种缓冲液可以是相同或不同的。在若干种实施方案中，使用两层制造工艺来制造微流体通道的细胞旋转区域，使得旋转的轴线垂直于细胞下游迁移的轴线并且平行于细胞横向迁移。
在细胞向下游迁移时、在细胞翻滚和/或旋转的情况下，可在细胞旋转区域的至少一部分中对细胞成像。替代地或附加地，可以在与细胞旋转区域相邻或下游的成像区域中对细胞成像。在一些实例中，细胞可以在流动通道内的单个流线中流动，并且当细胞在单个流线内旋转时，可以对细胞成像。细胞的旋转速度可以沿成像区域的长度是恒定的或变化的。这可以允许以不同的角度对细胞成像(例如，由于细胞旋转而从多个角度拍摄的细胞的多个图像)，这可以提供比在单个图像或者在没有任何显著程度旋转的细胞的图像序列中捕获的关于细胞特征的更准确的信息。由于跨图像的旋转角度是已知的，因此这也允许使用可用软件对细胞进行3D重构。替代地，可以单独分析图像序列中的每个单个图像，以单独地分析(例如，分类)来自每个图像的细胞。在一些情况下，可以对图像序列的单独分析的结果进行汇集以确定最终决定(例如，细胞的分类)。
在一些实施方案中，通过提供通道高度(即，微流体通道的横截面的两个尺寸中较小的尺寸以及垂直于成像平面的尺寸)的变化来实现跨细胞的速度梯度的类似变化。通道高度的这种增加应当使得宽度继续大于通道的高度。同样在增加通道高度的情况下，可以使细胞聚焦位置在高度尺寸上偏移，这在成像和成像焦平面调整期间应当考虑。在实例中，可以通过(i)改变通道的底表面(例如，按压通道的底表面)和/或(ii)改变通道的顶表面(例如，升高通道的顶表面)来增加通道高度。
在一些实施方案中，根据本公开的实施方案，微流体通道的细胞旋转区域在成像区域之前并入注入的共流。可以在z平面(垂直于成像平面)中引入共流以使细胞旋转。由于成像是在x-y平面上进行的，因此，通过将在先前图像中可能已被遮挡的细胞部分旋转到每个后续图像的视野中，细胞围绕与y轴线平行的轴线的旋转提供额外的信息。由于通道尺寸的变化，在点x0处，跨细胞施加速度梯度，这可以使得细胞旋转。细胞的角速度取决于通道和细胞尺寸以及Q1(主通道流速)和Q2(共流流速)之间的比率，并且可以按照适合于给定应用的要求配置。在一些实施方案中，细胞旋转区域并入了微流体通道的在一个尺寸的增加，以引发跨细胞的速度梯度的改变，以向细胞施加旋转。在一些方面，根据本公开的实施方案，微流体通道的细胞旋转区域在成像区域之前并入了微流体通道的横截面的在z轴线尺寸上的增加。通道高度的变化可以引发跨细胞在微流通道的z轴线上的速度梯度变化，这可以使得细胞像使用共流一样旋转。
尽管上文描述了对细胞施加速度梯度的特定技术，但是根据本公开的各个实施方案，可以按照适合于特定应用的要求，利用多种技术中的任何一种对细胞的单个流线施加旋转。
流动池
在一些实施方案中，本公开的系统和方法将细胞聚焦在微流体通道中。如本文所用，术语聚焦广义上意指控制细胞/细胞运动的轨迹，并且包括控制细胞在微流体通道内行进的位置和/或速度。在一些实施方案中，控制颗粒在微流体通道内行进的横向位置和/或速度允许准确地预测细胞到达分叉点的时间。然后可以精确地对细胞进行分拣。对于在微流体通道内细胞聚焦的至关重要的参数包括但不限于通道几何形状、颗粒尺寸、整体系统通量、样品浓度、成像通量、视场大小和分拣方法。
在一些实施方案中，使用惯性力来实现聚焦。在一些实施方案中，本公开的系统和方法使用惯性聚焦将细胞聚焦到距离通道底部的一定高度(Dino Di Carlo,2009,Lab ona Chip,其通过引用以整体并入本文)。在这些实施方案中，细胞与物镜的距离是相等的，并且所有细胞的图像将是清晰的。这样，诸如核形状、结构和尺寸的细胞细节以最小模糊清楚地出现在输出的图像中。在一些方面，本文公开的系统具有可调节的成像聚焦平面。在一些方面，通过移动物镜或镜台来调节聚焦平面。在一些方面，通过在不同平面上记录视频来寻找最佳聚焦平面，成像的细胞在该最佳聚焦平面具有最高傅里叶量级，因此，最高水平的细节和最高的分辨率是最佳平面(图5)。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法利用基于流体动力的z聚焦系统来获得待成像的感兴趣的细胞的一致z高度。在一些方面，该设计包括使用用于主流和侧流的多个入口的流体动力聚焦。在一些方面，基于流体动力的z聚焦系统是三冲设计(triple-punchdesign)(图6A)。在一些方面，设计包括具有三个入口的流体动力聚焦，其中两个侧流在中心处夹持细胞。对于某些通道设计，可以创建双z焦点，其中类似于三冲设计的双冲设计可以用于将物质送入到两个焦点之一以获得一致的聚焦的图像。在一些方面，设计包括具有2个入口的流体动力聚焦，其中仅使用一个侧流通道，并且将细胞聚焦在通道壁附近。在一些方面，流体动力聚焦包括不包含任何细胞的侧流和包含细胞的中间入口。侧通道上的流速与主通道上的流速的比率决定了细胞聚焦区域的宽度。在一些方面，设计是上述的组合。在所有方面，设计可以与本文公开的分叉和分拣机制集成。在一些方面，基于流体动力的z聚焦系统与基于惯性的z聚焦结合使用。
图6B示出了用于流体动力聚焦的单侧流系统的实施例。顶部入口可以引导具有一种或多种颗粒的溶液流过主通道(从左至右横穿示意图)，侧面入口(顶部入口下方)可以将侧流引导到主通道，从而将一种或多种颗粒聚焦在主通道的壁附近。图6C和图6D示出了用于流体动力聚焦的双侧流系统的实施例。主入口(具有五角形形状的大入口)可以引导具有一种或多种颗粒的溶液流过主通道(从左向右横穿示意图)，两个侧通道可以各自将侧流引导至主通道，从而将一种或多种颗粒聚焦到主通道的中心。在一些情况下，两个侧通道可以与两个单独的侧入口流体连通，如图6C所示。在一些情况下，两个侧通道可以与单个共享入口流体连通，如图6D所示。
在一些实施方案中，术语“颗粒”、“物体”和“细胞”可以互换使用。在一些方面，细胞是活细胞。在一些方面，细胞是固定细胞(例如，在甲醇或多聚甲醛中)。在一些情况下，在流过流动池时，一种或多种细胞可以偶联(例如，共价或非共价附着)到底物(例如，聚合物珠子或磁性珠子)上。在一些情况下，在流过流动池时，一种或多种细胞可以不偶联到任何底物上。
控制颗粒到达时间的方法
在各种实施方案中，本公开的系统和方法通过确保系统中的细胞在作出决定并且完成阀致动时准确到达分叉点来分拣细胞。在一些方面，通过控制微流体通道的长度来确保物体在作出决定且完成阀致动时(或在此之前)准确到达分叉点。在一些实施方案中，该通道是长通道，并且基于以下因素确定通道的长度：包括但不限于(i)作出决定的估计时间、(ii)切换机构(诸如阀)的时延和开窗口以及(iii)颗粒的速度(图2)。
在一些实施方案中，通过控制细胞的速度来确保物体在作出决定且完成阀致动时(或在此之前)准确到达分叉点。控制细胞的速度可以包括增加细胞的速度、降低细胞的速度、增加细胞的加速度和/或降低细胞的加速度。在一些实施例中，这是通过使微流体通道分支来实现。在这些实施例中，一个或多个分支用于将流体引导到多个通道中的一个或多个中，从而改变(例如，降低)任何一个通道中的流体和颗粒的速度，同时保持颗粒在焦点上。在一些方面，修改(例如，降低)速度的因子取决于以下参数：包括但不限于通道数目、通道的相对宽度和/或通道的相对高度。其中颗粒聚焦到中心的3-分支设计的示例性快照在(图3)中示出。在一些实施方案中，微流体通道分为2、3、4、5、6、7、8、9或10个分支。
在一些实施方案中，通过通道的宽度和/或高度的逐渐变化(例如，增加或减少)来实现完成确保颗粒在作出决定且完成阀致动时准确到达分叉点。在一些实例中，可以通过将颗粒引导到更宽和/或更高的通道中来以受控的方式降低颗粒的速度。在一些实例中，可以通过将颗粒引导到更宽和/或更高的通道中来以受控的方式增加颗粒的速度。在一些实施方案中，扩展的角度和/或长度被设计为避免颗粒改变轨迹。这样可以防止颗粒离焦。
在一些实施方案中，通过微流体通道内的设计来确保颗粒在作出决定且完成阀致动时(或在此之前)准确到达分叉点。这样的设计包括但不限于弯曲和/或螺旋设计，其可以在颗粒到达分叉点之前延迟颗粒，同时保持它们的横向位置以及它们相对于彼此的相对纵向位置恒定且受控。
在一些实施方案中，可以通过使用一个或多个流动单元(例如注射泵，如本公开中所提供的)来控制颗粒在微流体通道中行进(例如，流动)时的颗粒速度。
在一些实施方案中，在流动池的操作期间，通道的长度可以是固定的(或恒定的)。或者，可以改变通道的至少一部分的长度(例如，通过拉伸、缩短或弯曲通道的至少一部分)，从而改变细胞到达分叉点的时间。通道的至少一部分的一端或两端和/或一侧或多侧可以可操作地耦合到一个或多个致动器，以改变通道的至少一部分的长度。通道的这样的修改部分可以设置在流动池的成像区域之前或之后。
在一些方面，本文公开的方法和系统确保了颗粒在作出决定且完成阀致动时(或在此之前)准确到达分叉点，以及确保了颗粒到达时的横向位置是受控的。
在一些方面，本文公开的方法和系统可以包括：确定颗粒(例如细胞)在分叉点的预测到达时间晚于(i)作出细胞分类的决定时以及(ii)完成阀致动之后的预定持续时间。在这样的情况下，可以增加细胞的沿微流体通道并朝着分叉点的迁移速度，以在不会负面影响分类和分拣结果的效率和/或准确度的情况下，提高分类和分拣的效率(例如，减少时间)。在一些情况下，预定持续时间可以是至少0.00001秒、0.00005秒、0.0001秒、0.0005秒、0.001秒、0.005秒、0.01秒、0.05秒、0.1秒、0.5秒、1秒、5秒、10秒或更多。在一些情况下，预定持续时间可以是至多10秒、5秒、1秒、0.5秒、0.1秒、0.05秒、0.01秒、0.005秒、0.001秒、0.0005秒、0.0001秒、0.00005秒、0.00001秒或更少。
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统可以包括确定流动通道的多个位置处颗粒的预测到达时间。在一些实施方案中，本文公开的方法和系统可以包括确定分叉点多个颗粒的预测到达时间。在一些实施方案中，本文公开的方法和系统可以包括确定多个分叉点多个颗粒的预测到达时间。
在一些实施方案中，预测分叉点颗粒的到达时间可以包括确定(例如，计算)颗粒在预测到达时间到达分叉点的概率(即，可能性)。预测到达时间可以具有至少0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95或更大(例如1.0)的概率(从0到1.0的标度)。预测到达时间可以具有至多1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5或更小的概率(从1.0到0的标度)。在一些实施方案中，可以实时地更新用于预测到达时间的一种或多种算法(例如，通过将其与所测量的实际到达时间比较)，从而以较高的概率生成预测到达时间。
成像和分类
可以利用各种技术来对根据本公开的各种实施方案的分类和/或分拣系统捕获的细胞的图像进行分类。在一些实施方案中，保存图像捕获以用于手动或通过图像分析软件的未来分析/分类。任何合适的图像分析软件都可以用于图像分析。在一些实施方案中，使用OpenCV进行图像分析。在一些实施方案中，分析和分类是实时进行的。在一些实施方案中，以在10-10,000,000帧/秒之间的帧速率捕获图像：例如在10帧/sec至约100帧/sec、约10帧/sec至约1,000帧/sec、约10帧/sec至约10,000帧/sec、约10帧/sec至约100,000帧/sec、约10帧/sec至约1,000,000帧/sec、约10帧/sec至约10,000,000帧/sec、约100帧/sec至约1,000帧/sec、约100帧/sec至约10,000帧/sec、约100帧/sec至约100,000帧/sec、约100帧/sec至约1,000,000帧/sec、约100帧/sec至约10,000,000帧/sec、约1,000帧/sec至约10,000帧/sec、约1,000帧/sec至约100,000帧/sec、约1,000帧/sec至约1,000,000帧/sec、约1,000帧/sec至约10,000,000帧/sec、约10,000帧/sec至约100,000帧/sec、约10,000帧/sec至约1,000,000帧/sec、约10,000帧/sec至约10,000,000帧/sec、约100,000帧/sec至约1,000,000帧/sec、约100,000帧/sec至约10,000,000帧/sec、或约1,000,000帧/sec至约10,000,000帧/sec，并且实时地进行分类。在一些实施方案中，以100,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像，并且实时地进行分类。在一些方面，以200,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像，并且实时地进行分类。在一些方面，以300,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像，并且实时地进行分类。在一些方面，以300,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像，并且实时地进行分类。在一些方面，以400,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像，并且实时地进行分类。
在一些实施方案中，放置在本文公开的系统中的物体以非常高的速度流过系统的通道，以便维持高通量和高效的惯性聚焦。在一些方面，本公开的系统包括具有微秒曝光时间的超高速照相机以减少输出图像中的模糊。在一些方面，高速照相机以200,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像。在一些方面，高速照相机以300,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像。在一些方面，高速照相机以300,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像。在一些方面，高速照相机以400,000至500,000帧/秒之间的帧速率捕获图像。在一些方面，系统包括高速频闪灯。在一些方面，系统包括具有较慢照相机的高速频闪灯，其中同一物体的多个快照可以被成像到一个图像帧(例如，单个图像帧)上，其随后可以利用本文公开的特征提取和分类算法来分离。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法包括收集流体中的物体的多个图像。在一些方面，多个图像包括细胞的至少20个图像。在一些方面，多个图像包括细胞的至少19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个细胞图像。在一些实施方案中，多个图像包括来自多个细胞角度的图像。在一些方面，包括来自多个细胞角度的图像的多个图像帮助获得来自颗粒的额外特征，如果从单个视点对颗粒成像，这些额外特征通常会被隐藏。在一些方面，不希望受到理论的束缚，包括来自多个像细胞角度的图像的多个图像有助于获得来自颗粒的额外特征，如果将多个图像组合成多维重构(例如二维全息图或三维重构)，这些额外特征通常会被隐藏。在一些实例中，微流体系统可以被配置为使得当颗粒(例如，细胞)移动通过微流体通道时，诱导颗粒旋转(图4)。在图4中示出了旋转细胞的多个图像1、2、3和4的实施例。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法具有跟踪能力，其中系统和方法跟踪照相机下的颗粒(例如，细胞)并保持对哪些帧属于同一颗粒的了解。在一些实施方案中，跟踪颗粒直到它已被分类和/或分拣为止。在一些情况下，可以通过颗粒的一种或多种形态(例如形状、大小、面积、体积、纹理、厚度、圆度等)和/或光学(例如光发射、透射率、反射率、吸光度、荧光、发光等)特性追踪颗粒。在一些实施例中，可以基于一种或多种形态和/或光学特性为每个颗粒分配评分(例如，特性评分)，从而在颗粒行进通过微流体通道时跟踪和确认颗粒。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法包括在照相机的特定视场中对单个颗粒成像。在一些方面，本公开的系统和方法在照相机的同一视场中对多个颗粒成像。在照相机的同一视场中对多个颗粒进行成像可以提供额外的优势，例如，其将通过批量处理多个颗粒的数据收集和传输来增加系统的通量。在一些情况下，在照相机的同一视场中对至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个颗粒成像。在一些情况下，在照相机的同一视场中对100至200个颗粒成像。在一些情况下，在照相机的同一视场中对至多约100、90、80、70、60、50、40、9、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3或2个颗粒成像。在一些情况下，在流动池的整个操作期间中，在同一视场中成像的颗粒(例如细胞)的数目可能不会改变。替代地，在流动池的整个操作期间中，在同一视场中成像的颗粒(例如，细胞)的数目可以实时改变，例如，以在不会负面影响分类和分拣过程的质量和准确度的情况下，提高分类和/或分拣过程的速度。
成像区域可以在聚焦区域和排序区域的下游。因此，成像区域可能不是聚焦区域和排序区域的一部分。在实施例中，聚焦区域可以不包括任何成像装置或不被可操作地耦合到任何成像装置，该成像装置被配置为捕获用于颗粒分析(例如，细胞分类)的一个或多个图像。
特征提取与分类
在一些实施方案中，图像的分析和/或颗粒的分类是人工进行的，例如由人来进行。在一些实施方案中，分类是由一个或多个分类器来进行的。在一些实施方案中，分类器是自动分类器。在一些实施方案中，训练分类器以基于细胞特征和/或模式识别来进行结果确定。细胞特征和/或细胞模式包括但不限于细胞形状、细胞直径、核形状、核直径、核纹理、核边缘、核面积、核平均强度、核与细胞质比率、细胞纹理、细胞边缘、细胞面积、细胞平均强度、细胞的DNA含量(pgDNA)等的识别。
在一些实施方案中，使用适应性标记方法来训练在本公开的系统和方法中使用的一个或多个分类器。在这种训练方法中，首先用第一组已知细胞来训练分类器。然后使分类器对第二组细胞中的细胞进行分类，使得分类器以分类概率对第二组细胞中的每个细胞进行分类，其中分类概率表示分类器对特定细胞分类的确定性。在对第二组细胞分类之后，选择以低于预定阈值的分类概率分类的细胞。这些选择的细胞将表示分类器对类别“不确定”的情况。在一些情况下，这种不确定性可能是由于第一组已知细胞中该特定类型的细胞的稀疏性造成的。一旦已选择分类为低于预定阈值的细胞，在下一轮中训练分类器以对这些选择的细胞进行分类。在一些实施方案中，例如，可以重复这些步骤直到大多数细胞，例如大于50％的细胞、大于55％的细胞、大于60％的细胞、大于65％的细胞、大于70％的细胞、大于75％的细胞、大于80％的细胞、大于85％的细胞、大于90％的细胞、大于91％的细胞、大于91％的细胞、大于92％的细胞、大于93％的细胞、大于94％的细胞、大于95％的细胞、大于96％的细胞、大于97％的细胞、大于98％的细胞、大于99％的细胞、或100％的细胞以等于或大于预定阈值的分类概率被分类。该技术在图7中概述。
在一些情况下，在第一训练期间，本公开的分类器可以提供有第一组已知细胞的一个或多个初始区别特性(例如，形态特征)。分类器可以在第一训练之后发现第一组已知细胞的一个或多个额外特性。在实际细胞分类期间，额外特性可以(i)结合或(ii)代替初始区别特性中的一些来使用。在一些情况下，在第一训练期间，可以不向分类器提供第一组已知细胞的任何初始区别特性。可以允许分类器在第一训练期间发现第一组已知细胞的一个或多个特性，并且可以在实际细胞分类期间使用这些特性。利用这样的分类器的深度学习算法可以在多轮细胞分类和分拣期间连续地更新和修正分类器(例如，更新和修正靶细胞的区别特性)。
在一些实例中，预定阈值是大于0.50的分类概率。在一些实例中，预定阈值是大于0.60的分类概率。在一些实例中，预定阈值是大于0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98或大于0.99的分类概率。在一些情况下，阈值概率是1的分类概率。在各种实施方案中，基于验证测试来计算分类概率。验证测试的范围从生物学验证到软件和仿真验证。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法使用专门为细胞图像分类(例如用于单个细胞图像分类)而设计的增强型神经网络。因此，本文提供了修改用于单个细胞图像分类的卷积神经架构的通用框架。在一些方面，通过修改已知的神经网络来设计增强型神经网络，所述已知的神经网络被设计为与普通图像(诸如图像网络)良好地配合。在一些方面，通过修改神经网络(诸如AlexNet、VGGNet、GoogLeNet、ResNet(残差网络)、DenseNet和Inception网络)来设计增强型神经网络。在一些实例中，通过修改ResNet(例如ResNet 18、ResNet 34、ResNet 50、ResNet 101以及ResNet 152)或inception网络来设计增强型神经网络。在一些方面，修改包括一系列网络手术操作，这些手术操作主要用于改进包括推断时间和/或推断准确性。
在一些实施方案中，对已知神经网络的修改包括缩小已知神经网络的一个或多个后级层(late stage layer)。在一些实施例中，缩小一个或多个后级层导致神经网络的改进的推断时间。在一些情况下，由于细胞图像中的视觉特征具有比图像网络集合或类似数据集合中找到的物体更低的复杂度，因此后级层在细胞图像数据中的作用不那么重要。
在一些方面，后期层的缩小可能导致准确度损失。在一些实施方案中，这中损失可以通过向网络的较早部分添加背部隐藏层(back hidden layer)而至少部分地补偿。在一些实例中，缩小后期层并将其添加到神经网络的较早部分，甚至与将它们保留在后期层中相比、提高了分类器的准确度。
在各种实例中，早期层与后期层通过它们与输入层的距离和/或深度来区分。
通过本文公开的方法设计的示例性增强型神经网络在图8中示出。通过修改称为ResNet 50的残差学习网络来设计示例性增强型神经网络。在所例示的修改中，去除了一个512深度的块和两个256深度的块，这两个都是后期残差层，并且将一个块添加到网络中较早出现的128块中。在这种特定的实施例中，后期块的删除改进了推断时间，以及128深度块的添加重新获得甚至提高了推断准确度，这在标准的ResNet 50中初始是可行的。
在一些实施方案中，使用如本文所公开的增强型神经网络改进了推断时间，其中推断时间的增加为使用以下公式的百分比增加：推断时间的百分比增加＝(使用增强型神经网络的推断时间-使用已知神经网络的推断时间)/使用已知神经网络的推断时间X100。在一些实施方案中，与从中得到增强型网络的已知网络的推断时间相比，使用本文公开的增强型神经网络将推断时间改进了至少10％。在一些实施例中，推断时间改进了至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％。在一些实施方案中，增强型神经网络的推断准确度改进至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％。
在一些实施方案中，通过使用属于同一细胞的多个图像来辅助和增强分类器的准确度来改进本文公开的系统和/或方法的准确度。图9示出了这种实施方案。在一些实施方案中，多个图像包括从多个细胞角度获得的图像。在一些实施方案中，当细胞在微流体通道中旋转时，捕获来自多个细胞角度的图像。在一些实施方案中，当颗粒穿过微流体通道时，通过移动一个或多个成像装置来捕获来自多个细胞角度的图像。在一些实施方案中，来自多个细胞角度的图像是由多个成像装置捕获的，该多个成像装置通过被定位以从特定的颗粒角度捕获颗粒图像。在一些实施方案中，来自多个细胞角度的图像是由单个成像装置(例如，单个高速照相机)捕获的，以从多个颗粒角度捕获颗粒图像。
在一些实施方案中，通过使用用于分类的集合方法(ensemble method)来进一步提高了本文公开的系统和方法的准确度。本文公开的集合方法使用分类器组，其已基于不同的神经网络，不同的初始条件等进行训练。然后，允许分类器组对颗粒分类且将来自分类器组中的每个分类器的结果进行聚合以确定颗粒的最终分类。在一些实施方案中，使用至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个分类器。在一些情况下，具有集合方法的深度学习算法可以用于多角度的细胞分类。细胞可以通过流动通道运输。可以从多个不同角度捕获细胞的多个图像(例如，由于细胞的旋转、成像装置的旋转运动或使用多个成像装置)。随后，可以使用深度学习算法来分析多个图像中的每个图像，以对多个不同角度中的每个角度处的多个不同图像中的每个图像的细胞进行分类。如图9所示，该分析可以确定细胞被分类为特定的靶细胞的概率(例如，在角度1处，细胞可以是概率为0.8的细胞类型A，而细胞可以是概率为0.1的细胞类型B)。之后，可以组合(例如，使用聚合器函数)来自分析的多个这样的细胞分类以确定细胞的最终分类。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法通过在单个训练或推断过程中从多个细胞角度获得的图像连结到分类器来利用所获取的数据的多视图性质(multi-viewnature)。在一些方面，连结类似于传统神经网络中进行的连结，以连结红绿蓝(RGB)色彩。在一些方面，本公开将连结属于同一细胞或颗粒的单独的图像，其中，由于每个细胞仅进行一个推断操作，因此训练和分类过程两者都得到了加速。图10示出了这种实施方案。
在一些情况下，可以分析来自多个角度的细胞的多个图像(例如，馈送至一个或多个深度学习分类器)以确定在多个图像中的每一个的细胞的聚焦程度。在一些情况下，可以确定细胞聚焦在图像上的概率。分类器(例如，可操作地耦合到流动池的神经网络)可以确定细胞在多个图像中的每个图像中是对焦(in focus)还是离焦(out of focus)(即“模糊”)。分类器可以提供有一个或多个参数(例如，傅立叶变换算法、强度比较算法等)，这些参数可以用于确定每个图片中细胞的聚焦程度。替代地，分类器可以不提供有这样的工具，并且分类器可以学习和发现(“学习”)其自身的参数、定义或特性以确定每个图像中的细胞的聚焦程度。当确定多个图像中的一些(或大多数)为离焦时，深度学习算法可以更新细胞的一种或多种流动机制(例如，本文提供的基于惯性的z聚焦)以调整微流体通道内的细胞流线的位置并改善聚焦。在一些实施方案中，不同的深度学习神经网络可以用于细胞分类和多个图像的聚焦分析。在一些实施方案中，相同的深度学习神经网络可以用于细胞分类和多个图像的聚焦分析两者。
在一些情况下，可以基于细胞的聚焦程度来修改(例如，实时地)一个或多个成像装置的一个或多个参数(例如，景深、快门速度等)以改进聚焦。在一些情况下，可以基于细胞的聚焦程度来修改(例如，实时地)流动池的一个或多个其他参数(例如，流速、共流、细胞旋转、流体中的细胞密度等)以改进聚焦。
分拣
在一些实施方案中，本公开的系统和方法主动地分拣颗粒流。如本文所用的，术语分拣(sort)或(sorting)是指物理地分离具有一个或多个所需特性的颗粒，例如细胞。一个或多个所需特性可以包括从细胞的图像分析的和/或获得的细胞特性。一个或多个细胞特性的实施例可以包括大小、形状、体积、电磁辐射吸收率和/或透射率(例如，荧光强度、发光强度等)或生存力(例如，当使用活细胞时)。
流动通道可以分支成多个通道，并且细胞分拣系统可以被配置为通过基于分析的细胞图像将细胞引导至多个通道中的选择的通道来分拣细胞。所分析的图像可以指示细胞的一个或多个特性，其中一个或多个特性用作细胞分拣的参数。在一些情况下，多个通道中的一个或多个通道可以具有多个子通道，并且多个子通道可以用于对已被分过一次的细胞进行进一步分拣。
细胞分拣可以包括从细胞群中分离一个或多个靶细胞。靶细胞可以分离到单独的容器中，其使靶细胞与群体中的其他细胞保持分离。细胞分拣准确度可以定义为已被鉴定并分拣到单独的容器中的细胞群中靶细胞的比例(例如百分比)。在一些情况下，本文提供的流动池的细胞分拣准确度可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高(例如，99.9％或100％)。在一些情况下，本文提供的流动池的细胞分拣准确度可以为至少100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％或更低。
在一些情况下，可以以至少1个细胞/秒、5个细胞/秒、10个细胞/秒、50个细胞/秒、100个细胞/秒、500个细胞/秒、1,000个细胞/秒、5,000个细胞/秒、10,000个细胞/秒、50,000个细胞/秒或更大的速率分拣细胞。在一些情况下，可以以至多50,000个细胞/秒、10,000个细胞/秒、5,000个细胞/秒、1,000个细胞/秒、500个细胞/秒、100个细胞/秒、50个细胞/秒、10个细胞/秒、5个细胞/秒、1个细胞/秒或更小的速率分拣细胞分拣。
在一些方面，本文公开的系统和方法使用主动分拣机制。在各种实施方案中，主动分拣独立于分析和判定平台和方法。在各种实施方案中，分拣是由分拣器进行的，其接收判定单元(例如，分类器)或任何其他外部单元的信号，然后在细胞到达分叉点时对其进行分拣。如本文所用的，术语“分叉点”是指流动通道分成两个或多个通道的端，使得具有一个或多个所需特性的细胞被分拣或引导到两个或多个通道之一，而不具有一个或多个所需特性的细胞被引导到其余通道。在一些实施方案中，流动通道终止于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个通道。在一些实施方案中，流动通道终止于至多10、9、8、7、6、5、4、3或2个通道。在一些实施方案中，流动通道终止于两个通道，并且具有一个或多个所需特性的细胞被引导到两个通道之一(正通道)，而不具有一个或多个所需特性的细胞被引导到另一个通道(负通道)。在一些实施方案中，流动通道终止于三个通道，并且具有第一所需特性的细胞被引导到三个通道之一，具有第二所需特性的细胞被引导到三个通道中的另一个，以及不具有第一所需特性和第二所需特性的细胞被引导到三个通道中的其余通道。
在一些实施方案中，分拣是由分拣器进行的。分拣器可以通过预测颗粒到达分叉点的准确时间来工作。为了预测颗粒到达的时间，分拣器可以使用任何可适用的方法。在一些实施例中，分拣器通过使用(i)分叉点上游的颗粒速度(例如，沿着微流体通道的长度的颗粒的下游速度)以及(ii)在速度测量/计算位置与分叉点之间的距离来预测颗粒到达的时间。在一些实施例中，分拣器通过使用恒定的延迟时间作为输入来预测颗粒到达的时间。
在一些情况下，在细胞到达分叉点之前，分拣器可以测量颗粒(例如细胞)的速度至少1、2、3、4、5或更多次。在一些情况下，在细胞到达分叉点之前，分拣器可以测量颗粒的速度至多5、4、3、2或1次。在一些情况下，分拣器可以使用至少1、2、3、4、5个或更多个传感器。在一些情况下，分类器可以使用至多5、4、3、2或1个传感器。传感器的实施例可以是成像装置(例如，照相机，诸如高速照相机)、单点或多点光(例如，激光)检测器等。在一些情况下，分拣器可以使用布置在成像区域138或邻近成像区域布置的任何一个成像装置(例如，高速照相机系统114)。在一些实施例中，当细胞在通道内旋转和迁移时，相同的成像装置可以用于捕获细胞的一个或多个图像，并且可以对一个或多个图像分析以(i)对细胞进行分类以及(ii)测量通道内细胞的旋转和/或横向速度，并预测细胞到达分叉点的时间。在一些实施例中，分拣器可以使用与成像区域138的成像装置不同的传感器。分拣器可以测量(i)成像区域138的上游、(ii)成像区域138处和/或(iii)成像区域138的下游的颗粒的速度。
分拣器可以包括或可操作地耦合到处理器，诸如计算机处理器。这样的处理器可以是可操作地耦合到成像装置114的处理器116或不同的处理器。处理器可以被配置为计算颗粒的速度(颗粒的旋转速度和/或下游速度)以预测颗粒到达分叉点的时间。处理器可以可操作地耦合至分叉点的一个或多个阀。处理器可以被配置为指导阀打开和关闭与分叉点流体连通的任何通道。处理器可以被配置为预测和测量阀的操作(例如，打开或关闭)何时完成。
在一些实施例中，分拣器可以包括自含(self-included)单元(例如，包括诸如成像装置的传感器)，其能够(i)预测物品的到达时间和/或(ii)当颗粒到达分叉点时对其进行检测。为了对颗粒进行分拣，由自含单元检测到的颗粒到达分叉点的顺序可以与从判定单元(例如，分类器)接收到的信号的顺序匹配。在一些方面，受控颗粒用于根据需要对齐和更新顺序。在一些实施例中，判定单元可以分别对第一细胞、第二细胞和第三细胞进行分类，并且分拣器可以确认第一细胞、第二细胞和第三细胞分别按相同的顺序被分拣。如果确认了顺序是，则分类和分拣机制(或深度学习算法)可以保持不变。如果分类和分拣之间的顺序不同，则可以手动或自动更新或优化分类和/或分拣机制(或深度学习算法)。在一些方面，受控颗粒可以是细胞(例如，活细胞或死细胞)。
在一些方面，受控颗粒可以是特定的校准珠子(例如，塑料珠子、金属珠子、磁性珠子等)。在一些实施方案中，所使用的校准珠子是尺寸在约1μM至约50μM之间的聚苯乙烯珠子。在一些实施方案中，所使用的校准珠子是尺寸为至少约1μM的聚苯乙烯珠子。在一些实施方案中，所使用的校准珠子是尺寸为至多约50μM的聚苯乙烯珠子。在一些实施方案中，所使用的校准珠子是尺寸在以下范围内的聚苯乙烯珠子：约1μM至约3μM、约1μM至约5μM、约1μM至约6μM、约1μM至约10μM、约1μM至约15μM、约1μM至约20μM、约1μM至约25μM、约1μM至约30μM、约1μM至约35μM、约1μM至约40μM、约1μM至约50μM、约3μM至约5μM、约3μM至约6μM、约3μM至约10μM、约3μM至约15μM、约3μM至约20μM、约3μM至约25μM、约3μM至约30μM、约3μM至约35μM、约3μM至约40μM、约3μM至约50μM、约5μM至约6μM、约5μM至约10μM、约5μM至约15μM、约5μM至约20μM、约5μM至约25μM、约5μM至约30μM、约5μM至约35μM、约5μM至约40μM、约5μM至约50μM、约6μM至约10μM、约6μM至约15μM、约6μM至约20μM、约6μM至约25μM、约6μM至约30μM、约6μM至约35μM、约6μM至约40μM、约6μM至约50μM、约10μM至约15μM、约10μM至约20μM、约10μM至约25μM、约10μM至约30μM、约10μM至约35μM、约10μM至约40μM、约10μM至约50μM、约15μM至约20μM、约15μM至约25μM、约15μM至约30μM、约15μM至约35μM、约15μM至约40μM、约15μM至约50μM、约20μM至约25μM、约20μM至约30μM、约20μM至约35μM、约20μM至约40μM、约20μM至约50μM、约25μM至约30μM、约25μM至约35μM、约25μM至约40μM、约25μM至约50μM、约30μM至约35μM、约30μM至约40μM、约30μM至约50μM、约35μM至约40μM、约35μM至约50μM或约40μM至约50μM。在一些实施方案中，所使用的校准珠子是尺寸为约1μM、约3μM、约5μM、约6μM、约10μM、约15μM、约20μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM或约50μM的聚苯乙烯珠子。
在一些实施方案中，分拣器(或布置在分叉点或邻近分叉点布置的额外的传感器)可以被配置为验证颗粒(例如，细胞)到达分叉点。在一些实例中，分拣器可以被配置为测量颗粒(例如，细胞)到达分叉点的实际到达时间。分拣器可以分析(例如，比较)预测到达时间、实际到达时间、在速度的任何调整之前通道下游的颗粒的速度、和/或在这种调整之后通道下游的颗粒的速度。基于该分析，分拣器可以修改流动池的任何操作(例如，细胞聚焦、细胞旋转、控制细胞速度、细胞分类算法、阀致动过程等)。分拣器的验证可用于流动池的任何操作的闭环和实时更新。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法中使用的分拣器是自学细胞分拣系统或智能细胞分拣系统。这些分拣系统可以基于分拣的结果不断学习。例如，对细胞样品进行分拣，对分拣后的细胞进行分析，以及将这种分析的结果反馈给分类器。在一些实施例中，可以分析和验证被分类为“阳性”的细胞(即，靶细胞或目标细胞)。在一些实例中，可以分析和验证被分类为“阴性”的细胞(即，非靶细胞或非目标细胞)。在一些实施例中，可以验证阳性和阴性细胞两者。分拣的细胞的这样的验证(例如，基于二次成像和分类)可以用于初生细胞分类算法的闭环和实时更新。
在一些方面，在本文公开的系统和方法中使用的分拣器不依赖于“监督标签”。在一些方面，分拣器可以识别样品中的“外观不同”的亚群，其中系统以无监督学习或半监督学习的方式、通过运行和收集细胞类型特征从而通过对它们成像，来自动识别和聚集不同的细胞类型。在一些方面，系统通过运行样品几秒钟来工作，其中分类器随后“学习”样品的组分，然后开始对那些类别进行实际分拣。在一些方面，系统是分拣器系统，其中通过人工智能(AI)，诸如深度学习来作出分拣判定。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法包括级联分拣系统，其中进行第一步骤批量分拣，其中依次或同时监测样品中的颗粒亚组中的阳性颗粒(例如具有一个或多个所需特性的细胞)，以及如果在颗粒亚组中检测到任何阳性颗粒，则对该颗粒亚组进行进一步分拣。在一些实施方案中，级联分拣包括当多个细胞通过第一流动通道时，捕获多个细胞的亚组的图像；并分析图像的特征。之后，如果检测到特征，则再次对亚组中的一个或多个细胞成像。在一些实施方案中，第一步骤包括一次对10至100个细胞成像，以及如果检测到任何阳性细胞，则将所述10至100个细胞的组送入至分叉点的一侧并再次进行分析。在一些方面，第一步骤包括一次对20至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对30至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对40至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对监测的50至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对50至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对60至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对70至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对80至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤包括一次对90至100个细胞成像。在一些方面，第一步骤之后是根据本文所述的方法对细胞亚组进行下一阶段分拣。在一些实施方案中，下一阶段分拣通过以下进行：根据本文所述的方法，通过将细胞亚组引导至第二流动通道并通过一次单个细胞、对亚组中的细胞进行成像。
在一些实施例中，细胞样品可以被分成多个细胞亚组。每个细胞亚组的大小可以是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞。每个细胞亚组的大小可以是至多100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或更少个细胞。在级联分拣的第一阶段，可以对细胞亚组进行成像和分析以检测靶细胞的存在。如果亚组中的靶细胞的数量(或其在亚组中的比例)高于预定阈值，则可以收集或引导整个细胞亚组以用于级联分拣的第二阶段。预定阈值可以是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个细胞。预定阈值可以是至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个细胞。预定比例可以是亚组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。预定比例可以是亚组的至多10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。在一些实施例中，在作出进入第二阶段的判定之前，可以在第一阶段期间分析整个亚组。在一些实施例中，可以仅分析亚组的一部分，以及当达到预定阈值时，可以将细胞亚组引导到第二阶段。在第二阶段期间，可以将细胞亚组引导回到相同的成像区域，以对细胞亚组中的每一个进行分类和分拣。替代地，可以将细胞亚组引导到不同的成像区域，以对细胞亚组中的每一个进行分类和分拣。在另一种替代方案中，可以收集和储存细胞亚组(例如，在与流动池流体连通的容器中或在单独的容器中)，直到整个细胞样品经历级联分拣的第一阶段。
分拣技术
在一些实施方案中，本文公开的方法和系统可以使用任何分拣技术来分拣颗粒。在图11中示出了用于对细胞进行分拣的示例性设计，其中将所需细胞引导/分拣到阳性收集容器中。收集容器的至少一部分可以或可以不预先填充有流体，例如缓冲液。在一些实施方案中，分拣技术包括在分叉点的一侧关闭通道以在另一侧收集所需细胞。在一些方面，可以通过采用任何已知技术来关闭通道。在一些方面，通过施加压力来进行关闭。在一些情况下，压力是气动致动。在一些方面，压力可以是正压力或负压力。在一些实施方案中，使用正压力。在一些实施例中，通过施加压力并使顶层与底层之间的软膜偏转来关闭分叉点的一侧。在WO2001001025A2中进一步描述了气动致动，其通过引用以整体并入本文。
在一些方面，通过增加另一侧上的流体阻力，将待分拣的颗粒引导到分叉点的一侧。例如，如果分叉点的一侧可以设计成具有比其他侧更长的通道。在这样的实施方案中，即使当两个阀都打开时，细胞通常进入另一个(较短的)通道。在这样的情况下，仅当较短的通道上的阀关闭时，细胞才会进入较长的通道。
在一些实施方案中，通过施加电场来关闭分叉点的一侧上的通道。在一些实施例中，通过使用压电致动器来关闭分叉点的一侧上的通道。例如，可以沿着通道使用压电致动器。当将电压加到压电元件上时，压电元件通过拉长和/或收缩通道横截面而变形。在图12中示出了压电致动器的使用示意图。在一些情况下，可变形材料用于微流体通道，例如使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
在一些方面，通过施加磁场来关闭分叉点的一侧上的通道。在一些实施例中，通过使用磁性激励来关闭分叉点的一侧上的通道。例如，可以沿着通道的一侧使用电磁体(EM)，并且可以在通道的另一侧使用磁体。在一些情况下，当电磁体被激活时，磁体被吸引到电磁体，从而使通道横截面收缩和关闭。在一些情况下，在(图13)中示出的微流体通道中使用可变形的材料，例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
样品和数据收集
在各种实施方案中，本公开的系统和方法包括一个或多个容器，其被设计为在颗粒已被分拣之后收集颗粒。在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为约1个细胞至约1,000,000个细胞。在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为至少约1个细胞。在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为至多约1,000,000个细胞。在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为约1个细胞至约100细胞、约1个细胞至约500细胞、约1个细胞至约1,000细胞、约1个细胞至约5,000细胞、约1个细胞至约10,000细胞、约1个细胞至约50,000细胞、约1个细胞至约100,000细胞、约1个细胞至约500,000细胞、约1个细胞至约1,000,000细胞、约100个细胞至约500细胞、约100个细胞至约1,000细胞、约100个细胞至约5,000细胞、约100个细胞至约10,000细胞、约100个细胞至约50,000细胞、约100个细胞至约100,000细胞、约100个细胞至约500,000细胞、约100个细胞至约1,000,000细胞、约500个细胞至约1,000细胞、约500个细胞至约5,000细胞、约500个细胞至约10,000细胞、约500个细胞至约50,000细胞、约500个细胞至约100,000细胞、约500个细胞至约500,000细胞、约500个细胞至约1,000,000细胞、约1,000个细胞至约5,000细胞、约1,000个细胞至约10,000细胞、约1,000个细胞至约50,000细胞、约1,000个细胞至约100,000细胞、约1,000个细胞至约500,000细胞、约1,000个细胞至约1,000,000细胞、约5,000个细胞至约10,000细胞、约5,000个细胞至约50,000细胞、约5,000个细胞至约100,000细胞、约5,000个细胞至约500,000细胞、约5,000个细胞至约1,000,000细胞、约10,000个细胞至约50,000细胞、约10,000个细胞至约100,000细胞、约10,000个细胞至约500,000细胞、约10,000个细胞至约1,000,000细胞、约50,000个细胞至约100,000细胞、约50,000个细胞至约500,000细胞、约50,000个细胞至约1,000,000细胞、约100,000个细胞至约500,000细胞、约100,000个细胞至约1,000,000个细胞或约500,000个细胞至约1,000,000个细胞。在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为约1个细胞、约100个细胞、约500个细胞、约1,000个细胞、约5,000个细胞、约10,000个细胞、约50,000个细胞、约100,000个细胞、约500,000个细胞或约1,000,000个细胞。
在一些实施方案中，待分拣的细胞数目为100至500个细胞、200至500个细胞、300至500个细胞、350至500个细胞、400至500个细胞或450至500个细胞。在一些实施方案中，容器可以是毫升尺寸的容器。在一些实施例中，一个或多个容器被预先填充有缓冲液，并且分拣的细胞被存储在缓冲液中。使用缓冲液有助于增加细胞的体积，然后其可以容易地进行处理，例如移液。在一些实施例中，缓冲液是磷酸盐缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法包括细胞分拣技术，其中将不包含阴性物体的缓冲溶液的袋送入至阳性输出通道，以便将稀有物体推出收集容器。在一些方面，一旦通道被冲洗干净，额外的缓冲溶液被送入到阳性输出通道以在运行结束时冲掉所有阳性物体。
实时集成
在一些实施方案中，本公开的系统和方法包括技术的组合，其中图形处理单元(GPU)和数字信号处理器(DSP)用于运行人工智能(AI)算法并将分类结果实时用于系统。在一些方面，本公开的系统和方法包括用于实时细胞分拣的混合方法。
验证
在一些实施方案中，本文公开的系统还包括验证单元(validation unit)，其检测颗粒的存在，而不获取详细信息、诸如成像。在一些情况下，验证单元可以用于一个或多个目的。在一些实施例中，验证单元检测接近分叉点的颗粒并能够实现精确分拣。在一些实施例中，在颗粒已被分拣到与分叉流体连通的子通道之一之后、验证单元检测颗粒。在一些实施例中，验证单元用多个激光光斑(例如两个激光光斑)提供定时信息。在一些情况下，验证单元通过参考成像时间来提供定时信息。在一些情况下，验证单元提供精确的时间延迟信息和/或颗粒的流速。
在一些实施方案中，验证单元是激光辅助系统。在一些方面，激光辅助系统测量激光阻挡或散射，并由此可以推断出颗粒的尺寸。在一些方面，激光辅助系统测量激光阻挡散射，并由此可以推断出颗粒的其他物理信息，包括但不限于大小、形状、密度和纹理。在一些方面，激光辅助系统测量激光阻挡或散射，并由此可以推断出物体的瞬态速度。
在一些实施方案中，验证单元(例如激光辅助系统)位于分叉点之后(例如在阳性侧、阴性侧或两侧)。在一些实施例中，验证单元的这种位置提供了关于分拣的准确度和有效性的澄清信息。在一些方面，验证系统可以用于创建闭合反馈回路以调节系统的控制参数。在一些情况下，闭合反馈回路可用于在实验运行过程中提高系统准确度和/或适应缓慢的系统通风(system draft)。
在一些实施方案中，验证单元包括激光辅助系统，其中利用了两个或更多个激光光斑。当两个或更多个激光光斑被紧密放置时，本文公开的不同方法用于产生两个或更多个激光光斑，以及随后分离成两个或更多个独立的信号以用于光电检测。在一些实施方案中，两个或更多个紧密间隔的激光光斑之间的距离在10μm至约1,000μm的范围内，例如，距离在10μm至500μm之间、在50μm至500μm之间、100μm至500μm、150μm至500μm、在200μm至500μm之间、在250μm至500μm之间、在300μm至500μm之间、在350μm至500μm之间、在400μm至500μm之间或在450μm至500μm之间。
在一些实施方案中，两个或更多个紧密间隔的激光光斑来自具有各自倾斜角的不同光具组。在一些方面，两个或更多个紧密间隔的激光穿过相同的聚焦光学器件，但是以稍微不同的角度入射，以及因此以彼此稍微偏移的方式聚焦。在一些方面，两个或更多个紧密间隔的激光光斑具有不同的波长，并且通过分色镜以轻微偏移的方式重新组合，该分色镜在反射其他激光的情况下、使一些激光通过，其中通过适当的布置，这些激光可以与期望的偏移一起出射。在一些方面，两个或更多个激光光斑具有不同的偏振，并且可以通过偏振分束镜与期望的偏移重新组合。在一些方面，两个或更多个紧密间隔的激光通过经由通用分束器以紧密邻近的方式重新组合而产生，如图14A所示。
在一些实施方案中，可以通过利用至少一个光源(例如，至少一个基于二极管的激光)和棱镜(例如，沃拉斯顿(Wollaston)或罗森(Rochon)棱镜)、将光束的两个偏振分成以期望的角度间隔出射的两个光束、以产生两个光斑(例如，两个紧密堆积的激光光斑)。两个光束(例如，两个椭圆形光束)可以聚焦到同一焦平面上，在两个聚焦光斑之间隔开期望的距离。两个光束可以彼此平行。在一些情况下，没有任何光束成形光学器件，聚焦光斑可以是椭圆形形状的，并且沿同一轴线取向。两个聚焦光斑之间的距离可以由棱镜、聚焦透镜和/或其他位于中间的光学器件确定。两个聚焦光斑之间的分离可以通过适当选择棱镜(例如，Wollaston/Rochon棱镜)和/或聚焦透镜的焦距来控制。图14B示出了在同一焦平面上产生两个聚焦和平行光斑(例如，椭圆形光斑)的相对于彼此配置的激光二极管、Wollaston棱镜以及聚焦透镜的实施例配置。
在一些实施方案中，由于可见光光源提供的光的形状(例如，来自非VCSEL(垂直腔面发射激光)激光二极管的光束的椭圆形形状)，一个或多个所得到的聚焦光斑的轮廓可以呈现出相似的形状(例如，椭圆形)。在一些情况下，可以用一个或多个光束成形光学部件，例如，柱面透镜、鲍尔(Powell)透镜、变形透镜(cylindrical lense)等来改变得到的聚焦光斑的形状。可以通过在光路的一个或两个分支中利用棱镜或棱镜对(诸如德芙(Dove)或类似的棱镜)来进一步控制两个聚焦光斑(例如，两个椭圆形的聚焦光斑)之间的角度，从而使光束沿该路径旋转期望的角度。在一个实施例中，通过将Dove棱镜插入两个光束的一个分支中，同时，可选地，将补偿光学器件插入光路的另一分支，可以将两个聚焦光斑之一的长轴旋转(即到达(clocked))为垂直于两个聚焦光斑中的另一个的长轴。这种非平行激光光斑的配置可以用于检测“L”通道汇接点中的细胞。类似地，通过插入适当类型和/或数目的棱镜产生的不同时钟角可以用于检测“Y”或其他通道汇接点配置中的细胞。图14C示出了激光二极管、Wollaston棱镜、沿底部光束路径的旋转棱镜(例如Dove棱镜)、沿顶部光束路径的补偿光学元件以及与顶部和底部光束路径两者光学连通的聚焦透镜以在同一焦平面上产生两个聚焦和平行光斑(例如，椭圆形光斑)的实施例配置。
在一些实施方案中，可以通过颠倒本文所述的产生方法来分离来自两个或更多个紧密间隔的激光的信号。在一些方面，可以使用具有良好对准的光学部件来分离两个或更多个激光的信号。在一些情况下，光学部件是圆形玻璃球。在一些方面，可以通过将信号发送到位置灵敏检测器来分离两个或更多个激光的信号。在一些情况下，位置灵敏检测器是双光电检测器。在一些情况下，位置灵敏检测器是四光电检测器。在一些方面，本公开包括其中利用两个紧密间隔的激光光斑的激光辅助系统。在一些方面，激光光斑包括在它们之间狭缝，其中不同检测区域中的变化用于计算原始的两个激光信号变化。
在一些实施方案中，通过使用反向通道设计来执行本文公开的方法和系统的颗粒分拣的验证，如图15所示。在这些实施方案中，验证包括对流动通道(称为正向通道)和出口进行成像，在流动通道首次对细胞进行成像，在细胞被分拣之后细胞流出该出口。在一些方面，出口被设计为反向通道，其与用于对流动通道中的颗粒进行成像的成像装置在相同的视场中。在一些方面，出口颗粒可以通过它们的位置和/或速度与正向通道颗粒比较来识别。在一些情况下，颗粒的速度在正向通道中为正。在一些情况下，颗粒的速度在反向通道中为负。
额外分析
分拣的颗粒(例如，“阳性”或“阴性”细胞)可以进行额外处理和/或分析步骤。额外处理和/或分析可以包括但不限于细胞培养(例如，增殖、分化等)，细胞透化和固定、通过探针的细胞染色、质谱流式细胞术、多路离子束成像(MIBI)、共聚焦成像、核酸(例如DNA、RNA)或蛋白质提取、聚合酶链反应(PCR)、靶核酸富集、测序、序列映射等。在一些情况下，分拣的颗粒可能会被转移(例如手动)到一个或多个的仪器中，该仪器配置为执行额外处理和/或分析步骤中的任何一个。在一些情况下，流动通道可以与这样的一个或多个仪器流体连通，以自动转移和执行额外处理和/或分析步骤中的任何一个。
用于细胞染色(或标记)的探针的实施例可以包括但不限于荧光探针(例如，用于对诸如胎儿细胞中的X、Y、13、18和21等的染色体进行染色)、显色探针、直接免疫剂(例如标记的一级抗体)、间接免疫剂(例如与次级酶偶联的未标记的一级抗体)、量子点、荧光核酸染色剂(诸如DAPI、溴化乙锭、Sybr绿色、Sybr金色、Sybr蓝色、Ribo绿色、Pico绿色、YoPro-1、YoPro-2 YoPro-3、YOYo、Oligreen吖啶橙、噻唑橙、碘化丙啶或Hoeste)、发射光子的另一种探针或放射性探针。
在一些情况下，用于额外分析的仪器可以包括执行以下的计算机可执行逻辑：核型分析、原位杂交(ISH)(例如，荧光原位杂交(FISH)、显色原位杂交(CISH)、纳米金原位杂交(NISH))、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、聚合酶链反应(PCR)技术、流式细胞术、电子显微术、量子点分析或检测单核苷酸多态性(SNP)或RNA水平。
样品
在一些实施方案中，通过本文公开的系统和方法分析的颗粒(例如细胞)包含在样品中。样品可以是获自受试者的生物样品。在一些实施方案中，生物样品包括来自受试者的活检样品。在一些实施方案中，生物样品包括来自受试者的组织样品。在一些实施方案中，生物样品包括来自受试者的液体活检。在一些实施方案中，生物样品可以是固体生物样品，例如肿瘤样品。在一些实施方案中，来自受试者的样品可以包括至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％来自肿瘤的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，样品可以是液体生物样品。在一些实施方案中，液体生物样品可以是血液样品(例如，全血、血浆或血清)。全血样品可以通过使用Ficoll试剂进行细胞组分(例如血浆、血清)以及细胞组分的分离。在一些实施方案中，液体生物样品可以是尿液样品。在一些实施方案中，液体生物样品可以是外淋巴样品。在一些实施方案中，液体生物样品可以是粪便样品。在一些实施方案中，液体生物样品可以是唾液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是精液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是羊水。在一些实施方案中，液体生物样品可以是脑脊髓液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是胆汁。在一些实施方案中，液体生物样品可以是汗液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是泪液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是痰。在一些实施方案中，液体生物样品可以是滑液。在一些实施方案中，液体生物样品可以是呕吐物。
在一些实施方案中，可以在一段时间内收集样品，并且可以使用本文公开的系统和方法将样品彼此比较或与标准样品进行比较。在一些实施方案中，标准样品是获自不同受试者(例如已知健康的不同受试者或已知不健康的不同受试者)的可比样品。样品可以定期收集，或者可以不定期间歇性地收集。
在一些实施方案中，受试者可以是动物(例如人、大鼠、猪、马、牛、狗、小鼠)。在一些情况下，受试者是人类以及样品是人类样品。样品可以是胎儿人类样品。样品可以来自多细胞组织(例如，器官(例如，脑、肝、肺、肾、前列腺、卵巢、脾、淋巴结、甲状腺、胰腺、心脏、骨骼肌、肠、喉、食道和胃)、胚泡)。样品可以是来自细胞培养物的细胞。在某些样品中，受试者是怀孕的人或疑似怀孕的人。
样品可以包括多个细胞。样品可以包括多个相同类型的细胞。样品可以包括多个不同类型的细胞。样品可以包括在细胞周期和/或分化途径中相同点的多个细胞。样品可以包括在细胞周期和/或分化途径中不同点的多个细胞。
多个样品可以包括一个或多个恶性细胞。一个或多个恶性细胞可以源自肿瘤、肉瘤或白血病。
多个样品可以包括至少一种体液。体液可以包括血液、尿液、淋巴液、唾液。多个样品可以包括至少一种血液样品。
多个样品可以包括来自一个或多个生物组织的至少一个细胞。一个或多个生物组织可以是骨、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾、肾、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼睛或脑。
生物组织可以包括感染组织、患病组织、恶性组织、钙化组织或健康组织。
非侵入性产前检查(NIPT)
用于检测胎儿异常和性别确定的常规产前筛查方法使用通过侵入性技术(诸如羊膜穿刺术和绒毛活检术(CVS))获取的胎儿样品。超声成像还用于检测结构畸形，诸如涉及神经管、心脏、肾、四肢等的那些结构畸形。目前可以使用CVS和/或羊膜穿刺术检测染色体畸变，诸如存在多余的染色体(诸如21三体综合征(唐氏综合征)、克兰费尔特综合征、13三体综合征(帕托综合征)、18三体综合征(爱德华兹综合征))或者缺少染色体(诸如特纳综合症))或者各种易位和缺失。两种技术都需要仔细操作，并且给母亲和妊娠带来一定程度的风险。
对35岁以上的妇女和/或已知携带遗传病(如平衡易位或微缺失)的妇女提供产前诊断。
在妊娠的第9周和第14周之间进行绒毛活检术(CVS)。CVS包括通过子宫颈插入导管或将针插入受试者/患者的腹部。针或导管用于取出少量的胎盘样品，称为绒毛。然后在CVS过程的一到两周内确定胎儿的核型。由于CVS过程具有侵入性，因此与过程相关的流产风险为2％至4％。CVS还与胎儿异常(诸如四肢发育不良)的风险增加相关，这可能是由于吸出的胎盘组织的出血或栓塞引起的。
羊膜穿刺术在妊娠的第16周与第20周之间进行。羊膜穿刺术包括通过将细针穿过患者的腹部插入子宫。该过程带来0.5％至1％的与过程相关的流产风险。用针吸取羊水，并将胎儿成纤维细胞进一步培养1至2周，然后对其进行细胞遗传学和/或荧光原位杂交(FISH)分析。
已开发出最新的技术来预测胎儿异常并预测妊娠中可能的并发症。这些技术使用母体血液或血清样品，并重点使用三种特异性标记物，包括甲胎蛋白(AFP)、绒毛膜促性腺激素(hCG)和雌三醇。这三个标记物用于筛选唐氏综合症和神经管缺陷。母体血清目前用于染色体非整倍性和神经管缺陷的生化筛选。
有核细胞在母体和胎儿之间的传代是经过充分研究的现象。使用母体血液中存在的胎儿细胞进行非侵入性产前诊断可以防止通常与常规侵入性技术相关的风险。胎儿细胞包括来自妊娠前三个月期间母体血液的胎儿滋养层细胞、白细胞和有核红细胞。因此，从母体血液中分离滋养层细胞受到其多核形态和抗体可用性的限制，而白细胞的分离则受到缺乏将母体与胎儿白细胞区分开的独特细胞标志物的限制。此外，由于白细胞可以在母体血液中持续长达27年，因此先前妊娠的母体血液中可能存在残留细胞。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于非侵入性产前测试(NIPT)，其中所述方法用于分析来自怀孕女性的母体血清或血浆样品。在一些方面，系统和方法用于非侵入性产前诊断。在一些方面，本文公开的系统和方法可以用于分析源自母体血液的母体血清或血浆样品。在一些方面，可以使用低至10μL的血清或血浆。在一些方面，较大的样品用于提高准确性，其中所使用的样品的体积取决于所检测的状况或特性。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于非侵入性产前诊断，包括但不限于性别确定、血型和其他基因分型、母亲先兆子痫的检测、与母体血清或血浆中的胎儿DNA本身或胎儿DNA的数量或质量相关的任何母体或胎儿病症或特征的确定以及与胎儿中存在的主要或次要胎儿畸形或遗传病的鉴定。在一些方面，胎儿是人类胎儿。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于分析来自母体血液样品的血清或血浆，其中所述血清或血浆制备是通过标准技术进行的，并且经受核酸提取过程。在一些方面，使用蛋白酶K处理，然后用苯酚/氯仿提取提取血清或血浆。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于对从怀孕女性受试者获取的母体血清或血浆的细胞进行成像。在一些方面，受试者是人。在一些方面，怀孕的女性人受试者超过35岁。在一些方面，已知怀孕的女人受试者患有遗传病。在一些方面，受试者是人。在一些方面，怀孕的女性人受试者超过35岁，并且已知患有遗传病。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于分析来自母体血清或血浆的胎儿细胞。在一些方面，用于使用本文公开的系统和方法进行非侵入性产前检查的细胞是胎儿细胞，诸如胎儿滋养层细胞、白细胞和有核红细胞。在一些方面，胎儿细胞来自妊娠的前三个月期间的母体血液。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于使用包括滋养层细胞的胎儿细胞进行非侵入性产前诊断。在一些方面，用于本公开的滋养层细胞是使用抽吸从宫颈管中抽取(retrieve)的。在一些方面，用于本公开的滋养层细胞是使用细胞刷或棉签从宫颈管中抽取的。在一些方面，用于本公开的滋养层细胞是通过宫颈灌洗术从宫颈管中抽取的。在一些方面，用于本公开的滋养层细胞是通过宫内灌洗术从宫颈管中抽取的。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于分析来自母体血清或血浆的胎儿细胞，其中细胞群是混合的并且包括胎儿细胞和母体细胞。在一些方面，本公开的系统和方法用于鉴定混合细胞群体中的胚胎或胎儿细胞。在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于鉴定混合细胞群中的胚胎或胎儿细胞，其中核大小和形状用于鉴定混合细胞群中的胚胎或胎儿细胞。在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于从细胞群中分拣胎儿细胞。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于测量胎儿有核红细胞(RBC)的计数，其中胎儿有核RBC计数(或比例)增加指示胎儿非整倍性的存在。在一些实例中，对照样品(例如，来自未怀孕个体的已知血液或血浆样品)可以用于比较。在一些情况下，本文公开的系统和方法用于提供胎儿中存在异常状况的可能性(即，概率)。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于对从怀孕女性受试者获取的母体血清或血浆的细胞进行成像。在一些方面，细胞未被标记。在一些方面，细胞是流动的。在一些方面，从不同角度对细胞成像。在一些方面，细胞是活细胞。在一些方面，细胞被容纳在本公开的系统内的流动通道中，其中流动通道具有形成为在单个流线内将多个细胞间隔开的壁。在一些方面，细胞被容纳在本公开的系统内的流动通道中，其中流动通道具有形成为在单个流线内旋转多个细胞的壁。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于对从怀孕女性受试者获取的母体血清或血浆的细胞进行成像。在一些方面，使用本公开的系统和方法收集细胞的多个图像。在一些方面，分析多个图像以确定受试者中是否存在特定疾病病症，其中在成像期间细胞处于流动中，并且其中多个图像包括来自多个角度的细胞图像。在一些方面，受试者是胎儿。在一些方面，受试者是怀孕女性受试者。
精子分析
在一些实施方案中，本文所述的方法和系统中使用的样品是精液样品，并且本公开的系统和方法用于鉴定精子质量和/或性别。在这些实施方案中，本文所述的方法包括根据本文所述的方法对来自受试者的精液样品进行成像，并分析精液样品中的精子中的一个或多个特征。在一些实施方案中，本文所述的系统和方法用于获得精子计数。在一些方面，本文描述的系统和方法用于获得关于精子生存力和/或健康的信息。在一些方面，本文描述的系统和方法用于获得关于精子性别的信息。在一些实施方案中，本文所述的分拣系统和方法用于自动富集具有所需形态特征的精子。在一些实施方案中，根据本文所述的方法和系统获得的富集的精子用于体外受精。在一些方面，特征与健康、活力和/或性别相关。
癌细胞
因为现有诊断程序和过程的灵敏度低，许多癌症在疾病的晚期才被诊断出来。在美国，每年有多于150万人被诊断出患有癌症，其中600,000人死亡(Jemal等人，2010)。当前，第一癌症筛查方法涉及肿瘤的检测。通过自体或临床检查可以发现许多癌症肿瘤，诸如乳腺癌。但是，通常只有在肿瘤体积达到1mL或1cc(当它包含大约109个细胞时)之后才能检测到这些肿瘤。乳房X线照相术的常规筛查更加敏感，并且允许在肿瘤变得明显之前检测肿瘤，但是只有在他们的直径达到一英寸之后才能检测。MRI、正电子发射断层显像(PET)和单光子发射计算机体层摄影(SPECT)可以显示甚至比乳房X线照片所探测的更小的肿瘤。然而，这些成像方法存在明显的缺点。用于磁共振成像(MRI)的造影剂是有毒的，提供SPECT或PET检查的放射性核素是电离辐射的来源。由于其相对较差的分辨率，卵巢癌通常需要使用计算机体层成像(CT)或MRI进行多次跟踪扫描，同时采取一切预防措施以保护可能的妊娠，以揭示正在发展的肿瘤的良好解剖结构(Shin等人，2011)。另外，所有这些诊断技术都需要专用的设施、昂贵的设备、受过良好训练的人员以及财务负担。
通常通过获得疑似组织的样品并在显微镜下检查组织中是否存在恶性细胞来诊断患者的癌症。尽管当疑似组织的解剖位置已知时，此过程相对简单，但是当没有易于识别的肿瘤或癌前病变时，该过程将变得非常具有挑战性。例如，为了从痰液样品中检测出肺癌的存在，就需要样品中存在一种或多种相对稀少的癌细胞。因此，如果样品不能敏锐且准确地反映出肺部状况，则可能无法正确诊断出患有肺癌的患者。
因为焦平面深度、采样角度的限制以及通常导致细胞在图像平面中重叠的细胞制备的问题，利用安装在载玻片上的细胞的常规光学显微术只能近似2D和3D测量。光学显微术的另一个缺点是通过物镜观察的固有局限性，其中只有狭窄的焦平面内的区域才能提供用于分析的准确数据。
流式细胞术方法通常通过使细胞在流体流中依次流动来克服细胞重叠问题。不幸的是，流式细胞术系统不能产生与传统光学显微镜相同质量的细胞图像，并且在任何情况下，图像都不是三维的。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法使得能够获取单个细胞的三维成像数据，其中来自细胞群的每个单个细胞是从多个角度成像的。在一些方面，本公开用于诊断癌症，其中鉴定、跟踪单个癌细胞，并将其分组在一起。在一些方面，细胞是活的。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于受试者的癌症诊断，该方法包括对来自受试者的生物样品中的细胞成像以收集细胞的多个图像并分析该多个图像，以确定受试者中是否存在癌性细胞，其中癌性细胞在成像期间处于流中并旋转，并且其中多个图像包括来自不同旋转角度的图像。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于癌细胞检测，其中癌性细胞来自生物样品，并且当它们通过本公开的系统时被检测和追踪到。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于从获自哺乳动物受试者的生物样品中鉴定癌细胞，其中通过核细节、核轮廓、核仁的存在与不存在、细胞质的质量、细胞质的量、核纵横比、细胞质纵横比或核与细胞质之比来分析细胞群。在一些方面，识别的癌细胞指示哺乳动物样品中存在癌症，包括但不限于淋巴瘤、骨髓瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌或前列腺癌。在一些方面，癌症是转移性癌症。在一些方面，癌症是早期癌症。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于对来自受试者的大量细胞成像并收集细胞的多个图像，以及然后基于对多个图像中的一个或多个的分析来对细胞分类；其中多个图像包括来自多个细胞角度的图像，并且其中跟踪细胞直至已对细胞分类。在一些方面，所追踪的细胞被分类为癌性的。在一些方面，受试者是人类。
在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的细胞是活细胞。在一些方面，将被分类为癌性细胞的细胞进行分离，随后对其进行培养以用于潜在的药物化合物筛选、生物活性分子的测试和/或进一步研究。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于鉴定来自哺乳动物受试者的细胞群中的癌细胞。在一些方面，受试者是人类。在一些方面，本文公开的系统和方法用于确定癌症的进展，其中来自受试者的样品是从两个不同的时间点获得的，并且使用本公开的方法进行比较。在一些方面，本文公开的系统和方法用于确定抗癌治疗的有效性，其中来自受试者的样品是在抗癌治疗之前和之后获得的，并使用本公开的方法比较两个样品。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法包括使用快速训练的神经网络的癌症检测系统，其中神经网络通过分析细胞的原始图像来检测癌性细胞并将来自图像的像素的成像信息提供给神经网络。在一些方面，神经网络使用源自细胞图像的信息，尤其细胞的面积、平均强度、形状、纹理和DNA(pgDNA)来进行对癌细胞的识别和鉴定。在一些方面，神经网络使用源自细胞图像的纹理信息来执行癌细胞的识别，其中包括角二阶矩(angularsecond moment)、对比度、相关系数、平方和、差分矩、逆向差分矩、和平均值、和方差、和熵、项(entry)、差分方差、差熵、信息量度、最大相关系数、变异系数、峰转移概率、对角线方差、对角线阶矩、二阶对角线阶矩、积阶矩、三角形对称性和块(boldness)。
来自人细胞的细菌
在一些实施方案中，本文公开的方法用于细菌检测，其中含有细菌的人细胞来自生物样品，并且当它们通过本公开的系统时被检测和追踪到。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法使得能够获取样品中存在的细菌的三维成像数据，其中每个单个细菌是从多个角度成像的。在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于细菌检测，其中细菌来自生物样品，并且当它们通过本公开的系统时被检测和追踪到。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于检测流体中的细菌，该流体包括血液、血小板和用于输血的其他血液制品以及尿液。在一些方面，本公开提供了用于从流体样品中可能存在的疑似的完整细菌细胞中分离完整的真核细胞的方法。在一些方面，本公开识别某些细菌物种，包括但不限于：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium species)、大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcesens)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法包括使用快速训练的神经网络的细菌检测系统，其中神经网络通过分析细胞的原始图像来检测细菌并将来自图像的像素的成像信息提供给神经网络。在一些方面，神经网络使用源自细菌图像的信息，尤其细胞的面积、平均强度、形状、纹理和DNA(pgDNA)来进行对细菌的识别和鉴定。在一些方面，神经网络使用源自细胞图像的纹理信息对癌细胞进行识别，其中包括角二阶矩、对比度、相关系数、平方和、差分矩、逆向差分矩、和平均值、和方差、和熵、项、差分方差、差熵、信息量度、最大相关系数、变异系数、峰转移概率、对角线方差、对角线阶矩、二阶对角线阶矩、积阶矩、三角形对称性和块。
脓毒症
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于脓毒症的检测和/或鉴定。不希望受到理论的束缚，具有血液细菌感染(诸如脓毒症)的受试者的血浆细胞(例如髓样细胞，诸如白细胞、淋巴细胞等)可以表现出不同的形态特征(例如，几何形状、纹理、形状、纵横比、面积等)。因此，在一些实例中，如本文所提供的分类和分拣过程可以用于诊断脓毒症。
镰状细胞疾病
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于镰状细胞的检测和/或鉴定。在一些方面，本文公开的系统和方法用于对细胞成像并确定该细胞是否为镰状细胞。本公开的方法可以进一步用于收集确定为镰状细胞的细胞。在一些实施方案中，细胞来自受试者的生物样品，并且本文公开的方法用于确定受试者是否患有或易患镰状细胞疾病。在一些实施方案中，镰状细胞疾病是镰状细胞贫血。
生物样品中的晶体
当前用于检测血液和/或尿液中的晶体的诊断方法包括放射学、血清学、超声检查和酶促方法。
尿液晶体可以是几种不同的类型。最常见的晶体是由鸟粪石(磷酸镁铵)、草酸盐、尿酸盐、半胱氨酸或硅酸盐形成的，但也可能由其他物质，诸如胆红素、碳酸钙或磷酸钙组成。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于检测生物样品中的晶体。在一些方面，形成了检测到的晶体。在一些方面，根据本文所述的方法对来自受试者的生物样品进行成像，以确定该生物样品是否包括晶体。在一些方面，生物样品是血液。在一些方面，血液是受试者的静脉血液。在一些方面，生物样品是尿液。在一些方面，受试者是人类、马、兔子、豚鼠或山羊。在一些方面，本公开的方法可以进一步用于从样品中分离和收集晶体。在一些方面，生物样品来自受试者，并且本公开的系统和方法用于确定受试者是否患有或易患疾病或病症。
在一些实施方案中，本文公开的方法用于分析来自生物样品的晶体。在一些方面，本文公开的方法可以用于对晶体进行成像，并且可以对晶体图像进行分析，包括但不限于晶体形状、大小、纹理、形态和颜色。在一些实施方案中，生物样品来自受试者，并且本文公开的方法可用于确定受试者是否患有疾病或病症。在一些实例中，受试者是人类。例如，本公开的方法可以用于分析人类受试者的血液样品中的晶体，并且结果可以用于确定受试者是否患有病理病症，包括但不限于慢性或风湿性白血病。在一些方面，生物样品是尿液样品。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法使得能够获取晶体的三维成像数据，如果在生物样品中发现晶体，其中对各单个晶体从多个角度进行成像。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法包括使用快速训练的神经网络的晶体检测系统，其中神经网络通过分析多个晶体的原始图像来检测晶体并将来自图像的像素的成像信息提供给神经网络。在一些方面，神经网络使用源自晶体图像的信息，尤其面积、平均强度、形状、纹理来进行对多个晶体的识别和鉴定。在一些方面，神经网络使用源自细胞图像的纹理信息对晶体进行识别，其中包括角二阶矩、对比度、相关系数、平方和、差分矩、逆向差分矩、和平均值、和方差、和熵、项、差分方差、差熵、信息量度、最大相关系数、变异系数、峰转移概率、对角线方差、对角线阶矩、二阶对角线阶矩、积阶矩、三角形对称性和块。
液体活检
液体活检包括从患有原发性或复发性疾病的癌症患者中收集血液和/或尿液，以及分析血液和/或尿液中与癌症相关的生物标志物。液体活检是外科手术活检的简单且非侵入性的替代方法，该方法使医生能够发现有关肿瘤的一系列信息。液体活检越来越被认为是监测患者疾病进展、消退、复发和/或对治疗的响应的可行且非侵入性的方法。
在一些实施方案中，本文公开的方法用于液体活检诊断，其中活检是通过本公开的系统的液体生物样品。在一些方面，用于液体活检的液体生物样品少于5mL的液体。在一些方面，用于液体活检的液体生物样品少于4mL的液体。在一些方面，用于液体活检的液体生物样品少于3mL的液体。在一些方面，用于液体活检的液体生物样品少于2mL的液体。在一些方面，用于液体活检的液体生物样品少于1mL的液体。在一些方面，将用于液体活检的液体生物样品离心以获得血浆。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于体液样品评估，其中对样品内的细胞成像和分析，并生成报告，该报告包括样品内的所有组分、样品中异常的存在、以及与来自同一患者的先前成像的或测试的样品或其他健康个体基线的比较。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于诊断免疫疾病，包括但不限于结核病(TB)和获得性免疫缺陷病(AIDS)，其中在本文公开的系统中对白细胞进行成像以检查其释放促炎细胞因子和抗炎细胞因子的能力。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于通过对患者的白细胞进行成像并分析其释放促炎细胞因子和抗炎细胞因子的能力的变化来评估患者对免疫调节疗法的免疫应答。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于通过分离患者的白细胞并分析靶治疗剂对其释放促炎细胞因子和抗炎细胞因子的能力的影响、来鉴定治疗剂的功效和/或指导药剂或其剂量的选择。
在一些实施方案中，本公开的系统和方法用于通过获得细胞的图像并分离具有所需表型的细胞、来分离源自干细胞的组织细胞的纯样品。
测试生物活性分子
在一些实施方案中，本文公开的方法用于测试生物活性分子，例如药物。在一些实施方案中，使用本公开的方法从样品中收集所需细胞，以及然后用生物活性分子处理所需细胞，以便测试生物活性分子对收集的细胞的作用。
在一些实施方案中，本公开的方法和系统用于鉴定治疗剂的功效。在一些方面，使用本文公开的系统鉴定治疗剂的功效是通过治疗之前和之后获得的细胞的图像并分析图像以确定细胞是否对靶治疗剂有相应来进行的。
在一些实施方案中，本文公开的系统和方法用于病变细胞检测，其中病变细胞来自生物样品，并且通过本公开的系统对其进行检测和追踪。在一些方面，将病变细胞分离并分组在一起以进一步研究。
在一些实施方案中，本文公开的方法中使用的细胞是活细胞。在一些方面，分离被分类为病变细胞的细胞，以及随后对其进行培养以用于潜在的药物化合物筛选、生物活性分子的测试和/或进一步研究。
尽管已在某些特定方面描述了本公开，但是对于本领域技术人员而言，许多额外的修改和变化将是显而易见的。因此，应当理解，在不脱离本公开的范围和精神的情况下，可以以不同于具体实施方案的方式来实践本公开。因此，本公开的一些实施方案在所有方面都应当被认为是说明性的而不是限制性的。
旁床治疗(Point-of-care)全血细胞计数(complete blood count,CBC)
CBC可以提供有关血液或血浆中细胞类型和数目的信息。白细胞(WBC)计数可以用作急性感染和/或炎症的生物标志物。虽然升高的WBC可能与感染、炎症、组织损伤、白血病和过敏有关，但低的WBC计数可能与病毒感染、免疫缺陷、急性白血病和骨髓衰竭有关。因此，有效的旁床治疗CBC可以增强(例如，加快)需要这样的信息的任何临床决策过程。因此，机构(例如，医院、药房、任何旁床治疗点等)可以包括本公开的流动池的任何主题实施方案，以分析受试者的血液(或血浆)并获得CBC。此外，本文提供的流动池可以提供CBC以跟踪针对受试者的每次治疗(例如，针对癌症患者的化疗治疗)之前和之后的WBC的数目。因此，在一些情况下，本文提供的流动池可以消除对通常在中央实验室或卫星实验室中进行的基于血液分析的CBC的需求。
计算机系统
本公开提供了被编程用于实现本公开内容的方法的计算机系统。图16示出了被编程或以其他方式配置为捕获和/或分析细胞的一个或多个图像的计算机系统1601。计算机系统1601可以调节本公开的细胞分拣系统的组件(例如，泵、阀和成像装置)的各个方面。计算机系统1601可以是用户的电子设备或相对于该电子设备位于远程位置的计算机系统。该电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1601包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)1605，其可以是单核或多核处理器，或是用于并行处理的多个处理器。计算机系统1601还包括存储器或存储器位置1610(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元1615(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1620(例如，网络适配器)，以及外围设备1625(诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器)。存储器1610、存储单元1615，接口1620和外围设备1625通过诸如主板等的通信总线(实线)与CPU 1605通信。存储单元1615可以是用于储存数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1601可以借助于通信接口1620而可操作地耦合至计算机网络(“网络”)1630。网络1630可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1630是远程通信和/或数据网络。网络1630可以包括一个或多个计算机服务器，所述计算机服务器可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，网络1630可以借助于计算机系统1601实现点对点网络，该点对点网络可以使得耦合至计算机系统1601的设备能够表现为客户端或服务器。
CPU 1605可以执行一系列机器可读指令，该指令可体现在程序或软件中。指令可以存储在诸如存储器1610的存储器位置中。指令可以引入到CPU 1605，其可以随后对CPU1605进行编程或以其他方式配置以实现本公开的方法。由CPU 1605执行的操作示例可以包括提取、解码、执行和回写。
CPU 1605可以是诸如集成电路等的电路的一部分。在该电路中可以包括系统1601的一个或多个其他组件。在一些情况下，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元1615可存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元1615可以储存用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1601可以包括一个或多个附加数据存储单元，该附加数据存储单元在计算机系统1601外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1601通信的远程服务器上。
计算机系统1601可以通过网络1630与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1601可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板式电脑(例如，
Figure BDA0003019666240000701
iPad、
Figure BDA0003019666240000702
GalaxyTab)、电话、智能电话(例如，
Figure BDA0003019666240000703
iPhone、支持Android的设备、
Figure BDA0003019666240000704
)或个人数字助理。用户可以经由网络1630访问计算机系统1601。
如本文所述的方法可通过存储在计算机系统1601的电子存储位置上(例如，存储器1610或电子存储单元1615上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式实施。机器可执行代码或机器可读代码能够以软件的形式提供。在使用中，该代码可以由处理器1605执行。在一些情况下，代码可以从存储单元1615检索并存储在存储器1610上以供处理器1605随时访问。在一些情况下，可以排除电子存储器单元1615，并且将机器可执行指令存储在存储器1610上。
代码可被预编译并且配置为用于与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时期间被编译。代码可以用编程语言来提供，该编程语言可被选择以使该代码能够以预编译或编译后(as-compiled)的方式来执行。
本文提供的系统和方法(如计算机系统1601)的各个方面可以在编程中体现。该技术的各个方面可被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关联数据的形式的“产品”或“制品”，这些代码和/或相关联数据在一种类型的机器可读介质中被承载或体现。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、快闪存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或全部有形存储器或者相关联的模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、硬盘驱动器等，其可以在任何时刻为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络通信。这样的通信例如可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括诸如通过有线和光陆线网络以及通过各种空中链路而跨本地设备之间的物理接口使用的光波、电波和电磁波。携载这样的波的物理元件、诸如有线或无线链路、光学链路等，亦可被认为是承载软件的介质。如本文所使用的，除非限制于非暂时性有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”等的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码等的机器可读介质可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何(一个或多个)计算机等中的任何存储设备，诸如可用于实现附图中所示的数据库的那些介质等。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式、或者诸如射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的声波或光波的形式。因此，计算机可读介质的常见形式例如包括：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带、传送数据或指令的载波、传送载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质形式中的许多可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带至处理器以供执行。
计算机系统1601可以包括电子显示器1635或与电子显示器通信，该电子显示器包括用于提供例如通过细胞分拣系统的通道输送的细胞的一个或多个图像的用户界面(UI)1640。在一些情况下，计算机系统1601可以被配置为提供图像的实时反馈。UI的实施例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开内容的方法和系统可以通过一个或多个算法的方式实现。算法可以在由中央处理器1605执行时通过软件的方式实现。该算法可以是例如能够对细胞进行分拣的深度学习算法。
实施例
以下特定的实施例是说明性而非限制性的。本文所述的实施例提及并提供了在前述部分中所述的各种实施方案的非限制性的支持。
实施例1.非侵入性产前检查
样品制备：将五到十mL的母体外周血收集到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的试管和普通试管(plain tube)中。对于经受羊膜穿刺术的妇女，将在流程前收集母体血液。将在静脉切开术后的1至3个小时之间对母体血液样品进行处理。将血液样品以3000g离心，分别从含EDTA的试管和普通试管中小心取出血浆和血清，并将血浆和血清转移到普通的聚丙烯试管中。在去除血沉棕黄层或血块时，血浆或血清样品必须保持不受干扰。在去除血浆样品之后，保存红细胞团粒和血沉棕黄层以用于在本公开的系统中处理。
样品测试：可以使用本公开的系统和方法对来自怀孕女性受试者的母体血清或血浆的细胞进行成像，其中细胞未标记并且将其置于流中。将细胞从不同角度进行成像。在一些方面，细胞将被容纳在本公开的系统内的流动通道中，其中流动通道具有形成为在单个流线内将多个细胞间隔开的壁。在一些方面，细胞将被容纳在本公开的系统内的流动通道中，其中流动通道具有形成为在单个流线内旋转多个细胞的壁。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方案只是以实施例的方式提供的。本文并不旨在受限于说明书中提供的具体实施例。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但本文的实施方式的描述和图示不应以限制性的意义来解释。本领域技术人员现将在不偏离本发明的情况下想到众多变更、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的具体描绘、配置或相对比例，而是取决于多种条件和变量。应当理解，在本发明的实践中可以采用本文描述的本发明的实施方式的各种替代方案。因此可以设想，本发明还应当覆盖任何这样的替代、修改、改变或等同物。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并因此涵盖这些权利要求范围内的方法和构造及其等同物。

Claims (119)

1.一种分拣细胞的方法，包括：
(a)通过流动通道运输细胞；
(b)当通过所述流动通道运输所述细胞时，从多个不同角度捕获所述细胞的多个图像；以及
(c)使用深度学习算法分析所述多个图像以分拣所述细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括：当通过所述流动通道运输所述细胞时，旋转所述细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括：在所述细胞上施加速度梯度以旋转所述细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞以第一速度在第一缓冲液中流动，并且其中在所述细胞上施加所述速度梯度包括使第二缓冲液以第二速度共流。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞进行旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴不同。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述细胞进行旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴垂直。
7.根据权利要求1所述的方法，还包括：当通过所述流动通道运输所述细胞时，将所述细胞在所述流动通道内的一定高度处聚焦成流线。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述聚焦包括使所述细胞经受惯性升力，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数大于1。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数至少为20。
10.根据权利要求1所述的方法，其中以约10帧/秒至约500,000帧/秒的速率捕获所述多个图像。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个角度围绕所述细胞或在所述细胞的一部分上延伸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中从(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧或(6)所述细胞的右侧捕获所述细胞的所述多个图像。
13.根据权利要求12所述的方法，其中从选自由以下组成的组的至少两侧捕获所述细胞的所述多个图像：(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧和(6)所述细胞的右侧。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括：
通过将所述细胞引导至所述流体通道的下游的多个通道中的一选定通道，基于所分析的多个图像来分拣所述细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在将所述细胞引导至所述选定通道之前，关闭除所述选定通道之外的所述多个通道。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用压力、电场、磁场或其组合关闭除所述选定通道之外的所述多个通道。
17.根据权利要求14所述的方法，还包括使用光对所述细胞的所述分拣进行验证。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述验证包括使用所述光的阻挡或散射来确定与所述细胞相关的信息。
19.根据权利要求18所述的方法，其中与所述细胞相关的所述信息包括所述细胞的大小、形状、密度、纹理或速度。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述验证包括(i)通过将至少两束光导向所述选定通道，在所述选定通道上提供至少两个光斑，以及(ii)确定所述细胞在所述至少两个光斑之间的行进时间，其中所述至少两个光斑的间隔为约10微米至约1,000微米。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述光包括激光。
22.根据权利要求14所述的方法，其中所述分拣包括(i)将第一细胞引导至所述多个通道中的第一通道，以及(ii)将第二细胞引导至所述多个通道中的第二通道，其中所述第一细胞和所述第二细胞具有或疑似具有一个或多个不同特征。
23.根据权利要求1所述的方法，还包括以至少10个细胞/秒的速率分拣多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞。
24.根据权利要求1所述的方法，还包括：
使用分类器来分拣包含所述细胞的多个细胞；以及
将来自所述分拣的数据反馈至所述分类器，以训练所述分类器用于将来的分拣。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述分类器包括神经网络。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述分类器被配置为基于与所述多个细胞的多个所述分析的多个图像相对应的分类概率，来执行所述多个细胞中的每个的分类。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞来自受试者的生物样品，并且其中所述方法还包括基于所述分析的多个图像来确定所述受试者是否存在病症或属性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者的所述生物样品选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、淋巴液、粪便、唾液、精液、羊水、脑脊液、胆汁、汗液、眼泪、痰、滑液、呕吐物、骨、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾脏、肾脏、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼、脑、感染组织、患病组织、恶性组织、钙化组织和健康组织。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述恶性组织包括肿瘤、肉瘤、血癌或其衍生物。
30.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获包括用闪光灯以小于1毫秒的曝光时间照射所述细胞，其中所述闪光灯包括选自由以下组成的组的波长：470纳米(nm)、530nm、625nm和850nm。
31.根据权利要求1所述的方法，还包括(i)使用深度学习算法的集合对所述多个图像中的每个进行分析，以在所述多个不同角度的每个角度处对所述多个不同图像中的每个图像的所述细胞进行分类；以及(ii)从所述分析中聚合所述细胞的多个分类，以确定所述细胞的最终分类。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞来自母体血清。
33.根据权利要求1所述的方法，还包括识别有核红细胞(RBC)，其中所述有核RBC的存在指示胎儿异常状况。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述胎儿异常状况是胎儿非整倍性。
35.根据权利要求1所述的方法，还包括(i)预测所述细胞到达分拣汇接点的到达时间，以及(ii)如果所述细胞的预测到达时间(1)在步骤(c)完成之前或(2)在所述分拣汇接点处的一个或多个阀门的致动完成之前，则调节所述细胞的速度以改变所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。
36.根据权利要求35所述的方法，还包括确定所述细胞在所述预测到达时间到达所述分拣汇接点的概率。
37.根据权利要求35所述的方法，其中调节所述细胞的速度包括降低所述细胞的速度。
38.根据权利要求35所述的方法，其中调节所述细胞的速度以延迟所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。
39.根据权利要求35所述的方法，还包括(iii)检测所述细胞到达所述分拣汇接点的实际到达时间，以及(iv)基于所述预测到达时间与所述实际到达时间的比较，修改一个或多个细胞分析算法和/或所述一个或多个阀门的致动信号。
40.根据权利要求39所述的方法，其中实时地执行(iv)。
41.根据权利要求1所述的方法，还包括(i)提供包含所述细胞的细胞群，(ii)对所述细胞群的亚群进行第一次分析以检测靶细胞，(iii)如果所述亚群中的所述靶细胞的数量高于预定阈值数量，则收集所述亚群，以及(iv)对所述亚群进行第二次分析。
42.根据权利要求41所述的方法，还包括，在(ii)中，捕获所述亚群中的每个细胞的一个或多个图像。
43.根据权利要求42所述的方法，还包括从单个角度捕获每个细胞的单个图像。
44.根据权利要求41所述的方法，其中，在(iii)中，所述预定阈值数量为至少1个靶细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述预定阈值数量为至少2个靶细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述预定阈值数量为至少5个靶细胞。
47.根据权利要求41所述的方法，其中所述亚群包含至少约10个细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述亚群包含至少约50个细胞。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述亚群包含至少约100个细胞。
50.根据权利要求41所述的方法，还包括，在(iv)中，(1)捕获所述亚群中的每个细胞的多个图像，(2)对所述多个图像中的每个图像进行分析，(3)对所述亚群中的每个细胞进行分类，以及(4)对所述亚群中的每个细胞进行分拣。
51.根据权利要求1所述的方法，还包括(i)捕获经分拣的细胞中的至少一个细胞的一个或多个图像，以及(ii)使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。
52.根据权利要求51所述的方法，还包括基于对所述至少一个经分拣的细胞的所述分析来修改一个或多个细胞分析算法。
53.根据权利要求52所述的方法，还包括实时地执行所述修改。
54.一种用于分拣细胞的系统，包括：
流动通道，所述流动通道被配置为通过所述流动通道运输细胞；
成像装置，所述成像装置被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，从多个不同角度捕获所述细胞的多个图像；以及
处理器，所述处理器被配置为使用深度学习算法分析所述多个图像以分拣所述细胞。
55.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统还被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，旋转所述细胞。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述系统还被配置为在所述细胞上施加速度梯度以旋转所述细胞。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述流动通道被配置为通过所述流动通道以第一速度在第一缓冲液中运输所述细胞，并且其中所述系统还被配置为通过所述流体通道使第二缓冲液以第二速度共流，从而在所述细胞上施加所述速度梯度。
58.根据权利要求55所述的系统，其中所述细胞进行旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴不同。
59.根据权利要求58所述的系统，其中所述细胞进行旋转的轴与所述细胞沿所述流动通道进行迁移的附加轴垂直。
60.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统还被配置为当通过所述流动通道运输所述细胞时，将所述细胞在所述流动通道内的一定高度处聚焦成流线。
61.根据权利要求60所述的系统，其中所述系统被配置为使所述细胞经受惯性升力以聚焦所述细胞，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数大于1。
62.根据权利要求61所述的系统，其中所述惯性升力的特征在于雷诺数至少20。
63.根据权利要求54所述的系统，其中所述流动通道的宽度或高度沿所述流动通道的轴是不均匀的。
64.根据权利要求55所述的系统，其中所述流动通道的所述宽度或所述高度沿通过所述流动通道运输所述细胞的方向逐渐增加。
65.根据权利要求54所述的系统，其中所述流动通道包括壁，所述壁形成为将所述细胞聚焦成流线。
66.根据权利要求54所述的系统，其中以约10帧/秒至约500,000帧/秒的速率捕获所述多个图像。
67.根据权利要求54所述的系统，其中所述多个角度围绕所述细胞或在所述细胞的一部分上延伸。
68.根据权利要求54所述的系统，其中从(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧或(6)所述细胞的右侧捕获所述细胞的所述多个图像。
69.根据权利要求68所述的系统，其中从选自由以下组成的组的至少两侧捕获所述细胞的所述多个图像：(1)所述细胞的顶侧、(2)所述细胞的底侧、(3)所述细胞的前侧、(4)所述细胞的后侧、(5)所述细胞的左侧和(6)所述细胞的右侧。
70.根据权利要求54所述的系统，其中所述多个图像中的每个图像包括二维图像或三维图像。
71.根据权利要求54所述的系统，其中所述流动通道被配置为通过所述流动通道运输多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞，并且其中所述成像装置还被配置为当通过所述流动通道运输所述多个细胞时，捕获所述多个细胞的一个或多个图像。
72.根据权利要求71所述的系统，其中所述成像装置被配置为捕获所述多个细胞的单个图像。
73.根据权利要求71所述的系统，其中所述成像装置被配置为单独捕获所述多个细胞中的每个细胞的一个或多个图像。
74.根据权利要求71所述的系统，其中所述成像装置被配置为从相对于所述多个细胞中的每个细胞的多个不同角度捕获所述多个细胞的所述一个或多个图像。
75.根据权利要求54所述的系统，其中所述流动通道在所述流动通道的下游分支成多个通道，并且其中所述系统被配置为通过将所述细胞引导至所述多个通道中的选定通道，基于所分析的多个图像来分拣所述细胞。
76.根据权利要求75所述的系统，其中所述多个通道中的一个或多个通道包含阀门，所述阀门被配置为调节通过所述多个通道中的一个或多个通道的流量。
77.根据权利要求76所述的系统，其中所述阀门是压力阀、电场阀或磁场阀。
78.根据权利要求75所述的系统，其中在将所述细胞引导至所述选定通道之前，关闭除所述选定通道之外的所述多个通道。
79.根据权利要求75所述的系统，还包括验证模块，所述验证模块被配置为在将所述细胞分拣之后、对所述细胞进行检测，并基于所述检测对所述细胞的所述分拣进行验证。
80.根据权利要求79所述的系统，其中所述验证模块被配置为向所述细胞提供光以确定与所述细胞相关的信息，其中所述检测基于所述细胞对所述光的散射的阻挡。
81.根据权利要求80所述的系统，其中与所述细胞相关的所述信息包括所述细胞的大小、形状、密度、纹理或速度。
82.根据权利要求80所述的系统，其中所述验证模块被配置为(i)通过将至少两束光导向所述选定通道，在所述选定通道上提供至少两个光斑，以及(ii)确定所述细胞在所述至少两个光斑之间的行进时间，其中所述至少两个光斑的间隔为约10微米至约1,000微米。
83.根据权利要求80所述的系统，其中所述光包括激光。
84.根据权利要求75所述的系统，其中所述系统被配置为通过以下步骤对所述细胞进行分拣：(i)将第一细胞引导至所述多个通道中的第一通道，以及(ii)将第二细胞引导至所述多个通道中的第二通道，其中所述第一细胞和所述第二细胞具有或疑似具有一个或多个不同特征。
85.根据权利要求54所述的系统，其中所述处理器被配置为以至少10个细胞/秒的速率分拣多个细胞，其中所述多个细胞包含所述细胞。
86.根据权利要求54所述的系统，其中所述处理器被配置为(i)使用分类器来分拣包含所述细胞的多个细胞，以及(ii)将来自所述分拣的数据反馈至所述分类器，以训练所述分类器以用于将来的分拣。
87.根据权利要求86所述的系统，其中所述分类器包括神经网络。
88.根据权利要求86所述的系统，其中所述分类器被配置为基于与所述多个细胞的多个所分析的多个图像相对应的分类概率，来执行所述多个细胞中的每个的分类。
89.根据权利要求54所述的系统，其中所述细胞来自受试者的生物样品，并且其中所述方法还包括基于所述分析的多个图像来确定所述受试者是否存在病症或属性。
90.根据权利要求89所述的系统，其中所述受试者的所述生物样品选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、外淋巴液、粪便、唾液、精液、羊水、脑脊液、胆汁、汗液、眼泪、痰、滑液、呕吐物、骨、心脏、胸腺、动脉、血管、肺、肌肉、胃、肠、肝、胰腺、脾脏、肾脏、胆囊、甲状腺、肾上腺、乳腺、卵巢、前列腺、睾丸、皮肤、脂肪、眼、脑、感染组织、患病组织、恶性组织、钙化组织和健康组织。
91.根据权利要求90所述的系统，其中所述恶性组织包括肿瘤、肉瘤、血癌或其衍生物。
92.根据权利要求54所述的方法，其中所述成像装置被配置为通过用闪光灯以小于1毫秒的曝光时间照射所述细胞来捕获所述多个图像，其中所述闪光灯包括选自由以下组成的组的波长：470纳米(nm)、530nm、625nm和850nm。
93.根据权利要求54所述的系统，其中所述处理器还被配置为(i)使用深度学习算法的集合对所述多个图像中的每个进行分析，以在所述多个不同角度的每个角度处、对所述多个不同图像中的每个图像的所述细胞进行分类；以及(ii)从所述分析中聚合所述细胞的多种分类以确定所述细胞的最终分类。
94.根据权利要求54所述的系统，其中所述细胞来自母体血清。
95.根据权利要求54所述的系统，其中所述处理器被配置为基于所述分析识别有核红细胞(RBC)，其中所述有核RBC的存在指示胎儿异常状况。
96.根据权利要求95所述的系统，其中所述胎儿异常情况是胎儿非整倍性。
97.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统还被配置为(i)预测所述细胞到达分拣汇接点的到达时间，以及(ii)如果所述细胞的预测到达时间(1)在所述分析完成之前或(2)在所述分拣汇接点处的一个或多个阀门的致动完成之前，则调节所述细胞的速度以改变所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。
98.根据权利要求97所述的系统，其中所述系统还被配置为确定所述细胞在所述预测到达时间到达所述分拣汇接点的概率。
99.根据权利要求97所述的系统，其中调节所述细胞的所述速度包括降低所述细胞的速度。
100.根据权利要求97所述的系统，其中调节所述细胞的速度以延迟所述细胞到达所述分拣汇接点的所述到达时间。
101.根据权利要求97所述的系统，其中所述系统还被配置为(iii)检测所述细胞到达所述分拣汇接点的实际到达时间，以及(iv)基于所述预测到达时间与所述实际到达时间的比较，修改一个或多个细胞分析算法和/或所述一个或多个阀门的致动信号。
102.根据权利要求101所述的系统，其中实时地执行(iv)。
103.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统被配置为还包括(i)对细胞群的亚群进行第一次分析以检测靶细胞，(ii)如果所述亚群中的所述靶细胞的数量高于预定阈值数量，则收集所述亚群，以及(iii)对所述亚群进行第二次分析。
104.根据权利要求103所述的系统，其中所述成像装置被配置为捕获所述亚群中的每个细胞的一个或多个图像。
105.根据权利要求104所述的系统，其中所述成像装置被配置为从单个角度捕获每个细胞的单个图像。
106.根据权利要求103所述的系统，其中所述预定阈值数量为至少1个靶细胞。
107.根据权利要求106所述的系统，其中所述预定阈值数量为至少2个靶细胞。
108.根据权利要求107所述的系统，其中所述预定阈值数量为至少5个靶细胞。
109.根据权利要求103所述的系统，其中所述亚群包含至少约10个细胞。
110.根据权利要求109所述的系统，其中所述亚群包含至少约50个细胞。
111.根据权利要求110所述的系统，其中所述亚群包含至少约100个细胞。
112.根据权利要求103所述的系统，其中所述系统被配置为通过以下步骤对所述亚群进行所述再次分析：(1)捕获所述亚群中的每个细胞的多个图像，(2)对所述多个图像中的每个图像进行分析，(3)对所述亚群中的每个细胞进行分类，以及(4)对所述亚群中的每个细胞进行分拣。
113.根据权利要求54所述的系统，其中所述系统还被配置为(i)捕获经分拣的细胞中的至少一个细胞的一个或多个图像，以及(ii)使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。
114.根据权利要求113所述的系统，其中所述成像装置或附加的成像装置被配置为捕获所述经分拣的细胞中的所述至少一个细胞的所述一个或多个图像。
115.根据权利要求113所述的系统，其中所述处理器或附加的处理器被配置为使用深度学习算法对所述一个或多个图像进行分析，以对所述至少一个经分拣的细胞进行分类。
116.根据权利要求113所述的系统，其中所述系统还被配置为基于所述至少一个经分拣的细胞的所述分析来修改一个或多个细胞分析算法。
117.根据权利要求116所述的系统，其中实时地执行所述修改。
118.一种包含机器可执行代码的非暂时性计算机可读介质，当所述机器可执行代码由一个或多个计算机处理器执行时，实现根据权利要求1-53中任一项所述的方法。
119.一种包括一个或多个计算机处理器和耦合到其上的计算机存储器的系统，其中所述计算机存储器包含机器可执行代码，当所述机器可执行代码由所述一个或多个计算机处理器执行时，实现根据权利要求1-53中任一项所述的方法。
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