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CN113166737A - 提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物 - Google Patents

提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物 Download PDF

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CN113166737A
CN113166737A CN201980076560.6A CN201980076560A CN113166737A CN 113166737 A CN113166737 A CN 113166737A CN 201980076560 A CN201980076560 A CN 201980076560A CN 113166737 A CN113166737 A CN 113166737A
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Abstract

提供了用于将体外转录(IVT)混合物中的RNA加帽的方法和组合物，所述混合物包括热稳定的RNA聚合酶变体和帽类似物，使得当将DNA模板添加到混合物中，然后将混合物在用于体外转录的条件下温育时，产生了加帽的RNA。方法描述了在升高的温度下以及在用于IVT的标准温度下的高加帽效率。所使用的RNA聚合酶是T7RNA聚合酶的热稳定变体，称为聚合酶M20，其包括在388和567位处的取代，特别是D388E和V567P。

Description

提高转录的RNA的加帽效率的方法和组合物
背景技术
真核mRNA在其5'-末端具有帽结构。该帽由7-甲基鸟苷(m7G)和三磷酸桥ppp(p3)组成，该桥将m7G的5'OH与5'-末端核苷酸N的5'OH连接，表示为m7G(5')pppN(m7G(5')p3N)(Cap 0结构)。帽结构赋予被加帽的RNA多种生物学功能(Ramanathan等人，(2016)NucleicAcids Research，44，7511-7526)。这些功能包括mRNA加工和运输；赋予mRNA分子稳定性；提高翻译效率；和加速mRNA与细胞机器(包括翻译装置、免疫受体和效应器)之间的多重相互作用。
经由体外转录(IVT)合成的RNA可以在转录反应期间(在称为“共转录加帽”的过程中)或其之后(即，转录后使用一系列酶促步骤)加帽(例如，参见Muttach等人，J.Org Chem.(2017)13：2819–2832)。在共转录加帽中，IVT反应中包括帽类似物以及四个核糖核苷三磷酸。帽类似物是N7-甲基化鸟苷三磷酸帽的合成类似物，并且可以向RNA添加天然或非天然的帽(参见Muttach，见上文)。然而，共转录加帽方法受到限制，这是因为帽类似物在反应中与GTP竞争作为引发剂核苷酸，因此，并非所有从这样的IVT获得的mRNA都被加帽。可以使用优化的帽类似物与GTP的比例(即通过降低GTP浓度)或通过用将RNA的5'端去磷酸化的磷酸酶消化未加帽(即三磷酸化)的RNA来部分缓解该问题(参见Muttach，见上文)。但是，前一种解决方案降低了反应的整体效率，而后一种解决方案增加了工作量。因此，这两种方法都无法以实际方式解决问题，因此产生大量均质加帽的RNA在技术上仍然具有挑战性。
因此，仍然需要一种通过共转录加帽有效产生均匀加帽的RNA的方法。
发明内容
提供了用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，该RNA聚合酶包括：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和
(b)在适合于DNA模板体外转录的条件下温育反应混合物以产生模板的加帽的RNA拷贝。
在本文提供的实例中，帽类似物具有下式：
Figure BDA0003075546720000021
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
P每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸(arylphosphonate)或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同，
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
标签可以直接连接到核糖上，或者可以经由连接基团连接。标签可以是亲和结合基团，例如生物素、脱硫生物素或寡核苷酸。标签可以是反应性基团。标签可以是可检测的标记，例如荧光分子。
另外，N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，该修饰包括2'-O-烷基、2'-O-甲氧基乙基、2'-O烯丙基、2'-O烷基胺、2'-氟代核糖(fluororibose)和2'-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以是选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
帽的其他特征可以是其以盐或溶剂化形式存在于混合物中。帽可能是式1描述的一种或多种化合物或其一种或多种盐的单一立体异构体或多种立体异构体。
添加帽用于体外转录。在本领域中众所周知，RNA聚合酶关于帽是不可知的，使得尽管本文描述了多种帽，但是它们表示实例，并不意图包括所有。这些实例描述了m7G-p3-A1pG2pG3p……的使用，仅出于方便目的，并不旨在是限制性的。
提供了RNA聚合酶变体，其优选为热稳定的。更具体地，RNA聚合酶变体可以包括(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代。更具体地，RNA聚合酶可以另外地包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置或两个或所有四个位置的氨基酸取代。更具体地，RNA聚合酶变体可以包括对应于D388E和/或V567P的一个或多个突变。更具体地，RNA聚合酶变体可以另外地包括对应于选自SEQ ID NO：1的以下位置的一个或多个位置或至少10个位置的氨基酸取代：75、83、108、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、428、446、454、461、495、510、584、591、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877。例如，一个或多个或10个或更多个取代可能包括T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q、D847E、F849V、S856T、A863P、A866K和E877R。
RNA聚合酶变体可用于本文所述的方法和试剂盒中。试剂盒的实例单独地或一起地包含根据式1的帽或帽类似物和上述RNA聚合酶变体，以及使用说明书，其包括使用至少30℃至约70℃范围内的温育温度实现至少95％的加帽。
一方面，可将聚合酶变体融合至外源DNA结合结构域。
附图说明
技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。
图1示意性地说明了如何从DNA模板开始转录，该DNA模板显示了被T7RNA聚合酶识别的两个启动子之一。这些是具有5'TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：2)序列(在图1、2D、3A、3B中使用)和II类启动子序列5'TAATACGACTCACTATT(SEQ ID NO：4)(在图3C中使用)的双链体。
图1示出了常规的共转录加帽方法如何可导致加帽的产物(其具有5'-m7G-ppp)和未加帽的产物(其具有5'-ppp)的混合物。在IVT的过程期间，RNA聚合酶结合DNA模板中的启动子序列(以灰色表示)，并在该示意图中以+1核苷酸表示的启动子下游序列处，以5'方向从第二条链开始转录。在存在标准核苷酸的情况下，由RNA聚合酶从该模板合成的RNA仅具有ppp-A+1G+2……(剩余的RNA)序列。在存在三核苷酸帽和标准核苷酸的情况下，当RNA聚合酶从该模板合成RNA时，RNA转录物应具有m7G-A+1G+2……(剩余的RNA)的5'序列。然而，市售的T7 RNA聚合酶提供低效的5'm7G并入，导致转录物的异质群体，其中一些RNA转录物被5'm7GAG加帽和一些是未加帽的5'-PPP-AG。
图2A-2D显示了来自加帽的合成RNA分子的液相色谱-质谱(LC-MS)分析的色谱图，该合成RNA分子是通过具有(SEQ ID NO：2)的启动子序列的25-碱基对模板TAATACGACTCACTATA-A+1G+2G+3……N+25的转录而产生的。使用野生型T7 RNA聚合酶(WT-T7)在37℃进行转录，使用WT-T7(M20)的变体在37℃和50℃下进行转录。转录产物是加帽的25-mer RNA(Cap-RNA)，或者如果加帽不完整，则其是磷酸化的(ppp-RNA)。
X轴表示检测到的RNA产物的质量，Y轴表示每种RNA种类的强度。使用以下式测量加帽效率：(加帽的峰的强度)/[(加帽的峰的强度)+(ppp峰的强度)]。
该数据表明，热稳定的聚合酶M20在37℃和50℃下使用帽类似物以100％的效率启动转录，相对来说，WT-T7聚合酶使用帽类似物只以92％的效率启动转录，所述热稳定的聚合酶M20是T7 RNA聚合酶的热稳定变体，其特征在于在对应于WT-T7序列的388和567的位置处的氨基酸取代等突变(参见，例如，美国专利申请序列号15/594,090，其通过引用并入本文)。
图2A显示了使用WT-T7(反应温度37℃)的加帽效率，其中观察到对应于加帽的RNA和也对应于磷酸化的未加帽的RNA的峰。92％的RNA被加帽，而8％的RNA被磷酸化。由于已知的在3'端添加单个核苷酸的现象，因此对于加帽的转录物显示了数个峰。在此，可以在25-核苷酸转录物的3'端添加第26个核苷酸，以产生分别对应于C的添加或G的添加的两个另外的峰。
图2B显示了使用M20-T7 RNA聚合酶(反应温度37℃)的加帽效率，其中观察到仅对应于加帽的RNA的峰，而没有对应于磷酸化的未加帽的RNA的峰。100％的RNA被加帽。
图2C显示了使用M20-T7 RNA聚合酶(反应温度50℃)的加帽效率，其中观察到仅对应于加帽的RNA的峰，而没有对应于磷酸化的未加帽的RNA的峰。100％的RNA被加帽。
图2D显示了启动子的5'序列和与三核苷酸帽和第三个核苷酸相关联的25-核苷酸转录物的前2个核苷酸，以及具有(1)5'帽m7G pAG和(2)5'三磷酸化的AG的转录产物。
图3A-3C提供了在从模板中转录期间使用m7G-ppp-A+1G+2三核苷酸帽的加帽效率，所述模板包含用于启动转录的不同启动子序列或在待转录序列的+3位处的不同核苷酸。与WT-T7相比，无论启动子序列的变化或+3位处核苷酸的变化如何，突变体M20-T7 RNA聚合酶均显示出改善的加帽效率。M20-T7 RNA聚合酶比市售的T7突变体RNA聚合酶(Toyobo，日本大阪)具有更高的加帽效率。
图3A-3C中显示的结果表明，与热稳定的T7聚合酶M20相比，市售的T7 RNA聚合酶的“Toyobo”变体(Toyobo，日本大阪)在37℃和50℃下使用帽类似物以低于90％的效率启动转录(图3A)。热稳定的T7 RNA聚合酶M20在37℃和50℃下使用帽类似物以接近100％的效率启动转录(图3B)。这些结果对于测试的两种不同启动子(图3B和图3C)是一致的。
图3A以表格形式提供了比较了T7-WT RNA聚合酶(37℃)和Toyobo突变体T7RNA聚合酶(37℃和50℃)对于如图2A-2C的相同DNA模板的加帽效率，该DNA模版即TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：2)的启动子序列与相邻的25个核苷酸。转录物序列起始于与启动子序列相邻的AGG处。
图3B提供了使用与图3A中的相同启动子序列观察到的加帽效率，但是其中DNA模板上与启动子相邻的25个核苷酸的转录起始位点是AGA而不是AGG。WT-T7(37℃)和M20-T7RNA聚合酶(37℃和50℃)的结果表明，M20-T7 RNA聚合酶与图3A中的模板一样有效地转录该模板。
图3C提供了使用与图3A和图3B中不同的启动子序列，即使用TAATACGACTCACTATT(SEQ ID NO：4)的启动子序列观察到的加帽效率，并且其中用于转录的DNA模板的相邻25个核苷酸以AGG开始。WT-T7(37℃)和M20-T7 RNA聚合酶(37℃和50℃)的结果表明，M20-T7RNA聚合酶与图3A和3B中的模板一样有效地转录该模板。
图4A-4C显示，当用RNA聚合酶变体M20完成转录时，增加了1.7kb功能性mRNA的加帽效率。该数据表明，M20聚合酶在37℃和50℃使用帽类似物以几乎100％的效率启动了1.7Kb mRNA的转录。
图4A是涉及测量1.7kb长的mRNA的加帽效率的过程的示意图。将加帽的RNA进行凝胶电泳、RNaseH介导的片段化，以将5'端解析为加帽和未加帽的产物，然后进行MS分析以评估加帽效率。
图4B RNase-H处理的mRNA的凝胶电泳分析表明加帽和未加帽(ppp)的5'RNA片段的存在和分离。
图4C当在反应中使用m7G-ppp-A-p-G多核苷酸帽时，与WT-T7相比，在37℃和50℃下使用M20 RNA聚合酶变体观察到加帽效率提高。使用以下式测量加帽效率：(加帽的峰的强度)/[(加帽的峰的强度)+(ppp峰的强度)]。
具体实施方式
使用工程化RNA聚合酶变体，提供了用于增加体外转录的RNA的共转录加帽效率的方法和组合物。本发明的实施方式利用多种类型的多核苷酸帽中的任何一种作为用于DNA模板的IVT的聚合酶变体的底物，以形成加帽的RNA分子。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY，第二版，John Wiley and Sons，纽约(1994)，以及Hale和Markham，THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，纽约(1991)，向技术人员提供本文中使用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和易于参考，在下面定义了某些术语。优选地，术语的任何进一步解释应与US10,034,951一致。
如本文所用，术语“体外转录”(IVT)是指无细胞反应，其中双链DNA(dsDNA)模板由DNA指导的RNA聚合酶拷贝以产生含有从模板拷贝的RNA分子的产物。
如本文所用，术语“DNA模板”是指在IVT反应中转录的dsDNA分子。DNA模板具有被转录的区域上游的RNA聚合酶识别的启动子(例如，T7、T3或SP6启动子)。
如本文所用，术语“RNA产物”是指IVT反应的产物。IVT的RNA产物含有RNA分子的混合物，并且取决于转录如何完成，可能包含双链RNA(dsRNA)分子。在IVT反应中生成dsRNA分子的分子事件是未知的，但是可以使用例如对dsRNA特异性的抗体或液相色谱法(例如HPLC)检测它们。
如本文所用，术语“变体”蛋白质是指具有与天然存在的氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质(即与天然存在的蛋白质的氨基酸序列具有小于100％的序列同一性)，但该蛋白质的氨基酸序列与天然存在的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。因此，相对于野生型蛋白质，变体可以具有一个或多个氨基酸取代。变体蛋白质可以包括“融合”蛋白。术语“融合蛋白”是指由在天然状态下未结合的多个多肽组分组成的蛋白质。融合蛋白可以是两种、三种或甚至四种或更多种不同蛋白质的组合。术语多肽包括融合蛋白，其包括但不限于两个或更多个异源氨基酸序列的融合，多肽与以下的融合：异源靶向序列、接头、表位标签、可检测的融合伴侣(例如荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、萤光素酶等)等等。融合蛋白可具有添加至蛋白质的N末端、C末端和/或中间部分的一个或多个异源结构域。如果融合蛋白的两个部分是“异源”的，则它们不是处于天然状态的同一蛋白质的部分。
如本文所用，术语“缓冲剂”是指当向溶液中加入酸或碱时使溶液抵抗pH值变化的试剂。可用于本发明的组合物、试剂盒和方法中的合适的非天然存在的缓冲剂的实例包括例如Tris、HEPES、TAPS、MOPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)或MES。
术语“药学上可接受的赋形剂”是与通过本领域使用的经皮肤、口服、静脉内或其他施用手段向活的哺乳动物生物体施用相容的任何溶剂。药学上可接受的赋形剂的实例包括例如在US 2017/0119740中所述的那些。
术语“非天然存在”是指天然中不存在的组合物。
本文所述的任何蛋白质可以是非天然存在的，其中术语“非天然存在”是指具有不同于处于天然状态的蛋白质的氨基酸序列和/或翻译后修饰模式的蛋白质。例如，非天然存在的蛋白质可以在蛋白质的N-末端、C-末端和/或在N-末端和C末端之间具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入。“非天然存在的”蛋白质可以具有与天然存在的氨基酸序列不同的氨基酸序列(即，与天然存在的蛋白质的氨基酸序列具有小于100％的序列同一性)，但是该氨基酸序列与天然存在的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。在某些情况下，如果非天然存在的蛋白质是由不同(例如细菌)细胞产生的，则该蛋白质可能含有N-末端甲硫氨酸或可能缺乏一个或多个翻译后修饰(例如糖基化、磷酸化等)
在核酸的背景下，术语“非天然存在”是指含有以下的核酸：a)与处于其天然状态的核酸不同的核苷酸序列(即，与天然存在的核酸序列具有少于100％的序列同一性)；b)一种或多种非天然存在的核苷酸单体(其可能导致不是G、A、T或C的非天然主链或糖)；和/或c)可以在核酸的5'-端、3'-端和/或5'-和3'-端之间含有一个或多个其他修饰(例如，添加的标记或其他部分)。
在制品的背景下，术语“非天然存在”是指：a)天然中未结合的组分的组合，例如由于它们处于不同的位置、在不同的细胞或不同的细胞室中；b)具有天然中未发现的相对浓度的组分的组合；c)缺乏通常与天然中的一种组分相关联的物质的组合；d)天然中未发现的形式的组合，例如干燥、冷冻干燥、结晶、水性；和/或e)含有天然中未发现的组分的组合。例如，制品可以含有在天然中未发现的“非天然存在的”缓冲剂(例如Tris、HEPES、TAPS、MOPS、三(羟甲基)甲基甘氨酸或MES)、清洁剂、染料、反应增强剂或抑制剂、氧化剂、还原剂、溶剂或防腐剂。
术语“帽类似物”包括天然的帽，例如7mG和以下通式的任何化合物：
Figure BDA0003075546720000081
其中R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同。
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
在称为共转录加帽的过程中，将帽类似物添加在RNA转录物的5'端处，以产生5'加帽的RNA(参见，例如，Muttach，见上文)。
帽类似物包括例如式m7G(5′)p3(5′)G的二核苷酸帽类似物，其中鸟嘌呤核苷酸(G)经由其5'OH连接至三磷酸桥。在一些二核苷酸帽类似物中，3'-OH基团被氢或OCH3取代(US 7,074,596；Kore,Nucleotides,Nucleotides,and Nucleic Acids,2006,25:307-14；和Kore,Nucleotides,Nucleotides,and Nucleic Acids,2006,25:337-40)。二核苷酸帽类似物包括m7G(5′)p3G、3′-OMe-m7G(5′)p3G(ARCA)。术语“帽类似物”还包括三核苷酸帽类似物(如下定义)以及其他更长的分子(例如，具有四个、五个或六个或更多个连接至三磷酸桥的核苷酸的帽类似物)。
在帽类似物中，N1和N2中的糖对于每个位置可以独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含包括以下的修饰：2'-O-烷基、2'-O-甲氧基乙基、2'-O烯丙基、2'-O烷基胺、2'-氟代核糖和2'-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置可以独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
术语“三核苷酸帽类似物”是指其中x＝1的帽类似物。Ishikawa等人在NucleicAcid Symp.Ser.，2009 53:129-30中公开了数种三核苷酸帽类似物，例如m7G(5′)p3ApG、m7G(5′)p3AmpG(Am是具有2′OMe-核糖的腺嘌呤)、m7G(5′)p3m6AmpG(m6A是N6-甲基腺嘌呤)和m7G(5′)p3m6ApG，并且在US2018/0105551中描述了许多其他的三核苷酸帽类似物，这些出版物通过引用并入本文。
本文提供了用于在IVT反应中以共转录方式(即，使用帽类似物)将RNA加帽并实现至少95％的加帽效率的方法等等。
在一些实施方式中，方法可包括(a)将rNTP或修饰的rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，该RNA聚合酶包含：(i)氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和(b)在适合于DNA模板的IVT的条件下温育反应混合物以产生模板的加帽的RNA拷贝。通过共转录完成加帽的该方法导致产物几乎完全被加帽(例如，至少90％、至少98％或至少99％加帽)，因此，RNA产物可以可能无需任何转录后酶促步骤即可使用。在一些实施方式中，聚合酶可以是热稳定的，并且因此，反应可以在30℃至70℃范围内的温度下进行，例如在37℃的温度、50℃的温度或在50℃至65℃范围内的温度下进行。
在一些实施方式中，方法中使用的RNA聚合酶(M20)：(i)可以具有与SEQ ID NO：1至少80％的序列同一性(例如，至少90％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性)的氨基酸序列；和(ii)可以在对应于下面所示的SEQ ID NO：1(WT-T7)的以下位置的一个或多个位置处包含一个或多个(例如，至少两个、至少三个、至少五个或至少十个)氨基酸取代：75、83、108、109、205、206、227、281、297、312、323、327、333、340、354、362、375、388、428、446、454、461、495、510、534、567、584、591、618、642、711、724、740、788、832、834、835、843、847、849、856、863、866和877。
SEQ ID NO：1：
MNTINIAKNDFSDIELAAIPFNTLADHYGERLAREQLALEHESYEMGEARFRKMFERQLKAGEVADNAAAKPLITTLLPKMIARINDWFEEVKAKRGKRPTAFQFLQEIKPEAVAYITIKTTLACLTSADNTTVQAVASAIGRAIEDEARFGRIRDLEAKHFKKNVEEQLNKRVGHVYKKAFMQVVEADMLSKGLLGGEAWSSWHKEDSIHVGVRCIEMLIESTGMVSLHRQNAGVVGQDSETIELAPEYAEAIATRAGALAGISPMFQPCVVPPKPWTGITGGGYWANGRRPLALVRTHSKKALMRYEDVYMPEVYKAINIAQNTAWKINKKVLAVANVITKWKHCPVEDIPAIEREELPMKPEDIDMNPEALTAWKRAAAAVYRKDKARKSRRISLEFMLEQANKFANHKAIWFPYNMDWRGRVYAVSMFNPQGNDMTKGLLTLAKGKPIGKEGYYWLKIHGANCAGVDKVPFPERIKFIEENHENIMACAKSPLENTWWAEQDSPFCFLAFCFEYAGVQHHGLSYNCSLPLAFDGSCSGIQHFSAMLRDEVGGRAVNLLPSETVQDIYGIVAKKVNEILQADAINGTDNEVVTVTDENTGEISEKVKLGTKALAGQWLAYGVTRSVTKRSVMTLAYGSKEFGFRQQVLEDTIQPAIDSGKGLMFTQPNQAAGYMAKLIWESVSVTVVAAVEAMNWLKSAAKLLAAEVKDKKTGEILRKRCAVHWVTPDGFPVWQEYKKPIQTRLNLMFLGQFRLQPTINTNKDSEIDAHKQESGIAPNFVHSQDGSHLRKTVVWAHEKYGIESFALIHDSFGTIPADAANLFKAVRETMVDTYESCDVLADFYDQFADQLHESQLDKMPALPAKGNLNLRDILESDFAFA
变体的实例包括在对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、388、534、567和618位的一个或多个(例如，至少两个、三个、四个、五个或六个)位置处具有氨基酸取代的RNA聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可在对应于388和567位的一个或两个位置处包含氨基酸取代。
例如，RNA聚合酶：具有与SEQ ID NO：1至少80％的序列同一性(例如，至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性)的氨基酸序列；并且可以包括以下氨基酸取代中的一个或多个(例如，至少两个、至少三个、至少五个或至少十个)：T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q、D847E、F849V、S856T、A863P、A866K和E877R，其中氨基酸取代在对应于SEQ ID NO：1中的位置的位置处。
变体RNA聚合酶可以包括以下氨基酸取代中的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)：I109L、H205S、D388E、L534V、V567P和G618Q，其中氨基酸取代在对应于SEQ ID NO：1中的位置的位置处，以及任选的以下氨基酸取代的一个或多个(例如，至少两个、至少三个、至少五个或至少十个)：T75Q、A83K、E108L、K206P、V227I、I281P、V297I、Y312D、A323I、A327P、K333P、V340E、A354Q、M362P、T375K、T375N、A428P、L446F、K454P、K461R、S495N、C510Q、A584K、D591E、K642R、K711R、A724P、K740R、G788A、M832F、D834E、T835L、A843Q、D847E、F849V、S856T、A863P、A866K和E877R，其中氨基酸取代在对应于SEQ ID NO：1中的位置的位置处。
变体RNA聚合酶可以含有在US 2017/0247670中描述的任何或所有特征。变体RNA聚合酶也可以是变体SP6 RNA聚合酶或变体T3 RNA聚合酶，所有这些在序列功能和性质上密切相关。
在一个实施方式中，用于优化以帽类似物加帽RNA的效率的方法包括形成具有DNA模板的试剂的混合物，其中试剂混合物包括rNTP和/或修饰的核苷酸、帽类似物和在美国专利申请序列号15/594,090中描述的类型RNA聚合酶变体的混合物，并且该RNA聚合酶变体在本文中以鉴定为M20的变体为例，其中M20具有与SEQ ID NO：1至少80％的序列同一性(例如，至少90％、至少95％或100％的序列同一性)，对应于SEQ ID NO：1中388和567位的一个或两个突变，以及可能的其他突变，直至并包括以上所述的任何、一些或全部突变。将含有变体RNA聚合酶的反应混合物中形成的转录物的至少95％加帽。当RNA聚合酶是突变体T7时，与WT-T7相比，使用反应混合物对新形成的转录物的加帽效率显示出显著更高的效率。使用质谱法(Mass Spec)也证实了共转录加帽以提供至少95％加帽的效率提高的确认，其中比较了加帽与未加帽的RNA——具有5'ppp。
RNA多核苷酸帽可以是盐或溶剂化形式。RNA多核苷酸帽可以是式1所述的一种或多种化合物或其一种或多种盐的单一立体异构体或多种立体异构体。
修饰的帽可以包括通过接头任选地附接在R1和/或R2基团上的标签，标签的实例包括可检测的标签，例如通过荧光或通过颜色检测的有助于转录后RNA的检测和定量的那些标签。修饰的帽可包括结合部分(例如生物素、去硫生物素、洋地黄毒苷)；与蛋白质标签(苄基鸟嘌呤或苄基氯嘧啶(benzylchoropyrimidine)(SNAP-标签)、苄基胞嘧啶(CLIP-标签)、卤代烷烃(Halo标签))形成不可逆键的基团等等以促进富集，从而导致例如通过大小或质量的鉴定。转录反应的一种或多种组分(引发加帽的寡核苷酸引物和/或NTP)可以用可检测的标记(例如邻氨基苯甲酰基团、Alexa Fluor染料；香豆素染料、BODIPY染料、量子点(Quantum Dots)、ATTO染料))或标记物进行标记，使得可以例如通过大小、质量、亲和捕获或颜色来鉴定之后的RNA。可检测的标记是荧光染料；并且亲和捕获标签是生物素或其他。
本文提供的方法和组合物可通过任何所期望的DNA模板和序列的酶依赖性转录用于体外合成，以制备5'加帽的RNA。例如，DNA模板可以具有与天然存在或合成的mRNA、tRNA、向导RNA、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、柯浩体特异小RNA(small cajal body-specific RNA)(scaRNA)一致的序列。转录的RNA除了帽多核苷酸结构(式1)以外，还可以包括一种或多种修饰的单磷酸核苷(nucleoside monophosphates)、一种或多种修饰的糖。
帽多核苷酸可以具有类似于Cap 0结构(+1核糖的2'OH没有甲基化)、Cap 1结构(+1核糖的2'OH甲基化)或Cap 2结构(+2核糖的2'OH的甲基化)的与天然帽结构相似的结构。
尽管本文描述的方法描述了热稳定的T7 RNA聚合酶变体介导的转录反应，但其他可利用的酶(包括天然或突变变体)包括例如SP6和T3 RNA聚合酶以及来自包括热稳定的RNA聚合酶的其他来源的RNA聚合酶。
还考虑了试剂盒，其包括用于执行转录的帽类似物和聚合酶变体，具有以下一种或多种试剂：修饰或未修饰的帽类似物、一种或多种未修饰的NTP、一种或多种修饰的NTP、RNA聚合酶或变体、其他酶、反应缓冲液、镁和DNA模板。试剂盒还可包括用于在30℃至70℃范围内的温度(例如37℃的温度、50℃的温度或37℃-50℃或50℃-65℃范围内的温度)下温育反应的说明书。
在一些实施方式中，RNA产物可以编码蛋白质，例如治疗性蛋白质或预期改变其引入的细胞的蛋白质，因此，RNA产物中的RNA分子可能具有5'非翻译区(5'UTR)、一个或多个编码序列和3'翻译区(3'UTR)，其中3'和5'UTR促进一个或多个编码序列的翻译以在细胞内产生蛋白质。在其他实施方式中，RNA产物可以是治疗性RNA。在一些实施方式中，RNA产物可以是向导RNA、短发夹RNA、siRNA、微小RNA、长非编码RNA或蛋白质编码RNA(其可以编码重组蛋白质或对细胞天然的蛋白质)。在一些实施方式中，RNA产物可能含有修饰的核苷酸(可以将其三磷酸酯添加到IVT反应中)。
在这些实施方式中，可以将修饰的核苷酸并入IVT RNA中。修饰核苷酸的并入可以增加RNA的翻译效率并增加RNA的稳定性。修饰可以存在于糖中(例如2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或存在于磷酸基团中(例如硫代磷酸和5'-N-亚磷酰胺键)；和/或存在于核苷酸碱基中(例如，参见：US8,383,340；WO 2013/151666；US 9,428,535B2；US 2016/0032316)。在一些实施方式中，可以在转录反应期间或之后改变RNA产物，例如，以降低RNA产物在细胞中降解的速率。在一些实施方式中，RNA产物可以含有加帽的RNA(参见，例如：WO 2016/090262；WO 2014/152673；WO 2009/149253；Strenkowska等人，(2016)，Nucleic Acids Research，44(20)：9578-90)。也可以产生具有不同长度的poly A尾巴的RNA和标记的RNA。
在一些实施方式中，该方法可以进一步包括测试或使用RNA产物(例如，将RNA施用于体外(即，在培养基中生长的)、离体或体内的哺乳动物细胞，而不执行转录后去除ppp-G并将m7G-ppp添加到RNA产物的5'端的酶促步骤。
在任何实施方式中，可以使用天然NTP，即GTP、CTP、UTP和ATP完成IVT，以产生不包含修饰的核苷的产物。
在任何实施方式中，可以在不存在假尿苷三磷酸的情况下使用对应于G、C、U和A的NTP来完成IVT，以产生不包含假尿苷的产物。引入RNA产物的细胞可以是体外的(即已经在合成培养基上体外培养的细胞)。在这些实施方式中，可以将RNA产物转染到细胞中。在其他实施方式中，引入RNA产物的细胞可以是体内的(为哺乳动物一部分的细胞)。在这些实施方式中，可以通过将RNA产物体内施用给受试者来完成引入。在一些实施方式中，引入RNA产物的细胞可以离体存在(为组织一部分的细胞，例如已经从哺乳动物中移出或从哺乳动物的血液中分离的软组织)。
还提供了制备制剂的方法。在一些实施方式中，方法可以包括将通过转录如上所述的模板DNA制得的RNA产物与药学上可接受的赋形剂组合以产生制剂。
在一些实施方式中，方法包括：(a)使用上述方法用RNA聚合酶转录模板DNA以产生具有或不具有修饰的加帽的RNA产物；和(b)将RNA产物与药学上可接受的赋形剂组合；其中该方法是在没有转录后加帽步骤的情况下完成的。
在一些实施方式中，方法可以包括以有效治疗剂量向哺乳动物受试者施用制剂，其中该受试者可以是人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长目动物)。可选地，可以将加帽的RNA施用至非哺乳动物受试者或体内的真核或原核细胞或体内施用。
加帽的RNA可以是裸的(naked)，也可以与合适的赋形剂一起配制以施用至受试者，例如人类。制剂可以包括液体制剂(溶液、混悬液、分散液)、局部制剂(凝胶、软膏、滴剂、乳膏)、脂质体制剂(例如在US 9,629,804 B2；US 2012/0251618 A1；WO 2014/152211；US2016/0038432 A1中所述的那些)。制剂可以包括将RNA包封在病毒颗粒中。
在一些实施方式中，通过将加帽的RNA产物包装到纳米颗粒(例如阳离子脂质和聚合物)、非病毒载体(如鱼精蛋白)中，可以将其递送至细胞中。也可以使用转染、显微注射、电穿孔、声孔效应实施将RNA直接引入细胞。RNA的递送(局部或全身)和包装(具有或不具有修饰)可以在对于递送方法或所使用的制剂最佳的温度下执行(例如在US 9,629,804 B2；US 2012/0251618 A1；WO 2014/152211；US 2016/0038432 A1；US 2016/0032316 A1；US 9,597,413 B2；US 2012/0258176中所述的那些)。
本文提供的方法和组合物可用于体外合成编码蛋白质(例如用于疫苗的抗原)的加帽的RNA产物，其用于癌症免疫疗法(例如在US 8,217,016 B2；US 2012/0009221 A1；US2013/0202645 A1；US 9,587,003 B2；Sahin等人，(2014)：Nature Reviews DrugDiscovery 13，759–80中所述的那些)，或过敏耐受性(例如Sahin(2014)中所述的那些，见上文)，或用于生产蛋白质替代疗法的重组体或天然存在的蛋白质(例如在US 2016/0032316 A1；US 8,680,069；PCT/US2013/031821；PCT/US2014/028330；US 9,181,321；US9,220,792 B2；US 9,233,141 B2；Sahin(2014)(见上文)中所述的那些)、补充疗法(例如在Sahin(2014)(见上文)中所述的那些)、细胞重编程(例如在US 2011/0143436 A1；US 8,802,438；US 9,371,544；WO 2009/077134 A2；Sahin(2014)(见上文)中所述的那些)、基因组编辑/工程化(如Sahin(2014)(见上文)中所述的那些)。将加帽的RNA引入靶细胞可以通过产生蛋白质或影响细胞中靶标的表达来改变细胞表型。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出以通过引用并入一样。这包括于2018年10月4日提交的临时申请序列号62/741,111。
实施方式
实施方式1.一种用于在IVT反应中将RNA加帽的方法，其包括：
(a)将rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，该RNA聚合酶包含：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和
(b)在适合于DNA模板的IVT条件下温育反应混合物以产生所述模板的加帽的RNA拷贝。
实施方式2.根据实施方式1的方法，其中该帽类似物是二核苷酸帽类似物。
实施方式3.根据实施方式1的方法，其中该帽类似物是三核苷酸帽类似物。
实施方式4.根据任何先前实施方式的方法，其中该帽类似物具有下式：
Figure BDA0003075546720000151
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
实施方式5.根据实施方式4的方法，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
实施方式6.根据任何先前实施方式的方法，其中该RNA聚合酶包括在对应于SEQID NO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
实施方式7.根据任何先前实施方式的方法，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
实施方式8.根据任何先前实施方式的方法，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少三个两个位置的氨基酸取代。
实施方式9.根据任何先前实施方式的方法，其中该RNA聚合酶进一步包括在对应于SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
实施方式10.根据任何先前实施方式的方法，其中该RNA聚合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
实施方式11.根据先前实施方式的任一中的方法，其中该加帽效率大于95％。
实施方式12.根据实施方式9的方法，其中步骤(b)中的温育进一步包括：在至少30℃至约70℃的温度下执行体外转录。
实施方式13.一种组合物，其包括：
rNTP、帽类似物和RNA聚合酶，该RNA聚合酶包括：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代。
实施方式14.根据实施方式13的组合物，其中该帽类似物具有下式：
Figure BDA0003075546720000161
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
实施方式15.根据实施方式12或13的组合物，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
实施方式16.根据实施方式12或14的任一中的组合物，其中该帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。
实施方式17.根据实施方式12-15的任一中的组合物，其中该RNA聚合酶包括在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
实施方式18.根据实施方式12-16的任一中的组合物，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
实施方式19.根据实施方式11-17的任一中的组合物，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少两个或三个位置的氨基酸取代。
实施方式20.根据实施方式12-18的任一中的组合物，其中该RNA聚合酶进一步包括在对应于SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
实施方式21.根据实施方式12-18的任一中的组合物，进一步包括核酸模板。
实施方式22.一种试剂盒，其包括：
(a)帽类似物；
(b)RNA聚合酶，其包括(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和(iii)使用说明书，其包括使用在至少30℃至约70℃范围内的温育温度，实现至少95％的加帽。
实施方式23.根据实施方式22的试剂盒，其中该帽类似物具有下式：
Figure BDA0003075546720000181
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同，
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
实施方式24.根据实施方式22或23的试剂盒，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
实施方式24.根据实施方式22-23的任一中的试剂盒，其中该帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。
实施方式25.根据实施方式22-24的任一中的试剂盒，其中该RNA聚合酶包括在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
实施方式26.根据实施方式22-25的任一中的试剂盒，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
实施方式27.根据实施方式22-26的任一中的试剂盒，其中该RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少三个两个位置的氨基酸取代。
实施方式28.根据实施方式22-27的任一中的试剂盒，其中该RNA聚合酶进一步包括在对应于SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
实施例
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和实例的方式以一些细节描述了前述发明，但是根据本发明的教导，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，可以对本发明进行某些改变和修改，而不背离所附权利要求书的精神或范围。为了举例说明所要求保护的发明，上面已经提供并以一些细节描述了附图。其证明的结果可以使用下面描述的方法来实现。
实施例1：用于加帽RNA转录物的方法
IVT和IVT RNA对照(缺少帽)的合成
根据New England Biolabs,Ipswich,MA，目录2017/2018提供的描述，利用WT-T7和利用来自Toyobo的T7 RNA聚合酶——使用Toyobo的优化方案以及T7 RNA变体(M20)——使用针对WT-T7 RNA聚合酶(New England Biolabs Inc,Ipswich,MA)描述的方案，执行IVT反应。图1、2A-2D和3A-3C的双链DNA模板是通过对两个单链DNA寡核苷酸退火而生成的。图4A-C的DNA模板是双链质粒DNA，其使用限制性内切酶NotI在T7启动子(New EnglandBiolabs Inc,Ipswich,MA)下游的位点处线性化。反应在37℃或50℃下执行1小时。在质谱分析之前，将IVT RNA的RNA产物通过离心柱(Norgen Biotek Corp.,Ontario或MEGACLEARTM,Thermo Fisher Scientific,Waltham,Mass.)处理，以除去未并入的(unincorporated)核苷酸。
IVT和IVT RNA对照(具有通过共转录加帽的帽)的合成
使用与上述相同的方法，根据Trilink Biotechnologies,CA所述的方法，将4mM的三核苷酸帽(m7G-ppp-A-p-G)用于每个反应。
使用LC-质谱法测量加帽效率的测定
对离心柱处理的RNA进行液相色谱质谱(LC-MS)分析(Novatia LLC,PA)。使用以下式确定加帽效率，(加帽的峰的强度)/[(加帽的峰的强度)+(ppp峰的强度)]。
测量长mRNA的加帽效率的测定
将在三核苷酸帽(Trilink BioTechnologies,San Diego,CA)的存在下用RNA聚合酶变体生成的体外转录的mRNA通过旋转柱(MEGACLEARTM,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)处理，以去除未并入的核苷酸。将序列与转录的加帽的RNA 5'端互补的25mer寡核苷酸退火到RNA，然后将退火的寡核苷酸-RNA杂交体进行RnaseH(New EnglandBiolabsInc,Ipswich,MA)消化。然后通过凝胶电泳分离反应产物，使得如图4B中所示，在凝胶的一个条带中检测到25mer双链加帽的RNA，并且在第二个条带中观察到未加帽的产物。分开地提取两个条带中的核酸，并对其进行液相色谱质谱(LC-MS)分析。使用以下公式确定加帽效率，(加帽的峰的强度)/[(加帽的峰的强度)+(ppp峰的强度)]。
序列表
<110> 新英格兰生物实验室公司
<120> 提高转录的RNA的加帽效率的方法和组合物
<130> NEB-412
<150> 62/741,111
<151> 2018-10-04
<160> 4
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 883
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 1
Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu
20 25 30
Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu
35 40 45
Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val
50 55 60
Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys
65 70 75 80
Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg
85 90 95
Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu
100 105 110
Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser
115 120 125
Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala
130 135 140
Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys
145 150 155 160
His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His
165 170 175
Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser
180 185 190
Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp
195 200 205
Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr
210 215 220
Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp
225 230 235 240
Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr
245 250 255
Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val
260 265 270
Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala
275 280 285
Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala
290 295 300
Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile
305 310 315 320
Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala
325 330 335
Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile
340 345 350
Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp
355 360 365
Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val
370 375 380
Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe
385 390 395 400
Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe
405 410 415
Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe
420 425 430
Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys
435 440 445
Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly
450 455 460
Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys
465 470 475 480
Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro
485 490 495
Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu
500 505 510
Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr
515 520 525
Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln
530 535 540
His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn
545 550 555 560
Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys
565 570 575
Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn
580 585 590
Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys
595 600 605
Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly
610 615 620
Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly
625 630 635 640
Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln
645 650 655
Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln
660 665 670
Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr
675 680 685
Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys
690 695 700
Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg
705 710 715 720
Lys Arg Cys Ala Val His Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp
725 730 735
Gln Glu Tyr Lys Lys Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu
740 745 750
Gly Gln Phe Arg Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu
755 760 765
Ile Asp Ala His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His
770 775 780
Ser Gln Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu
785 790 795 800
Lys Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr
805 810 815
Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr Met
820 825 830
Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr Asp Gln
835 840 845
Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met Pro Ala Leu
850 855 860
Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu Glu Ser Asp Phe
865 870 875 880
Ala Phe Ala
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 2
taatacgact cactata 17
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 3
attatgctga gtgatat 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 4
taatacgact cactatt 17

Claims (28)

1.一种用于在体外转录反应中将RNA加帽的方法，其包括：
(a)将rNTP、DNA模板、帽类似物和RNA聚合酶组合以产生反应混合物，所述RNA聚合酶包含：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ IDNO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和
(b)在适合于DNA模板的体外转录的条件下温育所述反应混合物以产生所述模板的加帽的RNA拷贝。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述帽类似物具有下式：
Figure FDA0003075546710000011
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQ IDNO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少两个或三个位置的氨基酸取代。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQ IDNO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶包括与SEQ ID NO：1具有至少95％的序列同一性的氨基酸序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述加帽效率大于95％。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的温育进一步包括：在至少30℃至约70℃的温度下执行体外转录。
12.一种组合物，其包括：
rNTP、帽类似物和RNA聚合酶，所述RNA聚合酶包括：(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述帽类似物具有下式：
Figure FDA0003075546710000031
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同；
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
14.根据权利要求12或13所述的组合物，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
15.根据权利要求12或14所述的组合物，其中所述帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的组合物，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQID NO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的组合物，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的组合物，其中所述RNA聚合酶包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少两个或三个位置的氨基酸取代。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的组合物，其中所述RNA聚合酶进一步包括在对应于SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
20.根据权利要求12-18中任一项所述的组合物，进一步包括核酸模板。
21.一种试剂盒，其包括：
(a)帽类似物；
(b)RNA聚合酶，其包括(i)与SEQ ID NO：1具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列；和(ii)在对应于SEQ ID NO：1的388和567位的一个或多个位置处的氨基酸取代；和(iii)使用说明书，其包括使用在至少30℃至约70℃范围内的温育温度，实现至少95％的加帽。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述帽类似物具有下式
Figure FDA0003075546710000041
其中：
R3选自鸟苷、腺苷、胞苷、尿苷、鸟苷类似物、腺苷类似物、胞苷类似物、尿苷类似物；
R4是(N1p)xN2，其中N1和N2是核糖核苷，并且N1与N2相同或不同；
p每个位置独立地是磷酸基团、硫代磷酸、二硫代磷酸、烷基膦酸、芳基膦酸或N-磷酰胺键；和
x是0-8，其中如果X≥2，则在(N1-p)x中的核糖核苷N1彼此相同或不同，
R1和R2基团独立地选自O-烷基(O-甲基)、卤素、标签、氢或羟基。
23.根据权利要求21或22所述的试剂盒，其中N1和N2中的糖对于每个位置独立地选自核糖和脱氧核糖，并且可以包含修饰，所述修饰包括2’-O-烷基、2’-O-甲氧基乙基、2’-O烯丙基、2’-O烷基胺、2’-氟代核糖和2’-脱氧核糖；和/或N1和N2中的碱基对于每个位置独立地选自腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷，或者腺嘌呤、尿苷、鸟嘌呤或胞苷的类似物，并且核苷酸修饰可以选自N6-甲基腺嘌呤、N1-甲基腺嘌呤、N6-2’-O-二甲基腺苷、假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-碘尿苷、4-硫代尿苷、2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假异胞嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-羟基胞嘧啶、N4-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、次黄嘌呤、N1-甲基鸟嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、1-甲基-鸟苷、N2-甲基-鸟苷、N2,N2-二甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、N7-甲基-鸟苷、1-甲基-鸟苷、N2,N7-二甲基-鸟苷和异鸟嘌呤。
24.根据权利要求21-23中任一项所述的试剂盒，其中所述帽类似物是二核苷酸帽类似物或三核苷酸帽类似物。
25.根据权利要求21-24中任一项所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶包括在对应于SEQID NO：1的388和567位的位置处的氨基酸取代。
26.根据权利要求21-25中任一项所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少一个位置的氨基酸取代。
27.根据权利要求21-26中任一项所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶进一步包括对应于选自SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的至少三个两个位置的氨基酸取代。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的试剂盒，其中所述RNA聚合酶进一步包括在对应于SEQ ID NO：1的109、205、534和618位的位置处的氨基酸取代。
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