CN113073106A

CN113073106A - 新型冠状病毒b.1.525尼日利亚突变株rbd的基因及其应用

Info

Publication number: CN113073106A
Application number: CN202110621618.XA
Authority: CN
Inventors: 翟俊辉; 杜红; 王轲珑
Original assignee: Beijing Huapeng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Huaxia Biotechnology (Qingdao) Co.,Ltd.
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2041-06-04
Also published as: CN113073106B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因及其应用。本发明的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示。本发明通过优化野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因序列，并结合筛选确定了相对最佳序列，优化后序列产生的克隆表达效率比野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD序列表达效率大幅提高，从而，本发明的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因可以用于制备新型冠状病毒疫苗。

Description

新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因及其应用。

背景技术

2019新型冠状病毒SARS-CoV-2，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV（引发重症急性呼吸综合征）和MERS-CoV（引发中东呼吸综合征）。

冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒粒子呈不规则形状，直径约60-220nm；基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。病毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白（S，Spike Protein，是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点）；小包膜糖蛋白（E，Envelope Protein，较小，与包膜结合的蛋白）；膜糖蛋白（M，Membrane Protein，负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成）。

冠状病毒的核酸为非节段单链（+）RNA，长27-31kb，是RNA病毒中最长的RNA核酸链，突变可以说是新冠病毒这类RNA病毒的最大特性。病毒入侵宿主细胞后，会大量复制自己来实现感染传播。在复制过程中，RNA病毒并没有校正机制，出现复制错误无法自行纠正，在大量的复制中就容易出现新的变异，而新的变异的结果是导致疫苗有效性降低或者失效的主要原因。

目前全世界已经发现数百种新冠病毒的变种，2020年12月中旬，尼日利亚首先在新冠患者的病毒基因组序列中检测到B.1.525毒株，之后，英国、法国等地也很快发现了该变种。仅仅2个月后，B.1.525就占到尼日利亚感染病例20%以上，全球有200多个病例中发现了这种病毒。病毒的主要变异是，S蛋白N端结构域的Q52R和A67出现了氨基酸替代，以及69-70和144位点的缺失。前者是新变种所特有的，后面2个位点的缺失则同样出现在了此前的英国变种B.1.1.7上。由于新冠病毒的N端结构域具有很高的抗原性，这个区域发生突变，很容易导致抗体中和逃逸现象出现。此外，1例抗体中和逃逸变体中还出现了S蛋白膜近端干区的888位和870位氨基酸替换。B.1.525携带了多种常见的新冠病毒突变，比如D614G，这个极大增强病毒传染性的突变几乎存在现阶段所有病毒变种中；还有之前出现E484K突变，使人对几种疫苗产生大约3倍的耐药性，对大多数恢复期抗体产生10倍的耐药性。Q677H位置的氨基酸替换，在美国最近发现的变种病毒中也有出现。这种突变发生在S蛋白远离受体结合域的S1部分，与D614G突变一样，可能增加S1-S2关联的稳定性，从而增强传播能力。该突变也可能有利于受体结合域的开放而不是封闭结合。B.1.525在构成其他蛋白质的基因组区域中也出现了大量突变，其中3个发生在构成大规模复制复合物的基因中，包括Orf1aNSP3:(T1189I)，NSP6:(3个氨基酸106-108缺失)，1个在主要的RNA依赖性RNA聚合酶Orf1bNSP12:(P323F)。病毒结构蛋白E:(l21F)、M:(i82f)和N:(A12G)和(T208I)的基因也出现了4个突变。这些突变大量出现的跨膜蛋白NSP6、E、M、N蛋白，在新冠患者中具有高度的抗原性。所有这些突变都可能导致抗体中和逃逸。orf1a中的其余突变可能提高复制效率，或者导致抗体中和逃逸，亦或是同时导致2种后果。

研究证实，大多数中和抗体都针对新型冠状病毒的突刺蛋白(S)的受体结合域(RBD)，RBD是病毒进入宿主细胞的关键部位，RBD蛋白可以和细胞的ACE2受体相互作用，打开细胞表面通道，使病毒颗粒得以进入细胞内，完成病毒入侵过程，因此研发针对新冠病毒突变株的重组RBD疫苗是有效防治病毒突变株的重点。

作为重组疫苗抗原组成，利用CHO、293T等细胞真核表达系统制备疫苗抗原是保证其免疫原性和正确高级结构的最佳途径之一。然而，突变株野生型病毒序列在真核表达系统一般来说表达水平很低，但作为疫苗研发而言，高表达水平是首要前提，其受多个环节的影响，例如，抗原编码的核苷酸序列，改变mRNA二级结构、筛选不同的信号肽、载体选择、宿主细胞选择，发酵工艺、培养工艺优化等等，但在这些因素中，首要需解决问题的是蛋白基因编码序列。

因此，如何提供一种经过设计可高效表达的新型冠状病毒尼日利亚突变株RBD核苷酸序列，并对其进行表达应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的设计优化后的基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供利用上述基因制备新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的方法。

本发明的再一目的在于提供上述基因在制备新型冠状病毒疫苗方面的应用。

根据本发明具体实施方式的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的优化后的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示。

其中，SEQ ID NO.1：

AGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAAAGATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACAAACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTC。

SEQ ID NO.6：

GCTAGC CCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAAAGATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACAAACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC。

其中，斜体“GCTAGC”为酶切位点，下划线部分“CCACC”为KOZAK序列。

为了在宿主细胞特异性高表达，本发明选择人血清白蛋白序列中的信号肽，其氨基酸序列为：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR，核苷酸序列为：ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGA。

因此，成熟的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株的RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

为了在宿主细胞特异性高表达，本发明也可以选择中国仓鼠血清白蛋白序列中的信号肽，其氨基酸序列为MKWVTFLLLLFVSDSAFS，优化后宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽的核的苷酸序列如下：

Atgaaatgggttactttcttattattattgtttgtatctgattctgctttttca。

本发明还提供了包含上述新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的重组载体，优选为pcDNA3.1+。将本发明的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD插入到质粒pcDNA3.1+的Nhel/Notl双酶切限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达载体。

本发明还提供新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的宿主细胞，优选为中国仓鼠CHO细胞、293细胞。中国仓鼠CHO细胞易实现大规模高密度培养、完整的蛋白糖基化修饰。宿主细胞特异性高表达分泌蛋白信号肽序列为人血清白蛋白序列中的信号肽，其氨基酸序列为：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR。

本发明还提供制备新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）用含有上述新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞，诱导新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的表达；

（3）回收并纯化所表达的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD。

本发明还提供了上述核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.6所示的基因在制备新冠病毒疫苗方面的应用。运用基因工程手段产业化生产新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD蛋白，并配以合适的药学佐剂，将其应用于新型冠状病毒疫苗中。

本发明的有益效果：

本发明通过优化野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因序列，并结合筛选确定了相对最佳序列，优化后序列产生的克隆表达效率比野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD序列提高了6倍。本发明的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD可诱导小鼠产生高滴度病毒中和抗体。本发明的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因可用于新型冠状病毒疫苗的生产中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示pcDNA3.1-RBD（B.1.525)质粒图谱。

图2显示4种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较情况。

图3为RBD蛋白纯化样品SDS-PAGE图。

图4显示二免14天后小鼠血清抗RBD抗体滴度（RBD糖蛋白）。

图5显示假病毒中和试验结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例 1 优化野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD序列

在野生型新型冠状病毒RBD氨基酸序列的基础上做如下优化，得到初步优化的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD核苷酸序列：

本发明按照中国仓鼠CHO细胞遗传密码子偏性，对编码序列中编码氨基酸序列的密码子进行优化；

其中，根据密码子的偏爱性、实验室以往的蛋白高效表达经验、mRNA二级结构等因素考虑，优化获得SEQ ID NO.1：

软件优化序列提供SEQ ID NO.2：

AGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGCGCTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCTTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGAATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTCTACAACTCCGCTTCCTTCTCGACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCTGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAAGTCCGTCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGAAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGTTGCGTCATCGCTTGGAACTCCAACAACCTCGACAGTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTGTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACACCATGCAACGGAGTGAAGGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCAACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTCTCCTTCGAGCTCTTGCACGCCCCTGCTACCGTGTGTGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTC。

软件优化序列提供SEQ ID NO.3：

CGTGTTCAGCCTACCGAATCTATTGTTCGTTTTCCTAATATTACCAACCTGTGTCCTTTTGGTGAAGTCTTTAATGCTACCCGTTTTGCTTCAGTTTATGCATGGAATCGTAAACGTATTAGTAACTGTGTTGCAGATTATAGCGTTCTGTATAACAGCGCCAGCTTTAGTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACTAAACTGAATGATCTGTGTTTTACCAATGTTTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGCCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAAGATTGCCGATTATAATTATAAACTGCCGGATGATTTTACCGGTTGTGTGATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGCAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTTCTACCGAAATTTATCAGGCGGGCAGCACACCGTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAACTGTTATTTTCCTCTGCAGTCTTATGGTTTTCAGCCGACCaacGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGCGTTGTGGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCAACGGTTTGTGGTCCTAAAAAGTCAACCAATCTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC。

新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株野生型RBD核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：

AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTC。

本发明进一步在优化型的序列前插入信号肽序列、KOZAK序列CCACC和酶切位点GCTAGC，在优化序列末端加入终止密码子taa和酶切位点GCGGCCGC。

选取宿主细胞特异性高表达人血清白蛋白信号肽序列，其核苷酸序列如:SEQ IDNO.5：

ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGA。

上述信号肽的氨基酸序列为：MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR。

含有信号肽的优化后的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD核苷酸序列如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示：

SEQ ID NO.6：

GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCAACAAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGAAAAAGGATCAGCAACTGCGTGGCAGACTACAGTGTGCTGTACAACTCCGCCTCCTTCTCCACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACCAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATTAGGGGCGACGAGGTGCGCCAGATCGCTCCTGGACAGACAGGAAAGATCGCCGACTATAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCTTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAAGTGGGCGGCAACTACAATTACCTGTACAGACTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAACCCTTCGAAAGAGACATCTCCACAGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCATGTAACGGAGTGAAGGGATTTAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGCTTCCAGCCAACAAACGGCGTGGGCTACCAGCCTTACAGGGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCTACAGTGTGTGGACCTAAGAAGTCCACCAACCTGGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC。

SEQ ID NO. 7：

GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAAGAGTGCAGCCAACAGAGAGCATCGTGCGCTTCCCCAACATCACAAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCTTCCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGAATCTCCAACTGCGTGGCTGACTACTCCGTCCTCTACAACTCCGCTTCCTTCTCGACCTTCAAGTGCTACGGTGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTCTGCTTCACCAACGTCTACGCTGACTCCTTCGTGATCCGCGGCGACGAAGTCCGTCAAATCGCTCCTGGTCAGACCGGAAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGTTGCGTCATCGCTTGGAACTCCAACAACCTCGACAGTAAGGTGGGTGGTAACTACAACTACCTGTACCGCCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAAAGGGACATCTCCACCGAGATCTACCAGGCCGGCTCCACACCATGCAACGGAGTGAAGGGTTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAATCCTACGGTTTCCAGCCCACCAACGGTGTGGGATACCAGCCTTACCGCGTGGTGGTGCTCTCCTTCGAGCTCTTGCACGCCCCTGCTACCGTGTGTGGTCCTAAGAAGTCCACCAACCTCGTGAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC。

SEQ ID NO. 8：

GCTAGCCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGACGTGTTCAGCCTACCGAATCTATTGTTCGTTTTCCTAATATTACCAACCTGTGTCCTTTTGGTGAAGTCTTTAATGCTACCCGTTTTGCTTCAGTTTATGCATGGAATCGTAAACGTATTAGTAACTGTGTTGCAGATTATAGCGTTCTGTATAACAGCGCCAGCTTTAGTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACTAAACTGAATGATCTGTGTTTTACCAATGTTTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGCCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAAGATTGCCGATTATAATTATAAACTGCCGGATGATTTTACCGGTTGTGTGATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGCAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTTCTACCGAAATTTATCAGGCGGGCAGCACACCGTGTAATGGTGTTAAAGGTTTTAACTGTTATTTTCCTCTGCAGTCTTATGGTTTTCAGCCGACCaacGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGCGTTGTGGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCAACGGTTTGTGGTCCTAAAAAGTCAACCAATCTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCtaaGCGGCCGC。

实施例 2 重组RBD蛋白的表达与纯化

将SEQ ID NO.6所示的完整目的基因进行Nhel/Notl双酶切，之后连接到经过同样酶切的pcDNA3.1+真核表达载体中，得到重组载体，质粒结构如图1所示。

将重组载体分别转化大肠杆菌，按常规方法进行质粒扩增，之后用天根生物有限公司试剂盒提取质粒。

转染中国仓鼠CHO细胞：按照Lipofectin试剂盒手册配制，得到DNA-脂质体混合物，并加入DMEM培养基培养的中国仓鼠CHO细胞中，37℃温育2h；换液成含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48h。

Neomycin抗性克隆筛选：把转染后的细胞从培养瓶中分离，按1×10⁵细胞/孔加到96孔板中，以含500 μg/mL Neomycin的DMEM培养基(加10% FBS)继续培养转染后的细胞，经7d后，选取形成克隆的细胞，扩增培养到6孔板。

表达RBD克隆分析：NEO抗性克隆经培养后，以1.5×10⁵/mL细胞密度接种到T25 培养瓶，在含5% CO₂培养箱中37℃培养72h，取上清得到RBD蛋白。

以同样的方式构建含信号肽序列的野生型新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株序列、及其优化株SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的表达载体，并进行转化、表达。

对获得的上清液进行鉴定，并分析RBD蛋白含量。

通过鉴定野生株序列、及SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8均可表达新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株的RBD蛋白，对上述四种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较，结果见表1、图2。

表 1 4种序列真核表达构建的克隆分泌的蛋白浓度比较（μg/mL）

结果如表1所示，SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8表达的蛋白浓度分别为9.36μg/mL、3.72μg/mL、2.40μg/mL，均高于野生型序列所表达的蛋白浓度，同时，SEQ IDNO.6表达的蛋白浓度显著高于SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所表达的蛋白浓度。

成熟的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株的RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF。

通过10 kDa膜包对SEQ ID NO.6表达蛋白进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10 kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释后，通过离子交换层析进行纯化，备用。如图3所示，纯化获得的RBD蛋白分子量在34kD左右，SDS-PAGE图显示RBD蛋白条带均一，纯度较好。

实施例 3 小鼠免疫实验

取20只6～8周龄大的雌性BALB/c小鼠，随机分为以下各组：

免疫1组（10μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100μL疫苗。所用疫苗为10 μg RBD+100 μg Al(OH)₃，其中，RBD即为实施例2制备得到的CHO细胞表达的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD糖蛋白，按100 μL体积含有10 μg RBD和100μg Al(OH)₃用生理盐水配伍疫苗。

免疫2组（5μg免疫组）：第0、14天分别肌肉注射100 μL疫苗。所用疫苗为5 μg RBD+100μg Al(OH)₃，其中，其中，RBD即为实施例2制备得到的CHO细胞表达的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD糖蛋白，按100μL体积含有5μg RBD和100μg Al(OH)₃用生理盐水配伍疫苗。

佐剂对照组：第0、14天分别肌肉注射100μL疫苗，所用佐剂为100μg Al(OH)₃。

生理盐水对照组：第0、14天分别肌肉注射100μL生理盐水。

以上各组均在第28天取血。

用ELISA法测各组小鼠血清中抗RBD的抗体滴度。操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M]. 科学出版社, 2008.。

结果如图4所示，二免两周10μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^6.22， 5μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^5.24，而佐剂组为1×10^1.58，生理盐水组为1×10^1.78。免疫组（10μg或者5μg组）的抗体滴度远高于生理盐水对照组或佐剂对照组的抗体滴度。

实施例 4 假病毒中和试验

假病毒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品号DD1451-02，操作步骤参见产品说明书。中和抗体在体外与假病毒中和，使得假病毒丧失感染细胞的能力，进入细胞的假病毒会表达fluc蛋白，与发光底物反应后，通过机器检测其发光值，通过与假病毒对照组发光值比较，计算其抑制百分比，通过计算公式可以计算出当假病毒50%被抑制时抗体的稀释倍数，来计算其ED50，用ED50来表示抗体对假病毒中和活性大小。

1) 样品准备：实施例3得到的4组小鼠免疫后血清56℃水浴灭活0.5-1小时；

2) 将96孔板四周的36个孔中加入260 μL高压灭菌水封边，减少因边缘孔培养基蒸发带来的误差；

3) 第2列（细胞对照CC）加入DMEM完全培养基150 μL/孔，第3列（病毒对照VC）列加入DMEM完全培养基100 μL/孔，在B4-B11孔（即96孔板的第4-11列）中加入培养基142.5 μL/孔，其余孔加入培养基100 μL/孔，每列6孔；

4) B4-B11孔中加入待测小鼠免疫血清样品（第一孔按1:100加入，倍比稀释。）7.5μL；

5) 对B4-B11孔中液体轻柔的反复吹吸6-8次，然后转移50 μL液体至对应的C4-C11孔（即96孔板的第C排4-11列），之后所有孔都3倍倍比稀释；

6) 用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴TCID50/mL，于第3~11列每孔加50μL；

7) 将上述96孔板置于细胞培养箱中（37℃，5%CO₂）孵育1小时；

8) 待孵育30min后，开始消化Huh7细胞，将细胞浓度稀释至2×10⁵cells/mL；

9) 孵育结束后，每孔加入100 μL细胞，使每孔细胞为2×104cells；

10) 放入37℃，5%CO₂细胞培养箱中培养24小时；

11) 培养完毕后，吸弃150μL上清，加入100 μL Bright-GloTM 荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min后，反复吹打，转移150 μL液体至白板中；

12) 使用PerkinElmer EnSight多功能成像酶标仪读取发光值（RLU）；

计算中和抑制率：

其中，VC-病毒对照VC，CC-细胞对照CC。

中和抗体滴度被表示为抑制率为50%时对应的血清稀释度的倒数或者抑制率为50%时对应的抗体浓度。

阳性判断值：中和实验过程中需要设置阴性对照，阳性对照，作为参照，来判断实验是否成立，阴性对照ED50小于30，阳性ED50大于30作为判断值。

结果如图5所示，二免两周高剂量10 μg免疫组小鼠病毒中和抗体滴度可达1×10^2.52，低剂量5 μg免疫组小鼠特异性抗体滴度可达1×10^2.33，而佐剂组为1：10 ，生理盐水组未检测到中和抗体。高剂量10 μg免疫组（10 μg RBD+100 μg Al(OH)₃）和低剂量5 μg免疫组（5 μg RBD+100 μg Al(OH)₃）的病毒中和抗体滴度＞1：100，明显高于剂对照组和生理盐水对照组。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 北京华芢生物技术有限公司

<120> 新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtgcagc caacagagag catcgtgagg ttccccaaca tcaccaacct gtgccccttc 60

ggcgaggtgt tcaacgcaac aaggttcgcc agcgtgtacg cctggaacag aaaaaggatc 120

agcaactgcg tggcagacta cagtgtgctg tacaactccg cctccttctc caccttcaaa 180

tgctatggcg tgtcccccac caagctgaac gatctgtgtt ttaccaacgt gtacgccgac 240

tccttcgtga ttaggggcga cgaggtgcgc cagatcgctc ctggacagac aggaaagatc 300

gccgactata actacaagct gcccgacgac ttcaccggct gcgtgattgc ttggaactcc 360

aacaacctgg acagtaaagt gggcggcaac tacaattacc tgtacagact gttcaggaag 420

agcaacctga aacccttcga aagagacatc tccacagaga tctaccaggc cggcagcacc 480

ccatgtaacg gagtgaaggg atttaactgc tacttccccc tgcagtccta cggcttccag 540

ccaacaaacg gcgtgggcta ccagccttac agggtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg 600

cacgcccccg ctacagtgtg tggacctaag aagtccacca acctggtgaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 2

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtgcagc caacagagag catcgtgcgc ttccccaaca tcacaaacct gtgccccttc 60

ggcgaggtgt tcaacgctac caggttcgct tccgtgtacg cctggaacag gaagagaatc 120

tccaactgcg tggctgacta ctccgtcctc tacaactccg cttccttctc gaccttcaag 180

tgctacggtg tgtcccctac caagctgaac gacctctgct tcaccaacgt ctacgctgac 240

tccttcgtga tccgcggcga cgaagtccgt caaatcgctc ctggtcagac cggaaagatc 300

gccgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggtt gcgtcatcgc ttggaactcc 360

aacaacctcg acagtaaggt gggtggtaac tacaactacc tgtaccgcct gttccgcaag 420

agcaacctga agcccttcga aagggacatc tccaccgaga tctaccaggc cggctccaca 480

ccatgcaacg gagtgaaggg tttcaactgc tacttccccc tgcaatccta cggtttccag 540

cccaccaacg gtgtgggata ccagccttac cgcgtggtgg tgctctcctt cgagctcttg 600

cacgcccctg ctaccgtgtg tggtcctaag aagtccacca acctcgtgaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 3

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgttcagc ctaccgaatc tattgttcgt tttcctaata ttaccaacct gtgtcctttt 60

ggtgaagtct ttaatgctac ccgttttgct tcagtttatg catggaatcg taaacgtatt 120

agtaactgtg ttgcagatta tagcgttctg tataacagcg ccagctttag tacctttaaa 180

tgttatggtg tgagtccgac taaactgaat gatctgtgtt ttaccaatgt ttatgcagat 240

agctttgtta ttcgtggtga tgaagttcgc cagattgcac cgggtcagac cggtaagatt 300

gccgattata attataaact gccggatgat tttaccggtt gtgtgattgc ctggaattca 360

aataatctgg atagcaaagt gggtggtaat tataattatc tgtatcgtct gtttcgcaaa 420

agcaatctga aaccgtttga acgtgatatt tctaccgaaa tttatcaggc gggcagcaca 480

ccgtgtaatg gtgttaaagg ttttaactgt tattttcctc tgcagtctta tggttttcag 540

ccgaccaacg gtgttggtta tcagccgtat cgcgttgtgg ttctgagttt tgaactgctg 600

catgccccgg caacggtttg tggtcctaaa aagtcaacca atctggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 4

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagtccaac caacagaatc tattgttaga tttcctaata ttacaaactt gtgccctttt 60

ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc 120

agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta tataattccg catcattttc cacttttaag 180

tgttatggag tgtctcctac taaattaaat gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat 240

tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt 300

gctgattata attataaatt accagatgat tttacaggct gcgttatagc ttggaattct 360

aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat tataattacc tgtatagatt gtttaggaag 420

tctaatctca aaccttttga gagagatatt tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca 480

ccttgtaatg gtgttaaagg ttttaattgt tactttcctt tacaatcata tggtttccaa 540

cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac agagtagtag tactttcttt tgaacttcta 600

catgcaccag caactgtttg tggacctaaa aagtctacta atttggttaa aaacaaatgt 660

gtcaatttc 669

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc ga 72

<210> 6

<211> 763

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60

attccagggg tgtgtttcgt cgaagagtgc agccaacaga gagcatcgtg aggttcccca 120

acatcaccaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc aacaaggttc gccagcgtgt 180

acgcctggaa cagaaaaagg atcagcaact gcgtggcaga ctacagtgtg ctgtacaact 240

ccgcctcctt ctccaccttc aaatgctatg gcgtgtcccc caccaagctg aacgatctgt 300

gttttaccaa cgtgtacgcc gactccttcg tgattagggg cgacgaggtg cgccagatcg 360

ctcctggaca gacaggaaag atcgccgact ataactacaa gctgcccgac gacttcaccg 420

gctgcgtgat tgcttggaac tccaacaacc tggacagtaa agtgggcggc aactacaatt 480

acctgtacag actgttcagg aagagcaacc tgaaaccctt cgaaagagac atctccacag 540

agatctacca ggccggcagc accccatgta acggagtgaa gggatttaac tgctacttcc 600

ccctgcagtc ctacggcttc cagccaacaa acggcgtggg ctaccagcct tacagggtgg 660

tggtgctgtc ttttgagctg ctgcacgccc ccgctacagt gtgtggacct aagaagtcca 720

ccaacctggt gaaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763

<210> 7

<211> 763

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60

attccagggg tgtgtttcgt cgaagagtgc agccaacaga gagcatcgtg cgcttcccca 120

acatcacaaa cctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaacgc taccaggttc gcttccgtgt 180

acgcctggaa caggaagaga atctccaact gcgtggctga ctactccgtc ctctacaact 240

ccgcttcctt ctcgaccttc aagtgctacg gtgtgtcccc taccaagctg aacgacctct 300

gcttcaccaa cgtctacgct gactccttcg tgatccgcgg cgacgaagtc cgtcaaatcg 360

ctcctggtca gaccggaaag atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg 420

gttgcgtcat cgcttggaac tccaacaacc tcgacagtaa ggtgggtggt aactacaact 480

acctgtaccg cctgttccgc aagagcaacc tgaagccctt cgaaagggac atctccaccg 540

agatctacca ggccggctcc acaccatgca acggagtgaa gggtttcaac tgctacttcc 600

ccctgcaatc ctacggtttc cagcccacca acggtgtggg ataccagcct taccgcgtgg 660

tggtgctctc cttcgagctc ttgcacgccc ctgctaccgt gtgtggtcct aagaagtcca 720

ccaacctcgt gaaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763

<210> 8

<211> 763

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctagcccac catgaagtgg gtaaccttta tttcccttct ttttctcttt agctcggctt 60

attccagggg tgtgtttcgt cgacgtgttc agcctaccga atctattgtt cgttttccta 120

atattaccaa cctgtgtcct tttggtgaag tctttaatgc tacccgtttt gcttcagttt 180

atgcatggaa tcgtaaacgt attagtaact gtgttgcaga ttatagcgtt ctgtataaca 240

gcgccagctt tagtaccttt aaatgttatg gtgtgagtcc gactaaactg aatgatctgt 300

gttttaccaa tgtttatgca gatagctttg ttattcgtgg tgatgaagtt cgccagattg 360

caccgggtca gaccggtaag attgccgatt ataattataa actgccggat gattttaccg 420

gttgtgtgat tgcctggaat tcaaataatc tggatagcaa agtgggtggt aattataatt 480

atctgtatcg tctgtttcgc aaaagcaatc tgaaaccgtt tgaacgtgat atttctaccg 540

aaatttatca ggcgggcagc acaccgtgta atggtgttaa aggttttaac tgttattttc 600

ctctgcagtc ttatggtttt cagccgacca acggtgttgg ttatcagccg tatcgcgttg 660

tggttctgag ttttgaactg ctgcatgccc cggcaacggt ttgtggtcct aaaaagtcaa 720

ccaatctggt taaaaacaaa tgtgtcaatt tctaagcggc cgc 763

<210> 9

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

Claims

1.新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.包含权利要求1所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体。

3.包含权利要求1所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体pcDNA3.1+。

4.一种制备新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用含有权利要求1所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

5.权利要求1所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因在制备新型冠状病毒疫苗方面的应用。

6.新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.包含权利要求6所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体。

8.包含权利要求6所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体pcDNA3.1+。

9.一种制备新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用含有权利要求6所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因的重组表达载体转化宿主细胞；

10.权利要求6所述的新型冠状病毒B.1.525尼日利亚突变株RBD的基因在制备新型冠状病毒疫苗方面的应用。