CN113083386B

CN113083386B - 一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法

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Publication number: CN113083386B
Application number: CN202110362088.1A
Authority: CN
Inventors: 李刚; 熊楠锟; 胡天保; 谢腾宝
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-04-02
Also published as: CN113083386A

Abstract

本发明公开了一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法，该芯片包括盖片层和疏水微结构层，盖片层包括至少一个进样口和一个储油腔，疏水微结构层包括至少一个微腔阵列和连通每个微腔阵列中各微腔的微管道阵列以及至少一个进样主管道。该芯片应用于液相样品离散化操作时，主要包括以下步骤：芯片的组装与脱气处理、充样、盖片层与疏水微结构层剥离；本发明基于油相和水相液体对结构层表面的浸润性差异以及液体表面张力作用，微管道中水相液体自动断裂，并被表面张力推入相连微腔，导致液样分散至各微腔中，实现其离散化。该芯片可实现液样的简便、快速、均一、低成本的离散化处理，可应用于数字化生物分析、微纳颗粒制备等领域。

Description

一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法

技术领域

本发明涉及微流控芯片分析技术领域，具体涉及一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法。

背景技术

样品离散化是生物、化学分析或者微纳米材料合成、药物颗粒制备中的重要步骤，传统的样品离散化方法包括：喷雾法、超声乳化法和搅拌乳化法。尽管这些传统方法具有规模化制备离散化样品的优势，但是无法实现样品离散化的均一性和重复性，也往往难以应用于微量样品的离散化，且这些基于机械作用的离散化方法可能会对液样中的生物样本产生损伤，因此实际应用中有较大的局限性。近年来，随着微流控技术的发展，液滴微流控芯片成为了目前液样离散化操作的主流平台，这一平台主要是利用两种互不相溶流体界面的不稳定性，通过表面张力和剪切力间的共同作用使含样品的液相在另一互不相溶液相（如油相）中分散形成大量液滴，从而实现样品的离散化。这种方法需要精密、昂贵的流体驱动装置实现两种液体相流速的精确控制，同时也需要在油相或水相中添加表面活性剂以防止相邻液滴的融合，这些要求在一定程度上限制了该方法的应用。除了液滴微流控技术，近些年，国际上还发展了一些阵列式的微流控芯片离散化方法无需添加表面活性剂维持离散化液样单元的稳定，避免了添加表面活性剂对分析结果或合成纯度的影响，但是这些方法也均有各自明显的缺陷，比如微阀阵列芯片需要外置气压装置和繁复的宏-微接口，滑移芯片需要繁琐的手动操作和操作人员熟练的操作技巧，亲-疏水图形芯片离散化液样的效果则受待离散化液样和芯片表面的浸润性及流体流速的影响较大，离散化效果不稳定，往往对不同液样的分解体积存在较大差异，而微腔阵列芯片在液样离散化过程中往往需要利用油相排除充样管道中的液样，以实现各微腔中液样的独立，但通常微管道截面尺度较小、油相粘度较大，导致微管道中流阻较大、离散化过程耗时较长。总之，现有的微流控液样大规模离散化方法在分解数目、操作的简便性、离散化效率、应用的成本和可靠性等方面均存在较大的局限。因此，迫切需要发展一种简便、快速、灵活度高、成本低廉的液样大规模离散化工具和方法，满足数字化生化分析、单分散微纳米颗粒合成等领域对高通量液样离散化的需求。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法，以解决现有的微流控液样大规模离散化方法存在操作复杂、离散化效率低、应用的成本高和可靠性差的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种液样简便、快速离散化芯片，包括盖片层和疏水微结构层，盖片层包括至少一个进样口和一个储油腔，疏水微结构层包括至少一个微腔阵列和连通每个微腔阵列中各微腔的微管道阵列以及至少一个进样主管道。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，盖片层为PDMS（聚二甲基硅氧烷）平板或聚氨酯平板，优选为聚二甲基硅氧烷平板。

进一步，微腔阵列包括若干个柱形微腔，柱形微腔的个数可根据实际需求确定并按照制备工艺制作完成，柱形微腔横截面为圆形或正多边形，且每个微腔阵列中所有柱形微腔的几何形状和大小均一致。

进一步，微管道的排布模式并不唯一，比如以每排错位排布或对齐排布，只要保证每个微腔阵列中所有微腔均连通即可；微管道的横截面小于微腔纵向横截面。

进一步，进样主管道位于微腔阵列一端或位于微腔阵列周围，且进样主管道的横截面大于连接微管道的横截面。

进一步，疏水微结构层的材质为硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物、聚苯乙烯或环氧树脂，或以聚二甲基硅氧烷或环烯烃共聚物为结构面、玻璃或硅为支撑基底的复合结构材质。

进一步，盖片层的厚度大于1毫米，优选为1~5毫米。

进一步，储油腔位置并没有具体限定，只要保证储油腔跟进样口不连通即可，如靠近盖片层末端，与进样口对应设置。

进一步，当盖片层与疏水微结构层贴合组装后，储油腔与微腔阵列及连接微管道均不连通。

上述液样简便、快速离散化芯片的使用方法，包括以下步骤：

（1）准备：将盖片层与疏水微结构层对准、贴合组装，并将组装好的芯片置于真空容器中进行脱气处理；

（2）充样：取出步骤（1）中经脱气处理的芯片，并在芯片进样口滴加待离散化水相液样；同时，在储油腔滴加油相液体；

（3）样品离散化：待步骤（2）中芯片充样完成后，将芯片的盖片层从疏水微结构层剥离，即可实现水相样品液的离散化。

进一步，步骤（1）中脱气处理的时间至少30分钟。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供一种液样简便、快速离散化芯片及其使用方法，首先将芯片组装完成后进行真空脱气处理，然后在芯片进样口和储油腔分别同时滴加待离散化水相液样和油相液体，利用油相液体对疏水微结构层表面的浸润特性结合剥离过程中“盖片层-疏水微结构层”接触缝隙的毛细作用，驱动油相铺满疏水微结构层表面，由于油相和水相液体对疏水微结构层疏水表面的浸润性差异以及水相液体表面张力作用，微管道中水相液体自动断裂，并被表面张力推入相连微腔，导致液样分散至各微腔中，实现水相样品液的离散化；

2、该液样简便、快速离散化芯片无需依赖精密的微泵驱动和复杂的表面亲疏水图形化制作，也无需复杂的宏-微接口，避免了液样离散化操作对专业技术人员的依赖，可简便、快速实现液样的均一、低成本的离散化处理；同时，基于该芯片的样品离散化方法可以实现芯片中填充水相液样的近乎完全离散化，相比现有的液体离散化系统，大大降低了样品的损耗率；另外，该方法基于微腔阵列几何结构结合液体表面张力作用实现自发离散化的方式，既避免了传统液滴乳化方法离散化效果易受流体驱动系统波动性影响的问题，也无需添加表面活性剂来维持离散化液滴的稳定性，避免了外加试剂对反应体系的影响。总之，本发明提供的液样简便、快速离散化芯片具有操作简便、离散化效率高、成本低廉、样品利用率高、单分散性好、可靠性高的优势，可应用于数字化生物分析、微纳颗粒制备合成等领域。

附图说明

图1为本发明液样简便、快速离散化芯片组成结构示意图；

图2为本发明液样简便、快速离散化芯片使用流程示意图；

图3为本发明实施例1液样简便、快速离散化芯片应用于数字PCR分析实验结果图；

图4为本发明实施例2液样简便、快速离散化芯片应用于数字化菌落计数实验结果图；

图5为本发明实施例3液样简便、快速离散化芯片应用于微纳颗粒合成实验结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

一种液样简便、快速离散化芯片，将其应用于数字PCR分析，以肺癌患者外周血中EGFR L858R突变检测为例，具体步骤如下：

（1）芯片制备：首先通过光刻工艺制作芯片模具，具体流程为：在干净的4英寸硅片上旋涂SU8-3010负性光刻胶（500 rpm，12 s；1000 rpm，40 s），静置1-2 h，经过前烘（95℃，15 min），曝光（3 min），避光后烘（93.5℃，3 min），自然冷却后显影（2 min），硬烘（170℃，30 min），制得芯片模具第一层的图形结构（对应芯片管道层）；待硅片冷却后，在图形结构上旋涂SU8-3050负性光刻胶（500 rpm，12 s；1000 rpm，40 s），静置2-3 h。经过前烘（95℃，30 min），曝光（3 min 40 s），避光后烘（93.5℃，5 min），自然冷却后显影（PGEMA，8 min），硬烘（170℃，30 min），完成芯片模具第二层的图形结构制作（对应芯片微腔层），待硅片冷却，则完成芯片模具制作。然后，通过PDMS浇注倒模制作芯片疏水微结构层，具体流程为：将PDMS预聚体与固化剂按质量比10:1混合，搅匀，置于真空容器中抽真空除泡（1 h），取出除泡后的PDMS浇注于芯片模具上，静置15 min后，移至热板上加热固化（80℃，2 h），待冷却后，将固化的PDMS从模具上剥离，并用解剖刀切割除去多余的PDMS，制得芯片疏水微结构层，疏水微结构层包含约35000个微腔及约100条串联微管道（如图3a所示），其中，每个微腔的形状为方柱形，截面正方形边长为100微米，深为100微米，微管道宽和高均为20微米；基于同样工艺流程，利用平整硅片或玻片结合2 mm厚限制框，制得2 mm厚的PDMS平板，并利用打孔器和解剖刀在适当的位置分别打孔和切制矩形通孔制作进样口和储油腔，制得PDMS盖片层；再将制得的芯片疏水微结构层和一片干净玻片置于等离子清洗机中，等离子处理30s，将疏水微结构层非结构面与玻片键合制得PDMS-玻璃复合疏水微结构层；最后，将盖片层与疏水微结构层对准、贴合，组装获得液相快速离散化芯片。

（2）样品溶液制备：针对EGFR L858R突变合成制备一对特异性引物；从肺癌患者外周血血清中提取循环DNA，并将聚合酶、引物、探针、缓冲液等加入存储循环DNA的样品管中，混合制备样品溶液；

（3）芯片脱气：将步骤（1）中获得的芯片置于真空容器中进行至少30分钟脱气处理，并真空封装备用；

（4）进样：向经步骤（3）处理后的芯片的进样口滴加40微升步骤（2）制备的样品溶液，使芯片中形成封闭微管道/微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道/微腔体系中的空气形成负压，驱动该水相液样进入并充满芯片中微管道/微腔体系；同时，向盖片层储油腔滴加硅油，使之充满；

（5）样品离散化：待水相液样充满芯片中整个微管道/微腔体系后，将PDMS盖片层从靠近储油腔一端剥离，由于油相液体对PDMS疏水微结构层表面的浸润性以及剥离过程中移动的 “盖片层-结构层”接触缝隙的毛细作用，驱动油相铺满疏水微结构层表面；同时，基于油相和水相液体对疏水微结构层疏水表面的浸润性差异以及水相液体表面张力作用，微管道中水相液体自动断裂，并被表面张力推入相连微腔，导致液样分散至各微腔中，实现水相样品液的离散化；

（6）液样密封：完成水相样品液的离散化后，将一片旋涂PDMS预聚体的玻璃封盖在已剥离盖片层的芯片疏水微结构层上，实现离散化液相样品的密封，形成的玻璃-PDMS-玻璃的三明治夹心结构保证了PCR热循环过程中的低水分挥发；

（7）PCR反应：将步骤（5）封闭后的芯片置于原位PCR仪上进行热循环扩增反应，具体热循环控制程序为：50℃持续10分钟，95℃持续10分钟，再经过45个循环的95℃ 45秒和60℃ 40 秒；

（8）信号获取和分析：通过荧光显微镜对步骤（7）完成PCR反应后的芯片进行荧光信号读取和数据分析，结果如图3b所示，图3b中(i)-(iii)分别显示了液相样品中靶标核酸分子浓度分别为10⁴、10³、10²copies/μL的PCR扩增结果。

实施例2：

一种液样简便、快速离散化芯片，将其应用于微生物菌落快速计数，以大肠杆菌检测为例，具体步骤如下：

（1）芯片制备：通过光刻制模工艺结合PDMS浇注倒模和氧等离子体表面处理键合工艺制作芯片疏水微结构层，该疏水微结构层包含约40000个微腔及约121000条连接相邻微腔的微管道，其中，每个微腔的形状为圆柱形，直径为100微米，深为100微米，微管道宽和高均为20微米；同时通过PDMS浇注、打孔制作包含一个进样口和一个储油腔的2毫米厚的芯片PDMS盖片层；然后，将盖片层与疏水微结构层对准、贴合，组装获得液相快速离散化芯片；芯片制备的具体过程参照实施例1；

（2）芯片脱气：步骤（1）中获得的芯片置于真空容器中进行至少30分钟脱气处理，并真空封装备用；

（3）进样：向经步骤（3）处理后的芯片的进样口滴加40微升步骤（2）制备的样品溶液，使芯片中形成封闭微管道/微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道/微腔体系中的空气形成负压，驱动该水相液样进入并充满芯片中微管道/微腔体系；同时，向盖片层储油腔滴加硅油，使之充满；

（4）样品离散化：待水相液样充满芯片中整个微管道/微腔体系后，将PDMS盖片层从靠近储油腔一端剥离，由于油相液体对PDMS疏水微结构层表面的浸润性以及剥离过程中移动的 “盖片层-结构层”接触缝隙的毛细作用，驱动油相铺满疏水微结构层表面；同时，基于油相和水相液体对疏水微结构层疏水表面的浸润性差异以及水相液体表面张力作用，微管道中水相液体自动断裂，并被表面张力推入相连微腔，导致液样分散至各微腔中，实现水相样品液的离散化。

（5）液样密封：完成水相样品液的离散化后，将一片旋涂PDMS预聚体的玻璃封盖在已剥离盖片层的芯片疏水微结构层上，实现离散化液相样品的密封，形成的玻璃-PDMS-玻璃的三明治夹心结构保证了大肠杆菌温育培养过程中的低水分挥发；

（6）温育扩增：将步骤（5）封闭后的芯片置于恒温培养箱中进行37℃温育5小时；

（7）信号获取和分析：通过荧光显微镜对步骤（6）完成温育后的芯片进行荧光信号读取和数据分析，结果如图4所示，图4中 (a)-(d)分别显示了液相样品中大肠杆菌浓度分别为10⁵、10⁴、10³、10²CFU/μL的温育扩增结果。

实施例3：

一种液样简便、快速离散化芯片，将其应用于微纳颗粒合成，以聚乙二醇双丙烯酸酯（PEGDA）凝胶微球合成为例，具体步骤如下：

（1）芯片制备：通过光刻制模工艺结合PDMS浇注倒模制作包含20000个微腔及联通微管道网络的PDMS疏水微结构层，其中，每个微腔的形状为圆柱形，直径为100微米，深为100微米；同时通过PDMS浇注、打孔制作包含一个进样口和一个储油腔的2毫米厚的芯片PDMS盖片层；然后，将盖片层与疏水微结构层对准、贴合，组装获得液相快速离散化芯片；芯片制备的具体过程参照实施例1；

（2）芯片脱气：将步骤（1）中获得的芯片置于真空容器中进行至少30分钟脱气处理，并真空封装备用；

（3）进样：向经步骤（2）处理后的芯片的进样口滴加40微升样品液（由1.6微升0.01克/毫升的罗丹明B、30微升乙醇、8微升PEGDA、0.4微升1173光引发剂（2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙，HMPP）混合而成，使芯片中形成封闭微管道/微腔体系，利用脱气PDMS盖片吸收微管道/微腔体系中的空气形成负压，驱动该液相样品进入并充满芯片中微管道/微腔体系；同时，向盖片层储油腔滴加正十六烷，使之充满；

（4）样品离散化：待水相液样充满芯片中整个微管道/微腔体系后，将PDMS盖片层从靠近储油腔一端剥离，由于油相液体对PDMS疏水微结构层表面的浸润性以及剥离过程中移动的 “盖片层-结构层”接触缝隙的毛细作用，驱动油相铺满疏水微结构层表面；同时，基于油相和水相液体对疏水微结构层疏水表面的浸润性差异以及水相液体表面张力作用，微管道中水相液体自动断裂，并被表面张力推入相连微腔，导致液样分散至各微腔中，实现水相样品液的离散化，结果如图5a所示；

（5）离散化样品球形化：完成水相样品液的离散化后，将芯片置于室温或热板上，使得离散化液滴中乙醇挥发，导致离散化水相液滴收缩，并在表面张力作用下，水相液滴在连续油相中形成球形，因为所有微腔体积相同，形成的球形液滴具有很好的均一性（如图5b所示）；

（6）聚合成型：在离散化样品完成球形化后，将芯片暴露于330-380 nm的100 W紫外光下照射120分钟，通过光固化方式使得球形水相液滴聚合形成PEGDA凝胶微球，结果如图5c和5d；

（7）微球收集：在完成聚合后，将芯片置于异丙醇浸泡5分钟，震荡，最后离心收集PEGDA小球。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种液样简便、快速离散化芯片，其特征在于，包括盖片层和疏水微结构层，所述盖片层包括至少一个进样口和一个储油腔，所述疏水微结构层包括至少一个微腔阵列和连通每个微腔阵列中各微腔的微管道阵列以及至少一个进样主管道；所述微管道的横截面小于微腔纵向横截面；所述进样主管道位于微腔阵列一端或位于微腔阵列周围，且进样主管道的横截面大于微管道的横截面；所述盖片层为聚二甲基硅氧烷平板或聚氨酯平板，其厚度大于1毫米；所述盖片层与疏水微结构层贴合组装后，储油腔与微腔阵列及微管道均不连通；所述液样简便、快速离散化芯片的使用方法包括以下步骤：

（3）样品离散化：待步骤（2）中芯片充样完成后，将芯片的盖片层从靠近储油腔的一端从疏水微结构层剥离，即可实现水相样品液的离散化。

2.根据权利要求1所述的液样简便、快速离散化芯片，其特征在于，所述微腔阵列包括若干个柱形微腔，柱形微腔横截面为圆形或正多边形，且每个微腔阵列中所有柱形微腔的几何形状和大小均一致。

3.根据权利要求1所述的液样简便、快速离散化芯片，其特征在于，所述疏水微结构层的材质为硅、玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、环烯烃共聚物、聚苯乙烯或环氧树脂，或以聚二甲基硅氧烷或环烯烃共聚物为结构面、玻璃或硅为支撑基底的复合结构材质。

4.根据权利要求1所述的液样简便、快速离散化芯片，其特征在于，所述步骤（1）中脱气处理的时间至少30分钟。