CN113166797B - 基于核酸酶的rna耗尽 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于耗尽来自核酸样本的不需要RNA种类的方法和材料。具体地，本公开描述了如何去除可能干扰样本中靶RNA分子的分析、操作和研究的不需要rRNA、tRNA、mRNA或其他RNA种类。
Description
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背景技术
核酸样本(如取自人细胞或组织的核酸样本)中的不需要RNA会使该样本的分析，诸如基因表达分析、微阵列分析和样本测序复杂化。由于核糖体RNA(rRNA)约占细胞中RNA的95％，因此它的存在是可干扰和混淆样本中靶核酸或研究人员或诊断人员可能想要进一步了解的那些核酸的结果的RNA种类的一个示例。例如，不需要rRNA种类可使得分析样本中的感兴趣的RNA分子(诸如tRNA或mRNA)变得尤其困难。这个问题，尤其是对于已经被固定(例如被福尔马林固定)然后包埋在蜡中的组织，诸如来自活检的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织来说，普遍存在。如果不将rRNA种类从FFPE组织去除，它们就会干扰组织中靶RNA的测量和表征，从而极难从靶RNA获得可用于医学方面的信息，诸如疾病和癌症鉴定、潜在治疗选择以及疾病或癌症诊断和预后。虽然FFPE组织只是一个示例，但rRNA的问题同样适用于所有类型的样本，诸如血液、细胞和其他类型的含有核酸的样本。
目前可商购获得的用于耗尽来自核酸样本的非期望RNA的方法包括(Epicentre)和 rRNA耗尽试剂盒(NEB)以及如美国专利9,745,570和9,005,891中所述的RNA耗尽方法。然而，这些方法虽然可用于耗尽RNA，但也具有其自身的缺点，这些缺点包括不易使用、样本输入要求高、技术人员操作须及时、成本高和/或耗尽来自样本的非期望RNA的效率低。所需要的是能够更容易地或更经济有效地耗尽来自样本的不需要RNA种类，从而解锁靶RNA中可能已隐藏的信息(诸如罕见的或难以确定的序列变体)的材料和方法。如本公开所述方法简单且可靠，可极大地增加用于测试目的的靶RNA分子的可用性，从而发现这些靶RNA分子持有的关于样本及其来源的生物体的信息。
发明内容
核酸样本(诸如来自真核生物或原核生物的核酸样本)含有多种核酸，其中许多核酸并不是研究人员所关注的。研究人员通常希望研究特定类型的核酸，诸如DNA或RNA。当研究RNA时，感兴趣的样本可包含许多不同类型的RNA种类，这些RNA种类可掩盖并隐藏作为研究焦点的靶RNA。因此，RNA耗尽是指去除来自核酸样本的不需要RNA和/或DNA种类，从而留下富含期望RNA的核酸样本以用于研究。
本公开提供了用于在进一步研究之前耗尽过量的不需要RNA种类的核酸样本的解决方案。例如，靶RNA样本不仅包含待研究的靶RNA，还包含丰富的转录物如rRNA、珠蛋白mRNA、病毒污染物或任何其他不需要核酸，这些核酸可在样本中占主导地位并掩盖感兴趣的目标，从而大大降低研究人员准确分析转录物组的期望部分的能力。
因此，在分析(诸如表达微阵列或测序)之前耗尽来自核酸样本的不需要RNA提高了对期望RNA靶标分析的特异性和准确性。在本公开中，通过降解特异性DNA:RNA杂交体来耗尽脱靶RNA允许在文库制备和分析之前有效去除样本中的不需要RNA种类。一旦样本耗尽了不需要RNA种类，剩余的靶RNA就可转化为cDNA。通过稳健样本获得可操作数据可更好地了解癌症预后和诊断的潜在治疗选项、更好地了解人类的微生物组及其在人和其他真核系统中的重要性、更透彻地了解感兴趣的基因的表达分析等。
在一个实施方案中，本公开描述了用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA分子的方法，所述方法包括：
a)使包含至少一个RNA或DNA靶序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿所述至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少两个DNA探针，从而使所述DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基；以及
b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物。
在一个实施方案中，本公开涉及包含探针组的组合物，所述探针组包含沿核酸样本中的至少一个脱靶RNA分子的全长(例如，沿全长间隔至少5个或至少10个碱基)与不连续序列互补的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，组合物还包含能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA的核糖核酸酶。在另一个实施方案中，本公开涉及包含探针组的组合物，所述探针组包含与至少一个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针，其中每个DNA探针沿所述脱靶RNA分子的长度与所述探针组中的任何其他DNA探针间隔至少5个或至少10个碱基进行杂交。
在一个实施方案中，本公开描述了包含探针组和核糖核酸酶的试剂盒，所述探针组包含至少两个DNA探针，所述至少两个DNA探针沿核酸样本中的至少一个脱靶rRNA分子的全长(例如，沿全长间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基)与不连续序列互补，所述核糖核酸酶能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA。
在一个实施方案中，本公开描述了补充用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA核酸分子的探针组的方法，所述方法包括：a)使包含来自第一种类的至少一个RNA或DNA靶序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿来自第二种类的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少两个DNA探针，从而使所述DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基；b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物；c)从所述降解混合物中分离所降解的rRNA；d)对来自所述样本的剩余RNA进行测序；e)评估剩余RNA序列中是否存在来自第一种类的脱靶RNA分子，从而确定缺口序列区；以及f)用与所述缺口序列区中的一个或多个缺口序列区中的不连续序列互补的附加DNA探针来补充所述探针组。
附图说明
图1示出了用于耗尽来自样本的RNA种类的示例性工作流程。步骤1包括核酸变性，随后加入耗尽DNA探针并将探针与不需要RNA种类杂交，从而产生DNA:RNA杂交体。步骤2包括使用核糖核酸酶(诸如RNA酶H)消化来自DNA:RNA杂交体的RNA。步骤3包括通过加入DNA酶消化来自降解混合物的残余DNA探针。步骤4包括捕获样本中剩余的靶RNA，随后任选地进行附加操作，这些附加操作将最终使得样本中可进行测序，暴露于微阵列表达分析、qPCR或其他分析技术的不需要RNA种类耗尽。
图2A-图2C示出了当将甲酰胺加入到rRNA耗尽工作流程中时来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)样本rRNA耗尽的示例性数据((2A)0％甲酰胺、(2B)25％甲酰胺、(2C)45％甲酰胺)。在每个图中，X轴列出了所检测到的rRNA种类，并且Y轴示出了通过序列读段百分比表示的耗尽百分比。
图3示出了比较不同量的测序样本(100ng、10ng或1ng)的人脑RNA(HBR)和通用人RNA(UHR)的rRNA耗尽样本的示例性下一代测序(NGS)序列数据。
图4示出了使用不同浓度的甲酰胺(0％、25％、45％)加入到rRNA耗尽工作流程中的来自小鼠RNA和大鼠RNA的rRNA耗尽样本的示例性NGS序列数据。
图5示出了使用低样本输入比较和RNA酶H酶去除rRNA耗尽方法从不同微生物种类去除rRNA的示例性数据。对所有样本读段深度进行了归一化。X轴示出了rRNA耗尽方法(RZ＝RiboZero或ED＝RNA酶H酶耗尽方法)，并且Y轴示出了％rRNA读段。
图6示出了与图表右侧的无rRNA耗尽(无)相比，图表左侧的RNA酶H rRNA耗尽(ED)后枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和大肠杆菌(E.coli)在不同读段深度处的示例性转录物检测数据。X轴示出了测序读段(M)，并且Y轴示出了检测到的转录物的数量。
图7A-图7B示出了基因表达成对线性回归数据的示例性图表，其表明了本发明所公开的rRNA耗尽方法的可重复性。图7A示出了两次大肠杆菌(E.coli)重复测定基因表达水平，并且图7B示出了两次枯草芽孢杆菌(B.subtilis)重复测定基因表达水平。两种细菌类型在RNA酶H rRNA耗尽后均表现出基因表达水平重复测定之间的高度相关性。
图8示出了20个菌株(MSA-2002，左侧)和12个菌株(MSA-2006，右侧)混合样本的示例性三次测定的rRNA读段数据。通过RiboZero方法(RZ)或本文所述的RNA酶H(ED)耗尽方法耗尽混合样本三次测定的rRNA。MSA2002样本的RNA输入为10ng，而MSA2006的RNA输入为80ng。X轴示出了rRNA耗尽方法，并且Y轴示出了％rRNA读段。
图9示出了小鼠线粒体12S(mt-Rnr1)和16S(mt-Rnr2)rRNA基因座(图底部)的测序读段覆盖以及333DNA探针组(SEQ ID NO:1-333)对耗尽来自通用小鼠参考RNA(UMR)样本的小鼠16S rRNA的影响。正方形表示与333DNA探针组在50个碱基对长度上90％匹配或在30个碱基对长度上70％匹配的位置。在不存在附加小鼠和大鼠探针的情况下，没有探针覆盖的缺口对应于图顶部所示的两次重复测定(Rep1和Rep2)的残余或未耗尽rRNA的峰。
具体实施方式
由于大量不需要转录物诸如核糖体RNA、珠蛋白mRNA、病毒污染物等可在样本中占主导地位并掩盖感兴趣的RNA序列，因此从RNA创建用于测序的核酸文库通常是困难的。如果不去除不需要转录物，则具有预后、诊断或研究益处的转录物组的分析可能会受到损害。因此，在分析(诸如测序或其他下游应用)之前耗尽来自核酸样本的不需要RNA可增加期望分析的特异性和准确性。
本公开描述了可用于耗尽来自核酸样本的不需要RNA种类的方法和材料，使得重要的RNA可得到研究并且不会丢失在众多非期望RNA转录物中。
与用于RNA耗尽的现有方法相比，本发明所公开的方法可在利用较少量的输入总RNA的同时仍然保持相当的性能度量。因此，当研究者具有其他方法不能适应的少量原料时，其可使用本发明所公开的方法。此外，本发明所公开的方法可使用同时靶向多种不同生物体的不需要RNA种类的一个探针池进行，而不损害耗尽效率。例如，本公开可同时耗尽RNA样本中的不需要真核和原核RNA种类，包括但不限于人、细菌、病毒和/或古生菌来源的不需要RNA。
核酸样本或混合物是指含有RNA或DNA或两者的样本，包括非期望(脱靶或不需要)核酸和期望(靶)核酸两者。样本中的DNA或RNA可以是未修饰的或修饰的，并且包括但不限于单链或双链DNA或RNA或其衍生物(例如，DNA或RNA的一些区域是双链的，而同时DNA或RNA的其他区域是单链的)等。一般来讲，核酸样本包括所有化学、酶促和/或代谢修饰形式的核酸以及所有未修饰形式的核酸或它们的组合。核酸样本可含有需要和不需要核酸，诸如基因组DNA或总细胞RNA或两者的组合。不需要核酸包括来自真核生物的那些不作为研究目标的核酸，以及来自细菌、病毒、古生菌种类等的污染核酸。需要或期望核酸是作为研究基础或焦点的那些核酸，即靶核酸。例如，研究者可期望研究mRNA表达分析，其中rRNA、tRNA和DNA会被认为是不需要核酸，而mRNA则是靶核酸。同样，可期望研究总RNA，而rRNA、mRNA和DNA会被认为是不需要或非期望核酸，而总RNA则是靶核酸。不需要RNA包括但不限于核糖体RNA(rRNA)、线粒体rRNA、核rRNA、mRNA(诸如珠蛋白RNA)或转移RNA(或tRNA)或它们的混合物。在一些实施方案中，脱靶RNA是rRNA。在一些实施方案中，脱靶RNA是珠蛋白mRNA。
例如，核酸样本可含有期望信使RNA(mRNA)或总RNA，同时还包含非期望核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)和可能非期望DNA。用于从总样本如血液、组织、细胞、固定组织等中提取RNA的一般方法是本领域熟知的，如在Current Protocols for Molecular Biology(John Wiley和Sons)和众多分子生物学方法手册中所见。RNA分离可通过可商购获得的纯化试剂盒进行，这些试剂盒例如Qiagen RNeasy迷你柱、MasterPure完全DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre)、Parrafin Block RNA分离试剂盒(Ambion)、RNA-Stat-60(Tel-Test)或氯化铯密度梯度离心。目前的方法不受RNA耗尽之前从样本中分离RNA的方法的限制。
研究者怀疑将靶向细菌rRNA和人rRNA的探针混合到同一池中会导致大量的期望转录物脱靶耗尽(Mauro等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997年，第94卷：第422-427页；Minoone和Pesole，Appl.Bioinformatics2002年，第1卷:第145-154页)。令人惊讶的是，在开发本发明所公开的方法的同时进行的研究证实并非如此，因为DNA探针与不需要RNA转录物杂交的特异性导致样本中的不需要RNA种类被有效地耗尽。还发现，加入去稳定剂(诸如甲酰胺)有助于去除一些不需要RNA，这些不需要RNA在不存在甲酰胺的情况下更难耗尽。虽然没必要了解甲酰胺是如何帮助去除那些RNA的，但研究者认为甲酰胺可起到使不需要RNA中的结构屏障松弛的作用，使得DNA探针可更有效地结合。此外，加入甲酰胺已经表明了可能通过使例如具有非常稳定的二级或三级结构并且通常在其他文库制备方法中表现不佳的mRNA的区域变性/松弛来改善一些非靶向转录物的检测的额外益处。
核酸样本或混合物
本公开不限于核酸样本的来源，例如，该来源可来自真核生物或原核生物，包括但不限于人、非人灵长类动物、哺乳动物、鸟类、爬行动物、植物、细菌、病毒、存在于土壤、水或其他液体和其他环境样本中的核酸。样本可从细胞、组织、器官、环境、裂解物等获得，并且可来自任何状态的样本，诸如新鲜样本、冷冻样本、冻干样本、重构样本或固定样本，该固定样本诸如来自已经福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)或其他细胞学或组织学样本处理的组织或活检标本。
可受益于RNA耗尽方法的核酸样本可来自任何真核或原核种类(诸如人、非人、小鼠、大鼠、细菌等)，并且可在一个样本中包含单个或多个种类。另外，本发明的耗尽方法可用于新鲜样本或保存样本，诸如包括已使用福尔马林处理并包埋在石蜡中的样本(例如，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本)的活检或组织样本。在一些实施方案中，核酸样本来自人或非人来源，该非人来源诸如非人真核生物、细菌、病毒、植物、土壤或它们的混合物。一旦样本耗尽了不需要RNA种类，剩余的期望靶标就可转化成cDNA以进行进一步处理，如本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，核酸样本来自人或非人灵长类动物。在一些实施方案中，核酸样本来自大鼠或小鼠。在一些实施方案中，核酸样本包括非人来源的核酸。在一些实施方案中，非人来源的核酸来自非人真核生物、细菌、病毒、植物、土壤或它们的混合物。
耗尽方法
因此，通过所述方法耗尽了核酸样本中不需要或非期望RNA。通过使部分或完全互补的DNA探针与不需要RNA分子杂交，将不需要RNA转化成DNA:RNA杂交体。用于使核酸探针与核酸杂交的方法在科学中得到很好的确立，并且无论探针是与伙伴序列部分互补还是完全互补，在样本的洗涤和其他操作后DNA探针与不需要RNA种类杂交的事实表明了DNA探针可用于本公开的方法。用于耗尽的不需要RNA组可来自任何真核种类，例如人、小鼠、大鼠等，其中耗尽来自样本的RNA可使下游研究(诸如测序)更顺利(例如，不需要核酸种类产生的结果较少)。如果用于研究的靶标是RNA，则DNA也可被认为是不需要核酸，此时DNA也可通过耗尽去除。
在一个实施方案中，本公开描述了用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA分子的方法，所述方法包括：
a)使包含至少一个RNA或DNA靶序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿所述至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少两个DNA探针，从而使所述DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基；以及
b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物。
在一个实施方案中，在存在DNA探针的情况下使RNA样本变性。示例性工作流程示出于图1。在图1的示例中，将DNA探针加入到变性RNA样本中(在95℃变性2分钟)，然后将反应冷却至37℃15-30分钟使得DNA探针与其相应的靶RNA序列杂交，从而产生DNA:RNA杂交分子。
在一些实施方案中，与探针组接触包括用去稳定剂处理核酸样本。在一些实施方案中，去稳定剂是热或核酸去稳定化学品。在一些实施方案中，核酸去稳定化学品是甜菜碱、DMSO、甲酰胺、甘油或它们的衍生物或它们的混合物。在一些实施方案中，核酸去稳定化学品是甲酰胺或其衍生物，任选地其中该甲酰胺或其衍生物以总杂交反应体积的约10％至45％的浓度存在。在一些实施方案中，用热处理样本包括施加高于至少一个DNA:RNA杂交体的解链温度的热。
在一些实施方案中，不考虑RNA样本来源(例如，人、小鼠、大鼠等)，将甲酰胺加入到杂交反应中。例如，在一些实施方案中，与DNA探针杂交在存在至少3体积％、5体积％、10体积％、20体积％、25体积％、30体积％、35体积％、40体积％或45体积％的甲酰胺的情况下进行。在一个实施方案中，用于RNA耗尽的杂交反应包括约25体积％至45体积％的甲酰胺。
在杂交反应后，将降解来自DNA:RNA杂交体的RNA的核糖核酸酶加入到该反应中。在一些实施方案中，核糖核酸酶是RNA酶H或杂交酶。RNA酶H(NEB)或杂交酶(Lucigen)是会降解来自DNA:RNA杂交体的RNA的酶的示例。通过核糖核酸酶(诸如RNA酶H或杂交酶)的降解将RNA降解成之后可被去除的小分子。例如，据报道，RNA酶H将来自DNA:RNA杂交体的RNA消化成约每7-21个的碱基(Schultz等人，J.Biol.Chem.，2006年，第281卷：第1943-1955页；Champoux和Schultz，FEBS J.，2009年，第276卷：第1506-1516页)。在一些实施方案中，消化DNA:RNA杂交体的RNA可在37℃进行约30分钟，如图1中的步骤2和实施例1中所述。
在一些实施方案中，在DNA:RNA杂交分子消化后，核酸样本中的剩余DNA探针和任何脱靶DNA均被降解。因此，在一些实施方案中，方法包括使核糖核酸酶降解混合物与DNA消化酶接触，从而降解该混合物中的DNA。在一些实施方案中，将消化样本暴露于降解DNA探针的DNA消化酶，诸如DNA酶I。将DNA酶DNA消化反应在例如37℃温育30分钟，之后可使DNA酶在75℃变性一段时间，该段时间为使DNA酶变性必需的时间，例如至多20分钟。
在一些实施方案中，耗尽方法包括将降解RNA与降解混合物分离。在一些实施方案中，分离包括例如使用核酸纯化培养基，诸如RNA捕获珠粒(诸如RNAClean XP珠粒(BeckmanCoulter))来纯化来自降解RNA(和降解DNA，如果存在的话)的靶RNA。因此，在一些实施方案中，在酶消化后，可通过在去除降解产物的同时保留期望的且较长的RNA靶标来富集靶RNA。合适的富集方法包括用结合期望片段大小的富集RNA靶标的磁珠、离心柱等来处理降解混合物。在一些实施方案中，可使用磁珠(诸如AMPure XP珠粒、SPRISelect珠粒、RNAClean XP珠粒(Beckman Coulter))，只要这些珠粒不含RNA酶(例如，质量控制为不含RNA酶)。这些珠粒为核酸结合提供不同的大小选择选项，例如RNAClean XP珠粒靶向100nt或更长的核酸片段，并且SPRISelect珠粒靶向150至800nt的核酸片段而不靶向更短的核酸序列(诸如由RNA酶H和DNA酶消化产生的降解RNA和DNA)。如果mRNA是待研究的靶RNA，则可使用例如包含用于捕获mRNA腺苷酸化尾的寡聚脱氧胸苷酸(oligodT)序列的珠粒通过捕获来进一步富集mRNA。mRNA捕获方法是技术人员熟知的。
一旦靶RNA从包含非期望降解核酸的反应组分中纯化出来，就可进行附加的样本操作。在本公开中，实施例2提供了用于从富集靶总RNA合成cDNA的示例性工作流程，实施例3提供了专门用于在例如Illumina测序仪上进行后续测序的示例性文库制备工作流程。然而，应当理解，这些工作流程仅是示例性的，并且技术人员将会理解，富集RNA可直接用于或者在诸如通过使用确立的和将理解的方案将RNA转化成cDNA的附加操作后用于诸如PCR、qPCR、微阵列分析等的多种附加应用中。
本文所述的用于RNA耗尽的方法将产生富含靶RNA分子的样本。例如，本文所述的方法结果是包含小于15％、13％、11％、9％、7％、5％、3％、2％或1％或其间任意范围的不需要RNA种类的耗尽RNA样本。然后富集RNA样本包含至少99％、98％、97％、95％、93％、91％、89％或87％或其间任意范围的靶总RNA。一旦样本被富集，则可将该样本用于文库制备或其他下游操作。
DNA探针组/DNA探针
DNA探针是指与不需要RNA种类具有序列互补性的单链DNA寡核苷酸。DNA探针序列可与核酸样本中耗尽的非期望的RNA部分或完全互补。用于耗尽的不需要RNA包括但不限于rRNA、tRNA和mRNA以及它们的混合物。在一些实施方案中，每个DNA探针为约10至100个核苷酸长，或约20至80个核苷酸长，或约40至60个核苷酸长，或约50个核苷酸长。DNA探针能够与不需要RNA种类杂交，从而产生DNA:RNA杂交分子。虽然在一些实施方案中，至少两种DNA探针与特定的脱靶RNA分子杂交，但所述DNA探针不涉及不需要RNA分子序列的整个长度。例如，在一些实施方案中，探针组在探针组中没有互补DNA探针的情况下留下不需要RNA的缺口或区域。DNA探针以非重叠方式与不需要RNA完全或部分杂交，在所得DNA:RNA杂交体之间留下至少5个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个或更多个核苷酸的缺口。因此，在一些实施方案中，每个DNA探针沿至少一个脱靶RNA分子的全长与探针组中的任何其他DNA探针间隔至少5个或至少10个碱基进行杂交。因此，不需要RNA整体不与DNA探针完全杂交。此外，本公开提供了与单个RNA杂交以用于耗尽的多个DNA探针，因此并不是“一个DNA探针针对一个RNA”，而是探针组中的多个不连续DNA探针靶向给定的不需要RNA。例如，在一些实施方案中，针对用于耗尽的给定RNA组，使用DNA探针组，其中每个探针为大约20-80个核苷酸长，并且每个探针在与组中另一个DNA探针相距5-15个核苷酸的任意位置与不需要RNA杂交。DNA探针可与待耗尽的RNA上的特定位置完全或部分互补，例如DNA探针序列可与待耗尽的RNA转录物上的靶位置至少80％、85％、90％、95％或100％或其间任意范围互补。对互补性的唯一限制在于DNA探针应以如本文所述的使得DNA:RNA杂交体变为可酶促消化的方式与待耗尽的靶RNA杂交。在一些情况下，mRNA是感兴趣的靶标而不是用于耗尽的靶标，在这种情况下DNA探针不包含polyT序列，使得探针不会与mRNA种类杂交。在一些实施方案中，DNA探针不包含具有允许通过物理手段耗尽杂交体的捕获部分(诸如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或磁珠)的标签，而在其他实施方案中，DNA探针包含具有允许通过物理手段耗尽杂交体的捕获部分(诸如生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或磁珠)的标签。
在一些实施方案中，探针组包含至少与来自人和细菌的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含至少与来自人、细菌和古生菌的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含至少与来自人、细菌、小鼠和大鼠的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含至少与来自人、细菌、小鼠、大鼠和古生菌的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。在一些实施方案中，来自细菌的脱靶RNA分子来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌或它们的混合物。在一些实施方案中，探针组包含与来自古生菌种类的一个或多个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与来自古生菌种类的两个或更多个rRNA序列互补的至少两个DNA探针。
在一些实施方案中，探针组包含与选自28S、23S、18S、5.8S、5S、16S、12S、HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2、HBG1和HBG2的至少一个或至少两个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与选自28S、23S、18S、5.8S、5S、16S、12S、HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2、HBG1和HBG2的两个或更多个rRNA序列互补的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与选自来自人的28S、18S、5.8S、5S、16S和12S的一个或多个、或两个或更多个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与来自大鼠和/或小鼠，任选地选自大鼠16S、大鼠28S、小鼠16S和小鼠28S以及它们的组合的一个或多个、或两个或更多个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与选自来自血红蛋白的HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2、HBG1和HBG2的一个或多个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与选自来自革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌的23S、16S和5S的一个或多个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针。用于耗尽的珠蛋白mRNA可包括但不限于存在于啮齿动物诸如小鼠或大鼠中的珠蛋白mRNA(包括HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2)和存在于人中的珠蛋白mRNA(包括HBA-A1、HBA-A2、HBB、HGB1和HGB2)。适用于耗尽的线粒体rRNA包括18S和12S(人和啮齿动物)。适用于耗尽的核rRNA包括28S、18S、5.8S和5S(人和啮齿动物)以及原核rRNA(包括5S、16S和23S)。在一些样本中，可期望耗尽来自古生菌种类的rRNA，诸如rRNA 23S、16S或5S。在另外的实施方案中，探针组包含与选自革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌rRNA 5S、16S和23S的两个或更多个rRNA序列互补的至少两个DNA探针。在一些实施方案中，探针组包含与人28S、18S、5.8S、5S、16S和12S、珠蛋白mRNA HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2以及革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌rRNA 5S、16S和23S中的每一个RNA互补的至少两个(或至少五个、或至少10个或至少20个)DNA探针。在一些实施方案中，针对特定脱靶RNA分子的探针与脱靶RNA分子序列的约80％至85％互补，其中在每个探针杂交位点之间具有至少5个或至少10个碱基的缺口。
在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-333(人、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或333个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-428(人、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、古生菌、小鼠和大鼠)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或350个或更多个、或400个或更多个、或428个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-377(人、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和古生菌)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或350个或更多个、或377个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-333(人、革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌)和SEQ ID NO:378-428(小鼠和大鼠)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或350个或更多个、或384个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQID NO:334-377(古生菌)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或44个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:378-428(小鼠和大鼠)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或51个序列。
在一些实施方案中，DNA探针是部分或完全互补的，并且包含与人28S、18S、5.8S和/或5S rRNA杂交的序列，例如如表1中SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:150中所示的DNA探针序列。在第二实施方案中，DNA探针包含与线粒体rRNA 16S和/或12S杂交的序列，例如如表1中SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:39中所示的DNA探针序列。在其他实施方案中，DNA探针包含与血红蛋白mRNA(包括HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2、HBG1和/或HBG2)杂交的序列，例如表1中SEQ ID NO:151至SEQ ID NO:194所示的DNA探针序列。在一些实施方案中，DNA探针包含与细菌rRNA(诸如革兰氏阳性细菌rRNA和/或革兰氏阴性细菌rRNA 23S、16S和/或5S)杂交的序列，例如如表1中SEQ ID NO:195至SEQ ID NO:262(革兰氏阴性细菌代表性大肠杆菌(E.coli))和SEQ ID NO:263至SEQ ID NO:333(革兰氏阳性细菌代表性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))所示的DNA探针序列。在其他实施方案中，DNA探针包含与古生菌rRNA(诸如rRNA 23S、16S和/或5S)杂交的序列，例如表1中SEQ ID NO:334至SEQ ID NO:384中所示的与来自古生菌种类史密斯甲烷菌(Methanobrevibacter smithii)的rRNA杂交的DNA探针序列。在一些实施方案中，DNA探针包含与小鼠rRNA(诸如小鼠16S和/或28S)杂交的序列，例如表1中SEQ ID NO:385至SEQ ID NO:393和SEQ ID NO:400至SEQ ID NO:419中所示的DNA探针序列。在一些实施方案中，DNA探针包含与大鼠rRNA(诸如大鼠16S和/或28S)杂交的序列，例如表1中SEQ ID NO:394至SEQ ID NO:399和SEQ ID NO:420至SEQ ID NO:428中所示的DNA探针序列。
表1.用于不需要RNA耗尽的DNA探针序列
在一个实施方案中，RNA样本来自人，并且DNA探针组包含如本公开所述的对人不需要RNA种类(诸如rRNA和线粒体mRNA转录物)具有特异性的探针。在另一个实施方案中，用于耗尽来自人RNA样本的不需要RNA的DNA探针组包含如本公开所述的对人rRNA和线粒体mRNA转录物具有特异性的探针和对革兰氏阳性和革兰氏阴性不需要RNA转录物具有特异性的探针。在另一个实施方案中，用于耗尽来自人RNA样本的不需要RNA的DNA探针组包含如本公开所述的对古生菌种类(其示例是史密斯甲烷菌(M.smithii))具有特异性的探针。因此，在一些实施方案中，用于耗尽来自人RNA样本的rRNA的DNA探针组包含仅针对人不需要RNA种类的探针或包含还靶向非人不需要RNA转录物的混合DNA探针组。技术人员将理解，用于RNA耗尽的探针组将取决于针对样本的研究目的、样本的获取环境以及RNA样本的RNA耗尽实验设计引入的任何其他因素。
在一个实施方案中，RNA样本来自非人真核生物，并且DNA探针组包含对该真核生物来源的样本中的不需要RNA具有特异性的探针。例如，如果RNA样本来自小鼠或大鼠，则DNA探针组将包含对小鼠或大鼠不需要RNA种类具有特异性的探针，其还可包含对不需要革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌RNA种类或其他细菌种类(诸如古生菌种类)具有特异性的DNA探针。
在一些实施方案中，DNA探针不与整个连续长度的待耗尽的RNA种类杂交。令人惊讶的是，在实验期间发现被靶向用于耗尽的RNA种类的全长序列不需要用全长DNA探针或在整个RNA序列上连续平铺的探针组来靶向；实际上，本文所述的DNA探针留下了缺口，使得形成的DNA:RNA杂交体是不连续的。令人惊讶的是，DNA:RNA杂交体之间至少5nt、10nt、15nt或20nt的缺口提供了有效的RNA耗尽。此外，包含缺口的探针组可更有效地与不需要RNA杂交，因为DNA探针不会产生像与覆盖被靶向用于耗尽的整个RNA序列的探针或彼此重叠的探针可能会妨碍相邻探针的杂交那样的情况。
此外，可补充探针组以改善用于给定种类的RNA耗尽方法。补充用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA核酸分子的探针组的方法可包括：a)使包含来自第一种类的至少一个RNA或DNA靶序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿来自第二种类的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少两个DNA探针，从而使所述DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基；b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物；c)从所述样本中分离所降解的RNA；d)对来自所述样本的剩余RNA进行测序；e)评估剩余RNA序列中是否存在来自第一种类的脱靶RNA分子，从而确定缺口序列区；以及f)用与所述缺口序列区中的一个或多个缺口序列区中的不连续序列互补的至少一个DNA探针来补充所述探针组。在一些实施方案中，缺口序列区包含至少50、或至少60或至少70个碱基对。在一些实施方案中，第一种类是非人种类，并且第二种类是人。在一些实施方案中，第一种类是大鼠或小鼠。用于补充探针组以改善小鼠样本中脱靶rRNA核酸分子的耗尽的示例性方法概述于实施例8和图9中。
在一些实施方案中，第一种类是非人种类，并且第二种类是人。在一些实施方案中，第一种类是大鼠或小鼠。在一些实施方案中，第二种类是人、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌或它们的混合物。
组合物和试剂盒
在一个实施方案中，本公开涉及包含如本文所述的探针组的组合物。在一些实施方案中，组合物包含探针组和能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA的核糖核酸酶，诸如RNA酶H或杂交酶。在一些实施方案中，探针组包含与核酸样本中的至少一个脱靶rRNA分子互补的至少两个DNA探针，其中所述探针是不重叠的并且相对于脱靶rRNA分子的长度是不连续的(例如，沿全长间隔至少5个或至少10个碱基)。在一些实施方案中，组合物包含探针组，所述探针组包含与至少一个脱靶RNA分子杂交的至少两个DNA探针，其中每个DNA探针沿所述脱靶RNA分子的长度与所述探针组中的任何其他DNA探针间隔至少5个或至少10个碱基进行杂交。在一些实施方案中，组合物包含核酸去稳定化学品，诸如甲酰胺、甜菜碱、DMSO、甘油或它们的衍生物或混合物。在一个实施方案中，去稳定化学品是甲酰胺或其衍生物，该甲酰胺或其衍生物以杂交总反应体积的10％-45％之间的浓度存在。
在一个实施方案中，本公开描述了包含探针组和核糖核酸酶的试剂盒，所述探针组包含至少两个DNA探针，所述至少两个DNA探针沿核酸样本中的至少一个脱靶rRNA分子的全长(例如，沿全长间隔至少5个碱基或间隔至少10个碱基)与不连续序列互补，所述核糖核酸酶能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA。在一些实施方案中，探针组包含本文所述的DNA探针中的任一种DNA探针或它们的任何组合。
在一些实施方案中，试剂盒包含缓冲液和核酸纯化培养基。在一些实施方案中，试剂盒包含缓冲液、核酸纯化培养基和如本文所述的DNA探针组中的一种或多种。在一些实施方案中，探针组包含SEQ ID NO:1-333的两个或更多个序列。在一些实施方案中，探针组包含SEQ ID NO:1-428的两个或更多个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-377(人、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和古生菌)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或350个或更多个、或377个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:1-333和SEQ ID NO:378-428(人、革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、小鼠和大鼠)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或100个或更多个、或150个或更多个、或200个或更多个、或250个或更多个、或300个或更多个、或350个或更多个、或384个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:334-377(古生菌)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或44个序列。在一些实施方案中，探针组包含来自SEQ ID NO:378-428(小鼠和大鼠)的2个或更多个、或5个或更多个、或10个或更多个、或25个或更多个、或50个或更多个、或51个序列。
在一些实施方案中，试剂盒包含：1)如本文所述的探针组；2)核糖核酸酶；3)DNA酶；和4)RNA纯化珠粒。在一些实施方案中，试剂盒包含RNA耗尽缓冲液、探针耗尽缓冲液和探针去除缓冲液。
耗尽样本的分析
本发明所公开的方法还可用于分析来自单个或混合样本的转录物组。转录物组分析可受到高相对丰度的核糖体RNA的阻碍，例如样本可包含≥85％的细菌细胞总RNA的rRNA分子。在有如此大量的rRNA竞争测序试剂或其他分析试剂的情况下，可能难以集中于转录物组中信息更丰富的部分，这些部分可能会丢失在不需要rRNA分析的背景中。本发明所公开的方法可有助于微生物或真核分离物的富集转录物组分析，例如，在低DNA输入时降低rRNA测序读段，降低测序成本并且能够对低生物质样本进行宏转录物组分析。这项分析例示于实施例4中，其中使用本公开中所述的RNA酶rRNA耗尽方法来评估来自混合样本的低输入量(<80ng)。本文所述的方法可与多种下游应用一起使用，例如使用RT-PCR中的富集样本创建用于核酸测序技术的文库，随后进行微阵列分析、PCR、qPCR等。然而，应当理解，由本文所述的RNA耗尽方法产生的富集RNA样本不限于任何特定的下游应用，诸如测序。
例如，RNA耗尽样本可用于创建测序文库，使得所创建的文库可连接在阵列中的固定位置处，使得它们的相对位置不改变，并且其中对该阵列进行重复成像。在不同颜色通道(例如，与用于将一种核苷酸碱基类型与另一种核苷酸碱基类型区分开的不同标签吻合)中获得图像的实施方案尤其适用。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化过程。优选的实施方案包括边合成边测序(“SBS”)技术。
SBS技术通常包括通过针对模板链反复加入核苷酸进行的新生核酸链的酶促延伸。在传统的SBS方法中，可在每次递送中在存在聚合酶的情况下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。SBS可利用具有终止子部分的核苷酸单体或缺少任何终止子部分的核苷酸单体。利用缺少终止子的核苷酸单体的方法包括例如焦磷酸测序和使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序。在使用缺少终止子的核苷酸单体的方法中，在每个循环中加入的核苷酸的数目通常是可变的，并且该数目取决于模板序列和核苷酸递送的方式。对于利用具有终止子部分的核苷酸单体的SBS技术，终止子在使用的测序条件下可为有效不可逆的，如利用双脱氧核苷酸的传统桑格测序的情况，或者终止子可为可逆的，如由Solexa(现为Illumina,Inc.)开发的测序方法的情况。
可利用RNA耗尽工作流和RNA富集样本的测序方法包括但不限于通过逐步加入含有例如可裂解或可光漂白的染料的可逆终止子核苷酸来完成的循环测序。可利用本文所述方法的Illumina仪器的示例包括HiSeqTM、MiSeqTM、NextSeqTM、NovaSeqTM、NextSeqTM和iSeqTM商用仪器。
其他测序技术包括通过连接进行测序。此类技术利用DNA连接酶掺入寡核苷酸并确定此类寡核苷酸的掺入。
此外，纳米孔测序还可使用本发明所公开的用于文库制备的RNA耗尽样本。纳米孔测序方法对穿过孔的核酸链进行测序，其中通过孔的电流的变化是核苷酸通过孔的特征。
此外，使用DNA聚合酶活性的实时监测的测序可利用RNA耗尽样本。
可使用本文所述的RNA耗尽样本创建用于测序的文库的其他SBS技术包括检测在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可使用可从IonTorrent公司(Guilford，CT，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术。
在如本文所述的RNA耗尽后可利用富集样本的附加下游应用包括PCR、qPCR、微阵列分析等。例如，微阵列分析是用于研究基因表达的强大技术。可通过按照技术人员已知的方法(例如逆转录酶聚合酶链反应RT-PCR)将富集RNA转化为cDNA来将富集样本用于微阵列分析。然后可将cDNA固定在底物上，施加微阵列探针，并按照任意数量的微阵列分析方法(例如，Agilent、Affymetrix和Illumina等公司销售的商用微阵列分析系统)测定表达分析。聚合酶链反应(PCR)或定量PCR(qPCR)也可按照已确立的技术(Current Protocols forMolecular Biology)利用富集样本作为底物。
因此，由本文所述的方法得到的RNA耗尽样本可用于创建测序文库、扩增产物等，其可用于下游分析方法。本发明所公开的方法不受任何下游应用的限制。
实施例
以下实施例仅为示例性的，并非旨在限制本申请的范围。修改形式对于技术人员来说将是显而易见的并且是可理解的，并且包括在本申请的实质和公开内容的范围内。
实施例1—来自样本的不需要RNA种类的耗尽
在该实施例中，总RNA是样本中的靶核酸，并且RNA耗尽包括四个主要步骤：1)杂交、2)RNA酶H处理、3)DNA酶处理和4)靶RNA纯化。
通过使样本中变性RNA限定的DNA探针组退火来完成杂交。将10ng-100ng的RNA样本在具有1μL的1μM/oligo DNA寡核苷酸探针组(探针对应于SEQ ID NO:1-333，如表1中所列)、3μL的5X杂交缓冲液(500mM Tris HCl pH 7.5和1000mM KCl)、2.5μL的100％甲酰胺和足够的水的管中温育，总反应体积为15μL。将杂交反应在95℃温育2分钟以使核酸变性，以0.1℃/秒的降温速度缓慢冷却至37℃并保持在37℃。反应达到37℃时无需温育时间。变性达到37℃所需的总时间为约15分钟。
在杂交后，将以下组分加入到反应管中以用RNA酶H去除来自DNA:RNA双链体的不需要RNA种类；4μL 5X RNA酶H缓冲液(100mM Tris pH 7.5、5mM DTT、40mM MgCl2)和1μLRNA酶H酶。将酶促反应在37℃温育30分钟。可将反应管置于冰上。
在去除来自DNA:RNA杂交体的RNA后，降解DNA探针。向20μL反应管中加入以下组分：3μL 10X Turbo DNA酶缓冲液(200mM Tris pH7.5、50mM CaCl2、20mM MgCl2)、1.5μLTurbo DNA酶(Thermo Fisher Scientific)和5.5μL H2O，总体积为30μL。将酶促反应在37℃温育30分钟，随后在75℃温育15分钟。75℃温育可用于将靶总RNA裂解成期望的插入物尺寸以用于下游处理，在该实施例中，靶插入物尺寸为总RNA的约200nt。如技术人员已知的，可根据后续反应所需的插入物尺寸来调节该温育步骤的时间。在温育后，可将反应管置于冰上。
在探针与不需要RNA杂交、去除RNA并去除DNA后，可将样本中的靶总RNA从反应条件中分离出来。在4℃时取出反应管，并使其升至室温，然后加入60μL的RNAClean XP珠粒(Beckman Coulter)，并将反应管温育5分钟。温育后，将管置于磁体上5分钟，之后轻轻移除上清液并弃去。在仍将管置于磁体上时，将附着有总RNA的珠粒在175μL新鲜的80％EtOH中洗涤两次。在第二次洗涤后，将珠粒在微量离心机中离心以使珠粒沉淀在管的底部，将管放回磁体上并移除EtOH，小心移除尽可能多的残余EtOH而不干扰珠粒。将珠粒风干几分钟，再重悬于9.5μL的ELB缓冲液(Illumina)中，将其在室温再静置几分钟并放回磁体上以收集珠粒。将8.5μL上清液转移到新管中并置于冰上进行附加下游处理，诸如由靶总RNA产生cDNA。
又如，在96孔PCR板的每个孔中将100ng总RNA稀释于11μL不含核酸酶的超纯水中。向每个孔中加入4μL杂交缓冲液中的DNA探针(SEQ ID NO:1-333)，然后将孔内容物混合并任选地离心。将板在95℃加热2分钟，然后以0.1℃/秒的降温速度将温度降至37℃，然后保持在37℃以杂交探针。将板以280×g离心10秒。为了降解DNA:RNA杂交体，向每个孔中加入5μL缓冲液中的RNA酶并将孔内容物混合。将板在37℃加热15分钟，然后保持在4℃。向每个孔中加入10μL缓冲液中的DNA酶，并将孔内容物混合。将板在37℃加热15分钟，然后保持在4℃。将样本板以280×g离心10秒。向每个孔中加入60μL RNAClean XP珠粒，并将孔内容物混合。将板在室温温育5分钟。将板置于磁力架上直至上清液澄清(约5分钟)。移除每个孔中的上清液并弃去。用80％乙醇洗涤珠粒两次。从每个孔中移除残余的乙醇，并将板在磁力架上风干1分钟。向每个孔中加入10.5μL洗脱缓冲液，将孔内容物混合，并将板在室温温育2分钟。将板密封并以280×g离心10秒。将板置于磁力架上直至上清液澄清(约2分钟)。从每孔中取8.5μL的上清液转移到新板的相应孔中。
实施例2—cDNA合成
来自实施例1的RNA的进一步处理可以是从可例如通过NGS测序的RNA靶核酸来制备文库制备物。向来自实施例1的8.5μL的最终反应物(8.5μL的洗脱液)中加入Prime高浓度随机六聚物混合物缓冲液(EPH缓冲液，TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)，总体积为17μL。将样本在65℃温育2分钟以使核酸变性。在变性后，可将反应管置于冰上。通过向变性样本中加入8μL的逆转录酶混合物(9μL第一链合成混合物(FSA，TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)和1μL Protoscript II RT(NEB)进行第一链合成，总体积为25μL。将反应混合物在加热封盖热循环仪中按以下条件下温育：25℃5分钟，42℃25分钟，70℃15分钟。一旦第一链合成反应完成，就可将反应管置于冰上。
第二链cDNA合成可通过将5μL重悬缓冲液(RSB，TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)和20μL第二链标记混合物(SSM缓冲液，TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)加入到冰样本中进行。将反应管在16℃温育60分钟，然后可将样本置于冰上。
在cDNA合成步骤后，可通过例如向反应管中加入90μL SPB(Illumina)并在室温温育5分钟来清洁cDNA并将其与反应组分分离。在温育后，将管置于磁体上约8分钟以收集顺磁珠，轻轻移除上清液并弃去。在仍将管置于磁体上时，用175μL新鲜的80％EtOH洗涤珠粒两次。在洗涤后，将珠粒离心至管底部，将管放回磁体上，轻轻移除EtOH并弃去。将珠粒干燥几分钟并重悬于18.5μL RSB中，充分混合并将其在室温温育约5分钟，然后放回磁体上。根据下游应用，可将期望量的纯化cDNA移至新管中。在该实施例中，正制备用于下游测序的文库，因此将17.5μL的上清液转移到可置于冰上的新管中。
实施例3—用于下一代测序的文库制备
用于制备测序用文库的方法包括对cDNA片段进行A-加尾、连接衔接子、扩增靶片段以及在测序之前对所得片段进行定量。
使用具有来自实施例2的17.5μL纯化cDNA的管进行处理。向纯化cDNA加入12.5μLATL(Illumina)以对片段进行A-加尾。将反应管在37℃温育30分钟，随后在70℃温育5分钟，并将管放回冰上。通过依次加入2.5μL RSB、2.5μL索引衔接子(TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)和2.5μL的连接缓冲液(Illumina)，将衔接子连接至带A尾的样本。将反应管在30℃温育10分钟，之后加入5μL的终止连接缓冲液(Illumina)，并将反应置于冰上。
一旦衔接子连接反应完成，就将连接的片段与反应组分分离。为了纯化衔接子连接的片段，将34μL SPB加入到反应管中，然后将反应管在室温温育约5分钟。然后将管置于磁体上以捕获顺磁珠，并用175μL 80％EtOH洗涤珠粒两次，第二次洗涤后轻轻移除EtOH。在珠粒风干3分钟后，将珠粒重悬于52μL RSB中，打浆混合，使其在室温再静置5分钟，然后放回磁体上。将上清液(50μL)转移到新管中进行第二轮珠粒纯化。
对于第二轮，将40μL SPB加入50μL样本中并重复上述过程，不同的是将最终纯化片段重悬于21μL的RSB中，并将20μL的最终纯化样本转移到新反应管中用于后续扩增，这增加了靶序列的量以获得优化的测序结果。
向20μL的纯化衔接子连接的样本中加入5μL的PCR引物混合物(PPC，TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)和25μL PPM(TruSeq链式总RNA试剂盒，Illumina)，并且在加热封盖热循环仪中进行以下扩增程序：98℃30秒，之后是循环程序：98℃10秒，60℃30秒，72℃30秒。扩增循环的次数取决于整个过程开始时RNA的输入量。例如，对于100ng RNA，大约12-13次循环经足够了；对于10ng RNA，可能需要15-16次循环；而对于1ng RNA，可能需要17-18次循环。通常对扩增循环的次数进行优化以用于技术人员已知的任何制备。
可通过向反应管中加入50μL SPB将扩增子从反应条件中纯化出来，在室温温育，将管离心以使珠粒沉淀并磁性捕获珠粒。可弃去上清液，如前所述洗涤珠粒，之后将洗涤后的珠粒重悬于26μL RSB中，捕获磁性珠粒并将含有DNA文库的上清液转移至新管进行测序。通常在测序之前，例如通过使用QubitTM高灵敏度试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测量等分试样和/或在生物分析仪(Agilent)上运行等分试样，对文库进行定量和分析。技术人员将会知道可对样本中的核酸进行定量的许多方式。
然后可将所得文库制备物用于下一代测序、微阵列分析或其他下游应用。对于诸如测序的应用，文库制备方法通过所使用的测序仪器和针对该测序仪器限定的伴随文库制备方法来确定。在该实施例中，当在Illumina测序仪器上测序时，文库制备方法是文库创建的特征。技术人员将理解，文库制备方法可根据测序仪器而变化，因此本发明的实施例仅是示例性的，并且本发明的RNA耗尽方法不限于任何特定的文库制备工作流程。实际上，本发明的方法提供了RNA耗尽样本，该RNA耗尽样本可输入到会受益于耗尽了不需要RNA种类的RNA样本的任何下游应用中。
实施例4—微生物转录物组分析
在该实施例中，从ATCC获得微生物分离物、细菌种类的混合样本和标准细胞混合物以用于测试。
可使用RNeasy Power Microbiome试剂盒(Qiagen)按照制造商规程提取总RNA，并通过生物分析仪RNA电泳(Agilent)评估其完整性并进行定量。可按照RiboZero方法(Illumina，按照制造商规程)或本文所公开的方法使用RNA酶H酶促降解不需要rRNA将来自每个样本的10ng-250ng的总RNA用于rRNA耗尽。可使用TruSeq链式总RNA样本制备试剂盒(Illumina)按照制造商说明书制备核糖核酸耗尽RNA和非核糖核酸耗尽RNA(对照)样本以用于测序。可将文库合并，并例如在MiSeq或NextSeq测序仪(Illumina)上进行测序以获得2x76个配对末端读段。
可使用在线BaseSpace Sequencing Hub(BSSH)和以下示例性工作流程来执行序列过滤、对准和转录物覆盖，工作流程例如：1)Partition rRNA Sequences应用程序(解析rRNA序列以表示为分析中的丰富序列)、2)RNA Custom Genome Builder应用程序(创建STAR相容的微生物转录物组)和3)RNA-Seq Alignment应用程序(STAR对准和salmon转录物定量)。为了对来自微生物样本内的多个菌株的rRNA进行定量，可从NCBI注释的基因组中检索rRNA序列并将这些rRNA序列用作BSSH工作流程的输入。
对微生物分离物、微生物混合物和对照样本的转录物组进行测序并比较％rRNA读段。本文所公开的RNA酶H酶促方法在耗尽受试种类中的不需要rRNA方面是非常有效的(<5％rRNA读段)。与建立的RiboZero方法相比，RNA酶H方法对大肠杆菌(E.coli)低输入样本(10ng)的核糖体RNA耗尽最为显著；分别为<0.5％对13％平均rRNA读段(图5)。
当使用RNA酶H rRNA耗尽方法并将其与无rRNA耗尽进行比较时，使用数据来对有生物学意义的RNA读段的富集进行评估。图6示出了评估的结果，其中一般来讲，如果样本在文库制备和测序之前使用RNA酶H方法耗尽了rRNA，则与无rRNA耗尽相比，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或大肠杆菌(E.coli)样本的读段深度减少20-50倍。
对收集的数据进行评估，以确定实验性微生物转录物组测序工作的可重复性。对针对作为示例性系统的大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)进行的RNA酶HrRNA耗尽重复测定之间的基因表达水平的成对线性回归进行测定。高相关性(R2>0.99)表明RNA酶H rRNA耗尽方法能够重现去除来自样本的rRNA(图7)。
为了评估RNA酶H酶促rRNA耗尽方法是否可用于混合样本的rRNA耗尽，图8示出了20株MSA2002和人肠道MSA2006混合样本三次测定的示例性数据。将来自MSA2002的10mg总RNA或来自MSA2006的80ng总RNA的低输入样本用于rRNA耗尽方法。对于20株MSA2002样本，与未耗尽样本相比，RNA酶H rRNA耗尽方法使rRNA读段减少了83％直到为<2％的序列读段，而RiboZero rRNA耗尽方法使得rRNA丰度更可变且更高。对于12株MSA2006样本，观察到相同的结果，其中与未耗尽样本相比，RNA酶H方法使rRNA读段减少了大约95％直到为<13％的测序读段，RiboZero方法产生了更可变的结果。
因此，确定在评估混合样本或其他样本的实验中，RNA酶H rRNA耗尽方法为减少样本中的不需要rRNA提供了稳健且有效的工作流程以进行高质量微生物全转录物组研究。RNA酶H rRNA耗尽方法对于低输入样本来说也非常有效且适用。
实施例5—甲酰胺对RNA耗尽的影响
图2示出了RNA样本已耗尽不需要RNA种类的示例性数据。使用本文所述的方法耗尽RNA样本中的不需要RNA，同时评估甲酰胺浓度对不需要RNA耗尽的影响。在该实施例中，DNA探针靶向耗尽来自革兰氏阳性细菌(23S、16S、5S)、革兰氏阴性细菌(包括23S、16S、5S)、人线粒体(16S、12S)、人rRNA(28S、18S、5.8S、5S)、人血红蛋白mRNA(HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1、HBG2)的不需要rRNA种类，而靶RNA种类是来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的总RNA。随着甲酰胺浓度的增加，不需要RNA种类读段的百分比显著降低。例如，在RNA耗尽期间无甲酰胺导致产生革兰氏阳性细菌23S和16S以及革兰氏阴性细菌(包括大肠杆菌(E.coli))23S和16S(包括大肠杆菌特异性序列)的脱靶RNA读段。将25％甲酰胺加入到杂交反应中使得革兰氏阴性细菌23S和16S的脱靶读段检测不到(大肠杆菌(E.coli)特异性的脱靶读段显著减少)，并且革兰氏阳性细菌23S和16S的脱靶读段显著减少。将45％甲酰胺加入到杂交反应中观察到革兰氏阳性细菌非期望rRNA 23S和16S的脱靶读段的进一步显著减少，并且脱靶大肠杆菌(E.coli)读段进一步减少。因此，将甲酰胺加入到RNA耗尽杂交反应中显示出增加了革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌非期望RNA耗尽的量，如那些种类的脱靶读段的减少所证实的那样。一般来讲，研究发现甲酰胺的加入提高了不需要rRNA转录物的耗尽。当使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)RNA作为靶RNA进行分析时，例如测定大肠杆菌(E.coli)和人rRNA序列可提供潜在污染的测量。
实施例6—输入原料的变化
进行实验以确定输入原料对RNA耗尽和后续下游分析的影响，诸如图3所示，其中使用来自人脑(HBR)和通用人RNA(UHR)的RNA耗尽和富集RNA样本来创建文库以用于在Illumina NextSeqTM500或550测序仪器上进行测序。在使用100ng、10ng或1ng输入样本进行RNA耗尽后，如实施例1-3所例示制备测序文库。如NextSeqTM用户指南所推荐的那样进行测序，之后使用两个BaseSpace(Illumina)应用程序、RNASeq Alignment应用程序和RNAExpress应用程序进行数据分析。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和大肠杆菌(E.coli)存在情况的数据分析也使用改进的工具Fastqscreen(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/)进行。数据显示，无论RNA样本的输入量和靶RNA的％总对准如何，HBR和UHR两者的RNA耗尽都保持恒定，同时随着输入量的减少而减小；数据还显示，即使在使用1ng输入样本时也可收集可操作且有用的序列数据。此外，在比较实验中，当与使用用于RNA耗尽的RiboZero rRNA耗尽试剂盒(Epicentre)(100ng～3％、25ng～5％、10ng～8％和1ng～35％)或NEBNext rRNA耗尽方法(NEB)(100ng～8％、25ng～8％、10ng～9％和1ng～30％)时的数据进行比较时，当前的RNA耗尽方法使得在所有输入水平(100ng～3％、25ng～4％、10ng～3％和1ng～3％)的非靶读段的丰度降低。
实施例7—小鼠和大鼠RNA样本的RNA耗尽
为了证明RNA耗尽方法可用于非人RNA样本，将小鼠和大鼠RNA样本两者用于RNA耗尽方法。对于图4，使用与人RNA样本相同的方法和DNA探针来将小鼠或大鼠RNA样本的不需要RNA耗尽。对于每个啮齿动物种类，在杂交反应中再次改变甲酰胺浓度(包括无甲酰胺、25％甲酰胺或45％甲酰胺)。虽然总的％对准读段不受甲酰胺增加的影响，但随着甲酰胺增加，非靶读段的检测可能存在增加的趋势。同样地，将甲酰胺加入到杂交反应中在一些样本类型中可能是有用的，因为甲酰胺能改善对一些转录物的检测，因此应对其加入进行优化。
实施例8—补充小鼠探针的制备
在用于酶促去除不需要序列(SEQ ID NO:1-333)的上述333种DNA探针池中，基于主要的人rRNA转录物(即5S、5.8S、18S和28S)，以及两种线粒体rRNA序列12S和16S，设计了用于真核rRNA耗尽的DNA寡核苷酸。当测试人总RNA时，该333-DNA探针库在去除rRNA读段方面非常有效。然而，当用小鼠(小家鼠(小家鼠)或大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))总RNA样本测试时，耗尽程度较低，表明探针不能与啮齿动物rRNA序列的一些区域有效杂交并去除这些区域，因为这些小鼠和大鼠区域与人序列不同。
将包含从333-DNA探针实验获得的总测序读段的fastq文件与小鼠和大鼠核糖体RNA序列以及与333DNA探针序列进行对准。对准结果显示，探针对所有核糖体RNA序列的覆盖普遍良好，但在一些区域中探针序列与啮齿动物rRNA不对准。更具体地讲，大多数不与探针库图谱对准的小鼠和大鼠rRNA读段属于28S或16S啮齿动物rRNA转录物(表2)。使用默认设置的版本2.1.0的Bowtie2(参见Langmead和Salzberg，Nature Methods 2012年，第9卷：第357-359页)。333DNA探针酶促方法未耗尽的大多数核糖体RNA来自缺少探针对准的相同区域(图9)。
表2.用于研究的小鼠/大鼠Genbank序列
| 基因组 | 16S | 28S |
| 小家鼠 | NC_005089.1:1094-2675 | NR_003279.1 |
| 褐家鼠 | NC_001665.2:1094-2664 | NR_046246.1 |
为了更有效地耗尽这些区域，设计附加探针以覆盖上述确定的小鼠和大鼠核糖体RNA序列的区域。为了使附加探针的数目和探针冗余最小化，针对小鼠rRNA序列中的缺口设计附加探针，然后将这些数据与333DNA探针组信息合并在一起，以通过将组合库与大鼠rRNA转录物对准来确定大鼠rRNA覆盖中的任何剩余缺口。该顺序过程产生总共44个附加寡核苷酸探针，以提供377个探针的补充库。用该377DNA探针组重复如上所述的测序实验。在小鼠和大鼠样本中，与333-DNA探针组相比，加入44个新探针使得来自文库的rRNA读段百分比降低，显示出耗尽效率增加(表3)。
表3.使用333-和377-探针组的测序读段中的核糖体RNA百分比
| RNA酶H探针组 | 小鼠样本 | 大鼠样本 |
| 333DNA探针组 | 9.5％ | 5.3％ |
| 377DNA探针组 | 7.0％ | 3.7％ |
用针对某些啮齿动物序列的附加探针补充333DNA探针库改善了所测试啮齿动物样本中的rRNA耗尽。针对小鼠16S的示例性探针包括SEQ ID NO:385至SEQ ID NO:393。针对小鼠28S的示例性探针包括SEQ ID NO:400至SEQ ID NO:419。针对大鼠16S的示例性探针包括SEQ ID NO:394至SEQ ID NO:399。针对大鼠28S的示例性探针包括SEQ ID NO:420至SEQID NO:428。
序列表
<110> EPICENTRE TECHNOLOGIES公司
<120> 基于核酸酶的RNA耗尽
<130> 01243-0012-00PCT
<150> US 62/783,869
<151> 2018-12-21
<150> US 62/847,797
<151> 2019-05-14
<160> 428
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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ttgggttctg ctccgaggtc gccccaaccg aaatttttaa tgcaggtttg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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tcccgccgtt tacccgcgct tcattgaatt tcttcacttt gacattcaga 50
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<212> DNA
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cacatcgcgt caacacccgc cgcgggcctt cgcgatgctt tgttttaatt 50
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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cggccccggg ggcggacccg gcggggggga ccggcccgcg gcccctccgc 50
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acgaaccgcc ccgccccgcc gcccgccgac cgccgccgcc cgaccgctcc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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cgcgcgcgac cgagacgtgg ggtgggggtg gggggcgcgc cgcgccgccg 50
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<223> DNA探针
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gcggccgcga cgcccgccgc agctggggcg atccacggga agggcccggc 50
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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ccggcggccg ccgcgcggcc cctgccgccc cgacccttct ccccccgccg 50
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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ctcccccggg gaggggggag gacggggagc gggggagaga gagagagaga 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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agggagcgag cggcgcgcgc gggtggggcg ggggagggcc gcgagggggg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggggcgcgc gcctcgtcca gccgcggcgc gcgcccagcc ccgcttcgcg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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cccagccctt agagccaatc cttatcccga agttacggat ccggcttgcc 50
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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cattgttcca acatgccaga ggctgttcac cttggagacc tgctgcggat 50
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cgcgagattt acaccctctc ccccggattt tcaagggcca gcgagagctc 50
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aaccgcgacg ctttccaagg cacgggcccc tctctcgggg cgaacccatt 50
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cttcacaaag aaaagagaac tctccccggg gctcccgccg gcttctccgg 50
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<212> DNA
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<220>
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cgcactggac gcctcgcggc gcccatctcc gccactccgg attcggggat 50
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<223> DNA探针
<400> 109
caggaccgac tgacccatgt tcaactgctg ttcacatgga acccttctcc 50
<210> 110
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 110
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<210> 111
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
<400> 111
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gggggaggcc caaggggcaa gaagcatggc caccgaggct ccagcttaac 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 153
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 154
gggaggtggg cggccagggt caccagcagg cagtggctta ggagcttgaa 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 155
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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ccacggcgtt ggtcagcgcg tcggccacct tcttgccgtg gcccttaacc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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acggtatttg gaggtcagca cggtgctcac agaagccagg aacttgtcca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 162
caggggtgaa ctcggcgggg aggtgggcgg ccagggtcac cagcaggcag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 164
catgtcgtcc acgtgcgcca cggcgttggt cagcgcgtcg gccaccttct 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 165
cctgggcaga gccgtggctc aggtcgaagt gcgggaagta ggtcttggtg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 166
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 167
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 168
gcaatgaaaa taaatgtttt ttattaggca gaatccagat gctcaaggcc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 169
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gcttagtgat acttgtgggc cagggcatta gccacaccag ccaccacttt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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cactggtggg gtgaattctt tgccaaagtg atgggccagc acacagacca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 172
gcctgaagtt ctcaggatcc acgtgcagct tgtcacagtg cagctcactc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 173
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 174
cttcacctta gggttgccca taacagcatc aggagtggac agatccccaa 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 175
tctgggtcca agggtagacc accagcagcc tgcccagggc ctcaccacca 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 176
accttgcccc acagggcagt aacggcagac ttctcctcag gagtcagatg 50
<210> 177
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 177
gtgatctctc agcagaatag atttattatt tgtattgctt gcagaataaa 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 178
ctctgaatca tgggcagtga gctcagtggt atctggagga cagggcactg 50
<210> 179
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 179
atcttctgcc aggaagcctg cacctcaggg gtgaattctt tgccgaaatg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 180
caccagcaca tttcccagga gcttgaagtt ctcaggatcc acatgcagct 50
<210> 181
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 181
cactcagctg ggcaaaggtg cccttgagat catccaggtg ctttgtggca 50
<210> 182
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 182
agcaccttct tgccatgtgc cttgactttg gggttgccca tgatggcaga 50
<210> 183
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 183
gccaaagctg tcaaagaacc tctgggtcca tgggtagaca accaggagcc 50
<210> 184
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 184
ctccagcatc ttccacattc accttgcccc acaggcttgt gatagtagcc 50
<210> 185
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 185
aaatgaccca tggcgtctgg actaggagct tattgataac ctcagacgtt 50
<210> 186
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gtgatctctt agcagaatag atttattatt tgattgcttg cagaataaag 50
<210> 187
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 187
tctgcatcat gggcagtgag ctcagtggta tctggaggac agggcactgg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 188
tcttctgcca ggaagcctgc acctcagggg tgaattcttt gccgaaatgg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 189
accagcacat ttcccaggag cttgaagttc tcaggatcca catgcagctt 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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actcagctgg gcaaaggtgc ccttgagatc atccaggtgc tttatggcat 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 191
gcaccttctt gccatgtgcc ttgactttgg ggttgcccat gatggcagag 50
<210> 192
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 192
ccaaagctgt caaagaacct ctgggtccat gggtagacaa ccaggagcct 50
<210> 193
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 193
tccagcatct tccacattca ccttgcccca caggcttgtg atagtagcct 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<220>
<223> DNA探针
<400> 195
atgcctggca gttccctact ctcgcatggg gagaccccac actaccatcg 50
<210> 196
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 196
acttctgagt tcggcatggg gtcaggtggg accaccgcgc tacggccgcc 50
<210> 197
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 197
ggttaccttg ttacgacttc accccagtca tgaatcacaa agtggtaagt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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aagctaccta cttcttttgc aacccactcc catggtgtga cgggcggtgt 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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acgtattcac cgtggcattc tgatccacga ttactagcga ttccgacttc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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agactccaat ccggactacg acgcacttta tgaggtccgc ttgctctcgc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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tgtatgcgcc attgtagcac gtgtgtagcc ctggtcgtaa gggccatgat 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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tgcagcacct gtctcacggt tcccgaaggc acattctcat ctctgaaaac 50
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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gaccaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc 50
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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tccggaagcc acgcctcaag ggcacaacct ccaagtcgac atcgtttacg 50
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<223> DNA探针
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gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgcactgagc gtcagtcttc 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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ttcgccaccg gtattcctcc agatctctac gcatttcacc gctacacctg 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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ctacgagact caagcttgcc agtatcagat gcagttccca ggttgagccc 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
<400> 211
gacttaacaa accgcctgcg tgcgctttac gcccagtaat tccgattaac 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 212
attaccgcgg ctgctggcac ggagttagcc ggtgcttctt ctgcgggtaa 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gtattaactt tactcccttc ctccccgctg aaagtacttt acaacccgaa 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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cgcggcatgg ctgcatcagg cttgcgccca ttgtgcagta ttccccactg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gtctggaccg tgtctcagtt ccagtgtggc tggtcatcct ctcagaccag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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taggtgagcc gttaccccac ctactagcta atcccatctg ggcacatccg 50
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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ctccatcagg cagtttccca gacattactc acccgtccgc cactcgtcag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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aaggttaagc ctcacggttc attagtaccg gttagctcaa cgcatcgctg 50
<210> 220
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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cctatcaacg tcgtcgtctt caacgttcct tcaggaccct taaagggtca 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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ccattggcat gacaacccga acaccagtga tgcgtccact ccggtcctct 50
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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atccccggag taccttttat ccgttgagcg atggcccttc cattcagaac 50
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<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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accccatcaa ttaaccttcc ggcaccgggc aggcgtcaca ccgtatacgt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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ccgcgaggga cctcacctac atatcagcgt gccttctccc gaagttacgg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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accgtagtgc ctcgtcatca cgcctcagcc ttgattttcc ggatttgcct 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 241
acgcttaaac cgggacaacc gtcgcccggc caacatagcc ttctccgtcc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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accaagtaca ggaatattaa cctgtttccc atcgactacg cctttcggcc 50
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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cgctttatcg ttacttatgt cagcattcgc acttctgata cctccagcat 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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catggtttag ccccgttaca tcttccgcgc aggccgactc gaccagtgag 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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<212> DNA
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<223> DNA探针
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ggggaatctc ggttgatttc ttttcctcgg ggtacttaga tgtttcagtt 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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attaacctat ggattcagtt aatgatagtg tgtcgaaaca cactgggttt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
<400> 262
gccggttata acggttcata tcaccttacc gacgcttatc gcagattagc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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gcttggcggc gtcctactct cacaggggga aacccccgac taccatcggc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 264
ttccgtgttc ggtatgggaa cgggtgtgac ctcttcgcta tcgccaccaa 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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tagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc gatacggcta ccttgttacg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 266
tctgtcccac cttcggcggc tggctcctaa aaggttacct caccgacttc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 50
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<212> DNA
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<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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gtgggattgg cttaacctcg cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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caccttagag tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac 50
<210> 273
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 273
gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc 50
<210> 274
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 274
attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 50
<210> 275
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc gccactggtg 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 368
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<210> 369
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
<400> 369
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<213> 人工序列
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<223> DNA探针
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<220>
<223> DNA探针
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<220>
<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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<223> DNA探针
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gggttcccaa tcctacacgg atcaacacaa aaaaaatgtg ctaggaagtc 50
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA探针
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<213> 小家鼠
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Ala Thr
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Thr Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Thr Thr Cys
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Thr Thr
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<213> 小家鼠
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Gly Ala
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Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Cys Cys Thr Ala
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Ala Ala
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Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala Gly Cys
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<212> PRT
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Thr Thr Gly Gly Gly Cys Thr Ala Ala Cys Gly Ala Gly Thr Thr Ala
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Gly Gly
50
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<212> PRT
<213> 褐家鼠
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Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala Cys Cys Thr
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Ala Thr Gly Ala Thr Thr Cys Gly Ala Thr Ala Ala Thr Thr Gly Ala
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Cys Ala Ala Thr Gly Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Thr
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Thr Gly
50
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<212> PRT
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Gly Thr Thr Ala Cys Thr Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Ala Cys Ala
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Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Gly Ala
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Thr Cys
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<212> PRT
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Thr Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Gly Gly
20 25 30
Ala Ala Thr Thr Ala Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Ala
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<213> 小家鼠
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Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys
35 40 45
Cys Cys
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<400> 403
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Cys Cys
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<213> 小家鼠
<400> 404
Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys
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Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly
20 25 30
Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly
35 40 45
Ala Gly
50
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 405
Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys
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Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Gly
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Gly Gly Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala
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Ala Ala
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Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Ala Ala Ala
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Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala
35 40 45
Cys Ala
50
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 407
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ala Cys Ala Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys
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Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Ala
50
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 408
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Gly Ala
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<213> 小家鼠
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Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Gly
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Thr Cys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 410
Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Cys
1 5 10 15
Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Gly Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly
35 40 45
Gly Gly
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<213> 小家鼠
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35 40 45
Cys Gly
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<213> 小家鼠
<400> 412
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1 5 10 15
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35 40 45
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<213> 小家鼠
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Thr Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys
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Thr Cys Thr Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
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Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys
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Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala
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Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly
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Ala Cys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 415
Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly
20 25 30
Gly Cys Cys Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
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<213> 小家鼠
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Gly Ala
50
<210> 418
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 418
Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Gly
1 5 10 15
Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Ala
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Cys Thr
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 419
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly
1 5 10 15
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Gly Ala Gly Ala Cys Gly Cys Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys
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Gly Gly
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<212> PRT
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<400> 420
Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Gly Cys Cys Cys Cys Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly
35 40 45
Ala Gly
50
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<211> 50
<212> PRT
<213> 小家鼠
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Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys
1 5 10 15
Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Cys Gly Ala
35 40 45
Gly Gly
50
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 422
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1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Gly Cys Cys
20 25 30
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Gly Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 423
<211> 50
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 423
Gly Cys Cys Ala Ala Cys Cys Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Thr
1 5 10 15
Thr Cys Gly Gly Cys Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Cys
20 25 30
Gly Thr Thr Cys Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Ala
35 40 45
Thr Thr
50
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 424
Cys Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys
1 5 10 15
Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Cys Gly Ala Cys Gly
20 25 30
Gly Ala Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly
35 40 45
Gly Gly
50
<210> 425
<211> 50
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 425
Thr Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Gly
1 5 10 15
Gly Cys Cys Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Cys Thr Thr Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys
35 40 45
Ala Cys
50
<210> 426
<211> 50
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 426
Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ala Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Gly Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Cys Gly Gly
35 40 45
Cys Cys
50
<210> 427
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 427
Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Cys Thr Gly Thr Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly Cys
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Cys
35 40 45
Cys Ala
50
<210> 428
<211> 50
<212> PRT
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<400> 428
Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Thr Cys Gly Gly Cys Thr Thr Cys Gly Cys Thr Cys Cys
20 25 30
Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Gly
35 40 45
Gly Gly
50
Claims (39)
1.一种用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA分子的方法，所述方法包括：
a)使包含至少一个靶RNA或DNA序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿所述至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少40个DNA探针，从而使所述至少40个DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中
i) 所述至少40个DNA探针中的每一个的长度为40个至60个碱基，并且
ii) 每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔5个至40个碱基；以及
b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：c)通过使所述降解混合物与DNA消化酶接触来降解任何剩余的DNA探针，以形成DNA降解混合物；以及d)从所述降解混合物或所述DNA降解混合物中分离所降解的RNA。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述DNA消化酶为DNA酶I。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述与探针组接触包括用热处理所述核酸样本，其中所述热高于至少一个DNA:RNA杂交体的解链温度；或者
其中，所述与探针组接触包括用去稳定剂处理所述核酸样本，其中所述去稳定剂是核酸去稳定化学品。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸去稳定化学品是甜菜碱、DMSO、甲酰胺、甘油、或它们的衍生物或它们的混合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H或杂交酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样本来自人、非人真核生物、细菌、病毒、植物、土壤或它们的混合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述非人真核生物是大鼠、小鼠、或非人灵长类动物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱靶RNA是rRNA、mRNA、tRNA或它们的混合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述mRNA是珠蛋白mRNA。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针组包含与选自以下项目的至少一个脱靶RNA分子杂交的DNA探针：
a) 28S、23S、18S、5.8S、5S、16S、12S、HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBB-B1、HBB-B2、HBG1和HBG2；
b) 来自血红蛋白的HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2，以及来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的23S、16S和5S；
c) 古生菌种类；和/或
d) 大鼠和/或小鼠。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述探针组包含与选自来自人的28S、18S、5.8S、5S、16S和12S的两个或更多个脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述探针组包含与选自大鼠16S、大鼠28S、小鼠16S和小鼠28S以及它们的任意组合的一个或多个脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，所述探针组包含针对特定脱靶RNA分子的DNA探针，其中在每个探针杂交位点之间具有5个至40个碱基的缺口，其中所述DNA探针包含：
a)选自SEQ ID NO: 1-333的2个或更多个序列；或
b)选自SEQ ID NO: 1-428的2个或更多个序列；或
c)选自SEQ ID NO: 1-377的2个或更多个序列；或
d)选自SEQ ID NO: 1-333和SEQ ID NO: 378-428的2个或更多个序列；或
e)选自SEQ ID NO: 334-377的2个或更多个序列；或
f)选自SEQ ID NO: 378-428的2个或更多个序列；
或它们的组合。
15.一种组合物，所述组合物包含探针组，所述探针组包含：
a）至少40个DNA探针，所述至少40个DNA探针沿核酸样本中的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补，其中所述至少40个DNA探针中的每一个的长度为40个至60个碱基，其中所述至少40个DNA探针选自SEQ ID NO: 1-428；以及
b）核糖核酸酶，所述核糖核酸酶能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA，其中每个DNA探针沿所述至少一个脱靶RNA分子的全长与所述探针组中的任何其他DNA探针间隔5个至40个碱基进行杂交。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物包含去稳定化学品。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述去稳定化学品是甲酰胺。
19.根据权利要求16或17所述的组合物，其中所述脱靶RNA是rRNA、mRNA、tRNA或它们的混合物。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述mRNA是珠蛋白mRNA。
21.根据权利要求16所述的组合物，其中所述探针组包含与选自以下项目的至少一个脱靶RNA分子杂交的DNA探针：
a）28S、23S、18S、5.8S、5S、16S、12S、HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2；
b）来自血红蛋白的HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2，以及来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的23S、16S和5S；
c）古生菌种类；和/或
d）大鼠和/或小鼠。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述探针组包含与选自来自人的28S、18S、5.8S、5S、16S和12S的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述探针组包含与选自大鼠16S、大鼠28S、小鼠16S和小鼠28S以及它们的任意组合的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
24.一种试剂盒，所述试剂盒包含探针组，所述探针组包含：
a）至少40个DNA探针，所述至少40个DNA探针沿核酸样本中的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列间隔5个至40个碱基互补，其中所述至少40个DNA探针中的每一个的长度为40个至60个碱基，其中所述至少40个DNA探针选自SEQ ID NO: 1-428；
b）核糖核酸酶，所述核糖核酸酶能够降解DNA:RNA杂交体中的RNA；
c）缓冲液；
d）核酸纯化培养基；以及
e）去稳定化学品。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述脱靶RNA是rRNA、mRNA、tRNA或它们的混合物。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述mRNA是珠蛋白mRNA。
27.根据权利要求24或25所述的试剂盒，其中所述探针组包含与选自以下项目的至少一个脱靶RNA分子杂交的DNA探针：
a）28S、23S、18S、5.8S、5S、16S、12S、HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2；
b）来自血红蛋白的HBA-A1、HBA-A2、HBB、HBG1和HBG2，以及来自革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌的23S、16S和5S；
c）古生菌种类；和/或
d）大鼠和/或小鼠。
28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述探针组包含与选自来自人的28S、18S、5.8S、5S、16S和12S的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
29.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述探针组包含与选自大鼠16S、大鼠28S、小鼠16S和小鼠28S以及它们的任意组合的脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
30.根据权利要求24所述的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)探针组，所述探针组包含SEQ ID NO: 1-333；
b)核糖核酸酶；
c)DNA酶；和
d)RNA纯化珠粒。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述核糖核酸酶是RNA酶H。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含RNA耗尽缓冲液、探针耗尽缓冲液和探针去除缓冲液。
33.一种补充用于耗尽来自核酸样本的脱靶RNA核酸分子的探针组的方法，所述方法包括：
a)使包含来自第一种类的至少一个RNA或DNA靶序列和至少一个脱靶RNA分子的核酸样本与探针组接触，所述探针组包含沿来自第二种类的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的至少40个DNA探针，从而使所述至少40个DNA探针与所述脱靶RNA分子杂交以形成DNA:RNA杂交体，其中每个DNA:RNA杂交体沿给定的脱靶RNA分子序列与任何其他DNA:RNA杂交体间隔5个至40个碱基，并且其中所述至少40个DNA探针中的每一个的长度为40个至60个碱基；
b)使所述DNA:RNA杂交体与核糖核酸酶接触，所述核糖核酸酶降解来自所述DNA:RNA杂交体的RNA，从而降解所述核酸样本中的脱靶RNA分子以形成降解混合物；
c)从所述降解混合物中分离所降解的RNA；
d)对来自所述样本的剩余RNA进行测序；
e)评估剩余RNA序列中是否存在来自第一种类的脱靶RNA分子，从而确定缺口序列区；以及
f)用与所述缺口序列区中的一个或多个缺口序列区中的不连续序列互补的附加DNA探针来补充所述探针组。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第一种类是非人种类，并且所述第二种类是人。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一种类是大鼠或小鼠。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述缺口序列区包含50个或更多个碱基对。
37.根据权利要求33所述的方法，其中根据权利要求15至23中任一项所述的组合物用于提供所述核糖核酸酶和所述探针组，所述探针组包含沿人的至少一个脱靶RNA分子的全长与不连续序列互补的DNA探针。
38.根据权利要求33或权利要求37所述的方法，其中所述方法用于确定与来自大鼠和/或小鼠的一个或多个脱靶RNA分子杂交的DNA探针。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，来自大鼠和/或小鼠的一个或多个脱靶RNA分子选自大鼠16S、大鼠28S、小鼠16S和小鼠28S以及它们的任意组合。
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| US20210190770A1 (en) | 2019-12-23 | 2021-06-24 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays |
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| BR112023019959A2 (pt) | 2021-03-30 | 2024-01-30 | Illumina Inc | Métodos aprimorados de preparação isotérmica de biblioteca e dna complementar |
| EP4347879A1 (en) | 2021-06-03 | 2024-04-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis |
| EP4286457A4 (en) | 2021-08-13 | 2024-09-11 | Lg Chemical Ltd | POLYMER COMPOSITE AND MOLDED PRODUCT |
| WO2023034489A1 (en) | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 10X Genomics, Inc. | Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array |
| WO2023056328A2 (en) | 2021-09-30 | 2023-04-06 | Illumina, Inc. | Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples |
| WO2024077162A2 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for improving coronavirus sample surveillance |
| WO2024077152A1 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for depleting abundant small noncoding rna |
| WO2024077202A2 (en) | 2022-10-06 | 2024-04-11 | Illumina, Inc. | Probes for improving environmental sample surveillance |
Citations (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2037673A1 (en) * | 1990-03-07 | 1991-09-08 | Nanibhushan Dattagupta | Ribonuclease scission chain reaction |
| WO1994009156A1 (en) * | 1992-10-08 | 1994-04-28 | The Regents Of The University Of California | Pcr assays to determine the presence and concentration of a target |
| CN1176663A (zh) * | 1994-12-09 | 1998-03-18 | 基因库公司 | 用特定序列组合体检测核酸的方法 |
| AU8935798A (en) * | 1990-12-31 | 1999-01-07 | Promega Corporation | Nucleic acid amplification with DNA-dependent RNA polymerase activity of RNA replicases |
| CN1333465A (zh) * | 2000-06-08 | 2002-01-30 | 王小兵 | 用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒 |
| WO2002016647A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-02-28 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization |
| CN1405325A (zh) * | 2001-06-04 | 2003-03-26 | 理化学研究所 | Rna探针的制备方法、靶核酸的检测方法以及rna探针的制备试剂盒 |
| US6900013B1 (en) * | 2000-08-25 | 2005-05-31 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization |
| CN101103122A (zh) * | 2004-12-11 | 2008-01-09 | 西托吉尼克斯公司 | 高质量核酸的无细胞生物合成及其用途 |
| CN101935697A (zh) * | 2010-04-16 | 2011-01-05 | 北京原平皓生物技术有限公司 | 用于核酸序列检测的方法和试剂盒 |
| GB201106254D0 (en) * | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| CN202830041U (zh) * | 2009-04-03 | 2013-03-27 | Illumina公司 | 用于加热生物样本的设备 |
| WO2013079649A1 (en) * | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Qiagen Gmbh | Method and kit for characterizing rna in a composition |
| CN103354840A (zh) * | 2011-01-31 | 2013-10-16 | 欧凌科公司 | 核酸外切酶可实现的邻近延伸分析 |
| WO2014043133A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of depleting a target nucleic acid in a sample and kits for practicing the same |
| WO2014044724A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Qiagen Gmbh | Method and kit for preparing a target rna depleted sample |
| WO2014152397A2 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | The Broad Institute, Inc. | Selective purification of rna and rna-bound molecular complexes |
| CN104114718A (zh) * | 2012-01-30 | 2014-10-22 | 欧凌科公司 | 超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析 |
| CN105431554A (zh) * | 2013-07-01 | 2016-03-23 | Illumina公司 | 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝 |
| CN106399533A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-02-15 | 承启医学（深圳）科技有限公司 | 一种去除总RNA样品中核糖体核酸rRNA的方法和组合物 |
| CN106414765A (zh) * | 2013-12-20 | 2017-02-15 | Illumina公司 | 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息 |
| CN106459967A (zh) * | 2014-04-29 | 2017-02-22 | Illumina公司 | 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析 |
| CN107002145A (zh) * | 2014-10-08 | 2017-08-01 | 康奈尔大学 | 用于使用针对遗留预防的组合核酸酶、连接反应和聚合酶反应鉴定和相对定量核酸序列表达、剪接变体、易位、拷贝数或甲基化变化的方法 |
| CN107119043A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-09-01 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种去除rna样本中非目标rna的方法 |
| CN108350497A (zh) * | 2015-08-28 | 2018-07-31 | Illumina公司 | 单细胞核酸序列分析 |
| CN108367291A (zh) * | 2015-11-10 | 2018-08-03 | Illumina公司 | 惯性液滴的生成和颗粒的包封 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6040138A (en) | 1995-09-15 | 2000-03-21 | Affymetrix, Inc. | Expression monitoring by hybridization to high density oligonucleotide arrays |
| US20040152084A1 (en) * | 2003-01-31 | 2004-08-05 | Slattum Paul M. | Compounds and processes for single-pot attachment of a label to nucleic acid |
| US6962906B2 (en) * | 2000-03-14 | 2005-11-08 | Active Motif | Oligonucleotide analogues, methods of synthesis and methods of use |
| US20050003369A1 (en) | 2002-10-10 | 2005-01-06 | Affymetrix, Inc. | Method for depleting specific nucleic acids from a mixture |
| US20080102454A1 (en) | 2006-10-31 | 2008-05-01 | Hui Wang | Reducing size of analytes in RNA sample |
| US20110040081A1 (en) | 2009-08-14 | 2011-02-17 | Epicentre Technologies Corporation | METHODS, COMPOSITIONS, AND KITS FOR GENERATING rRNA-DEPLETED SAMPLES OR ISOLATING rRNA FROM SAMPLES |
| US9005891B2 (en) | 2009-11-10 | 2015-04-14 | Genomic Health, Inc. | Methods for depleting RNA from nucleic acid samples |
| US20160040218A1 (en) * | 2013-03-14 | 2016-02-11 | The Broad Institute, Inc. | Selective Purification of RNA and RNA-Bound Molecular Complexes |
| RU2558292C1 (ru) | 2014-09-17 | 2015-07-27 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) | Способ выделения коротких рнк из биологических жидкостей |
| US9666263B2 (en) | 2015-10-07 | 2017-05-30 | Samsung Electronics Co., Ltd. | DIMM SSD SoC DRAM byte lane skewing |
| EP3417071B1 (en) | 2016-02-15 | 2023-04-05 | F. Hoffmann-La Roche AG | System and method for targeted depletion of nucleic acids |
| US10400274B2 (en) * | 2016-06-18 | 2019-09-03 | Jan Biotech, Inc. | Fluorogenic probes and their use in quantitative detection of target RNA sequences |
-
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2022
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2024
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- 2024-08-01 JP JP2024125952A patent/JP2024149636A/ja active Pending
Patent Citations (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2037673A1 (en) * | 1990-03-07 | 1991-09-08 | Nanibhushan Dattagupta | Ribonuclease scission chain reaction |
| AU8935798A (en) * | 1990-12-31 | 1999-01-07 | Promega Corporation | Nucleic acid amplification with DNA-dependent RNA polymerase activity of RNA replicases |
| WO1994009156A1 (en) * | 1992-10-08 | 1994-04-28 | The Regents Of The University Of California | Pcr assays to determine the presence and concentration of a target |
| CN1176663A (zh) * | 1994-12-09 | 1998-03-18 | 基因库公司 | 用特定序列组合体检测核酸的方法 |
| CN1333465A (zh) * | 2000-06-08 | 2002-01-30 | 王小兵 | 用于特异性核酸检测和定量的同组异序引物延伸方法及其试剂盒 |
| CN1537955A (zh) * | 2000-06-08 | 2004-10-20 | 王小兵 | 用于核酸检测和定量的同组异序引物延伸法及试剂盒 |
| WO2002016647A1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-02-28 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization |
| US6900013B1 (en) * | 2000-08-25 | 2005-05-31 | Aviva Biosciences Corporation | Methods and compositions for identifying nucleic acid molecules using nucleolytic activities and hybridization |
| CN1405325A (zh) * | 2001-06-04 | 2003-03-26 | 理化学研究所 | Rna探针的制备方法、靶核酸的检测方法以及rna探针的制备试剂盒 |
| CN101103122A (zh) * | 2004-12-11 | 2008-01-09 | 西托吉尼克斯公司 | 高质量核酸的无细胞生物合成及其用途 |
| CN202830041U (zh) * | 2009-04-03 | 2013-03-27 | Illumina公司 | 用于加热生物样本的设备 |
| CN101935697A (zh) * | 2010-04-16 | 2011-01-05 | 北京原平皓生物技术有限公司 | 用于核酸序列检测的方法和试剂盒 |
| CN103354840A (zh) * | 2011-01-31 | 2013-10-16 | 欧凌科公司 | 核酸外切酶可实现的邻近延伸分析 |
| GB201106254D0 (en) * | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
| WO2013079649A1 (en) * | 2011-12-02 | 2013-06-06 | Qiagen Gmbh | Method and kit for characterizing rna in a composition |
| CN104114718A (zh) * | 2012-01-30 | 2014-10-22 | 欧凌科公司 | 超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析 |
| WO2014043133A1 (en) * | 2012-09-13 | 2014-03-20 | Clontech Laboratories, Inc. | Methods of depleting a target nucleic acid in a sample and kits for practicing the same |
| CN104685071A (zh) * | 2012-09-18 | 2015-06-03 | 凯杰有限公司 | 制备靶rna消除组合物的方法和试剂盒 |
| WO2014044724A1 (en) * | 2012-09-18 | 2014-03-27 | Qiagen Gmbh | Method and kit for preparing a target rna depleted sample |
| WO2014152397A2 (en) * | 2013-03-14 | 2014-09-25 | The Broad Institute, Inc. | Selective purification of rna and rna-bound molecular complexes |
| CN105431554A (zh) * | 2013-07-01 | 2016-03-23 | Illumina公司 | 无催化剂的表面官能化和聚合物接枝 |
| CN106414765A (zh) * | 2013-12-20 | 2017-02-15 | Illumina公司 | 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息 |
| CN106459967A (zh) * | 2014-04-29 | 2017-02-22 | Illumina公司 | 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析 |
| CN107002145A (zh) * | 2014-10-08 | 2017-08-01 | 康奈尔大学 | 用于使用针对遗留预防的组合核酸酶、连接反应和聚合酶反应鉴定和相对定量核酸序列表达、剪接变体、易位、拷贝数或甲基化变化的方法 |
| CN108350497A (zh) * | 2015-08-28 | 2018-07-31 | Illumina公司 | 单细胞核酸序列分析 |
| CN108367291A (zh) * | 2015-11-10 | 2018-08-03 | Illumina公司 | 惯性液滴的生成和颗粒的包封 |
| CN106399533A (zh) * | 2016-10-18 | 2017-02-15 | 承启医学（深圳）科技有限公司 | 一种去除总RNA样品中核糖体核酸rRNA的方法和组合物 |
| CN107119043A (zh) * | 2017-04-28 | 2017-09-01 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种去除rna样本中非目标rna的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Organism-Specific rRNA Capture System for Application in Next-Generation Sequencing;Sai-Kam Li等;《PLOS ONE》;第8卷(第9期);e74286 * |
| Selective Depletion of rRNA Enables Whole Transcriptome Profiling of Archival Fixed Tissue;John D. Morlan等;《PLOS ONE》;第7卷(第8期);e42882 * |
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