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CN113039197A - 使用靶特异性融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法 - Google Patents

使用靶特异性融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法 Download PDF

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CN113039197A
CN113039197A CN201980062787.5A CN201980062787A CN113039197A CN 113039197 A CN113039197 A CN 113039197A CN 201980062787 A CN201980062787 A CN 201980062787A CN 113039197 A CN113039197 A CN 113039197A
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CN
China
Prior art keywords
tcr
domain
cell
tfp
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980062787.5A
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English (en)
Inventor
帕特里克·亚历山大·博伊尔勒
罗伯特·霍夫梅斯特
丹尼尔·盖茨
瓦尼亚·阿什米诺瓦
丁健
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TCR2 Therapeutics Inc
Original Assignee
TCR2 Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、经工程化以表达一种或多种MUC16或IL13Rα2或MSLN TFP的T细胞及其用于治疗包括癌症在内的疾病的方法。

Description

使用靶特异性融合蛋白进行TCR重编程的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2018年7月26日提交的美国临时专利申请第62/703,824号、2018年8月30日提交的美国临时专利申请第62/725,066号、2018年7月26日提交的美国临时专利申请第62/703,834号、2018年9月5日提交的美国临时专利申请第62/727,469号和2018年9月5日提交的美国临时专利申请第62/727,459号的权益，所述美国临时专利申请的每一篇通过引用整体并入本文。
发明背景
大多数晚期实体瘤患者用标准疗法是无法治愈的。另外，常规治疗选项通常具有严重的副作用。已经进行了许多尝试来利用患者的免疫系统来排斥癌细胞，这种方法统称为癌症免疫疗法。然而，有几个障碍使其很难达到临床效果。虽然已经鉴定了数百种所谓的肿瘤抗原，但这些抗原通常来源于自身，因此可以针对健康组织实施癌症免疫治疗，或者免疫原性差。此外，癌细胞利用多种机制使其自身不可见或对癌症免疫疗法引发和传播的免疫攻击产生敌意。
使用嵌合抗原受体(CAR)修饰的自体T细胞疗法(其依赖于将遗传工程化的T细胞重定向至癌细胞上的合适的细胞表面分子)的最新进展显示出在利用免疫系统的力量治疗B细胞恶性肿瘤方面的有希望的结果(参见，例如，Sadelain等人，Cancer Discovery 3:388-398(2013))。CD-19特异性CAR T细胞(称为CTL019)的临床结果已显示患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者以及患有急性淋巴母细胞白血病(ALL)的儿童的完全缓解(参见，例如，Kalos等人，Sci Transl Med 3:95ra73(2011)，Porter等人，NEJM 365:725-733(2011)，Grupp等人，NEJM 368:1509-1518(2013))。替代方法是使用针对肿瘤相关肽抗原选择的T细胞受体(TCR)α链和β链对自体T细胞进行遗传工程。这些TCR链将形成完整的TCR复合物，并为T细胞提供具有第二确定特异性的TCR。对于在滑膜癌患者中表达NY-ESO-1-特异性TCRα链和β链的工程化的自体T细胞，获得了令人鼓舞的结果。
除了表达CAR或第二TCR的遗传修饰的T细胞在体外/离体识别并破坏各自靶细胞的能力以外，利用工程化的T细胞进行的成功患者疗法要求T细胞能够强烈活化、扩增和随时间推移的持续性，并且在疾病复发的情况下，使得能够产生“记忆”反应。CAR T细胞的高且可控制的临床疗效目前仅限于BCMA阳性和CD-19阳性B细胞恶性肿瘤和表达HLA-A2的表达NY-ESO-1-肽的滑膜肉瘤患者。显然有必要改进遗传工程化的T细胞，以更广泛地对抗各种人恶性肿瘤。
发明内容
本文提供了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)、经工程化以表达一种或多种TFP的T细胞及其用于治疗疾病的方法。
根据一个方面，本文提供了药物组合物，其包含(I)来自人受试者的T细胞，其中所述T细胞包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，(ii)TCR跨膜结构域，和(ⅲ)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗MUC16结合结构域、抗IL13Rα2结合结构域或抗间皮素(MSLN)结合结构域；以及(II)药学上可接受的载体；其中所述TCR亚基与所述抗原结合结构域可操作地连接；其中当在T细胞中表达时，所述TFP与TCR功能性地相互作用。
在一些实施方案中，所述T细胞与不含TFP的T细胞相比，对表达与抗原结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞表现出增强的细胞毒性。
在一些实施方案中，TCR亚基的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
在一些实施方案中，TCR亚基的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
根据一个方面，本文提供了药物组合物，其包含(I)来自人受试者的T细胞，其中所述T细胞包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分、(ii)跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗MUC16结合结构域、抗IL13Rα2结合结构域或抗间皮素(MSLN)结合结构域的scFv或单结构域抗体；以及(II)药学上可接受的载体；其中所述TCR亚基与所述抗MUC16结合结构或抗IL13Rα2结合结构或抗MSLN结合结构域可操作地连接；其中所述TCR亚基的胞外、跨膜和胞内信号传导结构域仅源自TCR亚基而非TCRα链或TCRβ链；其中当在所述T细胞中表达时，所述TFP与TCR功能性地相互作用；并且其中所述T细胞与不含所述TFP的T细胞相比，对表达与抗MUC16结合结构或抗IL13Rα2结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞表现出增强的细胞毒性。
在一些实施方案中，编码抗MUC16结合结构域或抗IL13Rα2结合结构域或抗MSLN结合结构域的序列通过编码接头的序列与编码TCR胞外结构域的序列连接。在一些实施方案中，接头包含(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，n为1至4的整数。
在一些实施方案中，抗MUC16结合结构域包含(a)重链(HC)CDR1序列GRTVSSLF、GRAVSSLF或GDSLDGYV，(b)HC CDR2序列ISRYSLYT或ISGDGSMR，和(c)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS或AADPPTWDY。在一些实施方案中，抗MUC16结合结构域包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗IL13Rα2结合结构域包含(a)重链(HC)CDR1序列GFTSDYYI或GFASDDYI，(b)HC CDR2序列ISSKYANT或ISSRYANT和(c)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS。在一些实施方案中，抗IL13Rα2结合结构域包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定序列同一性。
在一些实施方案中，抗MSLN结合结构域包含与SEQ ID NO:97或SEQ ID NO:98具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，药物组合物基本上不含血清。在一些实施方案中，scFv或单结构域抗体是scFv。在一些实施方案中，scFv或单结构域抗体是单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是VH结构域。在一些实施方案中，编码的抗TAA结合结构域包含抗TAA结合结构域，并且其中T细胞具有比CD8+T细胞或CD4+T细胞更大或更高效的细胞毒性活性，所述CD8+T细胞或CD4+T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(a)抗TAA结合结构域，其与(b)CD28胞外结构域的至少一部分、(c)CD28跨膜结构域、(d)CD28胞内结构域的至少一部分与(e)CD3ζ胞内结构域可操作地连接。在一些实施方案中，当在T细胞中表达时，编码的TFP分子与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。在一些实施方案中，T细胞是原代T细胞。在一些实施方案中，T细胞是人CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是人CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞还包含编码第一多肽的核酸，所述第一多肽包含选自由PD-1和BTLA组成的组的抑制性分子的至少一部分，其中所述抑制分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些实施方案中，所述第二多肽包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的共刺激结构域和初级信号传导结构域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160和B7-H3。在一些实施方案中，与不含TFP的T细胞相比，在表达与抗TAA结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞存在的情况下，T细胞产生的IL-2或IFNγ增加。在一些实施方案中，所述细胞是人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的单个T细胞包含至少两种TFP分子，或者所述群的至少两种T细胞共同包含至少两种TFP分子；其中所述至少两种TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；并且其中所述至少两种TFP分子中的至少一种与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。在一些实施方案中，TCR亚基仅源自CD3ε。在一些实施方案中，TCR亚基仅源自CD3γ。在一些实施方案中，TCR亚基仅源自CD3δ。
根据一个方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗TAA结合结构域的抗原结合结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且其中与用包含相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子的水平较低。在一些实施方案中，TCR胞内信号传导结构域源自CD3ε或CD3γ。在一些实施方案中，TCR亚基还包含TCR跨膜区。在一些实施方案中，TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRδ链、TCRγ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些实施方案中，TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRδ链、TCRγ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
在一些实施方案中，抗体结构域是与示于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的抗MUC16 VHH结构域。在一些实施方案中，抗体结构域是与示于SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的抗IL13Rα2VHH结构域。在一些实施方案中，使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定序列同一性。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
根据一个方面，本文提供了治疗患有与肿瘤相关抗原(TAA)(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来CD3ε或CD3γ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗TAA结合结构域的抗原结合结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且其中与用包含相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子的水平较低。
在一些实施方案中，抗体结构域是与示于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的VHH结构域。在一些实施方案中，抗体结构域是与示于SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:71或SEQ ID NO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的序列同一性的VHH结构域。在一些实施方案中，使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定序列同一性。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，与TAA表达相关联的疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤和与TAA(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)表达相关联的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：胶质母细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、输尿管癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌及其任何组合。在一些实施方案中，所述疾病是选自由由以下组成的组的癌症：胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌(papillaryserous ovarian adenocarcinoma)、透明细胞性卵巢癌、混合苗勒管卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结直肠腺癌、乳腺癌、与MUC16表达相关联的疾病、与IL13Rα2表达相关联的疾病、与MSLN表达相关联的疾病及其任何组合。在一些实施方案中，将表达TFP分子的细胞与增加表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。在一些实施方案中，对于给定的细胞因子，与用包含相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的给定的细胞因子的量相比，治疗后释放的给定的细胞因子的量减少至少10％。在一些实施方案中，给定的细胞因子包括选自由以下组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何组合。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被抑制，使得在治疗至少8天后，肿瘤的尺寸为用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物中的肿瘤尺寸的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％或至多60％，其中用表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物和用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物在治疗前具有相同的肿瘤尺寸。在一些实施方案中，哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被完全抑制至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多天。在一些实施方案中，与包含相同抗体结构域的CAR-T细胞相比，用TFP转导的T细胞群杀死相似量的肿瘤细胞。在一些实施方案中，用TFP转导的T细胞群具有不同于包含相同抗体结构域的CAR-T细胞的基因表达谱。在一些实施方案中，基因在用TFP转导的T细胞中的表达水平不同于该基因在包含相同抗体结构域的CAR-T细胞中的表达水平。在一些实施方案中，所述基因在抗原呈递、TCR信号传导、动态平衡、代谢、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、toll样受体信号传导、MMP和粘附分子信号传导或TNFR相关信号传导方面具有功能。
根据一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗TAA结合结构域的抗体结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
根据一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFR)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗TAA结合结构域的抗体结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
根据一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗TAA结合结构域的抗体结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
根据一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRα的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗TAA结合结构域的抗体结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
根据一个方面，本文提供了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRβ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗TAA结合结构域的抗体结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
在一些实施方案中，抗体结构域是人抗体结构域或人源化抗体结构域。在一些实施方案中，编码的抗原结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些实施方案中，编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR胞外结构域。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域。在一些实施方案中，TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自同一TCR亚基。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自由CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，TCR亚基包含胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体结构域包含抗体片段。在一些实施方案中，抗体结构域包含scFv或VH结构域。
在一些实施方案中，重组核酸分子编码(a)重链(HC)CDR1序列GRTVSSLF、GRAVSSLF或GDSLDGYV，(b)HC CDR2序列ISRYSLYT或ISGDGSMR，和(c)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS或AADPPTWDY。在一些实施方案中，重组核酸分子编码(a)重链(HC)CDR1序列GFTSDYYI或GFASDDYI，(b)HC CDR2序列ISSKYANT或ISSRYANT，和(c)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码重链可变结构域，其与示于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，抗体结构域是VHH结构域，其与示于SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ IDNO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性。在一些实施方案中，使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定序列同一性。在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一些实施方案中，共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(Cd137)组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与TFP结合而被磷酸化的氨基酸的修饰。在一些实施方案中，分离的核酸分子是mRNA。在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述ITAM包含选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d组成的组的蛋白质的ITAM或其部分、其功能性片段，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。在一些实施方案中，ITAM选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组，并替代选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的不同的ITAM。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸类似物。在一些实施方案中，核酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。在一些实施方案中，重组核酸分子还包含前导序列。
根据一个方面，本文提供了由本文所述的重组核酸分子编码的重组多肽分子。
根据一个方面，本文提供了包含抗TAA结合结构域(例如，MUC16、IL13Ra2或MSLN结合结构域)、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的重组TFP分子。
根据一个方面，本文提供了包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的重组TFP分子，其中所述TFP分子能够与内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
根据一个方面，本文提供了包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的重组TFP分子，其中所述TFP分子能够功能性地掺入内源TCR复合物中。
在一些实施方案中，重组TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含抗MUC16、抗IL13Rα2或抗MSLN结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
在一些实施方案中，抗TAA结合结构域是scFv、VHH或VH结构域。
在一些实施方案中，抗TAA结合结构域包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40的氨基酸序列具有95-100％同一性的重链、其功能性片段或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76的氨基酸序列具有95-100％同一性的重链、其功能性片段或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定序列同一性。
在一些实施方案中，重组TFP分子包含TCR胞外结构域，所述TCR胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些实施方案中，接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
根据一个方面，本文提供了包含编码TFP的序列的核酸。
在一些实施方案中，核酸选自由DNA和RNA组成的组。在一些实施方案中，核酸是mRNA。在一些实施方案中，核酸包含核苷酸类似物。在一些实施方案中，核酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。在一些实施方案中，核酸还包含启动子。在一些实施方案中，核酸是体外转录的核酸。在一些实施方案中，核酸还包含编码poly(A)尾的序列。在一些实施方案中，核酸还包含3’UTR序列。
根据一个方面，本文提供了包含编码TFP的核酸分子的载体。
在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含poly(A)尾。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含3’UTR。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述重组核酸分子的细胞。在一些实施方案中，本文提供了多肽分子。在一些实施方案中，本文提供了TFP分子。在一些实施方案中，本文提供了核酸。在一些实施方案中，本文提供了载体。在一些实施方案中，所述细胞是人T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞或CD4+CD8+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述抑制性分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些实施方案中，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
根据一个方面，本文提供了包含至少两种TFP分子的人CD8+T细胞或CD4+T细胞，所述TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
根据一个方面，本文提供了蛋白质复合物，其包含：(a)TFP分子，所述TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和(b)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
在一些实施方案中，TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基的蛋白质的胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些实施方案中，接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
根据一个方面，本文提供了蛋白质复合物，其包含(a)由本文公开的重组核酸分子中的任一种编码的TFP，和(b)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
根据一个方面，本文提供了蛋白质复合物，其包含：(a)TFP分子，所述TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和(b)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
在一些实施方案中，TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基的蛋白质的胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些实施方案中，接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
根据一个方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的TFP蛋白每蛋白质复合物。
根据一个方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的由本文所述的分离的核酸分子编码的TFP分子。
根据一个方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
根据一个方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种由本文所述重组核酸分子编码的TFP分子。
根据一个方面，本文提供了制备细胞的方法，其包括用本文所述的重组核酸分子、本文所述的核酸或本文所述的载体转导T细胞。
根据一个方面，本文提供了产生RNA工程化的细胞群的方法，其包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中所述RNA包含编码本文所述的TFP分子的核酸。
根据一个方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本文所述重组核酸分子、本文所述多肽分子、表达本文所述多肽分子的细胞、本文所述TFP分子、本文所述核酸、本文所述载体或本文所述细胞。在一些实施方案中，细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
根据一个方面，本文提供了治疗患有与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的分离的核酸分子、本文所述的多肽分子、表达多肽分子的细胞、本文所述的TFP分子、核酸、载体或本文所述的细胞。在一些实施方案中，与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关联的疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤、骨髓发育不良、骨髓增生异常综合征、白血病前期、与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关联的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，疾病是胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或其任何组合。在一些实施方案中，将表达TFP分子的细胞与增加表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。在一些实施方案中，与施用了有效量的表达抗TAA嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在哺乳动物中释放的细胞因子较少。在一些实施方案中，将表达TFP分子的细胞与改善与表达TFP分子的细胞的施用相关联的一种或多种副作用的剂组合施用。在一些实施方案中，将表达TFP分子的细胞与治疗与TAA(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)相关联的疾病的剂组合施用。在一些实施方案中，多肽分子、表达多肽分子的细胞、重组TFP、核酸、载体、复合物或细胞用作药剂。
根据一个方面，本文提供了用作药剂的编码TFP的重组核酸分子、TFP的非肽分子、表达TFP的多肽分子的细胞、重组TFP、编码TFP的核酸、包含编码TFP的核酸的载体、蛋白质复合物或细胞。根据一个方面，本文提供了治疗患有与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的重组核酸分子、多肽分子、表达多肽分子的细胞、重组TFP分子、核酸、载体或细胞，其中与施用了有效量的表达抗TAA嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在哺乳动物中释放的细胞因子较少。
根据一个方面，本文提供了药物组合物，其包含(I)来自人受试者的T细胞，其中所述T细胞包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域的至少一部分，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；和(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗原结合结构域；和(II)药学上可接受的载体；其中所述TCR亚基与所述抗IL13Rα2结合结构域可操作地连接；其中当在T细胞中表达时，所述TFP与TCR功能性地相互作用。在一些实施方案中，TCR亚基的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3δ或CD3γ。在一些实施方案中，TCR亚基的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些实施方案中，与不含TFP的T细胞相比，T细胞对表达与抗IL13Rα2结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞表现出增强的细胞毒性。
根据一个方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含TCR亚基，所述TCR亚基包含TCR胞外结构域的至少一部分和含有来自胞内信号传导结构域的刺激结构域的TCR胞内结构域；和包含抗原结合结构域的人或人源化抗体结构域，所述抗原结合结构域是抗间皮素结合结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且其中所述T细胞群，相较于具有较低间皮素表达的肿瘤细胞，优先杀伤具有较高间皮素表达的肿瘤细胞。
在一些实施方案中，TCR亚基还包含TCR跨膜结构域。在一些实施方案中，TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些实施方案中，TCR亚基的TCR胞外结构域、TCR跨膜结构域和TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。在一些实施方案中，TCR胞内信号传导结构域源自CD3ε或CD3γ。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利和专利申请具体地和单独地表示为通过引用并入。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅用彩色绘制的图。具有一副或多副彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本将由专利局根据请求并在支付必要的费用后提供。在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考下面的详细描述以及附图，将获得对本发明的特征和有利方面的更好理解，所述详细描述阐述了其中利用了本发明的原理的说明性实施方案，其中：
图1描绘了示例性IL13Rα2克隆序列。
图2是说明了进行Pall Forte Bio Dip&Read AHC表位分箱测定的方式的图解。AHC生物传感器尖端通过Fc结构域与4H11 scFv-Fc抗体(4H11)偶联，然后所述4H11 scFv-Fc抗体(4H11)通过其Fv结构域与抗原肽(“Ag”，例如，MUC16，IL13Ra2，MSLN)结合。然后以各自100nM的浓度加入SdAb(Ab2)，以评估与4H11 scFv-Fc抗体的对抗原结合的竞争。
图3A描绘了肿瘤细胞裂解试验的数据，所述测定测试了抗IL13Rα2纳米抗体的体外活性。
图3B描绘了实验数据，所述实验数据显示TFP T细胞诱导IFNγ和IL-2产生的能力。
图3C描绘肿瘤细胞裂解测定的实验数据，所述测定测试了抗IL13Rα2纳米抗体的体外活性。
图3D描绘了实验数据，所述实验数据显示了TFP T细胞诱导IFNγ和IL-2产生的能力。
图3E描绘了肿瘤细胞裂解测定的实验数据，所述测定测试了抗IL13Rα2纳米抗体的体外活性。
图3F描绘了实验数据，所述实验数据显示了TFP T细胞诱导IFNγ和IL-2产生的能力。
图4描绘了IL13Rα2U251 GBM模型的实验数据，所述模型测试IL13Rα2-TFP T细胞的功效。该图显示了在皮下注5x106个U251细胞至NSG小鼠中，然后在4天后静脉内施用1x107个IL13Rα2-TFP T细胞后，用卡尺测量的随时间变化的平均肿瘤体积。
图5A-图5C显示了亲本(骆马)和人源化抗MUC16单链抗体(VHH)的结合亲和力的滴定和测量。图5A是说明籍以使用NTA生物传感器(镀镍表面)筛选实施例5中产生的VHH结合物的实验程序的图解。加His标签的MUC16 SdAb(3.25μg/ml)与生物传感器结合，以0nM、1.56nM、6.25nM、25nM、50nM、100nM或200nM的浓度加入MUC16肽。缓冲液：1X Octet；1x
Figure BDA0002991027050000201
PBS(目录号21-040-CM)，含有0.02％
Figure BDA0002991027050000202
20，于30℃下。传感器：Pall Forte Bio Dip&Read(目录号18-5102)。图5B(克隆R3Mu4亲本和人源化变体)和图5C(克隆R3Mu29亲本和人源化变体)显示了sdAbs与MUC16靶标的结合动力学(也参见表1)。这些曲线用于推导每种蛋白质的结合亲和力常数，以及评估人源化对抗原结合的影响。
图6A-图6C显示了与用作阳性对照的MUC-16特异性scFv-Fc工具结合物4H11相比，抗MUC16 sdAb的表位分箱。图6A是说明了如图2中针对IL13Rα2结合物所示，进行PallForte Bio Dip&Read AHC表位分箱测定的方式的图解。AHC生物传感器尖端通过Fc结构域与4H11 scFv-Fc抗体(4H11)偶联，然后所述4H11 scFv-Fc抗体通过其Fv结构域与MUC16抗原肽(Ag)结合。然后在以各自100nM的浓度加入SdAb(Ab2)，以评估与4H11 scFv-Fc抗体的对MUC16抗原结合的竞争。如图6B所示，在4H11工具结合物已与MUC16肽结合后，MUC16sdAb-亲本(骆马)R3Mu4和亲本(骆马)R3Mu29显示出与MUC16肽结合，表明与4H11 scFv-Fc工具结合物相比，亲本sdAb识别并结合至MUC16肽的不同表位。没有抗原(MUC16肽)的阴性对照未显示结合，排除了任何非特异性结合的机会。图6C描绘了MUC16胞外域序列背景中相关抗体的表位。
图7显示了表达T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的T细胞对表达MUC16-胞外域(“MUC16ecto”)细胞的剂量依赖性裂解的图解，所述T细胞受体融合蛋白包含TCR亚基和含有抗MUC16结合结构域的抗体结构域。T细胞特异性杀伤SKOV3-MUC16Cterm卵巢癌细胞，所述细胞被转导以剂量依赖的方式过表达与C端细胞相关的MUC16形式，而亲本SKOV3 MUC16-阴性细胞免受T细胞介导的杀伤。同样，表达MUC16-TFP的T细胞消除了过表达MUC16的细胞相关形式的OVCAR3-MUC16-Cterm细胞。表达低水平MUC16的亲本OVCAR3细胞仅在最高的TFP-T细胞与靶细胞的比率下被杀伤。同样，当靶细胞上存在MUC16时，TFP-T细胞仅释放细胞因子，这支持了单结构域抗体的特异性。
图8描绘了显示MUC16-TFP在使用表达高和低水平MUC16的卵巢细胞系的细胞测定中的效力的示例性实验数据。在这些研究中，观察到取决于肿瘤细胞表面的MUC16水平，MUC16-TFP具有优先杀伤能力。更准确地说，观察到MUC16-TFP以剂量依赖的方式杀伤高MUC16表达肿瘤细胞，然而在这些测定中使用的剂量水平下未观察到低MUC16表达细胞的MUC16-TFP杀伤。
图9A-图9B描绘了基于流式细胞术的MUC16ecto拷贝数定量的结果。将4H11-PE抗体染色的肿瘤细胞与Quantibrite珠粒一起在
Figure BDA0002991027050000221
X-20上运行。计算细胞以及珠粒的几何中值荧光强度(gMFI)(图9A)。珠粒原料包含4个群体，所述群体被制造成每个珠粒具有不同数量的PE分子(高、中、低、负)。基于每个珠粒的给定的PE分子拷贝对比每组珠粒的测得的MFI生成标准曲线。然后基于珠粒生成的标准曲线来估计肿瘤细胞上的MUC16ecto的拷贝数。OVCAR3、OVCAR3-MUC16ecto、SKOV3和SKOV3-MUC16ecto细胞上的MUC16ecto的拷贝数分别被确定为726、3616、39和2351(图9B)。
图10A-图10D显示了一系列显示MUC16 TFP-T细胞对MUC16ecto特异性肿瘤细胞的裂解的图表。表达MUC16 TFP的T细胞特异性杀伤过表达MUC16的细胞相关形式的SKOV3-MUC16ecto细胞(图10A)，而亲本SKOV3细胞未被表达MUC16 TFP的T细胞杀伤(图10B)。同样地，表达MUC16 TFP的T细胞消除了过表达MUC16的细胞相关形式的OVCAR3-MUC16ecto细胞(图10C)。表达低水平MUC16ecto的亲本OVCAR3细胞仅被部分杀伤(图10D)。
图11A-图11H显示了一系列显示由MUC16 TFP-T细胞产生MUC16ecto外特异性细胞因子的图表。表达MUC16 TFP的T细胞在与SKOV3-MUC16ecto细胞(分别见图11A和图11E)或OVCAR3-MUC16ecto细胞(分别见图11C和图11G)共培养，但不与SKOV3细胞(分别见图11B和图11F)或OVCAR3细胞(分别见图11D和图11H)共培养时，分泌IFN-γ和IL-2。
图12描绘了表达MUC16-TFP的T细胞的MUC16ecto特异性增殖。通过流式细胞术分析监测T细胞示踪信号的稀释度(CellTraceTM的信号强度的降低)来确定MUC16-TFP T细胞的MUC16ecto特异性增殖。将表达MUC16-TFP的T细胞用CellTraceTM远红外增殖试剂盒(目录号C34564ThermoFisher)标记，然后与SKOV3或SKOV3-MUC16ecto细胞以1比1比率共培养3天。还用单独的培养基或用1μg/mL板结合的抗CD3抗体(克隆OKT-3，目录号14-0037-82，Invitrogen)刺激用CellTrace红外增殖试剂盒标记的表达MUC16-TFP的T细胞3天。表达MUC16-TFP的T细胞表现出MUC16ecto特异性增殖，表现为与SKOV3-MUC16ecto细胞但非SKOV3细胞共培养时CellTrace信号的降低(图12)。
图13A-图13C描绘了一系列显示MUC16-TFP T细胞体内活性的图表。在人卵巢癌细胞系SKOV3-MUC16ecto细胞和OVCAR3-MUC16ecto细胞的NSG小鼠异种移植模型中评估表达MUC16-TFP的T细胞。在SKOV3-MUC16ecto细胞的腹膜内模型中，与第0天(T细胞注射日)的基线水平相比，MUC16 TFP 1显示肿瘤负荷显著降低(图13A)。一致地，当与NT T细胞相比时，MUC16 TFP1在SKOV3-MUC16ecto细胞的皮下模型中显著延迟肿瘤生长(图13B)。在OVCAR3-MUC16ecto细胞的腹膜内模型中，MUC16 TFP1和MUC16TFP2都完成了小鼠肿瘤的清除(图13C)。
图14A-图14B是两个曲线图，其显示了在荷有高MSTO-MSLN或低MSTO-MSLN肿瘤的NSG小鼠中，MSLN-TFP T细胞针对MSLN高肿瘤(高MSTO-MSLN，11006个拷贝的表面MSLN)和低MSLN肿瘤(低MSTO-MSLN，198个拷贝的表面MSLN)的不同杀伤能力。给荷瘤小鼠静脉内注射未转导的T细胞(NT，1x107个总T细胞)或MSLN-TFP T细胞(1x107个总T细胞)。与NT T细胞治疗的小鼠相比，MSLN-TFP T细胞显著控制了高MSLN肿瘤的生长(图14A)。另一方面，在MSLN-TFP T细胞治疗的具有低MSLN肿瘤的小鼠中观察到有限的抗肿瘤反应(图14B)。
具体实施方式
本文描述了TCR亚基(包括CD3ε、CD3γ和CD3δ)的新型融合蛋白以及具有对细胞表面抗原特异的结合结构域的TCRα和TCRβ链的新型融合蛋白，其具有克服现有方法局限性的潜力。
本文描述了新型融合蛋白，其比CAR更高效地杀伤靶细胞，但释放相当或更低水平的促炎细胞因子。这些融合蛋白及其使用方法代表了T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)相对于CAR的有利方面，因为这些细胞因子水平的升高与过继性CAR-T疗法的剂量限制性毒性相关联。
一方面，本文描述了编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的分离的核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含TCR亚基和抗体结构域，所述抗体结构域包含抗肿瘤相关抗原(TAA)结合结构域(例如，IL13Ra2、MUC16或MSLN结合结构域)。在一些实施方案中，抗体结构域是人或人源化抗体结构域。在一些实施方案中，TCR亚基包含TCR胞外结构域。在其它实施方案中，TCR亚基包含TCR跨膜结构域。在其它实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域。在另外的实施方案中，TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自同一TCR亚基。在又一个实施方案中，TCR亚基包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自由CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。在又一个实施方案中，TCR亚基包含胞内结构域，所述胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个、两个或三个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的核酸分子包含(i)本文提供的任何抗TAA轻链结合结构域氨基酸序列的轻链(LC)CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或(ii)本文提供的任何抗TAA重链结合结构域氨基酸序列的重链(HC)CDR1、HC CDR2和HC CDR3。
在一些实施方案中，分离的核酸分子包含本文提供的任何抗TAA重链抗体或单结构域抗体的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。例如，重链抗体或单结构域抗体可存在于骆驼科动物中。偶蹄目(order Artiodactyla)的胼足亚目(suborder Tylopoda)的骆驼科(骆驼：单峰骆驼和双峰骆驼；骆驼：大羊驼(Lama glama)、原驼(Lama guanicoe)、骆马(Lamavicugna)；羊驼(alpaca)：南美羊驼(Vicugna pacos))，除了在其血清中的经典抗体之外，还有一种特殊类型的抗体。这些抗体被称为重链抗体(HCAb)，它们的独特之处在于缺乏整个轻链和第一个重链恒定区(CH1)。在须鲨、护士鲨和斑点鼠鱼(spotted ratfish)中也发现了类似于骆驼的仅有重链的抗体(cAb)的抗体。
在一些实施方案中，轻链可变区包含对本文提供的轻链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在其它实施方案中，重链可变区包含对本文提供的重链可变区的氨基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，TFP包括TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由T细胞受体的α或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分，或其功能性片段，或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列。在其它实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，其包含选自由TCR的α链、β链或TCR亚基CD3ε、CD3γ和CD3δ组成的组的蛋白质的跨膜结构域或其功能性片段、或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCR的α链、β链或ζ链或CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组的蛋白质的跨膜结构域及其功能片段。在一些实施方案中，编码的TFP包含蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质包含对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列，其中所述蛋白质选自由TCR的α链、β链或ζ链，或CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD2、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组以及其功能性片段。
在一些实施方案中，编码的抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些情况下，编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情况下，编码的接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，编码的长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，编码的接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，编码的短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一些情况下，共刺激结构域是从选自DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)组成的组的蛋白质中获得的功能性信号传导结构域，或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含前导序列。
本文还提供了由任何前述核酸分子编码的分离的多肽分子。
另一方面，本文还提供了分离的T细胞受体融合蛋白(TFP)分子，所述融合蛋白分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，分离的TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含人或人源化抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域是人或人源化结合结构域。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域不是人源化的。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域包含骆驼科动物抗体或其抗体片段。
在一些实施方案中，抗体结构域包含抗体片段。在一些实施方案中，抗体结构域包含scFv、单结构域抗体(sdAb)或VH结构域。
在一些实施方案中，人或人源化抗体结构域包含抗体片段。在一些实施方案中，人或人源化抗体结构域包含scFv、单结构域抗体(sdAb)或VH结构域。
在一些实施方案中，抗TAA结合结构域是scFv、单结构域抗体(sdAb)、VHH结构域或VH结构域。。在其它实施方案中，抗TAA结合结构域包含本文提供的氨基酸序列的轻链和重链，或其功能性片段，或对本文提供的轻链可变区氨的基酸序列具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，分离的TFP分子包含TCR胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由T细胞受体的α链或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分，或对其具有至少一个、两个或三个修饰但不超过20个、10个或5个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些情况下，接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，分离的TFP分子还包含编码共刺激结构域的序列。在其它实施方案中，分离的TFP分子还包含编码胞内信号传导结构域的序列。在又一个实施方案中，分离的TFP分子还包含前导序列。
本文还提供了包含编码任何前述TFP分子的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，载体是体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含poly(A)尾。在一些实施方案中，载体中的核酸序列还包含3’UTR。
本文还提供了包含任何所述载体的细胞。在一些实施方案中，细胞是人T细胞。在一些实施方案中，细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在其它实施方案中，细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述抑制性分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。在一些情况下，抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
在另一方面，本文提供了分离的TFP分子，所述分离的TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中TFP分子能够与内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域是人或人源化抗TAA结合结构域。
另一方面，本文提供了分离的TFP分子，所述TFP分子包含抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中TFP分子能够功能性地掺入内源TCR复合物中。
另一方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化的抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
另一方面，本文提供了蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含i)TFP分子，其包含人或人源化抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和ii)至少一种内源TCR复合物。
在一些实施方案中，TCR包含选自由T细胞受体的α链或β链、CD3δ、CD3ε或CD3γ组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分。在一些实施方案中，抗TAA结合结构域通过接头序列与TCR胞外结构域连接。在一些情况下，接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
本文还提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其蛋白复合物包含至少两种不同的TFP蛋白每任何上述蛋白质复合物。
另一方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含人或人源化抗TAA结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
另一方面，本文提供了人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种由本文提供的分离的核酸分子编码的TFP分子。
另一方面，本文提供了制备细胞的方法，所述方法包括用任何所述载体转导T细胞。
在另一方面，本文提供了产生RNA工程化的细胞群的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中所述RNA包含编码任何所述TFP分子的核酸。
另一方面，本文提供了在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的表达任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是自体T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是同种异体T细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。
另一方面，本文提供了治疗患有与肿瘤相关抗原(TAA)(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的包含任何所述TFP分子的细胞。在一些实施方案中，与TAA(例如，MUC16、IL13Rα2、MSLN)表达相关联的疾病选自诸如癌症或恶性肿瘤或癌前疾患等的增殖性疾病，诸如胰腺癌、卵巢癌、胃癌、间皮瘤、肺癌或子宫内膜癌，或者是与TAA(例如，MUC16、IL13Rα2、MSLN)表达相关联的非癌症相关适应症。
在一些实施方案中，将表达任何所述TFP分子的细胞与改善与表达TFP分子的细胞的施用相关联的一种或多种副作用的剂组合施用。在一些实施方案中，将表达任何所述TFP分子的细胞与治疗与TAA(例如，MUC16、IL13Rα2、MSLN)相关联的疾病的剂组合施用。
本文还提供了用作药剂的任何所述分离的核酸分子、任何所述分离的多肽分子、任何所述分离的TFP、任何所述蛋白质复合物、任何所述载体或任何所述细胞。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“一个/种(a)”和“一个/种(an)”是指物品的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个/种(an)元件”是指一个/种元件或不止一个/种元件。
如本文中所用，“约”可以表示加或减小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％，这取决于本领域技术人员已知或可知的情况。
如本文中所用，“受试者(subject)”或“受试者(subjects)”或“个体”可以包括但不限于哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物，例如驯养动物、农业动物或野生动物以及鸟类和水生动物。“患者”是患有疾病、病症或疾患或有发展所述疾病、病症或疾患的风险或另外地需要本文提供的组合物和方法的受试者。
如本文中所用，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指疾病或疾患的成功治疗或改善的任何征候。治疗可包括例如减轻、延迟或缓解疾病或疾患的一个或多个症状的严重度，或者其可包括降低由患者经历疾病、缺陷、病症或不利状况等的症状的频率。如本文中所用，“治疗或预防”有时在本文中用于指导致疾病或疾患的某种程度的治疗或改善的方法，并考虑了针对该目的的一系列结果，包括但不限于疾患的完全预防。
如本文中所用，“预防”是指对患者中的疾病或疾患，例如肿瘤形成的预防。例如，如果用本公开的方法治疗了有发展肿瘤或其它形式的癌症的风险的个体，并且所述个体后来没有发展肿瘤或其它形式的癌症，则在该个体中在至少一段时间内该疾病已被预防。
如本文中所用，“治疗有效量”是足以向施用组合物的个体提供有益效果或以其它方式减少有害的非有益事件的组合物或其活性成分的量。本文中的“治疗有效剂量”是指对于其施用产生一种或多种所需的或期望的(例如，有益的)作用的剂量，这种施用在给定的时间段内发生一次或多次。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；以及Pickar,Dosage Calculations(1999))
如本文中所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括源自包括TCR在内的各种多肽的重组多肽，所述重组多肽通常能够i)与靶细胞上的表面抗原结合并且ii)通常在T细胞内或其表面上共同定位时，与完整TCR复合物的其它多肽组分相互作用。“TFP T细胞”是已经根据本文公开的方法转导并表达TFP(例如，掺入到天然TCR中)的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+/CD8+T细胞。在一些实施方案中，TFP T细胞是NK细胞。在一些实施方案中，
如本文所用，术语“MUC16”也称为粘蛋白16或CA125(癌症抗原125、癌抗原125或碳水化合物抗原125)，是指在人中由MUC16基因编码的蛋白质。MUC16是粘蛋白家族糖蛋白的成员，已用作肿瘤标志物或生物标志物，其可在一些具有特定类型癌症或其它良性疾患的患者的血液中升高。MUC16被用作卵巢癌检测的生物标志物，并被发现在其它癌症中升高，所述癌症包括子宫内膜癌、输卵管癌、肺癌、乳腺癌和胃肠癌。还已显示MUC16在对癌细胞的免疫反应中抑制天然杀伤细胞的活性(参见，例如，Patankar等人，GynecologicOncology99(3)；704-13)。
如本文中所用，术语“IL13Rα2”，也称为分化簇213A2(CD213A2)，是指在人中由IL13Rα2基因编码的膜结合蛋白。IL13Rα2是白细胞介素13受体复合物的亚基，是IL13蛋白的受体。已发现IL13Rα2在多种癌症中过表达，所述癌症包括胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和恶性神经胶质瘤。
如本文中所用，术语“MSLN”或“间皮素”是指40kDa的细胞表面糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接的糖蛋白。人间皮素蛋白被合成为69kD前体，然后被蛋白水解处理。间皮素的30kD氨基端被分泌，被称为巨核细胞增强因子(Yamaguchi等人，J.Biol.Chem.269:805808,1994)。40kD的羧基端作为成熟的间皮素仍然结合于膜(Chang等人，Natl.Acad.Sci.USA 93:136 140,1996；Scholler等人，Cancer Lett247(2007),130-136)。示例性核酸和氨基酸间皮素序列还可从MSLN基因转录物中确定，所述转录物见于(NCBI登录号NM_005823或NCBI登录号NM_013404。因此，在本文公开的缀合物构建体的特征在于与针对间皮素或其表位的参考抗体交叉竞争的情况下，间皮素是在Scholler等人，CancerLett 247(2007),130-136中报道的间皮素。
人和鼠的氨基酸和核酸序列可见于公共数据库中，诸如GenBank、UniProt和Swiss-Prot。例如，人MUC16的氨基酸序列可见于UniProt/Swiss-Prot登录号Q8WXI7。编码人MUC16的核苷酸序列可见于登录号NM_024690。编码人MUC16转录物变体X1的核苷酸序列可见于登录号XM_017027486。编码人MUC16转录物变体X2的核苷酸序列可见于登录号XM_017027487。编码人MUC16转录物变体X3的核苷酸序列可见于登录号XM_017027488。编码人MUC16转录物变体X4的核苷酸序列可见于登录号XM_017027489。编码人MUC16转录物变体X5的核苷酸序列可见于登录号XM_017027490。编码人MUC16转录物变体X6的核苷酸序列可见于登录号XM_017027491。编码人MUC16转录物变体X7的核苷酸序列可见于登录号XM_017027492。编码人MUC16转录物变体X8的核苷酸序列可见于登录号XM_017027493。编码人MUC16转录物变体X9的核苷酸序列可见于登录号XM_017027494。编码人MUC16转录物变体X10的核苷酸序列可见于登录号XM_017027495。编码人MUC16转录物变体X11的核苷酸序列可见于登录号XM_017027499。编码人MUC16转录物变体X12的核苷酸序列可见于登录号XM_017027500。编码人MUC16转录物变体X13的核苷酸序列可见于登录号XM_017027501。在一个实例中，TFP的抗原结合部分识别并结合在神经胶质瘤细胞、神经胶质瘤起始细胞、正常或恶性间皮瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞或鳞状细胞癌细胞上表达的MUC16蛋白胞外结构域内的表位。
人IL13Rα2的氨基酸序列可见于UniProt/Swiss-Prot登录号Q14627。编码人IL13Rα2的核苷酸序列可见于登录号NM_000640。编码人IL13Rα2前体的核苷酸序列可见于登录号NP_000631。在一个实例中，TFP的抗原结合部分识别并结合在神经胶质瘤细胞、神经胶质瘤起始细胞、正常或恶性间皮瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞或鳞状细胞癌细胞上表达的IL13Rα2蛋白胞外结构域内的表位。
如本文中所用，术语“抗体”是指源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列，其与抗原特异性结合。抗体可以是多克隆或单克隆来源的完整免疫球蛋白或其片段，并且可以源自天然或重组来源。
术语“抗体片段”或“抗体结合结构域”是指抗体或其重组变体的至少一部分，其包含抗原结合结构域，即完整抗体的抗原决定性可变区，足以赋予抗体片段对靶标(诸如抗原及其定义的表位)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、单链(sc)Fv(“scFv”)抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(缩写为“sdAb”)(VL或VH)、骆驼科VHH结构域和由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“scFv”是指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区通过短的柔性多肽接头连续连接，并且能够表达为单个多肽链，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。
关于抗体的“重链可变区”或“VH”(或者，在单结构域抗体的情况下，例如，纳米抗体，“VHH”)是指包含三个CDR的重链片段，所述三个CDR被插入在称为框架区的侧翼片段之间，这些框架区通常比CDR更加保守并且形成支持CDR的支架。
除非特别说明，否则如本文中所用，scFv可以以任一顺序(例如，相对于多肽的N-末端和C-末端)具有VL和VH可变区，scFv可包含VL-接头-VH或可包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本发明的TFP组合物的部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链(包括例如单结构域抗体片段(sdAb)或重链抗体HCAb、源自鼠抗体、人源化抗体或人抗体的单链抗体(scFv))的一部分(Harlow等人，1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,N.Y.；Harlow等人，1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。一方面，本公开的TFP组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另外的方面，TFP包含含有scFv或sdAb的抗体片段。
术语“抗体重链”是指以其天然构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指以其天然构象存在于抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。卡帕(Kappa)(“κ”)和兰姆达(lambda)(“λ”)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。所述术语还应解释为意指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，所述DNA分子表达抗体蛋白或指定该抗体的氨基酸序列，其中已使用本领域可用和公知的重组DNA或氨基酸序列技术获得所述DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”是指能够被抗体特异性结合或以其它方式激发免疫反应的分子。这种免疫反应可涉及抗体的产生或特定免疫活性细胞的活化，或者两者。
技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可用作抗原。此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因而编码“抗原”，正如该术语在本文使用的含义那样。此外，本领域技术人员将理解抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于不止一个基因的部分核苷酸序列的使用，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码引发所需免疫反应的多肽。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可合成产生或可源自生物样品，或者可以是除了多肽以外的大分子。这样的生物样品可包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其它生物组分的流体。
术语“抗肿瘤作用”是指可通过各种方式表现出来的生物作用，包括但不限于例如肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数量的减少、转移灶数量的减少、预期寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活率的降低或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”还可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力来表现。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料之后将被重新引入该个体。
术语“同种异体的”是指任何材料，所述材料源自与引入该材料的个体相同的物种的不同动物或与所述个体不同的患者。当一个或多个基因座上的基因不完全相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异型材料可能在遗传上充分不同以在抗原性方面相互作用。
术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
术语“癌症”是指以异常细胞的快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散，也可以通过血液和淋巴系统扩散到身体的其它部位。本文描述了各种癌症的实例，其包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、肺癌等。
短语“与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病”包括但不限于与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病或与表达MUC16、IL13Rα2或MSLN的细胞相关联的疾患，包括例如增殖性疾病诸如癌症或恶性肿瘤或癌前疾患。一方面，癌症是胶质母细胞瘤。一方面，癌症是间皮瘤。一方面，癌症是胰腺癌。一方面，癌症是卵巢癌。一方面，癌症是脑癌。一方面，癌症是胃癌。一方面，癌症是肺癌。一方面，癌症是子宫内膜癌。与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的非癌症相关适应症包括但不限于，例如，自身免疫性疾病(例如，狼疮、类风湿性关节炎、结肠炎)、炎性病症(过敏症和哮喘)和移植。
术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变包含所述氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明的TFP内的一个或多个氨基酸残基可被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替代，并且改变的TFP可使用本文所述的功能测定法进行测试。
术语“刺激”是指通过刺激结构域或刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物)与其相关配体的结合(从而介导信号传导事件，诸如但不限于通过TCR/CD3复合物的信号传导)诱导的初级反应。刺激可介导某些分子表达的改变，和/或细胞骨架结构的重组织等。
术语“刺激性分子”或“刺激结构域”是指由T细胞表达的分子或其部分，其提供一个或多个初级细胞质信号传导序列，所述序列对T细胞信号传导途径的至少某些方面以刺激性方式调节TCR复合物的初级激活。一方面，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合启动，并且所述结合导致T细胞反应(包括但不限于增殖、活化、分化等)的介导。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或“ITAM”的信号传导基序。在本发明中特别使用的包含ITAM的初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)和CD66d的那些。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指在其表面上展示与主要组织相容性复合物(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞，诸如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将其呈递给T细胞。
如本文中所用，“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进包含TFP的细胞(例如，表达TFP的T细胞)的免疫效应子功能的信号。免疫效应子功能(例如，在表达TFP的T细胞中)的实例包括溶细胞活性和T辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，胞内信号传导结构域可包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括源自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些。在实施方案中，胞内信号传导域可包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括源自负责共刺激信号或不依赖于抗原的刺激的分子的那些。
初级胞内信号传导结构域可包含ITAM(“基于免疫受体酪氨酸的激活基序”)。包含ITAM的初级胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其可能是高效免疫反应所需的。共刺激分子包括但不限于MHC 1类分子、BTLA和一个Toll配体受体，以及DAP10、DAP12、CD30、LIGHT、OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)和4-1BB(CD137)。共刺激胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。细胞内信号传导结构域可包含其所源自的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。术语“4-1BB”指具有作为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸序列或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基的TNFR超家族的成员；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等效残基。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列在具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物性质的生物过程中，用作合成其它聚合物和大分子的模板的固有性质因此，基因、cDNA或RNA编码蛋白质，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质的话。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链，以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列还可包括内含子，达到编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含一个或多个内含子的程度。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文可互换使用，并且是指如本文所述的有效实现特定生物或治疗结果的化合物、制剂、材料或组合物的量。
术语“内源的”是指来自生物体、细胞、组织或系统的或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入的或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。所述术语还应解释为还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如多聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的顺式作用元件以用于表达；用于表达的其它元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是最高效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009)中提供的自身灭活型慢病毒载体。可在临床中使用的慢病毒载体的其它实例包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的LENTIVECTORTM基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统，等等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合物分子之间，例如，两个核酸分子，诸如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置都被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个DNA分子中的每一个中的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在该位置处是同源或相同的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半(例如，长度为十个亚基的多聚体中的五个位置)的位置是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配或同源的，则两个序列是90％同源的。
非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体及其抗体片段为人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，所述人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基由相应的非人残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可包含既不存在于受者抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中的残基。这些修饰还可精修和优化抗体或抗体片段的性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含基本上所有的至少一个，通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，并且所有或大部分的FR区是人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
术语“人”或“完全人”是指免疫球蛋白，诸如抗体或抗体片段，其中整个分子是人来源的或由与抗体或免疫球蛋白的人形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从自然状态改变或去除的。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
在本发明的说明书中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，“U”是尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列与导致后者表达的异源核酸序列之间的功能性键联。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子实现编码序列的转录或表达，则启动子与所述编码序列可操作地连接。可操作地连接的DNA序列可以彼此连续，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一阅读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子替代可通过产生序列来实现，在所述序列中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括任何包含两个或更多个通过肽键相互连接的氨基酸的肽或蛋白质。如本文中所用，该术语指短链和长链，所述短链在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚物，所述长链在本领域中通常称为蛋白质，所述蛋白质具有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的转录机制识别的DNA序列，或可启动多核苷酸序列的特异性转录的引入的合成机制。
术语“启动子/调控序列”是指与启动子/调控序列可操作地连接的可用于基因产物的表达的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在其它情况下，该序列还可包括增强子序列和基因产物的表达所需的其它调控节元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞的大多数或所有生理条件下导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时，才在细胞中产生基因产物的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指这样的核苷酸序列，当其与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞为对应于所述启动子的组织类型的细胞时，才基本上在细胞中产生基因产物。
如在scFv的情况下所用，术语“接头”和“柔性多肽接头”是指被单独或组合使用以将可变重链与可变轻链区域连接在一起的肽接头，其由氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1,n＝2,n＝3,n＝4,n＝5,n＝6,n＝7,n＝8,n＝9以及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在本发明的范围内还包括在WO2012/138475(通过引用并入本文)中描述的接头。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
如本文中所用，5'帽(也称为RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是经修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在转录开始后不久被添加到真核信使RNA的“前”或5’末端。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的末端基团组成。其存在对于被核糖体识别和免受RNA酶降解的保护至关重要。帽的添加与转录偶联，并且共转录地发生，使得彼此影响。转录开始后不久，所合成的mRNA的5'末端被与RNA聚合酶缔合的合成帽的复合物结合。这种酶复合物催化可以是mRNA封端所需的化学反应。合成作为多步生化反应进行。可修饰封端部分以调节mRNA的功能性，诸如其稳定性或翻译效率。
如本文中所用，“体外转录的RNA”是指已经在体外合成的RNA，优选mRNA。通常，体外转录的RNA由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
如本文中所用，“poly(A)”是通过多腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的优选实施方案中，polyA为50至5000，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。可以化学或酶促修饰Poly(A)序列，以调节mRNA功能性，诸如定位、稳定性或翻译效率。
如本文中所用，“多腺苷酸化”是指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价键联。在真核生物体中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'端被多腺苷酸化。3’poly(A)尾是通过酶多腺苷酸聚合酶的作用添加到前体mRNA中的腺嘌呤核苷酸的长序列(通常为数百个)。在高级真核生物中，将poly(A)尾添加到包含特定序列即多腺苷酸化信号的转录物上。poly(A)尾及与其结合的蛋白质有助于保护mRNA免受外切核酸酶的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核的输出以及翻译也很重要。DNA转录为RNA后，多腺苷酸化立即在细胞核中发生，但另外地也可在细胞质中稍后发生。转录终止后，通过与RNA聚合酶相关的内切核酸酶复合物的作用切割mRNA链。切割位点的特征通常在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。切割mRNA后，将腺苷残基添加到切割位点的3’末端。
如本文中所用，“瞬时”是指非整合的转基因表达数小时、数天或数周的时间，其中如果整合到基因组中或者包含在宿主细胞中的稳定的质粒复制子内，则表达的时间段短于基因表达的时间段。
术语“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用的多种信号传导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨细胞膜传递信号的分子和分子的复合物。
术语“受试者”旨在包括其中可引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞是指基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指已经与在其天然存在的状态下通常与其结合的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其它情况下，该术语仅指已与在它们的天然状态下与它们天然结合的细胞分离的细胞。在一些方面，体外培养细胞。在其它方面，不在体外培养细胞。
如本文中所用，术语“治疗的”意指治疗。通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态来获得治疗效果。
如本文中所用，术语“预防”是意指疾病或疾病状态的预防或对疾病或疾病状态的保护性治疗。
在本发明的说明书中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性病症抗原”或“与过度增殖性病症相关的抗原”是指特定过度增殖性病症所共有的抗原。在某些方面，本发明的过度增殖性病症抗原源自癌症，包括但不限于原发性或转移性黑色素瘤、胶质母细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌和胃癌。
在一些情况下，所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：间皮瘤、胶质母细胞瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞卵巢癌、混合苗勒管卵巢癌、内膜样粘液性卵巢癌、恶性胸膜病、胰腺腺癌、导管胰腺腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结直肠腺癌、乳腺癌、与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关的疾病及其任何组合。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指籍以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“特异性结合”是指这样的抗体、抗体片段或特异性配体，其识别并结合存在于样品中的同源结合配偶体(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)，但不一定和基本上不会识别或结合样品中的其它分子。
范围：贯穿本公开，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，以范围格式进行的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至6的范围的描述应该被认为已经具体地公开了子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，诸如95-99％同一性的范围包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的东西，以及包括诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性的子范围。无论范围有多广，这都适用。
描述
本文提供了用于治疗疾病诸如癌症的物质组合物和使用方法，所述方法使用T细胞受体(TCR)融合蛋白。如本文中所用，“T细胞受体(TCR)融合蛋白”或“TFP”包括源自包括TCR在内的各种多肽的重组多肽，所述重组多肽通常能够i)与靶细胞上的表面抗原结合并且ii)通常在T细胞内或其表面上共同定位时，与完整TCR复合物的其它多肽组分相互作用。如本文中所述，与嵌合抗原受体相比，TFP提供了显著的益处。术语“嵌合抗原受体”或者可选地“CAR”是指包含呈scFv形式的胞外抗原结合结构域、跨膜域和胞质信号传导结构域(在本文中也称为“胞内信号传导结构域”)的重组多肽，所述胞质信号传导结构域包含源自如下定义的刺激性分子的功能性信号传导结构域。通常，CAR的中心胞内信号传导结构域源自通常被发现与TCR复合物缔合的CD3ζ链。CD3ζ信号传导结构域可以与源自至少一种共刺激分子诸如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28的一个或多个功能性信号传导结构域融合。
MUC16
MUC16是肿瘤相关抗原多肽，由支气管、输卵管和子宫的粘膜中的人眼表上皮细胞表达。MUC16的一个建议功能可以是在粘膜表面提供保护性的润滑屏障，防止颗粒和感染因子。高度多态的MUC16由三个结构域组成：富含Ser/Thr的N端结构域、由11个至60多个平均每个156个氨基酸的部分保守的串联重复序列组成的重复结构域，以及包含跨膜序列和短细胞质尾的C端非重复结构域。MUC16可被严重O-糖基化和N-糖基化。与相应的正常人卵巢、乳腺和胰腺组织相比，编码由MUC16基因表达的MUC16多肽的mRNA可以分别地在某些类型的人癌性卵巢、乳腺和胰腺肿瘤中显著地、可重现地和可检测地过表达。对多种独立和不同类型的癌性人卵巢组织样品进行MUC16表达的定量分析表明，癌性样品中MUC16的表达水平是可变的，当与所分析的正常卵巢组织样品组的MUC16表达的平均水平相比时，相当数量的癌性样品显示MUC16表达增加了至少6倍(至高达约580倍)。特别地，当与正常卵巢组织相比时，对于卵巢癌类型、子宫内膜样腺癌、浆液性囊腺癌(包括乳头状和透明细胞腺癌)，可以观察到可检测和可再现的MUC16过表达。由于其在某些人肿瘤中的过表达，MUC16多肽和编码该多肽的核酸是用于各种哺乳动物组织样品之间定量和定性比较的靶标。MUC16多肽的表达谱和编码该多肽的核酸可被利用来诊断和治疗性治疗哺乳动物的某些类型的癌性肿瘤。
CA125(癌抗原125(O772P、CA-O772P、CA-125))是由MUC16基因编码的细胞外脱落蛋白，是常规用于监测卵巢癌患者的血清标志物。CA125是一种苗勒管分化抗原，在上皮性卵巢癌细胞中过表达并分泌到血液中，尽管其表达可能不完全局限于卵巢癌。约80％的上皮性卵巢癌(EOC)患者的血清CA125水平升高，但不到1％的健康妇女的血清CA125水平升高。CA125是存在于肿瘤细胞的细胞表面上的巨大的粘蛋白样糖蛋白，与β-半乳糖苷结合性细胞表面凝集素缔合，其可以是细胞外基质的组分，参与细胞粘附、细胞凋亡、细胞增殖和肿瘤进展的调节。高CA125血清浓度可以是浆液性卵巢腺癌的典型特征，而粘液性卵巢癌的CA125血清浓度并未升高。CA125可能不推荐用于卵巢癌筛查，因为正常水平可能不排除肿瘤。然而，CA125检测可作为监测患有组织学证实的恶性肿瘤的患者的临床过程和疾病状态的标准工具。大量研究证实了CA125水平在监测EOC患者进展方面的有效性，以及作为癌症血清标志物的有效性。CA125水平的升高通常可以先于临床检测约3个月。在化学疗法期间，血清CA125水平的变化可以与疾病的病程相关联。在新药试验中，CA125可用作临床反应的替代标志物。另一方面，由于其在许多良性疾患中升高，因此CA125可能在EOC的初始诊断中无用。CA125特异性抗体MAb-B43.13(奥戈伏单抗，OvaRex MAb-B43.13)作为免疫治疗剂用于卵巢癌患者的临床试验。
MUC16(CA-125)可通过几种不同的机制在促进肿瘤发生和肿瘤增殖中发挥作用。MUC16帮助肿瘤生长的一种方式可以是抑制天然杀伤细胞的反应，从而保护癌细胞免受免疫反应的影响。进一步的证据表明，MUC16可以保护肿瘤细胞免受免疫系统的影响，这可能是MUC16的高度糖基化的串联重复结构域可与半乳糖凝集素-1(一种免疫抑制性蛋白)结合的发现。MUC16可参与细胞间的相互作用，使得肿瘤细胞能够转移。这可得到显示MUC16可以选择性地与间皮素(一种通常由腹膜(腹腔内层)的间皮细胞表达的糖蛋白)结合的证据支持。MUC16与间皮素的相互作用可能是肿瘤细胞侵入腹膜的第一步。还发现间皮素在几种类型的癌症中表达，所述癌症包括间皮瘤、卵巢癌和鳞状细胞癌。由于间皮素也由肿瘤细胞表达，因此MUC16与间皮素的相互作用可有助于其它肿瘤细胞聚集到转移部位，从而增加转移的规模。证据表明，MUC16的细胞质尾的表达可使得肿瘤细胞能够生长，促进细胞运动，并可以促进侵袭。这似乎是由于MUC16的C端结构域能够促进信号传导，所述信号传导导致E-钙粘蛋白表达减少，N-钙粘蛋白和波形蛋白表达增加，这可以是与上皮-间质转化一致的表达模式。MUC16还可在降低癌细胞对药物疗法的敏感性方面发挥作用。例如，MUC16的过表达可以保护细胞免受基因毒性药物(诸如顺铂)的影响。
IL13Rα2
白细胞介素-13是正常生理条件下以及在癌症中的免疫反应过程中的免疫微环境调节剂。IL-13与两种不同的受体IL13Rα1和IL13Rα2结合。在大多数细胞中，IL-13以低亲和力结合受体IL13Rα1单体，并结合IL4Ra以形成异二聚体复合物，导致信号转导子和转录激活子(STAT)6的下游途径激活。在一些正常细胞诸如睾丸细胞中，IL-13与IL13Rα2受体结合，但其也以高亲和力结合癌细胞中的IL13Rα2受体。
位于Xq13.1-q28中的IL13Rα2基因的RNA转录物编码380个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质包含26个氨基酸的信号传导序列和短的17个氨基酸的胞内结构域。在神经胶质母细胞瘤细胞中，IL13Rα2表达多达30,000个IL-13蛋白的结合位点。
IL13Rα2的一个提议的功能是作为导致IL-13与IL13Rα1隔离开的诱饵受体。由于与IL13Rα1相比，IL13Rα2以更高的亲和力结合可用的IL-13，并提供更多的结合位点，因此在细胞中促进了IL-13的隔离。在正常细胞中，与IL13Rα1结合的IL-13激活STAT6，所述STAT6转移到细胞核，在细胞核中其对含有N6-生长停滞特异性启动子的基因(诸如15-脂氧化酶-1)进行转录控制。这可通过增强的半胱天冬酶-3活性来导致细胞凋亡。因此，IL-13隔离可以是肿瘤细胞的细胞凋亡逃逸机制。IL13Rα2的另一个提议的功能是IL13Rα2通过物理阻断STST6与受体的对接来阻断IL13Rα1。STAT6对接的缺乏阻碍了细胞凋亡的下游激活。IL13Rα2还在神经胶质瘤细胞中诱导STAT3和B细胞淋巴瘤2的上调。
IL13Rα2在神经胶质瘤起始细胞上表达，在约58％的成人和约83％的儿童脑肿瘤中表达。在卵巢癌和胰腺癌中，其通过胞外信号调节激酶/激活蛋白1的途径促进侵袭和转移。IL13Rα2在免疫细胞中的表达，诸如骨髓来源的抑制性细胞，也通过上调转化生长因子β来促进肿瘤免疫逃逸和进展。IL13Rα2表达增加可促进神经胶质瘤和其它肿瘤模型的肿瘤进展。IL13Rα2的表达随着神经胶质瘤的恶性程度增加而增加，从而能为患者生存提供预后指标。IL13Rα2多肽和编码该多肽的核酸的表达谱可被利用来诊断和治疗性治疗哺乳动物的某些类型的癌性肿瘤。
T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)
本公开涵盖编码TFP的重组DNA构建体，其中所述TFP包含与MUC16、IL13Rα2或MSLN(例如，人MUC16、IL13Rα2或MSLN)特异性结合的抗体片段，其中所述抗体片段的序列与编码TCR亚基或其部分的核酸序列毗连并处于同一阅读框中。本文提供的TFP能够与一个或多个内源(或可选地，一个或多个外源，或内源和外源的组合)TCR亚基缔合，以形成功能性TCR复合物。
一方面，本公开的TFP包含原本称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。部分的选择取决于定义靶细胞表面的靶抗原的类型和数量。例如，可选择抗原结合结构域来识别靶抗原，所述靶抗原充当与特定疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标志物。因此，可充当本发明的TFP中的抗原结合结构域的靶抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌症疾病(例如，恶性疾病)相关的那些细胞表面标志物。
一方面，可通过将抗原结合结构域工程化到特异性结合所需抗原的TFP中来将TFP介导的T细胞反应导向目标抗原。
一方面，包含抗原结合结构域的TFP的部分包含靶向MUC16、IL13Rα2或MSLN的抗原结合结构域。一方面，抗原结合结构域靶向人MUC16、IL13Rα2或MSLN
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，诸如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的用作抗原结合结构域的替代支架，诸如重组纤连蛋白结构域、抗运载蛋白(anticalin)、DARPIN等。同样地，可将特异性识别并结合靶抗原的天然或合成配体用作TFP的抗原结合结构域。在一些情况下，抗原结合结构域源自最终将在其中使用TFP的相同物种是有益的。例如，在人中使用时，TFP的抗原结合结构域包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可以是有益的。
因此，在一个方面，抗原结合结构域包括人源化抗体或人抗体或抗体片段，或骆驼科动物抗体或抗体片段，或鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗TAA结合结构域包含本文所述的人源化或人抗TAA结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，和/或本文所述的人源化或人抗TAA结合结构域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，例如人源化或人抗TAA结合结构域包含一个或多个(例如，全部三个)LC CDR和一个或多个(例如，全部三个)HC CDR。在一个实施方案中，人源化或人抗TAA结合结构域包含本文所述的人源化或人抗TAA结合结构域的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)中的一个或多个(例如，全部三个)，例如，人源化或人抗TAA结合结构域具有两个可变重链区域，每个可变重链区域均包含本文所述的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一个实施方案中，人源化或人抗TAA结合结构域包含本文所述的人源化轻链可变区或人轻链可变区和/或本文所述的人源化重链可变区或人重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人源抗TAA结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区，例如，至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，抗TAA结合结构域是包含具有本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，抗TAA结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含本文提供的重链可变区的氨基酸序列的具有至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗TAA结合结构域是scFv，并且包含本文所述氨基酸序列的轻链可变区通过接头(例如，本文所述的接头)与包含本文所述氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，人源化抗TAA结合结构域包括(Gly4-Ser)n接头，其中n为1、2、3、4、5或6，优选为3或4。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下取向中的任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域经修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似性。一方面，抗原结合结构域是人源化的。
可使用本领域已知的多种技术(包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利第EP239,400号；国际公开第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号，其每一个通过引用整体并入本文)、饰面(veneering)或重修表面(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利第EP 592,106号和第EP 519,596号；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人，1994,PNAS,91:969-973,其每一个通过引用整体并入本文)、链改组(参见，例如美国专利第5,565,332号，其通过引用整体并入本文))以及在例如以下文献中描述的技术来产生人源化抗体：美国专利申请公开第US2005/0042664号、美国专利申请公开第US2005/0048617号、美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 9317105号，Tan等人，J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等人，ProteinEng.,13(5):353-60(2000),Morea等人，Methods,20(3):267-79(2000),Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等人，Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto等人，Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等人，CancerRes.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每一个通过引用整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变例如改善抗原结合。这些框架取代通过本领域公知的方法鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定特定位置处的罕见框架残基(参见，例如，Queen等人，美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人，1988,Nature,332:323，所述文献通过引用整体并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有一个或多个保留在其中的来自非人来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。如本文所提供的，人源化抗体或抗体片段包含一个或多个来自非人免疫球蛋白分子的CDR和其中构成框架的氨基酸残基完全或主要源自人种系的框架区。用于抗体或抗体片段的人源化的多种技术是本领域公知的，并且基本上可以按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列(即，CDR移植)(EP 239,400；PCT公开第WO 91/09967号；和美国专利第4,816,567号、第6,331,415号、第5,225,539号、第5,530,101号、第5,585,089号、第6,548,640号，其内容通过引用整体并入本文)来进行。在此类人源化抗体和抗体片段中，基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体和抗体片段的人源化还可通过饰面或重修表面(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6):805-814(1994)和Roguska等人，PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利第5,565,332号)来实现，所述文献的内容通过引用整体并入本文。
选择人可变结构域(轻和重可变结构域)用于制备人源化抗体是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳适配”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库，筛选啮齿动物抗体可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人，J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用整体并入本文)。另一种方法使用源自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson等人Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区，例如，所有四个框架区，源自VH4-4-59种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。在一个实施方案中，框架区，例如，轻链可变区的所有四个框架区源自VK3-1.25种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，取代，例如，来自相应鼠序列的氨基酸。
在一些方面，包含抗体片段的本公开的TFP组合物的部分被人源化，保留了对靶抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。根据本公开的一个方面，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。这样，可从受者和输入序列中选择和结合FR残基，从而获得所需抗体或抗体片段特征，诸如对靶抗原的增加的亲和力。一般来说，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原结合。
人源化抗体或抗体片段可保持与原始抗体相似的抗原特异性(例如，在本公开中，结合人肿瘤相关抗原诸如MUC16、IL13Rα2或MSLN的能力)。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可具有与人MUC16、IL13Rα2或MSLN结合的增强的亲和力和/或特异性。
一方面，抗TAA结合结构域(即，MUC16、IL13Rα2或MSLN结合结构域)的特征在于抗体或抗体片段的特定功能特征或性质。例如，一个方面，包含抗原结合结构域的本发明的TFP组合物的部分特异性结合人MUC16、IL13Rα2或MSLN。一方面，本公开涉及包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域，其中所述抗体结合结构域与MUC16、IL13Rα2或MSLN蛋白或其片段特异性结合，其中所述抗体或抗体片段包含包括本文提供的氨基酸序列的可变轻链和/或可变重链。在某些方面，scFv与前导序列毗连并处于同一阅读框中。
一方面，抗TAA结合结构域是片段，例如，单链可变片段(scFv)。一方面，抗TAA结合结构域为Fv、Fab、(Fab’)2或双功能(例如双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。一方面，本文公开的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合MUC16、IL13Rα2或MSN蛋白。
本文还提供了获得对靶抗原(例如，MUC16、IL13Rα2、MLSN或本文别处所述的融合部分结合结构域的靶标的任何靶抗原)特异的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括通过在本文所列出的VH结构域的氨基酸序列中添加、删除、取代或插入一个或多个氨基酸来提供VH结构域，其为VH结构域的氨基酸序列变体，任选地将如此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合，并测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合，以鉴定对目标靶抗原(例如，MUC16、IL13Rα2、MSLN)特异并任选地具有一个或多个所需性质的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法(参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)制备VH结构域和scFv。scFv分子可通过使用柔性多肽接头将VH与VL区域连接在一起而产生。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如，5-10个氨基酸)，则链内折叠被阻止。链间折叠也可以是将两个可变区结合在一起形成功能性表位结合位点所必需的。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。关于接头取向和大小的实例，参见，例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利7,695,936号、美国专利申请公开第20050100543号和第20050175606号，以及PCT公开第WO2006/020258号和第WO2007/024715号(其全部通过引用并入本文)。
scFv可在其VL与VH区之间包含约10个、11个、12个、13个、14个、15个或大于15个残基的接头。接头序列可包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列，诸如(Gly4Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。接头长度的变化可以保持或增强活性，从而在活性研究中产生了更高的功效。在一些情况下，接头序列包括长接头(LL)序列。在一些情况下，长接头序列包含(G4S)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包含短接头(SL)序列。在一些情况下，短接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至3。
稳定性和突变
抗TAA结合结构域，例如，scFv分子(例如，可溶性scFv)的稳定性可参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理性质(例如，热稳定性)来评估。在一个实施方案中，人源化scFv或人scFv在所描述的测定中具有比亲本scFv高约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10摄氏度、约11摄氏度、约12摄氏度、约13摄氏度、约14摄氏度或约15摄氏度的热稳定性。
随后将抗TAA结合结构域(例如，scFv)的提高的热稳定性赋予整个TAA-TFP构建体，从而导致抗TAA TFP构建体的改善的治疗性质。与常规抗体相比，抗TAA结合结构域(例如，scFv)的热稳定性可提高至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体相比，抗TAA结合结构域(例如，scFv)具有提高了1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，抗TAA结合结构域(例如，scFv)具有提高了2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体相比，scFv具有提高了4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃或15℃的热稳定性。例如，可在本文公开的scFv分子与scFv VH和VL所源自的抗体的scFv分子或Fab片段之间进行比较。可使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一个实施方案中，可测量TM。在下文中更详细地描述了测量TM的方法和测定蛋白质稳定性的其它方法。
scFv中的突变(通过可溶性scFv的人源化或直接诱变产生的)改变了scFv的稳定性，并提高了scFv和抗TAA TFP构建体的总体稳定性。使用诸如TM、温度变性和温度聚集等的测量将人源化scFv的稳定性与鼠scFv进行比较。在一个实施方案中，抗TAA结合结构域(例如，scFv)包含至少一个从人源化过程产生的突变，使得突变的scFv赋予抗TAA TFP构建体提高的稳定性。在另一个实施方案中，抗TAA结合结构域(例如，scFv)包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个从人源化过程产生的突变，使得突变的scFv赋予抗TAA-TFP或抗TAA-TFP构建体提高的稳定性。
一方面，TFP的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且所述抗原结合结构域保留了本文所述的抗TAA抗体片段的所需功能性质。在一个特定方面，本发明的TFP组合物包含抗体片段。另一方面，该抗体片段包括scFv。
在各个方面，通过修饰一个或两个可变区(例如，VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸来对TFP的抗原结合结构域进行工程化。在一个特定方面，本发明的TFP组合物包含抗体片段。另一方面，该抗体片段包括scFv。
本领域普通技术人员将理解，本公开的抗体或抗体片段可被进一步修饰，使得它们的氨基酸序列(例如，来自野生型)发生改变，但是所需活性不改变。例如，可对蛋白质进行导致在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的另外的核苷酸取代。例如，分子中的非必需氨基酸残基可被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，一串氨基酸可被相异在于侧链家族成员的顺序和/或组成的结构相似的串替代，例如，可进行其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的保守取代。
具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已被定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下的同一性百分比是指两个或更多个相同的序列。如果两个序列在比较窗口或指定区域上进行比较和对齐以获得最大一致性(如使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的)时，具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域上，或者，当未指定时，在整个序列上，具有60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地存在于长度为100个至500个或1000个或更多个核苷酸(或20个、50个、200个或更多个氨基酸)的区域上。
为了进行序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，也可以指定其可选的参数。然后序列比较算法基于所述程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith和Waterman，(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过手工比对和目视检查(参见，例如，Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)来进行。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的两个实例是分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.AcidsRes.25:3389-3402；和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中的BLAST和BLAST2.0算法。可通过国家生物技术信息中心公开获得用于进行BLAST分析的软件。使用核苷酸BLAST来确定核苷酸序列同一性的算法参数可以使用匹配/错配分数为1、-2的评分参数，并且其中缺口成本(gap cost)是线性的。启动比对的序列长度或BLAST算法中的字大小可以设置为28以用于序列比对。用于使用蛋白质BLAST来确定肽序列同一性的算法参数可以使用具有BLOSUM62矩阵的评分参数来分配用于对齐残基对的分数，并确定总体对齐分数，其中缺口成本可具有为11的存在惩罚和为1的延伸惩罚。补偿序列氨基酸组成的矩阵调整方法可以是条件组成分数矩阵调整。启动比对的序列长度或BLAST算法中的字长大小可以设置为6以用于序列比对。
一方面，本发明设想了对起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列的修饰，所述修饰产生功能上等同的分子。例如，可以修饰包含在TFP中的抗TAA结合结构域的VH或VL(例如，scFv)，以保留至少约70％、71％.72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的与抗TAA结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的同一性。本发明内容设想了整个TFP构建体的修饰，例如，TFP构建体的各个结构域的一个或多个氨基酸序列中的修饰，以产生功能上等同的分子。可以修饰TFP构建体以保留至少约70％、71％.72％.73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的与起始TFP构建体的同一性。
胞外结构域
胞外结构域可源自天然或重组来源。在来源是天然的情况下，所述结构域可源自任何蛋白质，但尤其为膜结合蛋白或跨膜蛋白。一方面，胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。在本公开中特别使用的胞外结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β、γ、δ或ζ链或CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞外结构域，或在替代实施方案中，胞外结构域可包括CD28、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的至少一种胞外结构域。在一些情况下，TCR胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
跨膜结构域
一般来说，TFP序列包含由单个基因组序列编码的胞外结构域和跨膜结构域。在替代实施方案中，可将TFP设计为包含与TFP的胞外结构域异源的跨膜结构域。跨膜结构域可包含与跨膜区域相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜所源自的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)和/或与跨膜蛋白所源自的蛋白质的细胞内区域相关的一种或多种另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸)。在一些情况下，跨膜结构域可包括细胞外区域的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。在一些情况下，跨膜结构域可包含细胞内区域的至少30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个氨基酸。一方面，跨膜结构域是与所使用的TFP的另外的结构域之一相关的跨膜结构域。在一些情况下，可通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。一方面，跨膜结构域能够与TFP T细胞表面上的另一TFP同源二聚化。在不同的方面，可修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以使与存在于同一TFP中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
跨膜结构域可源自天然或重组来源。如果来源是天然的，则所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。一方面，每当TFP已与靶标结合时，跨膜结构域就能够向一个或多个胞内结构域发送信号。在一些实施方案中，TCR亚基包含跨膜结构域，所述跨膜结构域包含包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、TCRζ链、CD3εTCR亚单位、CD3γTCR亚单位、CD3δTCR亚单位、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。在一些情况下，跨膜结构域可通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)与TFP的细胞外区域(例如，TFP的抗原结合结构域)连接。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人免疫球蛋白(Ig)铰链，例如，IgG4铰链或CD8a铰链。
接头
任选地，长度为2至10个氨基酸的短寡肽接头或多肽接头可在TFP的跨膜结构域与细胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。例如，一方面，接头包含为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:99)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由为GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:100)的核苷酸序列编码。其它示例性接头示于表4中。
胞质结构域
如果TFP包含CD3γ、δ或ε多肽，则TFP的胞质结构域可包括胞内信号传导结构域；TCRα和TCRβ亚基通常不存在于信号传导结构域中。胞内信号传导结构域通常负责激活已向其中引入了TFP的免疫细胞的正常效应子功能中的至少一种。术语“效应子功能”是指细胞的专用功能。例如，T细胞的效应子功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行专用功能的蛋白质的部分。虽然通常可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整条链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短的部分可用来代替完整链，只要其传导效应子功能信号。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以传导效应子功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的TFP的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的细胞质序列以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列，所述T细胞受体(TCR)和共受体协同作用以在抗原受体结合后启动信号传导。
已知，仅通过TCR产生的信号可能不足以完全活化初始T细胞，并且可能需要次级和/或共刺激信号。因此，初始T细胞活化可以说是由两类不同的胞质信号传导序列(通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以不依赖于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域))介导的。
初级信号传导结构域可以以刺激方式或抑制方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。
在本发明中特别有用的含ITAM的初级胞内信号传导结构域的实例包括CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，本公开的TFP包含胞内信号传导结构域，例如，CD3-ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰的ITAM结构域，例如，突变的ITAM结构域，其与天然ITAM结构域相比具有改变的(例如，增强的或减弱的)活性。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包括经修饰的含ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，优化的和/或截短的含ITAM的初级胞内信号传导结构域。在实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
TFP的胞内信号传导结构域可以自身包含CD3ζ信号传导结构域，或者其可以与在本公开的TFP的情况下有用的一个或多个任何其它所需胞内信号传导结构域组合。例如，TFP的胞内信号传导结构域可包含CD3ε链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域是指包含共刺激分子的胞内结构域的TFP的部分。共刺激分子是除抗原受体或其配体外的细胞表面分子，其可能是淋巴细胞对抗原的高效反应所必需的。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、DAP10、DAP12、CD30、CD40、PD1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激已被证明在体外增强人TFP-T细胞的扩增、效应子功能和存活，并在体内增强人T细胞的持久性和抗肿瘤活性(Song等人Blood.2012；119(3):696-706)。
本公开的TFP的细胞质部分内的胞内信号传导序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地，例如长度为2至10个氨基酸(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可在胞内信号传导序列之间形成键联。
在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
一方面，本文所述的表达TFP的细胞还可包含第二TFP，例如，包含例如针对相同靶标(例如，MUC16、IL13Rα2、MSLN)或不同靶标(例如，CD123)的不同抗原结合结构域的第二TFP。在一个实施方案中，当表达TFP的细胞包含两种或多种不同的TFP时，不同TFP的抗原结合结构域可以使得抗原结合结构域不会彼此相互作用。例如，表达第一TFP和第二TFP的细胞可具有第一TFP的抗原结合结构域，例如，如不会与第二TFP的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scFv)，例如，第二TFP的抗原结合结构域为VHH。在一个实施方案中，抗原结合域是SD1(SEQ ID NO:15)、SD2(SEQ ID NO:20)、SD3(SEQ ID NO:25)、SD4(SEQ ID NO:30)、SD5(SEQ ID NO:35)或SD6(SEQ ID NO:40)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是LSD1(SEQ ID NO:51)、H1-LSD1(SEQ ID NO:56)、H2-LSD1(SEQ ID NO:61)、LSD2(SEQ ID NO:66)、H1-LSD1(SEQ ID NO:71)或H2-LSD2(SEQ ID NO:76)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是抗MSLN VHH1(SEQ ID NO:96)或抗MSLN VHH2(SEQ ID NO:97)。
另一方面，本文所述的表达TFP的细胞还可表达另一种剂，例如，增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如PD1，可降低表达TFP的细胞产生免疫效应物反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，所述剂包含例如抑制性分子诸如PD1、LAG3、CTLA4、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4和TIGIT或任何这些多肽的片段(例如，任何这些多肽的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，4-1BB、CD27或CD28，例如，如本文所述的))和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述剂包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是CD28受体家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD1可在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人1996Int.Immunol 8:765-75)。PD1的两个配体程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性死亡配体2(PD-L2)，已被证明在与PD1结合时下调T细胞活化(Freeman等人2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人2001Nat Immunol 2:261-8；Carter等人2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人癌症中可以是很丰富的(Dong等人2003J Mol Med 81:281-7；Blank等人2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人2004Clin Cancer Res 10:5094)。免疫抑制可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，所述剂包含抑制性分子的胞外结构域(ECD)，例如，程序性死亡1(PD1)可与跨膜结构域和任选的胞内信号传导结构域诸如41BB和CD3ζ融合(在本文也称为PD1 TFP)。在一个实施方案中，当与本文所述的抗TAA TFP组合使用时，PD1 TFP延长了T细胞的持久性。在一个实施方案中，TFP是包含PD 1胞外结构域的PD1 TFP。或者，提供了含有与PD-L1或PD-L2特异性结合的抗体或抗体片段诸如scFv的TFP。
另一方面，本公开提供了表达TFP的T细胞(例如，TFP-T细胞)群。在一些实施方案中，表达TFP的T细胞群包括表达不同TFP的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，TFP-T细胞群可包括第一细胞和第二细胞，所述第一细胞表达具有本文所述的抗TAA结合结构域的TFP，所述第二细胞表达具有不同的抗TAA结合结构域，例如，与由所述第一细胞表达的TFP中的抗TAA结合结构域相异的本文所述的抗TAA结合结构域的TFP。作为另一个实例，表达TFP的细胞群可包括第一细胞和第二细胞，所述第一细胞表达包括例如，如本文所述的抗TAA结合结构域的TFP，所述第二细胞表达包括针对除第一细胞的TAA FTP(例如，具有对MUC16、IL13Rα2或MSLN的特异性)外的靶标(例如，另一种肿瘤相关抗原)的抗原结合结构域的TFP。
另一方面，本公开提供了细胞群，其中所述群中的至少一个细胞表达具有本文所述的抗TAA结构域的TFP，并且第二细胞表达另一种剂，例如，增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。例如，在一些实施方案中，抑制性分子可以降低表达TFP的细胞产生免疫效应物反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的剂包含第一多肽，例如，抑制性分子，其与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。
本文发明了用于产生体外转录的编码TFP的RNA的方法。本公开还包括可被直接转染到细胞中的编码TFP的RNA构建体。用于产生用于转染的mRNA的方法可包括用特别设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加polyA，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达的核酸和polyA尾(通常长度为50-2000个碱基)的构建体。如此产生的RNA可高效地转染不同种类的细胞。一方面，模板包括TFP的序列。
一方面，抗TAA TFP由信使RNA(mRNA)编码。一个方面，将编码抗TAA TFP的mRNA引入T细胞以产生TFP-T细胞。在一个实施方案中，可将体外转录的RNA TFP作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。可使用合适的引物和RNA聚合酶，通过PCR将来自任何来源的目标DNA直接转化为用于体外mRNA合成的模板。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合适的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本发明的TFP。在一个实施方案中，用于PCR的DNA包含开放阅读框。DNA可来自生物体的基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可包括5’和/或3’非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可包含外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人核酸序列。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包括5’和3’UTR的人核酸序列。或者，DNA可以是在天然存在的生物体中不正常表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有基因的部分的人工序列，所述基因的部分被连接在一起形成编码融合蛋白的开放阅读框。连接在一起的DNA的部分可以来自单个生物体，也来自多个生物体。
将PCR用于产生用于mRNA的体外转录的模板，所述mRNA用于转染。进行PCR的方法在本领域是公知的。用于PCR的引物被设计成具有与被用作PCR的模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文中所用，“基本上互补的”是指这样的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的，或者错配的。在用于PCR的退火条件下，基本上互补的序列能够与预期的DNA靶标退火或杂交。引物可被设计成与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可被设计成扩增通常在细胞中转录的核酸的部分(开放阅读框)(包括5’和3’UTR)。引物也可被设计成扩增编码特定的目标结构域的核酸的部分。在一个实施方案中，引物被设计成扩增人cDNA的编码区，包括5’和3’UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可通过本领域公知的合成方法产生。“正向引物”是指含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与在待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补。“上游”在本文中用于指相对于编码链处于待扩增的DNA序列的5的位置。“反向引物”是含有核苷酸区域的引物，所述核苷酸区域与在待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补。“下游”在本文中用于指相对于编码链处于待扩增的DNA序列的3’的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶都可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶可从多种来源商购获得。
还可使用具有提高稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。所述RNA优选具有5’和3’UTR。在一个实施方案中，5’UTR的长度为1至3,000个核苷酸。待添加到编码区的5’和3’UTR序列的长度可通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR的不同区域退火的PCR引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可在转录的RNA的转录后，修改可用于达到最佳翻译效率的5’和3’UTR长度。
5’和3’UTR可以是目标核酸的天然存在的内源5’和3’UTR。或者，可通过将的UTR序列掺入正向和反向引物或通过模板的任何其它修饰来添加对于目标核酸不是内源的UTR序列。对于目标核酸不是内源的UTR序列的使用对于改变RNA的稳定性和/或翻译效率可以是有用的。例如，已知3’UTR序列中富含AU的元件可降低mRNA的稳定性。因此，可基于本领域公知的UTR的特性，选择或设计3’UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5’UTR可包含内源核酸的Kozak序列。或者，当通过如上所述的PCR添加对于目标核酸不是内源的5’UTR时，可通过添加5’UTR序列来重新设计共有Kozak序列。Kozak序列可以提高一些RNA转录物的翻译效率，但似乎不是所有RNA都需要它来实现高效翻译。在其它实施方案中，5’UTR可以是其RNA基因组在细胞中是稳定的RNA病毒的5’UTR。在其它实施方案中，各种核苷酸类似物可用于3’或5’UTR以阻止mRNA的外切核酸降解。
为了能够从DNA模板合成RNA而不需要基因克隆，应将转录启动子在待转录的序列上游连接至DNA模板。当将用作RNA聚合酶的启动子的序列添加到正向引物的5’末端时，将RNA聚合酶启动子在待转录的开放阅读框上游掺入PCR产物中。在一个优选实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文别处所述。其它有用的启动子包括但不限于T3和SP6 RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在优选实施方案中，mRNA在5’末端上具有帽并在3’末端具有poly(A)尾，这决定了核糖体的结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。在环状DNA模板(例如质粒DNA)上，RNA聚合酶产生长串联产物，所述产物不适合在真核细胞中表达。在3’UTR末端线性化的质粒DNA的转录产生正常大小的mRNA，所述mRNA在真核细胞转染中是无效的，即使其在转录后被多聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可将转录物的3’末端延伸到模板的最后一个碱基之外(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
将polyA/T延伸部分整合到DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒DNA中的polyA/T序列可导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞中获得的质粒DNA模板经常受到缺失和其它畸变的高度污染。这使得克隆过程不仅费力费时，而且常常不可靠。这就是为什么无需克隆就能构建具有polyA/T 3’延伸部分的DNA模板的方法是非常理想的。
转录DNA模板的polyA/T区段可以在PCR过程中通过使用含有polyT尾(诸如100T的尾(大小可以是50-5000T))的反向引物产生，或者在PCR后通过任何其它方法产生，包括但不限于DNA连接或体外重组。Poly(A)尾也为RNA提供了稳定性，减少了它们的降解。通常，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾在100与5000个腺苷之间。
可在体外转录后，使用polyA聚合酶诸如大肠杆菌(E.coli)polyA聚合酶(E-PAP)进一步延伸RNA的Poly(A)尾。在一个实施方案中，将poly(A)的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸，导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，将不同的化学基团附接至3’末端可增加mRNA稳定性。这种附接可包含修饰的/人工的核苷酸、适体和其它化合物。例如，可使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入poly(A)尾。ATP类似物可进一步增加RNA的稳定性。
5’帽也为RNA分子提供稳定性。在优选实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包含5’帽。使用本领域已知的和本文所述的技术(Cougot，等人，Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski，等人，RNA,7:1468-95(2001)；Elango，等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))提供5’帽。
通过本文公开的方法产生的RNA也可包含内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，其启动不依赖于帽的核糖体与mRNA的结合并促进翻译的启始。可包括任何适于细胞电穿孔的溶质，所述溶质可包含促进细胞渗透性和活力的因子，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可使用多种不同方法中的任何方法将RNA引入靶细胞，所述方法为例如商购可得的方法，包括但不限于电穿孔法(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物封装、肽介导的转染，或微粒轰击递送系统诸如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa，等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
编码TFP的核酸构建体
本公开还提供了编码本文所述的一种或多种TFP构建体的核酸分子。一方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。一方面，核酸分子作为DNA构建体提供。
编码所需分子的核酸序列可使用本领域已知的重组方法获得，例如，通过筛选来自表达该基因的细胞的文库，通过从已知包含该基因的载体中获得该基因，或者通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织中直接分离。或者，可通过合成而非克隆来产生目标基因。
在一些实施方案中，本文还公开了包含本文公开的重组核酸的载体。在一些情况下，载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。在一些情况下，载体是AAV6载体。在一些情况下，载体还包含启动子。在一些情况下，载体是体外转录的载体。在一些实施方案中，载体是环状RNA载体(例如，如共同未决的临时专利申请第62/836,977号中所公开的)。
本公开还提供了其中插入了本发明的DNA的载体。源自逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合及其在子细胞中的繁殖。慢病毒载体相对于源自肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有免疫原性低的额外优势。在一些实施方案中，本文公开了包含本文公开的重组核酸的载体。
在另一个实施方案中，包含编码本公开的所需TFP的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，编码TFP的核酸的表达可使用转座子诸如sleepingbeauty、crisper、CAS9和锌指核酸酶来完成(参见，June等人2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，通过引用并入本文)。
还可使用标准的基因递送方案将本公开的表达构建体用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，通过引用整体并入本文)。在另一个实施方案中，本公开提供了基因治疗载体。
可将核酸克隆到许多类型的载体中。例如，可将核酸克隆到载体中，所述载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别吸引人的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，还可以以病毒载体的形式向细胞提供表达载体。病毒载体技术在本领域中是公知的，并且在例如Sambrook等人，2012，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)和其它病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般而言，合适的载体包含在至少一种生物体中起作用的复制起始位点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一个或多个选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将选定的基因插入载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可分离重组病毒并在体内或离体地将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如，增强子，调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也显示出在起始位点下游含有功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，可将启动子元件之间的间隔增加至相隔50bp，然后活性开始下降。根据启动子的不同，似乎单个元件可以协同或独立地激活转录。
能够在哺乳动物T细胞中表达TFP转基因的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚基表达，所述亚基负责氨酰基tRNA向核糖体的酶促递送。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒中，并已被证明能有效地驱动从克隆到慢病毒载体中的转基因表达TFP(参见，例如，Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一个实例是早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，还可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外，本公开不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其在需要这种表达时，能够开启与其有可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时，关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素调节的启动子。
为了评估TFP多肽或其部分的表达，待引入细胞的表达载体也可包含选择标记基因或报告基因或这两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可在单独的DNA片段上携带选择标记并将其用于共转染程序。选择标记基因和报告基因两侧都可具有适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。有用的选择标记包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等。
报告基因用于鉴定潜在地转染的细胞和用于评估调控序列的功能性。一般而言，报告基因是受者生物体或组织中不存在或不由其表达的基因，其编码其表达表现为一些可易于检测的性质(例如，酶促活性)的多肽。在将DNA引入受者细胞后的合适时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因因(例如，Ui-Tei等人，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。一般而言，具有显示报告基因最高表达水平的最小5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区域可与报告基因连接，并用于评估剂的调节启动子驱动的转录的能力。
将基因引入细胞并表达的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情况下，载体可通过本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、微粒轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的(参见，例如，Sambrook等人，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第1-4卷，ColdSpring Harbor Press,NY)。将多核苷酸引入宿主细胞的一种方法是磷酸钙转染。
将目标多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I型、腺病毒和腺相关病毒等(参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号)。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有技术水平的核酸靶向递送的其它方法也是可用的，诸如用靶向纳米颗粒或其它合适的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。设想了使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。另一方面，可将核酸与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可被包封在脂质体的含水内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸都缔合的连接分子附接至脂质体上，被包封在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或者以其它方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束，或具有“塌陷的”结构。它们也可以简单地分散在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴，以及含有长链脂肪族烃及其衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类。
适合使用的脂质可从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,Mo.获得；磷酸联十六烷基酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的原液可在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过生成封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质媒介物。脂质体可被表征为具有拥有磷脂双层膜和内部含水介质的囊泡结构。多层脂质体具有被含水介质分隔的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人，1991Glycobiology 5:505-10)。然而，在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物也被涵盖在内。例如，脂质可能呈现胶束结构，或者仅仅作为脂质分子的不均匀聚集体而存在。还设想了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入宿主细胞或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可进行多种测定。此类测定包括，例如，本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，诸如DNA印迹和RNA印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的鉴定属于本发明范围内的剂的测定。
基因编辑技术
在一些实施方案中，使用基因编辑技术，诸如成簇的规律间隔短回文重复序列(
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参见，例如美国专利第8,697,359号)、转录激活物样效应子(TALE)核酸酶(TALEN，参见，例如美国专利第9,393,257号)、大范围核酸酶(具有包含12至40个碱基对的双链DNA序列的大识别位点的内切脱氧核糖核酸酶)、锌指核酸酶(ZFN，参见，例如，Urnov等人，Nat.Rev.Genetics(2010)第11卷，第636-646页)或megaTAL核酸酶(大范围核酸酶与TAL重复序列的融合蛋白)方法对本文公开的经修饰的T细胞进行工程化。这样，可对嵌合构建体进行工程化以组合每个亚基的所需特征，诸如构象或信号传递能力。另请参见Sander&Joung,Nat.Biotech.(2014)第32卷，第347-55页；和June等人，2009Nature ReviewsImmunol.9.10:704-716，每篇文献均通过引用并入本文。在一些实施方案中，对TFP亚基的胞外结构域、跨膜结构域或胞质结构域中的一种或多种进行工程化以具有超过一个天然TCR亚基结构域(即，是嵌合的)的方面。
永久性改变人基因组以及在疾病相关基因中引入位点特异性基因组修饰的技术的最新发展为治疗应用奠定了基础。这些技术现在通常被称为“基因组编辑”。
在一些实施方案中，基因编辑技术被用于破坏内源TCR基因。在一些实施方案中，所提及的内源TCR基因编码TCRα链、TCRβ链或TCRα链和TCRβ链。在一些实施方案中，基因编辑技术为多重基因组编辑铺平了道路，所述多重基因组编辑允许同时破坏内源TCR基因中的多个基因组基因座。在一些实施方案中，应用多重基因组编辑技术来产生在内源TCR和/或人白细胞抗原(HLA)、和/或程序性细胞死亡蛋白1(PD1)和/或其它基因表达方面具有缺陷的基因被破坏的T细胞。
目前的基因编辑技术包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)系统。这四大类基因编辑技术在结合用户定义的DNA序列和介导双链DNA断裂(DSB)方面具有共同的作用模式。然后，DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)或者-当存在供体DNA时-同源重组(HR)来修复，同源重组是从供体DNA片段引入同源序列的事件。另外，切口酶产生单链DNA断裂(SSB)。DSB可通过单链DNA掺入(ssDI)或单链模板修复(ssTR)来修复，单链模板修复是从供体DNA中引入同源序列的事件。
基因组DNA的遗传修饰可使用位点特异性的、稀有切割的内切核酸酶来完成，所述内切核酸酶被工程化来识别目标基因座中的DNA序列。产生工程化的位点特异性内切核酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，可对锌指核酸酶(ZFN)进行工程化以识别和切割基因组中的预定位点。ZFN是嵌合蛋白，其包含与Fokl限制性酶的核酸酶结构域融合的锌指DNA结合结构域。锌指结构域可通过合理的或实验性手段重新设计，以生产与预先确定的长度为18个碱基对的DNA序列结合的蛋白质。通过将这种工程化的蛋白质结构域与Fokl核酸酶融合，就有可能以基因组水平特异性来靶向DNA断裂。ZFN已被广泛用于多种真核生物的靶基因添加、去除和取代(综述于Durai等人(2005),Nucleic Acids Res 33,5978中)。同样地，可以产生TAL-效应子核酸酶(TALEN)来切割基因组DNA中的特定位点。与ZFN一样，TALEN包含与Fokl核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性的DNA结合结构域(综述于Mak等人(2013),Curr Opin Struct Biol.23:93-9)中。然而，在这种情况下，DNA结合结构域包括一个串联阵列的TAL效应子结构域，其每一个特异性识别单个DNA碱基对。紧凑型TALEN具有替代的内切核酸酶结构，避免了对二聚化的需要(Beurdeley等人(2013),Nat Commun.4:1762)。紧凑型TALEN包含与I-TevI归巢内切核酸酶的核酸酶结构域融合的工程化的、位点特异性TAL-效应子DNA结合结构域。与Fokl不同，I-TevI不需要二聚化来产生双链DNA断裂，因此紧凑型TALEN作为单体是有功能的。
基于CRISPR/Cas9系统的工程化的内切核酸酶在本领域也是已知的(Ran等人(2013),Nat Protoc.8:2281-2308；Mali等人(2013),Nat Methods 10:957-63)。CRISPR基因编辑技术由其DNA靶向特异性和切割活性可通过短的引导RNA或双链体crRNA/TracrRNA来编程的内切核酸酶蛋白组成。CRISPR内切核酸酶包含两个组分：(1)半胱天冬酶效应子核酸酶，通常为微生物Cas9；和(2)包含18至20个核苷酸靶向序列的短的“引导RNA”或RNA双链体，其将核酸酶导向基因组中的目标位置。通过在同一细胞中表达多种引导RNA，每种引导RNA具有不同的靶向序列，就可能将DNA断裂同时靶向基因组中的多个位点(多重基因组编辑)。
本领域中已知两类CRISPR系统(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)，每个种类都包含多个CRISPR类型。1类包括通常存在于古细菌的I型和III型CRISPR系统。而II类包括II型、IV型、V型和VI型CRISPR系统。尽管最广泛使用的CRISPR/Cas系统是II型CRISPR-Cas9系统，但CRISPR/Cas系统已被研究人员重新用于基因组编辑。在过去的几年里，已改造了10多种不同的CRISPR/Cas蛋白(Adli(2018)Nat.Commun.9:1911)。在这些蛋白中，诸如来自酸性氨基球菌属的某一种(Acid-aminococcus sp)(AsCpf1)和毛螺菌科细菌(Lachnospiraceaebacterium)(LbCpf1)的Cas12a(Cpf1)蛋白是特别令人感兴趣的。
归巢内切核酸酶是一组天然存在的核酸酶，其能识别植物和真菌基因组中常见的15-40个碱基对的切割位点。它们通常与寄生物的DNA元件缔合，诸如组1自我剪接内含子和内含肽(intein)。它们通过在染色体上产生双链断裂(这募集细胞的DNA修复机制(Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95))来自然地促进同源重组或在宿主基因组的特定位置插入基因。特定的氨基酸取代可重新编程归巢核酸酶的DNA切割特异性(Niyonzima(2017),Protein Eng Des Sel.30(7):503–522)。大范围核酸酶(MN)是具有天然核酸酶活性的单体蛋白，其源自细菌归巢内切核酸酶，并针对独特的靶位点进行了工程化(Gersbach(2016),Molecular Therapy.24:430–446)。在一些实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-CreI归巢内切核酸酶。在其它实施方案中，大范围核酸酶是工程化的I-SceI归巢内切核酸酶。
除了提及的四种主要的基因编辑技术以外，还已对包含大范围核酸酶、ZFN和TALEN的融合体的嵌合蛋白进行工程化，以产生新型单体酶，该酶利用ZFN和TALEN的结合亲和力和大范围核酸酶的切割特异性(Gersbach(2016)，Molecular Therapy.24:430–446)。例如，megaTAL是单一嵌合蛋白，其是来自TALEN的易于定制的DNA结合结构域与大范围核酸酶的高切割效率的组合。
为了执行基因编辑技术，核酸酶，以及在CRISPR/Cas9系统的情况下，gRNA，必须被高效地递送到目标细胞。诸如物理、化学和病毒方法等的递送方法也是本领域已知的(Mali(2013).Indian J.Hum.Genet.19:3-8.)。在一些情况下，物理递送方法可选自但不限于电穿孔、显微注射或使用弹道粒子的方法。另一方面，化学递送方法需要使用复杂分子，诸如磷酸钙、脂质或蛋白质。在一些实施方案中，使用病毒(诸如但不限于腺病毒、慢病毒和逆转录病毒)将病毒递送方法应用于基因编辑技术。
本发明还提供了包含编码TFP的核酸分子的载体。一方面，可将TFP载体直接转导到细胞(例如，T细胞)中。一方面，载体是克隆性载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆性载体、微环、微载体、双微体(double minutechromosome))、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。一方面，载体能够在哺乳动物T细胞中表达TFP构建体。一方面，哺乳动物T细胞是人T细胞。
T细胞的来源
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”旨在包括其中能够引发免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可使用本领域中可用的多种T细胞系。在本发明的某些方面，可使用本领域技术人员已知的多种技术，诸如FicollTM分离，由从受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个优选方面，通过单采获得来自个体循环血液的细胞。单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。一方面，可洗涤通过单采收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在另一方面，洗涤溶液缺乏钙，并且可以缺乏镁，或者可以缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在钙不存在的情况下，初始活化步骤会导致更大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，诸如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)来完成。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容的缓冲液中，例如，不含钙、不含镁的PBS、PlasmaLyte A或其它含或不含缓冲剂的盐溶液。或者，可以除去单采样品中不需要的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
一方面，通过裂解红细胞和耗竭单核细胞，例如经由通过PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞中分离出T细胞。可通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD3+T细胞、CD28+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD45RA+T细胞和CD45RO+T细胞。例如，一方面，通过与缀合有抗CD3/抗CD28(例如，3×28)的珠粒，诸如DYNABEADSTM M-450CD3/CD28 T一起孵育足以阳性选择所需的T细胞的一段时间来分离T细胞。一方面，所述时间段约为30分钟。另一方面，所述时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。另一方面，所述时间段为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在另一个优选方面，所述时间段为10至24小时。一方面，孵育时间段为24小时。在与其它细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，例如在从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)中，可使用更长的孵育时间来分离T细胞。另外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。因此，仅通过缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠粒结合的时间和/或通过增加或减少珠粒与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养开始时或在培养过程中的其它时间点优先选择或选除T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠粒或其它表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养开始时或其它期望的时间点优先选择或选除T细胞亚群。本领域技术人员将认识到，在本发明的说明书中也可使用多轮选择。在某些方面，可能希望执行选择程序并在活化和扩增过程中使用“未选中的”细胞。还可将“未选中”的细胞经历进一步轮次的选择。
通过阴性选择富集T细胞群可通过针对阴性选择的细胞所特有的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能需要富集或阳性选择调节T细胞，所述调节T细胞通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+。或者，在某些方面，通过缀合有抗C25的珠粒或其它类似的选择方法来耗竭调节T细胞。
在一个实施方案中，可以选择表达IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素中的一种或多种或其它合适的分子(例如，其它细胞因子)的T细胞群。筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号：WO 2013/126712中描述的方法来确定。
为了通过阳性或阴性选择来分离所需的细胞群，可改变细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的浓度。在某些方面，可能希望显著减小其中将珠粒和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，一方面，使用20亿个细胞/mL的浓度。一方面，使用10亿个细胞/mL的浓度。在另一方面，使用超过1亿个细胞/mL。在另一方面，使用1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万或5000万个细胞/mL的细胞浓度。在又一方面，使用7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/mL的细胞浓度。在另一方面，可使用1.25亿个或1.5亿个细胞/mL的浓度。使用高浓度可以增加细胞产率、细胞活化和细胞扩增。另外，高细胞浓度的使用允许更高效地捕获可能微弱表达目标靶抗原的细胞(诸如CD28阴性T细胞)，或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可具有治疗价值，并且是所希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱的CD28表达的CD8+T细胞。
在相关方面，可能希望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒诸如珠粒)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用降至最低。这就选择了与颗粒结合的表达大量所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达更高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更高效地被捕获。一方面，所用细胞的浓度为5x106/mL。在其它方面，所使用的浓度可以是从约1x105/mL至1x106/mL，以及介于两者之间的任何整数值。在其它方面，可将细胞在旋转器上以不同的速度在2-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
也可在洗涤步骤后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度上的单核细胞来提供更均一的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的，并且在这种情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或者含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或含有31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或者其它含有例如羟乙基淀粉溶液(Hespan)和PlasmaLyte A的合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1的速度冷冻至-80℃，并储存在液氮储罐的汽相(vapor phase)中。可使用其它受控冷冻的方法，以及立即在-20℃或在液氮中进行非受控冷冻。在某些方面，如本文所述解冻和洗涤冷冻保存的细胞，并使其在室温下静置一小时，然后使用本发明的方法进行活化。
在本发明的说明书中还设想了在可能需要本文所述的扩增的细胞之前的一段时间从受试者收集血液样品或单采产物。因此，可在任何必要的时间点收集待扩增的细胞的来源，分离所需的细胞(诸如T细胞)并将其冷冻，以待以后用于许多将受益于T细胞疗法的疾病或疾患(诸如本文所述的那些)的T细胞疗法。一个方面，血液样品或单采产物取自一般健康的受试者。在某些方面，从一般健康的受试者(所述受试者有发展疾病的风险，但尚未发展成疾病)获取血液样品或单采产物，并分离目标细胞，将其冷冻以备后用。在某些方面，可将T细胞扩增、冷冻并在以后使用。在某些方面，在如本文所述的特定疾病诊断后不久，但在任何治疗之前，从患者收集样品。在另外的方面，在进行多种相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，所述治疗模式包括但不限于利用诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学疗法等剂、放射、免疫抑制剂诸如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤和霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫消融剂诸如阿伦珠单抗、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢霉素、FK506、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和辐照等手段的治疗。
在本发明的另外方面，在给受试者留下功能性T细胞的治疗后，直接从患者获取T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在治疗后不久在患者通常从治疗中恢复期间，所获得的T细胞的质量对于它们离体扩增的能力而言可能是最佳的或得到改善的。同样，在使用本文所述方法进行离体操作后，这些细胞可能处于增强的植入和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的说明书中，设想了在该恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或其它造血谱系的细胞。另外，在某些方面，动员(例如，利用GM-CSF的动员)和条件化方案可用于在受试者中创造条件，在所述条件下，尤其在治疗后的限定时间窗内，有利于特定细胞类型的再增殖、再循环、再生和/或扩增。说明性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩增
通常可使用例如美国专利第6,352,694号、第6,534,055号、第6,905,680号、第6,692,964号、第5,858,358号、第6,887,466号、第6,905,681号、第7,144,575号、第7,067,318号、第7,172,869号、第7,232,566号、第7,175,843号、第5,883,223号、第6,905,874号、第6,797,514号、第6,867,041号和第7,572,631号中描述的方法来活化和扩增T细胞。
通常，可通过与表面接触来扩增本发明的T细胞，所述表面附着有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，可如本文所述，诸如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触来刺激T细胞群。对于辅助分子在T细胞表面的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，可在适于刺激T细胞增殖的条件下，将T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，可如使用本领域公知的其它方法(Berg等人，Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人，J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)那样使用。
已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制性T细胞群(TC，CD8+)更大的辅助性T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生了T细胞群，所述T细胞群在约8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约8-9天之后，T细胞群体包含越来越大的TC细胞群。因此，根据治疗的目的，用主要由TH细胞组成的T细胞群输注受试者可以是有利的。类似地，如果已经分离出抗原特异性的TC细胞亚群，则将该亚群扩增至更大的程度可以是有益的。
另外，除了CD4和CD8标志物以外，其它表型标志物也有显著变化，但在很大程度上，在细胞扩增过程中是可再现的。因此，这种再现性使得能够为特定目的定制活化的T细胞产品。
一旦构建了抗TAA TFP，就可使用各种测定来评估该分子的活性，诸如但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力，在再刺激不存在的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。评估抗TAA TFP作用的测定将在下面进一步详细描述。
原代T细胞中TFP表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，将表达TFP的T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞的1:1混合物)离体扩增超过10天，随后进行裂解并在还原条件下进行SDS-PAGE。通过蛋白质印迹法，使用针对TCR链的抗体来检测TFP。将相同的T细胞亚群用于在非还原条件下进行SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。
抗原刺激后的TFP+T细胞的离体扩增可通过流式细胞术来测量。例如，将CD4+和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28和APC刺激，然后在待分析的启动子的控制下用表达GFP的慢病毒载体进行转导。示例性启动子包括CMV IE基因、EF-1α、遍在蛋白C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在培养的第6天，通过流式细胞术评估CD4+T细胞和/或CD8+T细胞亚群中的GFP荧光(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。或者，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞的混合物，并在第1天使用表达TFP的双顺反子慢病毒载体利用TFP，以及使用2A核糖体跳跃序列利用eGFP一起转导所述细胞混合物。洗涤后，在抗CD3抗体和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在的情况下，用TAA+细胞(例如，K562细胞)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞再刺激培养物。每隔一天向培养物中加入100IU/mL的外源IL-2。通过使用基于珠粒的计数的流式细胞术对GFP+T细胞进行计数(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。
还可测量再刺激不存在的情况下的持续的TFP+T细胞扩增(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，在于第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并于第1天用指示的TFP转导后，在培养的第8天使用Coulter Multisizer III颗粒计数器测量平均T细胞体积(fl)。
还可使用动物模型来测量TFP-T的活性。例如，可使用异种移植模型，所述异种移植模型在免疫缺陷型小鼠中使用人TAA特异性TFP+T细胞治疗癌症(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009))。简言之，在建立癌症后，将小鼠随机分为治疗组。将不同数量的工程化的T细胞以1:1的比率共注射到携带癌症的NOD/SCID/γ-/-小鼠中。在注射T细胞后的不同时间，评估小鼠的脾脏DNA中每个载体的拷贝数。以每周为间隔对动物进行癌症评估。在注射了α-TAA-ξTFP+T细胞或模拟转导的T细胞的小鼠中，测量外周血TAA+癌症细胞计数。使用时序检验(log-rank test)比较各组的存活曲线。另外，还可分析NOD/SCID/γ-/-小鼠在注射T细胞后4周的绝对外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞计数。给小鼠注射癌症细胞，3周后给小鼠注射通过编码与eGFP连接的TFP的双顺反子慢病毒载体工程化以表达TFP的T细胞。通过在注射前与模拟转导的细胞混合，将T细胞针对45-50％的输入GFP+T细胞进行标准化，并通过流式细胞术进行确认。以1周的间隔对动物进行癌症评估。用时序检验比较TFP+T细胞组的存活曲线。
可以评估剂量依赖性TFP治疗反应(参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009))。例如，在建立癌症后35-70天，在于第21天注射了TFP T细胞、等数量的模拟转导的T细胞或未注射T细胞的小鼠中获得外周血。对各组小鼠进行随机放血以测定外周血TAA+癌症细胞计数测定，然后在第35天和第49天处死小鼠。在第57天和第70天评估剩余的动物。
先前已经例如在Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)中描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估。简言之，通过将洗涤过的T细胞与表达TAA或CD32和CD137(KT32-BBL)的细胞混合(最终的T细胞:表达TAA的细胞的比率为2:1)，在微量滴定板中进行TFP介导的增殖的评估。表达TAA的细胞在使用前用γ射线照射。将抗CD3(克隆OKT3)单克隆抗体和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加到含有KT32-BBL细胞的培养物中，用作刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期CD8+T细胞离体扩增。如制造商所描述的，使用CountBrightTM荧光珠粒(Invitrogen)和流式细胞术对培养物中的T细胞进行计数。使用利用表达eGFP-2A连接的TFP的慢病毒载体工程化的T细胞，通过GFP表达鉴定TFP+T细胞。对于不表达GFP的TFP+T细胞，利用生物素化的重组TAA蛋白和第二抗生物素蛋白-PE缀合物检测TFP+T细胞。还可用特异性单克隆抗体(BD Biosciences)同时检测T细胞上的CD4+和CD8+表达。根据制造商的说明，使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠粒阵列试剂盒(BDBiosciences)对再刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur式细胞仪评估荧光，并根据制造商的说明分析数据。
细胞毒性可通过标准51Cr释放测定进行评估(参见，例如，Milone等人，MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009))。简言之，在频繁搅拌的条件下，将靶细胞在37℃下用51Cr(如NaCrO4,New England Nuclear)加载2小时，在完全RPMI中洗涤两次，然后涂铺到微量滴定板中。在孔中，将效应T细胞与靶细胞在完全RPMI培养基中以不同的效应细胞∶靶细胞比率(E:T)混合。还准备了仅含培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃孵育4小时后，收获每个孔的上清液。然后使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,Mass.)测量释放的51Cr。以至少一式三份执行每种条件，裂解百分比使用以下公式计算：裂解％＝(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示每种实验条件下释放的平均51Cr。
可将成像技术用于在荷瘤动物模型中评估TFP的特定运输和增殖。此类测定已例如在Barrett等人，Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中进行了描述。简言之，给NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠IV注射癌细胞，7天后，在用TFP构建体电穿孔后4小时给小鼠注射T细胞。用慢病毒构建体稳定转染T细胞以表达萤火虫萤光素酶，并对小鼠的生物发光进行成像。或者，可如下测量癌症异种移植物模型中单次注射TFP+T细胞的治疗效果和特异性：给NSG小鼠注射经转导以稳定表达萤火虫萤光素酶的癌细胞，随后在7天后单次尾静脉注射用TAA TFP电穿孔的T细胞。在注射后的不同时间点对动物进行成像。例如，可生成第5天(治疗前2天)和第8天(TFP+PBL后24小时)的代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性癌症的光子密度热图。
其它测定，包括本文实施例部分所述的以及本领域已知的那些测定也可用于评估本文发明的抗TAA TFP构建体。
治疗应用
MUC16、IL13Rα2和MSLN相关疾病和/或病症
一方面，本公开提供了用于治疗与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关联的疾病的方法。一方面，本公开提供了用于治疗其中肿瘤的一部分对MUC16、IL13Rα2或MSLN呈阴性并且肿瘤的一部分对MUC16、IL13Rα2或MSLN呈阳性的疾病的方法。例如，本公开的TFP可用于治疗已接受与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达升高相关联的疾病的治疗的受试者，其中已接受对MUC16、IL13Rα2或MSLN水平升高的治疗的受试者表现出与MUC16、IL13Rα2或MSLN水平升高相关联的疾病。
一方面，本发明涉及载体，所述载体包含与用于在哺乳动物T细胞中表达的启动子可操作地连接的抗TAA TFP。一方面，本公开提供了用于分别治疗表达MUC16、表达IL13Rα2或表达MSLN的肿瘤的表达MUC16 TFP、IL13Rα2TFP或MSLN TFP的重组T细胞，其中表达MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP的重组T细胞被称为MUC16 TFP-T、IL13Rα2TFP-T或MSLN TFP-T。一方面，本公开的MUC16、IL13Rα2或MSLN TFP-T能够使肿瘤细胞与在其表面表达的至少一种本发明的MUC16 TFP、IL13Rα2TFP或MSLN TFP接触，使得TFP-T靶向肿瘤细胞并抑制肿瘤的生长。
一方面，本公开涉及抑制表达MUC16、IL13Rα2或MSLN的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本公开的抗MUC16 TFP T细胞、抗IL13Rα2TFP T细胞或抗MSLN TFP T细胞接触，使得TFP-T响应于抗原(例如，癌细胞表面上存在的MUC16、IL13Rα2或MSLN抗原)而被活化并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长被抑制。
一方面，本公开涉及治疗受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用本公开的抗TAATFP T细胞，使得受试者的癌症得以治疗。可由本发明的抗TAA TFP T细胞治疗的癌症的实例是与相应TAA的表达相关联的癌症。一方面，癌症是间皮瘤。一方面，癌症是胰腺癌。一方面，癌症是卵巢癌。一方面，癌症是胃癌。一方面，癌症是肺癌。一方面，癌症是子宫内膜癌。在一些实施方案中，可将抗TAA TFP疗法与一种或多种另外的疗法组合使用。
本公开包括一种类型的细胞疗法，其中对T细胞进行遗传修饰以表达TFP，并将表达TFP的T细胞输注给有此需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，表达TFP的T细胞能够在体内复制，导致长期保留，这可导致持续的肿瘤控制。在各个方面，在向患者施用T细胞后，向患者施用的T细胞或其后代在患者体内持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
本公开还包括一种类型的细胞疗法，其中例如通过体外转录的RNA修饰T细胞，以瞬时表达TFP，并将表达TFP的T细胞输注给有此需要的受者。输注的细胞能够杀伤受者体内的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在向患者施用T细胞后，向患者施用的T细胞存在少于一个月，例如三周、两周或一周。
不希望受任何特定理论的束缚，由表达TFP的T细胞引发的抗肿瘤免疫反应可以是主动或被动免疫反应，或者可选地可归因于直接对比间接免疫反应。一方面，响应于表达肿瘤相关抗原(TAA)(例如，MUC16、IL13Rα2或MSLN)的人癌细胞，TFP转导的T细胞表现出特异性促炎细胞因子分泌和强劲的细胞裂解活性，抵抗可溶性TAA抑制，介导旁观者杀伤并且/或者介导已建立的人肿瘤的消退。例如，在表达TAA的肿瘤的异质区域内的无抗原(antigen-less)肿瘤细胞可能容易受到TAA重定向的T细胞的间接破坏，所述T细胞先前已经对邻近的抗原阳性癌细胞发生了反应。
一方面，本公开的经人TFP修饰的T细胞可以是用于哺乳动物的离体免疫和/或体内疗法的一类疫苗。一方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于哺乳动物中之前，以下方面的至少一个方面在体外发生：i)细胞的扩增，ii)将编码TFP的核酸引入细胞，或者iii)细胞的冷冻保存。
离体程序在本领域是公知的，并且将在下面更全面地论述。简言之，从哺乳动物(例如，人)中分离细胞并用本文公开的表达TFP的载体对其进行遗传修饰(即，体外转导或转染)。可向哺乳动物受者施用经TFP修饰的细胞以提供治疗益处。所述哺乳动物受者可以是人，经TFP修饰的细胞相对于受者可以是自体的。或者，相对于受者，细胞可以是同种异型的、同系的或异种的。
在美国专利第5,199,942号(通过引用并入本文)中描述了用于造血干细胞和祖细胞离体外扩增的程序，其可应用于本发明的细胞。其它合适的方法在本领域中是已知的，因此本公开不限于任何特定的细胞离体扩增方法。简言之，T细胞的离体培养和扩增包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体中收集哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)离体扩增此类细胞。除了美国专利第5,199,942号中描述的细胞生长因子以外，还可将其它因子诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体用于培养和扩增细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗以外，本发明还提供了用于离体免疫(以在患者体内引发针对抗原的免疫反应)的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩增的细胞可用于治疗和预防免疫受损的个体中出现的疾病。具体而言，本发明的经TFP修饰的T细胞用于治疗与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病、病症和疾患。在某些方面，本发明的细胞用于治疗有患与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病、病症和疾患的风险的患者。因此，本发明提供了用于治疗或预防与MUC16、IL13Rα2或MSLN的表达相关联的疾病、病症和疾患的方法，其包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的本公开的经TFP修饰的T细胞。
一方面，本公开的TFP-T细胞可用于治疗增殖性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤或癌前疾患。一方面，癌症是间皮瘤。一方面，癌症是胰腺癌。一方面，癌症是卵巢癌。一方面，癌症是胃癌。一方面，癌症是肺癌。一方面，癌症是乳腺癌。一方面，癌症是子宫内膜癌。另外，与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关联的疾病包括但不限于，例如，非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前疾患或表达MUC16、IL13Rα2或MSLN的增殖性疾病。与MUC16、IL13Rα2或MSLN表达相关联的非癌症相关适应症包括但不限于，例如自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性病症(过敏症和哮喘)、炎性肠病、肝硬化、心力衰竭、腹膜感染以及腹部手术和移植。
本公开的经TFP修饰的T细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或其它组分诸如IL-2或其它细胞因子或细胞群的组合施用。
本发明还提供了抑制表达TAA的细胞群增殖或减少所述细胞群的方法，所述方法包括使包含表达TAA的细胞的细胞群与本公开的抗TAA TFP-T细胞接触，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。在一些方面，本公开提供了抑制表达TAA的癌细胞群的增殖或减少其数量的方法，所述方法包括使表达TAA的癌细胞群与本公开的抗TAA TFP-T细胞接触，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。一方面，本公开提供了抑制表达肿瘤相关抗原的癌细胞群的增殖或减少其数量的方法，所述方法包括使表达TAA的癌细胞群与本公开的抗TAA TFP-T细胞接触，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。在某些方面，相对于阴性对照，本公开的抗TAA TFP-T细胞将患有与表达TAA的细胞相关联的癌症的受试者或动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。一方面，受试者是人。
本公开还提供了用于预防、治疗和/或控制与表达TAA的细胞相关联的疾病(例如，表达TAA的癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的抗TAA TFP-T细胞，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。一方面，受试者是人。与表达TAA的细胞相关联的病症的非限制性例子包括自身免疫性疾病(诸如，狼疮)、炎性疾病(诸如过敏症和哮喘)和癌症(诸如胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宫内膜癌，或表达TAA的非典型癌症)。
本公开还提供了用于预防、治疗和/或控制与表达TAA的细胞相关联的疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本公开的抗TAA TFP-T细胞，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。一方面，受试者是人。
本公开提供了用于防止与表达TAA的细胞相关联的癌症复发的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本公开的抗TAA TFP-T细胞，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。一方面，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所述的抗TAATFP-T细胞与有效量的另一种疗法的组合，所述抗TAA TFP-T细胞与表达TAA的细胞结合。
联合治疗
可将本文所述的表达TFP的细胞与其它已知的剂和疗法组合使用。如本文中所用，“组合”施用意指在受试者患有病症的过程中，向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在受试者被诊断患有病症后并且在疾病被治愈或消除或治疗因其它原因停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当第二治疗的递送开始时，一种治疗的递送仍在进行，因此在施用方面存在重叠。这在本文中有时被称为“同时”或“同时递送”。在其它实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，由于组合施用，治疗更有效。例如，第二治疗比在没有第一治疗的情况下施用第二治疗或在对于第一治疗看到类似情况的情况下施用第二治疗更有效，例如，用较少的第二治疗可看到等效效果，或者第二治疗可在更大程度上减轻症状。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症相关的其它参数的减少大于在没有另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的所述减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可使得当递送第二治疗时，递送的第一治疗的效果仍然是可检测的。
在一些实施方案中，“至少一种另外的治疗剂”包括表达TFP的细胞。还提供了表达多种与相同或不同的靶抗原或相同靶抗原上相同或不同的表位结合的TFP的T细胞。还提供了T细胞群，其中T细胞的第一亚群表达第一TFP，而T细胞的第二亚群表达第二TFP。
本文所述的表达TFP的细胞和所述至少一种另外的治疗剂可以同时施用、于相同的组合物中施用，或者于分开的组合物中施用，或者依次施用。对于依次施用，可以首先施用本文所述的表达TFP的细胞，然后可以施用另外的剂，或者可以颠倒施用顺序。
在另外的方面，可将本文所述的表达TFP的细胞与手术、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂(诸如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其它免疫烧蚀剂(immunoablative agent)诸如阿仑单抗、抗CD3抗体或其它抗体疗法)、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照组合用于治疗方案。还可将本文所述的表达TFP的细胞与肽疫苗，诸如Izumoto等人2008J Neurosurg108:963-971中所述的肽疫苗组合使用。另一方面，还可将本文所述的表达TFP的细胞与髓样细胞分化的促进剂(例如，全反式维甲酸)、髓源性抑制细胞(MDSC)扩增的抑制剂(例如，c-kit受体的抑制剂或VEGF抑制剂)、MDSC功能的抑制剂(例如，COX2抑制剂或磷酸二酯酶-5抑制剂)或MDSC的治疗性消除(例如，利用化疗方案诸如利用多柔比星和环磷酰胺的治疗)组合使用。可防止MDSC扩增的其它治疗剂包括氨基-双膦酸酯、双膦酸酯、西地那非和他达拉非、硝基阿司匹林、维生素D3和吉西他滨。(参见，例如，Gabrilovich和Nagaraj,Nat.Rev.Immunol,(2009)第9卷(3):162-174)。
在一个实施方案中，可向受试者施用减轻或改善与施用表达TFP的细胞相关联的副作用的剂。与施用表达TFP的细胞相关联的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(CRS)和噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，也称为巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高烧、恶心、短暂性低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可包括向受试者施用本文所述的表达TFP的细胞，并进一步施用剂以控制利用表达TFP的细胞的治疗导致的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-6和IL8中的一种或多种。因此，被施用来治疗这种副作用的剂可以是中和这些可溶性因子的一种或多种的剂。此类剂包括但不限于类固醇、TNFα抑制剂和IL-6抑制剂。TNFα抑制剂的实例为依那西普。IL-6抑制剂的实例为托珠单抗(toc)。
在一个实施方案中，可向受试者施用增强表达TFP的细胞的活性的剂。例如，在一个实施方案中，所述剂可以是抑制抑制性分子的剂。在一些实施方案中，抑制性分子，例如，程序性死亡1(PD1)，可以降低表达TFP的细胞产生免疫效应子反应的能力。抑制性分子的实例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平上的抑制)可以优化表达TFP的细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，可用于抑制抑制性分子在表达TFP的细胞中的表达。在实施方案中，抑制剂是shRNA。在实施方案中，抑制性分子在表达TFP的细胞中被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子表达的dsRNA分子与编码TFP的组分(例如，所有组分)的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以是例如与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，所述剂可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称为MDX-010和MDX-101，并作为YervoyTM来销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(可从Pfizer获得的IgG2单克隆抗体，以前称为替西木单抗，CP-675,206))。在一个实施方案中，所述剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，可以通过慢病毒，例如特异性靶向CD4+T细胞或CD8+T细胞的慢病毒，在体内改变T细胞(例如，通过基因转移)。(参见，例如，Zhou等人，J.Immunol.(2015)195:2493-2501)。
在一些实施方案中，增强表达TFP的细胞活性的剂可以是例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，第二结构域是与阳性信号相关的多肽，例如包含本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与阳性信号相关的多肽可包括CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域，和/或初级信号传导结构域，例如CD3ζ，例如，本文所述的。在一个实施方案中，融合蛋白由表达TFP的同一细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达抗TAA TFP的细胞(例如，T细胞)表达。
药物组合物
本公开的药物组合物可包含表达TFP的细胞，例如本文所述的多种表达TFP的细胞，以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。一方面，将本公开的组合物配制用于静脉内施用。
可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用本公开的药物组合物。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病类型和严重程度等因素决定，尽管适当的剂量可由临床试验决定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如，不存在可检测水平的污染物(例如，选自由以下组成的组：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD3/抗CD28包被的珠粒、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌)。在一个实施方案中，所述细菌是选自由以下组成的组的至少一种细菌：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)和化脓性链球菌A组(Streptococcus pyogenes group A)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，医生可以在考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤尺寸、感染或转移的程度以及状况的个体差异的情况下，确定待施用的本公开的组合物的精确量。通常可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，在一些情况下为105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内的所有整数值)的剂量施用。也可以以这些剂量多次施用T细胞组合物。所述细胞可通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人，New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。
在某些方面，可能需要向受试者施用活化的T细胞，随后重新抽取血液(或进行单采)，根据本公开从血液中活化T细胞，并用这些活化和扩增的T细胞再输注给患者。这个过程可以每隔几周进行多次。在某些方面，可从10cc至400cc的取血中活化T细胞。在某些方面，可从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的取血中活化T细胞。
本发明组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输注、植入或移植。可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内途径向患者施用本文所述的组合物。一方面，通过皮内或皮下注射向患者施用本公开的T细胞组合物。一方面，通过静脉内(i.v.)注射施用本公开的T细胞组合物。可将T细胞的组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一个特定的示例性方面，受试者可进行白细胞去除术，其中离体收集、富集或去除白细胞，以选择和/或分离目标细胞，例如T细胞。这些T细胞分离株可通过本领域已知的方法扩增，并进行处理，使得可以引入本公开的一种或多种TFP构建体，从而产生本公开的表达TFP的T细胞。有需要的受试者可随后进行高剂量化学疗灶的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或移植的同时，受试者接受本公开的扩增的TFP T细胞的输注。另一方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
对患者进行的上述治疗的剂量将随着所治疗疾病的确切性质和治疗的受者而变化。用于人施用的剂量缩放(scaling of dosages)可以根据本领域公认的实践进行。例如，对于成年患者，阿仑珠单抗的剂量通常在1mg至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天的时期。优选日剂量为1至10mg/天，尽管在某些情况下可使用高达40mg/天的较大剂量(描述于美国专利第6,120,766号中)。
在一个实施方案中，例如，使用体外转录将TFP引入T细胞，并且受试者(例如，人)接受本公开的TFP T细胞的初始施用，以及本公开的TFP T细胞的一次或多次后续施用，其中一次或多次后续施用在前一次施用后少于15天，例如，14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如，人)施用多于一次的本公开的TFP T细胞的施用，例如，每周施用2次、3次或4次本公开的TFP T细胞的施用。在一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)每周接受多于一次的TFP T细胞的施用(例如，每周2次、3次或4次施用)(在本文中也称为一个周期)，随后一周不进行TFP T细胞施用，然后向受试者施用一次或多次另外的TFP T细胞的施用(例如，每周超过一次的TFP T细胞施用)。在另一个实施方案中，受试者(例如，人受试者)接受超过一个周期的TFP T细胞，并且每个周期之间的时间少于10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用TFP T细胞一次，每周施用3次。在一个实施方案中，施用本公开的TFP T细胞至少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更多周。
一方面，使用慢病毒载体诸如慢病毒产生TAA TFP T细胞。以这种方式产生的TFP-T细胞将具有稳定的TFP表达。
一方面，TFP T细胞在转导后瞬时表达TFP载体4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。TFP的瞬时表达可通过RNA TFP载体递送来实现。一方面，通过电穿孔将TFP RNA转导到T细胞中
使用瞬时表达TFP的T细胞(尤其是携带鼠scFv的TFP T细胞)治疗的患者中可出现的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这一理论束缚，据信这种过敏反应可能是由患者产生体液性抗TFP反应引起的，即抗TFP抗体具有抗IgE同种型。据认为，患者的抗体产生细胞在对抗原的暴露中中断10至14天时经历从IgG同种型(其不引起过敏反应)至IgE同种型的类别转换。
如果患者在短暂TFP疗法过程中有产生抗TFP抗体反应(诸如由RNA转导产生的那些)的风险，则TFP T细胞输注中断不应持续超过10至14天。
细胞因子释放
细胞因子释放综合征是全身炎症反应综合征的形式，其作为一些疾病或感染的并发症发生，也是一些单克隆抗体药物以及过继性T细胞疗法的副作用。TFP T细胞可表现出比CAR-T细胞更好的杀伤活性。向受试者施用的TFP T细胞可表现出比向受试者施用的CAR-T细胞更好的杀伤活性。这可以是TFP T细胞优于CAR-T细胞的有利方面之一。TFP T细胞相较于CAR-T细胞可以表现出较少的细胞因子释放。施用了TFP T细胞的受试者相较于施用了CAR-T细胞的受试者可表现出较少的细胞因子释放。这可以是TFP T细胞疗法优于CAR-T细胞疗法的有利方面之一。TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞类似或比其更好的杀伤活性，并且TFP T细胞相较于CAR-T细胞可以表现出更少的细胞因子释放。向受试者施用的TFP T细胞可以表现出与向受试者施用的CAR-T细胞相似的或比其更好的杀伤活性，并且受试者相较于施用了CAR-T细胞的受试者可以表现出更少的细胞因子释放。这可以是TFP T细胞疗法优于CAR-T细胞疗法的有利方面之一。
在一些情况下，利用TFP T细胞的治疗的细胞因子释放少于利用CAR-T细胞的治疗的细胞因子释放。在一些实施方案中，利用TFP T细胞的治疗的细胞因子释放比利用CAR-T细胞的治疗的细胞因子释放少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。与利用CAR-T细胞的T细胞治疗相比，在利用TFP T细胞的T细胞治疗中，各种细胞因子的释放较少。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β或其组合。在一些情况下，利用TFP T细胞的治疗相较于利用CAR-T的治疗释放较少的穿孔素、颗粒酶A、颗粒酶B或其组合。在一些实施方案中，在利用TFP T细胞的治疗中释放的穿孔素、颗粒酶A或颗粒酶B比利用CAR-T细胞的治疗少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或至少60％。
在一些实施方案中，对于给定的细胞因子，与用包含相同人或人源化抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的给定细胞因子的量相比，治疗后释放的所述给定的细胞因子的量减少至少10％。在一些实施方案中，给定的细胞因子包括选自由以下组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何组合。
在杀伤肿瘤细胞方面，TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞相似或比其更好的活性。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被抑制，使得在治疗至少8天后，肿瘤的尺寸为用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物中的肿瘤尺寸的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％或至多60％，其中用表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物和用不表达TFP的T细胞治疗的哺乳动物在治疗前具有相同的肿瘤尺寸。在一些实施方案中，哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制。在一些实施方案中，哺乳动物中的肿瘤生长被完全抑制至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多天。在一些实施方案中，与包含相同的人或人源化抗体结构域的CAR-T细胞相比，用TFP转导的T细胞群杀伤了相似量的肿瘤细胞。
与不表达TFP的细胞相比，TFP T细胞可以表现出不同的基因表达谱。在一些情况下，TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞相似的基因表达谱。在一些其它情况下，TFP T细胞可以表现出与CAR-T细胞不同于的基因表达谱。在一些实施方案中，用TFP转导的T细胞群具有与包含相同的人或人源化抗体结构域的CAR-T细胞不同的基因表达谱。在一些实施方案中，基因在用TFP转导的T细胞中的表达水平不同于基因在包含相同人或人源化抗体结构域的CAR-T细胞中的表达水平。在一些实施方案中，所述基因在抗原呈递、TCR信号传导、动态平衡、代谢、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、toll样受体信号传导、MMP和粘附分子信号传导或TNFR相关信号传导方面具有功能。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本公开。这些实施例仅是为了说明的目的而提供的，除非另有说明，否则并不旨在进行限制。因此，本公开决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖任何和所有的变型，所述变型由于本文提供的教导而变得明显。无需进一步描述，相信本领域普通技术人员可使用前面的描述和下面的说明性实施例，制造和利用本公开的化合物，并实施所要求的方法。以下工作实施例具体指出了本公开的各个方面，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1:TFP构建体
可通过在XbaI和EcoR1位点处将抗TAA VHH结构域(或SD结构域)DNA片段克隆到p510载体((System Biosciences(SBI))来工程化抗TAA TFP构建体，所述DNA片段通过编码短接头(SL)：AAAGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:2)或长接头(LL)：AAAIEVMYPPPYLGGGGSGGGGSGGGGSLE(SEQ ID NO:3)的DNA序列与CD3或TCRDNA连接。还可使用其它载体，例如pLRPO载体。
产生的抗TAA TFP构建体的实例包括p510_抗TAA_LL_TCRα(抗TAA VHH-长接头-人全长T细胞受体α链)、p510_TAA_LL_TCRαC(抗TAA VHH-长接头-人T细胞受体α恒定结构域链)、p510_抗TAA_LL_TCRβ(抗TAA VHH-长接头-人全长T细胞受体β链)、p510_抗TAA_LL_TCRβC(抗TAA VHH-长接头-人T细胞受体β恒定结构域链)、p510_抗TAA_LL_CD3γ(抗TAA VHH-长接头-人CD3γ链)、p510_抗TAA_LL_CD3δ(抗TAA VHH-长接头-人CD3δ链)、p510_抗TAA_LL_CD3ε(抗TAA VHH-长接头-人CD3ε链)、p510_抗TAA_SL_TCRβ(抗TAA VHH-短接头-人全长T细胞受体β链)、p510_抗TAA_SL_CD3γ(抗TAAVHH-短接头-人CD3γ链)、p510_抗TAA_SL_CD3δ(抗TAA VHH-短接头-人CD3δ链)、p510_抗TAA_SL_CD3ε(抗TAA VHH-短接头-人CD3ε链)。
本文使用的抗MUC16可以是人MUC16特异性scFv，例如4H11。
相应的抗MUC16、抗IL13Ra2或抗MSLN A CAR构建体、p510_抗TAA_28ζ的实例可以通过将编码抗TAA、部分CD28胞外结构域、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ的合成DNA在XbaI和EcoR1位点处克隆到p510载体中来产生。
各种其它载体可用于产生融合蛋白构建体。
实施例2:抗体序列
抗体序列的产生
scFv的产生
人或人源化抗TAA IgG可用于产生用于TFP构建体的scFv序列。可获得编码人或人源化VL和VH结构域的DNA序列，并且可以任选地对构建体的密码子进行优化，以便在来自智人的细胞中表达。VL结构域和VH结构域在scFv中出现的顺序是不同的(即，VL-VH或VH-VL取向)，三个拷贝的“G4S”或“G4S”亚基(G4S)3连接可变结构域以产生scFv结构域。抗TAA scFv质粒构建体可具有任选的Flag、His或其它亲和标签，并且可被电穿孔到HEK293或其它合适的人或哺乳动物细胞系中并纯化。验证测定包括通过FACS的结合分析、使用Proteon的动力学分析以及表达MUC16的细胞、表达IL13Rα2的细胞或表达MSLN的细胞的染色。
可与本文所述的组合物和方法一起使用的抗MUC16、抗IL13Rα2或抗MSLN结合结构域(包括VL结构域、VH结构域和CDR)的实例可在一些出版物和/或商业来源中找到。例如，某些抗MUC16抗体，包括3A5和11D10，已于WO 2007/001851(其内容通过引用并入)中公开。通过OVCAR-3Scatchard分析，3A5单克隆抗体以433pM的亲和力结合MUC16多肽的多个位点。VL和VH结构域、CDR和分别编码它们的核苷酸序列的实例可以是下列单克隆抗体中的那些：GTX10029、GTX21107、MA5-124525、MA5-11579、25450002、ABIN1584127、ABIN93655、112889、120204、LS-C356195、LS-B6756、TA801241、TA801279、V3494、V3648、666902、666904、HPA065600、AMAb91056。
人IL13Rα2多肽规范序列是UniProt登录号Q14627。提供了能够特异性结合人MUC16、IL13Rα2或MSLN多肽及其片段或结构域的抗体多肽。抗TAA抗体可使用多种技术(参见，例如，参Nicholson等人，1997)产生。当鼠抗TAA抗体用作起始材料时，鼠抗TAA抗体的人源化对于临床环境是期望的，其中鼠特异性残基可在接受T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)治疗的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)反应，即利用用TFP.TAA构建体转导的T细胞的治疗。人源化是通过将鼠抗TAA抗体的CDR区移植到合适的人种系受体框架上(任选地包括对CDR和/或框架区的其它修饰)来实现的。如本文所提供的，抗体和抗体片段残基的编号遵循Kabat(Kabat E.A.等人，1991；Chothia等人，1987)。
单结构域结合物
骆驼科动物和其它单结构域抗体也可用于产生抗MUC16、IL13Rα2、MSLN或其它抗肿瘤抗原TFP构建体。VHH结构域可用于与各种TCR亚基融合。在一些实施方案中，使用单结构域(例如，VHH)结合物，诸如表4中所列的那些(参见，例如，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:76、SEQID NO:97、OR SEQ ID NO:98的非限制性实例)。在实施例3和5中进一步描述了抗TAA单结构域抗体的制备。
TCR亚基的来源
人T细胞受体(TCR)复合物的亚基都包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。人TCR复合物包含CD3-ε多肽、CD3-γ多肽、CD3-δ多肽、CD3-ζ多肽、TCRα链多肽和TCRβ链多肽。人CD3-ε多肽规范序列是Uniprot登录号P07766。人CD3-γ多肽规范序列是Uniprot登录号P09693。人CD3-δ多肽规范序列是Uniprot登录号P043234。人CD3-ζ多肽规范序列是Uniprot登录号P20963。人TCRα链规范序列是Uniprot登录号Q6ISU1。人TCRβ链C区规范序列为Uniprot登录号P01850，人TCRβ链V区序列为P04435。
人CD3-ε多肽规范序列为：
MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI(SEQ ID NO:4)。
人CD3-γ多肽规范序列为：
MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGQDGVRQSRASDKQTLLPNDQLYQPLKDREDDQYSHLQGNQLRRN(SEQ ID NO:5)。
人CD3-δ多肽规范序列为：
MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKDKESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTQALLRNDQVYQPLRDRDDAQYSHLGGNWARNKS(SEQ ID NO:6)。
人CD3-ζ多肽规范序列为：
MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:7)。
人TCRα链规范序列为：
MAGTWLLLLLALGCPALPTGVGGTPFPSLAPPIMLLVDGKQQMVVVCLVLDVAPPGLDSPIWFSAGNGSALDAFTYGPSPATDGTWTNLAHLSLPSEELASWEPLVCHTGPGAEGHSRSTQPMHLSGEASTARTCPQEPLRGTPGGALWLGVLRLLLFKLLLFDLLLTCSCLCDPAGPLPSPATTTRLRALGSHRLHPATETGGREATSSPRPQPRDRRWGDTPPGRKPGSPVWGEGSYLSSYPTCPAQAWCSRSALRAPSSSLGAFFAGDLPPPLQAGAA(SEQ ID NO:8)。
人TCRα链C区规范序列为：
PNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:9)。
人TCRα链V区CTL-L17规范序列为：
MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAKGAGTASKLTFGTGTRLQVTL(SEQID NO:10)。
人TCRβ链C区规范序列为：
EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:11)。
人TCRβ链V区CTL-L17规范序列为：
MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQNPRHNITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLAGLNQPQHFGDGTRLSIL(SEQ ID NO:12)。
人TCRβ链V区YT35规范序列为：
MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCASSFSTCSANYGYTFGSGTRLTVV(SEQ IDNO:13)。
从TCR结构域和scFv生成TFP
可使用接头序列，诸如G4S、(G4S)2(G4S)3或(G4S)4，将MUC16、IL13Rα2或MSLN scFv与CD3-ε或其它TCR亚基重组连接。可以利用各种接头和scFv构型。TCRα链和TCRβ链可用于以全长多肽或仅作为其恒定结构域的形式生成TFP。TCRα链和TCRβ链的任何可变序列都可被允许用于制造TFP。
TFP表达载体
提供了表达载体，其包括：启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、使得能够分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如，SV40起始点和ColE1或本领域已知的其它元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和zeocin标记)。
可将编码TFP的核酸构建体克隆到慢病毒表达载体中，并基于TFP.TAA转导的T细胞(“TAA.TFP”或“TAA.TFP T细胞”或“TFP.TAA”或“TFP.TAA T细胞”)响应于TAA+靶细胞的效应T细胞反应的数量和质量验证表达，其中‘TAA’是例如MUC16、IL13Ra2或MSLN。效应T细胞反应包括但不限于细胞扩增、增殖、倍增、细胞因子产生和靶细胞裂解或细胞裂解活性(即，脱粒)。
抗TAA TFP慢病毒转移载体可用于产生包装在VSV-G假型慢病毒颗粒中的基因组物质。将慢病毒转移载体DNA与与
Figure BDA0002991027050001111
试剂组合的VSV-G、gag/pol和rev的三种包装组分混合，以将它们一起转染到HEK-293(胚胎肾，
Figure BDA0002991027050001112
CRL-1573TM)细胞中。24和48小时后，收集培养基，过滤并通过超速离心浓缩。将所得的病毒制剂于-80℃下储存。可通过在Sup-T1(T细胞淋巴母细胞淋巴瘤，
Figure BDA0002991027050001113
CRL-1942TM)细胞上滴定来确定转导单位的数量。通过用例如抗CD3抗CD28珠粒激活新鲜原初T细胞24小时，然后加入适当数量的转导单位以获得所需百分比的转导T细胞，来产生重定向的TFP T细胞。将使这些经修饰的T细胞扩增，直至它们变得静止并且尺寸缩小为止，此时将其冷冻保存以用于以后的分析。细胞的数量和尺寸使用Coulter MultisizerTM III来进行测量。冷冻保存前，转导细胞(在细胞表面上表达TFP)的百分比和表达的相对荧光强度将通过流式细胞分析来测定。从直方图中，可以通过将转导的百分比与它们的相对荧光强度进行比较来检测TFP的相对表达水平。
在一些实施方案中，通过用多种病毒载体转导T细胞来引入多种TFP。
评价人源化TFP重定向的T细胞的细胞裂解活性、增殖能力和细胞因子分泌
TFP T细胞产生细胞表面表达的TFP以及杀伤靶肿瘤细胞、增殖和分泌细胞因子的功能能力可使用本领域已知的测定来确定。
人外周血单核细胞(PBMC，例如来自其原初T细胞将通过对T细胞、CD4+和CD8+淋巴细胞的阴性选择而获得的正常单采供体的血液)将用人白细胞介素-2(IL-2)处理，然后用抗CD3x抗CD28珠粒活化(例如,在37℃下于10％RPMI、5％CO2中)，然后用编码TFP的慢病毒载体转导。流式细胞术测定将用于确认细胞表面是否存在TFP，诸如通过抗FLAG抗体或抗鼠可变结构域抗体。细胞因子(例如，IFN-γ)的产生将使用ELISA或其它测定来测量。
实施例3:抗IL13Rα2纳米抗体的制备
文库构建
免疫接种
在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天皮下注射骆马，每次注射约150μg与人IgG1的Fc结构域融合的重组人IL13Rα2(hIL13Rα2-Fc)(R&D Systems)。所用的佐剂是GERBU佐剂P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，从骆马收集约100ml抗凝血液用于淋巴细胞制备。
VHH文库的构建
从骆马淋巴细胞构建VHH文库，以筛选抗原特异性纳米抗体的存在。为此，将来自外周血淋巴细胞的总RNA用作用于利用寡聚(dT)引物合成第一链cDNA的模板。使用该cDNA，通过PCR扩增VHH编码序列，用PstI和NotI进行消化，并将其克隆到噬菌粒载体pMECS的PstI和NotI位点。由此获得的VHH文库被称为Core 94。所述文库由大约7x108个独立的转化体组成，其中100％的转化体含有具有正确插入片段大小的载体。
人IL13Rα2特异性纳米抗体的分离
将Core 94文库在固相包被的(100μg/ml，于100mM NaHCO3 pH 8.2中)hIL13Rα2抗原:hIL13Rα2-Fc抗原(通过因子Xa去除了Fc)上淘选3轮。噬菌体与包被在孔上的抗原上的任何剩余的人IgG1 Fc和任何污染因子Xa的结合被重组人IgG1 Fc(R&D Systems，目录号110-HG)和因子Xa(每种的终浓度为1μM)竞争。在每轮淘选后，通过将从抗原包被的孔中洗脱的噬菌粒颗粒的数量与从阴性对照(未包被的封闭的)孔中洗脱的噬菌粒颗粒的数量进行比较来评估抗原特异性噬菌体的富集。这些实验表明，在第一轮、第二轮和第三轮后，噬菌体群体中抗原特异性噬菌体分别被富集约7倍、200倍和1000倍。总共随机选择190个集落(第2轮95个，第3轮95个)，通过ELISA分析其周质提取物中抗原特异性纳米抗体的存在(使用包括可溶性纳米抗体的粗周质提取物的ELISA)。用于ELISA筛选的抗原与用于淘选的抗原相同，使用未包被的封闭孔和包被有重组人IgG1 Fc和因子Xa的混合物的孔作为阴性对照。二抗(抗小鼠抗体)在包被有重组人IgG1 Fc/Xa的孔上产生轻微的背景信号(在405nm处约0.3OD)，将5个克隆标记为与Fc具有交叉反应性。在这190个集落中，在该测定中141个集落对hIL13Rα2评分为阳性，但对hIgG1 Fc/因子Xa混合物评分不为阳性。基于对hIL13Rα2呈阳性而对hIG1 Fc/Xa因子混合物呈阴性的141个集落的序列数据，区分出54个不同的全长纳米抗体，其属于16个不同的CDR3组(B细胞谱系)。属于同一CDR3组(同一B细胞谱系)的纳米抗体非常相似，它们的氨基酸序列表明它们来自体细胞超突变导致的克隆相关B细胞，或者来自同一B细胞，但由于文库构建过程中的RT和/或PCR错误而多样化。属于同一CDR3组的纳米抗体识别相同的表位，但它们的其它特征(例如亲和力、效力、稳定性、表达产率等)可以不同。还通过ELISA测试了人IL13Rα2特异性纳米抗体与加有His标签的人IL13Rα1的结合(Acro Biosystems,目录号IL1-H5224)。这些ELISA实验显示，IL13Rα2特异性纳米抗体均不结合人IL13Rα1。来自这些淘选的克隆在其名称中带有以下代码：TIG。
hIL13Rα2特异性纳米抗体的流式细胞术分析
纳米抗体和细胞
以与对上述初始ELISA筛选所进行的方式相同的方式，为每种抗hIL13Rα2Nb产生周质提取物。将每个细胞系(U251_Luc_Mch和A431_Luc)的细胞解冻、洗涤并计数。将每个Nb克隆的周质提取物与约2x105个细胞一起孵育。洗涤后，将细胞与小鼠抗HA标签抗体和抗小鼠-PE的混合物一起孵育。在另一次洗涤后，将Topro作为活/死的染色加入到每个样品中，并在流式细胞仪上分析细胞。作为阳性对照Mab，使用PE偶联的抗IL13Rα2克隆47(+Topro)。每种细胞系的阴性对照为：含无关Nb(BCII10-细菌β内酰胺酶特异性的)的样品、含所有检测Mab的样品、仅含第二抗小鼠-PE Mab的样品和仅含细胞(含有和不含Topro)的样品。
抗体的人源化
选择了两个克隆体进行人源化。图1显示了克隆1和克隆2的序列比对，包括每种克隆的亲本(非人源化)序列和十种人源化变体。在Ni-NTA传感器上，利用125nM、41.66nM和13.86nM的抗原(IL13Rα2-Fc)的3倍稀释物，通过Octet在500nM处分析每种人源化纳米抗体。实验过程的示意图如图2所示。表1(克隆1)和表2(克隆2)中显示了图1中描绘的每种人源化变体的octed测量结果。
表1：克隆1亲本和人源化变体分析
Figure BDA0002991027050001141
Figure BDA0002991027050001151
表2:克隆1亲本和人源化变体分析
Figure BDA0002991027050001152
对于每个克隆选择两个人源化序列用于进一步研究，所述两个人源化序列分别对应于SEQ ID NOS:19-28和35-43。
实施例4:抗IL13Rα2纳米抗体的体外活性
实施例3中描述的人源化sdAb在pLRPO主链上表达并掺入CD3εTFP中。在表达IL-13的细胞系(U87)和IL13Rα2阴性细胞系(A431)上测试了相应的IL13Rα2-TFP T细胞的活性。克隆1和克隆2TFP T细胞都在U87细胞而非A431细胞中诱导了肿瘤细胞裂解(图3A)。
测试相同的TFP T细胞诱导IFNγ和IL-2产生的能力。如图3B所示，TFP T细胞没有从IL13Rα2阴性细胞(A431)诱导IFNγ或IL-2，但克隆1和克隆2TFP T细胞诱发了大于3000pg/ml的IFNγ反应和约100pg/ml的低IL-2产生。当在U251神经胶质母细胞瘤细胞中重复时，观察到类似的结果。
实施例5:对人MUC16肽：NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRN EPLTGNSDLP特异的纳米抗体的产生和鉴定
材料和方法
VHH的转化、再克隆和表达
用重组pMECS GG转化非抑制株(例如WK6)
在pMECS GG载体中克隆的纳米抗体基因在N端含有PelB信号序列，并且在C端含有HA标签和His6标签(PelB前导序列-纳米抗体-HA-His6)。PelB前导序列将纳米抗体导向大肠杆菌(E.coli)的周质空间，HA和His6标签可用于纳米抗体的纯化和检测(例如在ELISA、蛋白质印迹等中)。
在pMECS GG载体中，His6标签之后是琥珀终止密码子(TAG)，该琥珀终止密码子之后是M13噬菌体的基因III。在抑制性大肠杆菌菌株(例如TG1)中，琥珀终止密码子被读作谷氨酰胺，因此纳米抗体被表达为与噬菌体的蛋白III的融合蛋白，这允许在噬菌体外壳上展示纳米抗体以用于淘选。在非抑制性大肠杆菌菌株(例如，WK6)中，琥珀终止密码子被读作终止密码子，因此所得纳米抗体不与蛋白III融合。
为了表达和纯化在pMECS GG载体中克隆的纳米抗体，只需制备含有目标纳米抗体的基因的pMECS GG，并用该质粒转化非抑制性菌株(例如，WK6)。使用MP057引物(5’-TTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’)对所得克隆的纳米抗体进行测序，以验证克隆的身份。通过ELISA或任何其它合适的测定重新测试抗原结合能力。现在，含有具有纳米抗体基因的重组pMECS GG载体的非抑制性菌株(例如，WK6)可用于纳米抗体的表达和纯化。
将纳米抗体基因从pMECS GG重新克隆到pHEN6c载体
引物序列：
-引物A6E(5’GAT GTG CAG CTG CAG GAG TCT GGR GGA GG 3’)。
-引物PMCF(5’CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T 3’)。
-通用反向引物(5’TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C 3’).
-通用正向引物(5CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC 3’)。
通过使用含有具有纳米抗体基因的重组pMECS GG的大肠杆菌(作为模板)以及引物A6E和PMCF进行PCR(约30个循环的PCR，每个循环由以下步骤组成：于94℃下30秒、于55℃下30秒和于72℃下45秒，随后在PCR结束时在72℃下延伸10分钟)来扩增纳米抗体基因。扩增了约400bp的片段。然后纯化(例如，通过来自Qiagen的QiaqQuick PCR纯化试剂盒)PCR产物，并用PstI消化过夜。
将PCR产物纯化并用BstEII消化(或用来自Fermentas的Eco91I消化)过夜。如上所述纯化PCR产物，用PstI消化pHEN6c载体3小时；如上纯化消化后的载体，然后用BstEII消化2至3小时。将消化后的载体在1％琼脂糖凝胶上运行，从凝胶上切下载体条带并纯化(例如，通过来自Qiagen的QiaQuick凝胶提取试剂盒)。连接PCR产物与载体。用连接反应转化电感受态WK6细胞。使用LB/琼脂/氨苄青霉素(100μg/ml)/葡萄糖(1-2％)平板选择转化体。
纳米抗体的表达和纯化：
使用新转化的WK6菌落接种10-20ml LB+氨苄青霉素(100μg/ml)+葡萄糖(1％)，并在37℃下以200-250rpm振荡孵育过夜。将1ml这种预培养物加入到330ml补充有100μg/ml氨苄青霉素、2mM MgCl2和0.1％葡萄糖的TB培养基中，并在37℃下振荡(200-250rpm)生长，直至达到0.6-0.9的OD600。纳米抗体的表达是通过将IPTG加入到1mM的终浓度来诱导的，将培养物在28℃下振荡孵育过夜(约16-18小时；过夜诱导后的OD600理想地应该在25与30之间)。
将培养物以8000rpm离心8分钟，并将来自1升培养物的沉淀重悬浮在12ml TES中，并在冰上振荡1小时。每使用每12ml TES，加入18ml TES/4，并在冰上进一步孵育另外1小时(在振荡的条件下)，然后在4℃下以8000rpm离心30分钟。上清液含有从周质空间提取的蛋白质。
通过IMAC纯化：
His-select用PBS平衡：每周质提取物源自1升培养物，将1ml树脂(约2ml His-select溶液)加入50ml falcon管中，将PBS加入到50ml的终体积中，混合，然后以2000rpm钟离心2分钟。弃去上清液。用PBS洗涤树脂两次，然后加入周质提取物，在室温下轻轻摇动孵育30分钟至1小时(较长的孵育时间可能导致非特异性结合)。
将样品加载到底部具有过滤器的PD-10柱(GE healthcare，目录号17-0435-01)上，然后用50至100ml PBS(50-100ml PBS/1ml所用树脂)洗涤。洗脱进行3次，每次用1mlPBS/0.5M咪唑/1ml所用树脂，并在4℃下对PBS透析(截止值为3500道尔顿)过夜以除去咪唑。
蛋白质的量可在此时通过洗脱样品的OD280测量值来估计。每个克隆的消光系数可在Expasy蛋白质组学服务器上的一级结构分析下通过protParam工具来确定。纳米抗体的进一步纯化可通过不同的方法实现。例如，可通过在4℃下以2000rpm离心浓缩(Vivaspin5000MW截断值，Vivascience)样品，直至获得用于加载到Superdex 75 16/60上的合适体积(最大值4ml)。然后将浓缩的样品加载到用PBS平衡的Superdex 75 16/60柱上。合并峰级分，在OD280处测量样品以进行定量。将等分试样以约1mg/ml的浓度在-20℃下储存。
免疫接种
在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，用缀合于KLH的人MUC16肽(hMUC16)(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-KLH)和/或在C端生物素化的人MUC16肽(NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP-C-生物素)和/或在N端生物素化的人MUC16肽(生物素-NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP)皮下注射骆马。注射前将生物素化的肽与中性抗生物素蛋白混合。所用的佐剂是GERBU佐剂P(GERBU Biotechnik GmbH)。在第40天，从骆马收集约100ml抗凝血液用于淋巴细胞制备。
VHH文库的构建
从骆马淋巴细胞构建VHH文库，以筛选抗原特异性纳米抗体的存在。为此，将来自外周血淋巴细胞的总RNA用作用于利用寡聚(dT)引物合成第一链cDNA的模板。使用该cDNA，通过PCR扩增VHH编码序列，用SAPI消化，并将其克隆到噬菌粒载体pMECS-GG的SAPI位点。由此获得的VHH文库被称为Core 93GG。所述文库由约108个独立的转化体组成，其中约87％的转化体含有具有正确插入片段大小的载体。
人MUC16肽特异性纳米抗体的分离
在于C端或N端生物素化的hMUC16肽NFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRNGTQLQNFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLP(bio-hMUC16)上淘选Core 93GG文库，进行4轮。使bio-hMUC16肽与链霉抗生物素蛋白包被的板相互作用，之后将来自文库的噬菌体添加到板上。在每轮淘选后，通过将从抗原包被的孔中洗脱的噬菌粒颗粒的数量与从阴性对照孔(用链霉抗生物素蛋白包被并封闭但不含肽的)中洗脱的噬菌粒颗粒的数量进行比较来评估抗原特异性噬菌体的富集。这些实验表明，在第二轮后，噬菌体群体中抗原特异性噬菌体富集了约2倍。在第一、第三和第四轮后未观察到富集。总共随机选择380个菌落(第3轮190个，第4轮190个)，通过ELISA分析其周质提取物中抗原特异性纳米抗体的存在(使用包括可溶性纳米抗体的粗周质提取物的ELISA)。用于ELISA筛选的肽与用于淘选的肽相同，使用不含肽的封闭的链霉抗生物素蛋白包被的孔作为阴性对照。在这380个菌落中，34个菌落在该测定中得分为阳性。基于阳性菌落的序列数据，区分出6种不同的全长纳米抗体，其属于2种不同的CDR3组(B细胞谱系)(参见Excel文件)。属于同一CDR3组(同一B细胞谱系)的纳米抗体非常相似，它们的氨基酸序列表明它们来自体细胞超突变导致的克隆相关B细胞，或者来自同一B细胞，但由于文库构建过程中的RT和/或PCR错误而多样化。属于同一CDR3组的纳米抗体识别相同的表位，但它们的其它特征(例如亲和力、效力、稳定性、表达产率等)可以不同。来自这些淘选的克隆在其名称中具有以下代码：MU。
hMUC16肽特异性纳米抗体的流式细胞术分析
纳米抗体和细胞
以与对上述初始ELISA筛选所进行的方式相同的方式，为每种抗hMUC16肽Nb产生周质提取物。将来自每个细胞系(SKOV3 Muc16 Luc、OVCAR 3Muc16 Luc、Expi-293和Jurkat)的细胞解冻、洗涤并计数。将每个Nb克隆的周质提取物与约2x105个细胞一起孵育。洗涤后，将细胞与小鼠抗HA标签抗体和抗小鼠-PE的混合物一起孵育。在另一次洗涤后，将Topro作为活/死的染色加入到每个样品中，并在流式细胞仪上分析细胞。作为阳性对照Mab，将人抗Muc16-4h11(+抗人IgG-PE+Topro)用于SKOV3 Muc16 Luc和OVCAR 3Muc16 Luc细胞上。作为阴性对照，我们对每种细胞系使用：含有不相关Nb(BCII10-细菌β内酰胺酶特异性)的样品，含有所有检测Mab的样品，仅含有第二抗小鼠-PE Mab的样品和仅含有细胞的样品(含有或不含有Topro)。
实施例6:针对hMUC16靶标的抗MUC16 sdAb的筛选
使用NTA生物传感器(镍柱，关于概述该方法的图，参见图5A)筛选实施例5中产生的VHH结合物。加有His标签的MUC16 sdAb(3.25μg/ml)与柱子结合，然后使MUC16肽以200nM、100nM、50nM、25nM、6.25nM、1.56nM和0nM的浓度通过柱子。缓冲液：在30℃下含有0.02％
Figure BDA0002991027050001211
20的1X
Figure BDA0002991027050001212
PBS pH 7.4(目录号21-040-CM)。传感器：PallForte Bio Dip&Read(目录号18-5102)。
两种克隆R3Mu4(图1C)和R3Mu29(图1D)骆马和人源化sdAb与MUC16靶标的饱和结合表明，亲本和人源化αMuc16 sdAb变体表现出与Muc16胞外域(“MUC16ecto”)肽的高亲和力结合，与在6-94nM的范围内的KD值相关。与它们各自的亲本骆马克隆相比，人源化变体显示出一定的亲和力丧失。表3提供了概述。
表3.从滴定结合的1:1全局拟合模型确定KD
αMu16 sdAb* K<sub>D</sub>(nM)
亲本R3Mu4 10.2±1.7
R3Mu4 h11#2 10.9±1.6
R3Mu4 h12#2 94.6±1.5
R3Mu4 h13#9 36.2±15.4
亲本R3Mu29 6.3±0.1
R3Mu29_h13#11 8.3±0.1
R3Mu29_h14#13 36.4±0.8
R3Mu29_h15#16 22.9±0.4
实施例7:抗MUC16结合物与4H11工具结合物相比的表位分箱
为了确定与4H11 scFv-Fc工具结合物(来自4H11杂交瘤)相比，MUC16亲本R3Mu4和亲本R3Mu29 sdAb是结合相同的表位还是不同的表位，使用了夹心测定法(参见图6A)。
如图6B所示，MUC 16sdAb-亲本(骆马)R3Mu4和亲本(骆马)R3Mu29在暴露于4H11工具结合物后显示出结合，表明与4H11 scFv-Fc工具结合物相比，亲本SdAb识别MUC 16肽的不同表位并与不同的表位结合。无抗原(MUC16肽)的阴性对照显示没有结合，排除了任何非特异性结合的机会。图6C中显示了显示亲本骆马抗体R3Mu4和R3Mu29的结合表位的图解。
实施例8：表达MUC16-TFP的T细胞的临床前研究
在临床前体外研究中评估(表达MUC16-TFP的T细胞图7)。表达MUC16-TFP的T细胞特异性杀伤SKOV3-MUC16Cterm卵巢癌细胞，所述卵巢癌细胞被转导成以剂量依赖性方式过表达与C端细胞相关MUC16形式，而亲本SKOV3 MUC16阴性细胞则免于表达MUC16-TFP的T细胞介导的杀伤。同样，表达MUC16-TFP的T细胞消除了过表达MUC16的细胞相关形式的OVCAR3-MUC16-Cterm细胞。表达低水平MUC16的亲本OVCAR3细胞仅在最高的TFP-T细胞与靶细胞的比率下被杀伤，这强调了肿瘤细胞的剂量依赖性裂解。同样，当MUC16存在于靶细胞上时，TFP-T细胞才释放细胞因子。图8描绘了显示MUC16-TFP在使用表达高和低水平MUC16的卵巢细胞系的细胞测定中的效力的示例性实验数据。在这些研究中，观察到取决于肿瘤细胞表面的MUC16水平，MUC16-TFP具有优先杀伤能力。更准确地说，观察到MUC16-TFP以剂量依赖的方式杀伤高MUC16表达肿瘤细胞，然而在这些测定中使用的剂量水平下未观察到低MUC16表达细胞的MUC16-TFP杀伤。
实施例9.基于流式细胞术的MUC16ecto拷贝数定量
根据美国专利第9,169,328号产生了C端细胞相关MUC16形式(MUC16ecto)特异性抗体4H11，然后将其与PE缀合。每个抗体的PE分子的平均数量估计约为1。用2μg/样品的4H11-PE Ab对卵巢癌细胞系OVCAR3和SKOV3，或稳定地过表达MUC16ecto的衍生物(OVCAR3-MUC16ecto和SKOV3-MUC16ecto细胞)进行染色。按照制造商的说明通过Quantibrite Beads PE荧光定量试剂盒(BD Bioscience)估计细胞表面MUC16ecto的拷贝数。将4H11-PE抗体染色的肿瘤细胞与Quantibrite珠粒一起在
Figure BDA0002991027050001231
X-20上运行。计算细胞和珠粒的几何中位荧光强度(gMFI)。珠粒原料包含4个群体，所述群体被制造成每个珠粒具有不同数量的PE分子(高、中、低、负)。基于每个珠粒的给定的PE分子拷贝对比每组珠粒的测得的MFI生成标准曲线。然后基于珠粒生成的标准曲线来估计肿瘤细胞上的MUC16ecto的拷贝数。OVCAR3、OVCAR3-MUC16ecto、SKOV3和SKOV3-MUC16ecto细胞上的MUC16ecto的拷贝数分别被确定为726、3616、39和2351(图9B)。
实施例10.MUC16-TFP T细胞对MUC16ecto特异性肿瘤细胞的裂解
通过体外细胞毒性测定评价MUC16-TFP T细胞对MUC16ecto特异性肿瘤细胞的裂解。稳定转导具有或不具有MUC16ecto表达的肿瘤细胞系，以将萤火虫萤光素酶表达为报告分子。在共培养24小时后，用Bright-GloTM萤光素酶测定系统(Promega，目录号E2610)将共培养细胞的萤光素酶活性测定为残余活肿瘤细胞的替代指标(surgate)。然后用以下公式计算肿瘤细胞杀伤百分比：肿瘤细胞裂解％＝100％x[1–RLU(肿瘤细胞+T细胞)/RLU(肿瘤细胞)]。
表达MUC16-TFP的T细胞特异性杀伤SKOV3-MUC16ecto细胞(图10A)，而亲本SKOV3细胞免受表达MUC16-TFP的T细胞介导的杀伤(图10B)。同样，表达MUC16-TFP的T细胞消除了过表达MUC16的细胞相关形式的OVCAR3-MUC16ecto细胞(图10C)。表达低水平MUC16ecto的亲本OVCAR3细胞仅被部分杀伤(图10D)。
实施例11.MUC16-TFP T细胞产生MUC16ecto特异性细胞因子
对于从各种肿瘤细胞(具有或不具有MUC16ecto表达)和MUC16-TFP T细胞的共培养物中收集的上清液，测定了由MUC16-TFP T细胞产生的MUC16ecto特异性细胞因子。使用MAGPIX
Figure BDA0002991027050001241
xMAP技术(EMD Millipore)，利用2-plex试剂盒(Millipore，目录号HCYTOMAG-60K)分析上清液中人IFN-γ和IL-2的水平。
表达MUC16-TFP的T细胞以抗原特异性方式分泌促炎细胞因子。表达MUC16-TFP的T细胞在与SKOV3-MUC16ecto细胞(分别见图11A和图11E)或OVCAR3-MUC16ecto细胞(分别见图11C和图11G)共培养时分泌IFN-γ和IL-2，但在与SKOV3细胞(分别见图11B和图11F)或OVCAR3细胞(分别见图11D和图11H)共培养时不分泌IFN-γ和IL-2。
实施例12.表达MUC16-TFP的T细胞的MUC16ecto特异性增殖
通过流式细胞术分析监测T细胞示踪信号的稀释度(CellTraceTM的信号强度的降低)来确定MUC16-TFP T细胞的MUC16ecto特异性增殖。将表达MUC16-TFP的T细胞用CellTraceTM远红外增殖试剂盒(目录号C34564ThermoFisher)标记，然后与SKOV3或SKOV3-MUC16ecto细胞以1比1比率共培养3天。还用单独的培养基或用1μg/mL板结合的抗CD3抗体(克隆OKT-3，目录号14-0037-82，Invitrogen)刺激用CellTrace红外增殖试剂盒标记的表达MUC16-TFP的T细胞3天。表达MUC16-TFP的T细胞表现出MUC16ecto特异性增殖，表现为与SKOV3-MUC16ecto细胞而非与SKOV3细胞共培养时细胞示踪(CellTracer)信号的减弱(图12)。
实施例13.MUC16-TFP T细胞的体内活性
在人卵巢癌细胞系SKOV3-MUC16ecto细胞和OVCAR3-MUC16ecto细胞的NSG小鼠异种移植模型中评估表达MUC16-TFP的T细胞。用SKOV3-MUC16ecto细胞(5x 105个细胞/小鼠)或OVCAR3-MUC16ecto细胞(5x 106个细胞/小鼠)腹膜内或者用SKOV3-MUC16ecto细胞(5x 106个细胞/小鼠，与
Figure BDA0002991027050001251
的1:1的混合物)皮下接种6周龄雌性NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ,The Jackson Laboratory，排样号码005557)小鼠。通过腹膜内注射0.2ml的于PBS中稀释的萤光素底物(VWR)(150mg/kg)对腹膜内模型进行生物发光成像(BLI)来测定肿瘤负荷。利用卡尺将皮下模型的肿瘤负荷测量为肿瘤体积。一旦建立了肿瘤模型(腹膜内模型：BLI信号>108；皮下模型：肿瘤体积>75mm3)，就以107个T细胞/小鼠的剂量静脉内注射表达MUC16-TFP(MUC16 TFP1和MUC16 TFP2)的T细胞或未转导的T细胞(NT)或媒介物(PBS)。
在SKOV3-MUC16ecto细胞和OVCAR3-MUC16ecto细胞的腹膜内和皮下模型中观察了表达MUC16 TFP的T细胞的体内功效。在SKOV3-MUC16ecto细胞的腹膜内模型中，与第0天(T细胞注射日)的基线水平相比，MUC16 TFP 1显示肿瘤负荷显著降低(图13A)。一致地，当与NT T细胞相比时，MUC16 TFP1在SKOV3-MUC16ecto细胞的皮下模型中显著延迟肿瘤生长(图13B)。在OVCAR3-MUC16ecto细胞的腹膜内模型中，MUC16 TFP1和MUC16 TFP2都完成了小鼠肿瘤的清除(图13C)。
实施例14：用抗MUC16单结构域抗体Fc融合蛋白对正常人组织进行免疫组织化学染色
研究的目的是获得正常人组织中MUC16表达的信息。
对照材料和FFPE切片用抗MUC16单结构域抗体染色，所述抗MUC16单结构域抗体与小鼠Fc区遗传融合，以用于使用缀合有HRP的抗小鼠Fc二抗进行检测。阳性对照由来自两个供体的人卵巢肿瘤的FFPE切片组成。阴性对照是人心脏的FFPE切片。受试组织的小组包括：血细胞、小脑或大脑皮层、胃肠道(食道、小肠、胃、结肠-当可获得时)、脾、肾(肾小球、肾小管)、肝、淋巴结、皮肤、胎盘、睾丸和扁桃体(每个供体一个)。
结果：来自不同供体的两个人卵巢癌组织用作阳性对照，并显示不同强度的染色，对于肿瘤细胞膜和细胞质，染色范围为1-3+(偶发至频繁)和1-4+(偶发至频繁)。在正常组织中，除了以下两种以外，所有组织均显示MUC16阴性染色：1)人胃上皮，壁层(细胞质、细胞质颗粒)-1-2+(偶发至频繁)，和2)人扁桃体上皮表面，隐窝(膜、细胞质及其它组分)-1-3+(罕见至偶见)。
这些数据表明，MUC16在正常人组织中的表达有限，在某些肿瘤中的表达升高。这使得其成为MUC16阳性恶性肿瘤的癌症疗法的一个有吸引力的靶标。MUC16特异性单结构域抗体能够结合抗原阳性组织并对其进行染色。
实施例15：临床研究
患有复发性或难治性疾病的不可切除的卵巢癌患者将被纳入表达MUC16 TFP的T细胞的临床研究。最初的研究将探索表达MUC16TFP的T细胞的安全性特征，以及将探索细胞动力学和药效学结果。这些结果将为进一步研究的剂量选择提供信息，然后将向更大的不可切除的卵巢癌患者队列施用所述剂量，以确定表达MUC16 TFP的T细胞的疗效特征。
实施例16：抗MSLN TFP T细胞优先杀伤具有高MSLN表达的肿瘤细胞。
在荷有MSTO-MSLN高或MSTO-MSLN低肿瘤的NSG小鼠中，研究了MSLN-TFP T细胞对高MSLN肿瘤(MSTO-MSLN高，11006个拷贝的表面MSLN)和低MSLN肿瘤(MSTO-MSLN低，198个拷贝的表面MSLN)的差异杀伤能力。
将MSTO-MSLN高和MSTO-MSLN低细胞以1x 106个细胞/100μL的浓度重悬于无菌PBS(pH 7.4)中。然后将PBS细胞悬浮液以1:1与冰冷的
Figure BDA0002991027050001271
混合，最终注射体积为200μL/小鼠。对于所有动物，通过在后背侧底部进行皮下施用来注射200μL的于无菌
Figure BDA0002991027050001272
中的肿瘤细胞悬浮液。通过肿瘤体积监测肿瘤生长，通过卡尺每周测量肿瘤体积两次。一旦肿瘤模型建立(肿瘤注射后14天)(其中平均肿瘤体积达约300mm3)，就向荷瘤小鼠静脉注射未转导的T细胞(NT，1x107个总T细胞)或MSLN-TFP T细胞(1x107个总T细胞)。
与NT T细胞治疗的小鼠相比，MSLN-TFP T细胞显著控制了高MSLN肿瘤的生长(图14A)。另一方面，在MSLN-TFP T细胞治疗的具有低MSLN肿瘤的小鼠中观察到有限的抗肿瘤反应(图14B)。当在一只动物中观察到肿瘤消退时，其它9只MSLN-TFP T细胞治疗的小鼠显示出与接受NT T细胞的动物相比更慢(n＝2)或相似(n＝6)的肿瘤进展速度(图14B)。
尾注
虽然本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说，显然这些实施方案仅仅是作为实例提供的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。下面的权利要求旨在限定本发明的范围，并且这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构由此被覆盖。
表4-序列
Figure BDA0002991027050001281
Figure BDA0002991027050001291
Figure BDA0002991027050001301
Figure BDA0002991027050001311
Figure BDA0002991027050001321
Figure BDA0002991027050001331
Figure BDA0002991027050001341
Figure BDA0002991027050001351
Figure BDA0002991027050001361
Figure BDA0002991027050001371
Figure BDA0002991027050001381
Figure BDA0002991027050001391
Figure BDA0002991027050001401
Figure BDA0002991027050001411

Claims (291)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含
(I)来自人受试者的T细胞，其中所述T细胞包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，
(ii)TCR跨膜结构域，和
(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗原结合结构域；以及
(II)药学上可接受的载体；
其中所述TCR亚基与所述抗MUC16结合结构域可操作地连接；
其中当在所述T细胞中表达时，所述TFP与TCR功能性地相互作用。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中编码所述抗MUC16结合结构域的序列通过编码接头的序列与编码所述TCR胞外结构域的序列连接。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述接头包含(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，并且n为1至4的整数。
4.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其中所述抗MUC16结合结构域包含
(i)重链(HC)CDR1序列GRTVSSLF、GRAVSSLF或GDSLDGYV，
(ii)HC CDR2序列ISRYSLYT或ISGDGSMR，和
(iii)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS或AADPPTWDY。
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述抗MUC16结合结构域包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含血清。
7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是scFv。
8.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述单结构域抗体是VH结构域。
10.如权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述编码的抗MUC16结合结构域包含抗MUC16结合结构域，并且其中所述T细胞具有比CD8+T细胞或CD4+T细胞更大或更高效的细胞毒性活性，所述CD8+T细胞或CD4+T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(a)所述抗MUC16结合结构域，其与(b)CD28胞外结构域的至少一部分、(c)CD28跨膜结构域、(d)CD28胞内结构域的至少一部分和(e)CD3ζ胞内结构域可操作地连接。
11.如权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中当在所述T细胞中表达时，所述编码的TFP分子与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。
12.如权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是原代T细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是人CD4+T细胞。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是人CD8+T细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞还包含编码第一多肽的核酸，所述第一多肽包含选自由PD-1和BTLA组成的组的抑制性分子的至少一部分，其中所述抑制分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述第二多肽包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的共刺激结构域和初级信号传导结构域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160和B7-H3。
17.如权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中与不含所述TFP的T细胞相比，在表达与所述抗MUC16结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞存在的情况下，所述T细胞产生的IL-2或IFNγ增加。
18.如权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞是人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的单个T细胞包含至少两种TFP分子，或者所述群的至少两种T细胞共同包含至少两种TFP分子；其中所述至少两种TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；并且其中所述至少两种TFP分子中的至少一种功能性地与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。
19.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3ε。
20.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3γ。
21.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3δ。
22.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
23.如权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
24.如权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞与不含所述TFP的T细胞相比，对表达与所述抗MUC16结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞表现出增强的细胞毒性。
25.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗MUC16结合结构域的抗原结合结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且
其中与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子水平较低。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体结构域是与示于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的VHH结构域。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
28.如权利要求25或26所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
29.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
30.一种治疗患有与MUC16的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗MUC16结合结构域的抗原结合结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且
其中与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子水平较低。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述抗体结构域是与示于SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的VHH结构域。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
33.如权利要求30或31所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
34.如权利要求25-33中任一项所述的方法，其中所述TFP的所述TCR亚基还包含TCR跨膜结构域。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
37.如权利要求25-36中任一项所述的方法，其中所述TCR胞内信号传导结构域源自CD3ε或CD3γ。
38.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中与MUC16表达相关联的所述疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤和与MUC16表达相关联的非癌症相关适应症。
39.如权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、输尿管癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌及其任何组合。
40.如权利要求30-38中任一项所述的方法，其中所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞性卵巢癌、混合苗勒管卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结直肠腺癌、乳腺癌、与MUC16表达相关联的疾病及其任何组合。
41.如权利要求30-40中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与提高表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。
42.如权利要求25-41中任一项所述的方法，其中对于给定的细胞因子，与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的所述给定的细胞因子的量相比，治疗后释放的所述给定的细胞因子的量减少至少10％。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述给定的细胞因子包括选自由以下组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何组合。
44.如权利要求25-43中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物中的肿瘤生长被抑制，使得在治疗至少8天后，所述肿瘤的尺寸为用不表达所述TFP的T细胞治疗的哺乳动物中的肿瘤尺寸的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％或至多60％，其中用表达TFP的T细胞治疗的所述哺乳动物和用不表达所述TFP的T细胞治疗的所述哺乳动物在所述治疗前具有相同的肿瘤尺寸。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多天。
47.如权利要求25-46中任一项所述的方法，其中与包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞相比，所述用TFP转导的T细胞群杀伤相似量的肿瘤细胞。
48.如权利要求25-47中任一项所述的方法，其中所述用所述TFP转导的T细胞群与包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞相比具有不同的基因表达谱。
49.如权利要求48所述的方法，其中基因在用所述TFP转导的所述T细胞中的表达水平不同于所述基因在包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞中的表达水平。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述基因在抗原呈递、TCR信号传导、动态平衡、代谢、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、toll样受体信号传导、MMP和粘附分子信号传导或TNFR相关信号传导方面具有功能。
51.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
52.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
53.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
54.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRα链的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
55.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRβ链的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗MUC16结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
56.如权利要求51-55中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域是人或人源化抗体结构域。
57.如权利要求51-56中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的抗原结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
58.如权利要求57所述的重组核酸分子，其中所述编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
59.如权利要求51-58中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞外结构域。
60.如权利要求51-59中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR跨膜结构域。
61.如权利要求51-60中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞内结构域。
62.如权利要求51-61中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自同一TCR亚基。
63.如权利要求51-62中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自由CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。
64.如权利要求51-63中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含胞内结构域，所述胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。
65.如权利要求51-64中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域包含抗体片段。
66.如权利要求51-65中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域包含scFv或VH结构域。
67.如权利要求51-66中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码
(i)重链(HC)CDR1序列GRTVSSLF、GRAVSSLF或GDSLDGYV，
(ii)HC CDR2序列ISRYSLYT或ISGDGSMR，和
(iii)HC CDR3序列ASKLEYTSNDYDS或AADPPTWDY。
68.如权利要求51-67中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码与示于SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:40中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的重链可变结构域。
69.如权利要求51-68中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
70.如权利要求51-69中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
71.如权利要求51-70中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
72.如权利要求51-71中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。
73.如权利要求72所述的重组核酸分子，其中所述共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
74.如权利要求51-73中任一项所述的重组核酸分子，其中所述对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与所述TFP结合而被磷酸化的氨基酸的修饰。
75.如权利要求51-74中任一项所述的重组核酸分子，其中所述分离的核酸分子是mRNA。
76.如权利要求51-75中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述ITAM包含选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d组成的组的蛋白质的ITAM或其部分、其功能性片段，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
77.如权利要求76所述的重组核酸分子，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
78.如权利要求76所述的重组核酸分子，其中所述ITAM选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组，并替代选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的不同ITAM。
79.如权利要求51-78中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
80.如权利要求79所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
81.如权利要求51-80中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含前导序列。
82.一种重组多肽分子，所述重组多肽分子由权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子编码。
83.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
84.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
85.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性地掺入内源TCR复合物中。
86.如权利要求83所述的重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
87.如权利要求83-86中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗MUC16结合结构域是scFv、VHH或VH结构域。
88.如权利要求83-87中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗MUC16结合结构域包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:40的氨基酸序列具有95-100％同一性的重链、其功能性片段或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
89.如权利要求83-88中任一项所述的重组TFP分子，所述重组TFP分子包含TCR胞外结构域，所述TCR胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
90.如权利要求83-89中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗MUC16结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
91.如权利要求90所述的重组TFP分子，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
92.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求83-91中任一项所述的TFP的序列。
93.如权利要求92所述的核酸，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
94.如权利要求92或93所述的核酸，其中所述核酸是mRNA。
95.如权利要求92-94中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
96.如权利要求95所述的核酸，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
97.如权利要求92-96中任一项所述的核酸，所述核酸还包含启动子。
98.如权利要求92-97中任一项所述的核酸，其中所述核酸是体外转录的核酸。
99.如权利要求92-98中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码poly(A)尾的序列。
100.如权利要求92-99中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含3’UTR序列。
101.一种载体，所述载体包含编码权利要求83-100中任一项所述的TFP的核酸分子。
102.如权利要求101所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。
103.如权利要求101或102所述的载体，所述载体还包含启动子。
104.如权利要求101-103中任一项所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
105.如权利要求101-104中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含poly(A)尾。
106.如权利要求101-105中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含3’UTR。
107.一种细胞，所述细胞包含权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子、权利要求82所述的多肽分子、权利要求83-91中任一项所述的TFP分子、权利要求92-100中任一项所述的核酸、权利要求101-106中任一项所述的载体。
108.如权利要求107所述的细胞，其中所述细胞是人T细胞。
109.如权利要求108所述的细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
110.如权利要求107-109中任一项所述的细胞，所述细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述抑制性分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
111.如权利要求110所述的细胞，其中所述抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
112.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
113.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含：
i)TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和
ii)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
114.如权利要求113所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分。
115.如权利要求113或114所述的蛋白质复合物，其中所述抗MUC16结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
116.如权利要求115所述的蛋白质复合物，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
117.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含
(a)TFP，所述TFP由权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子编码，和
(b)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
118.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含：
i)TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和
ii)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
119.如权利要求118所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分。
120.如权利要求118或119所述的蛋白质复合物，其中所述抗MUC16结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
121.如权利要求120所述的蛋白质复合物，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
122.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的TFP蛋白每权利要求113-121中任一项所述的蛋白质复合物。
123.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的由权利要求51-81中任一项所述的分离的核酸分子编码的TFP分子。
124.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗MUC16结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与所述人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
125.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种由权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子编码的TFP分子。
126.一种制备细胞的方法，所述方法包括用权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子、权利要求92-100中任一项所述的核酸或权利要求101-106中任一项所述的载体转导T细胞。
127.一种产生RNA工程化的细胞群的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中所述RNA包含编码权利要求83-91中任一项所述的TFP分子的核酸。
128.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子、权利要求82所述的多肽分子、表达权利要求82所述的多肽分子的细胞、权利要求83-91中任一项所述的TFP分子、权利要求92-100中任一项所述的核酸、权利要求101-106中任一项所述的载体或权利要求107-112和122-126中任一项所述的细胞。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
130.如权利要求128所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
131.如权利要求128-130中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
132.一种治疗患有与MUC16的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求51-81中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求82所述的多肽分子、表达权利要求82所述的多肽分子的细胞、权利要求83-91中任一项所述的TFP分子、权利要求92-100中任一项所述的核酸、权利要求101-106中任一项所述的载体或权利要求107-112和122-125中任一项所述的细胞。
133.如权利要求132所述的方法，其中与MUC16表达相关联的所述疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤、骨髓发育不良、骨髓增生异常综合征、白血病前期、与MUC16的表达相关联的非癌症相关适应症。
134.如权利要求132所述的方法，其中所述疾病是胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或其任何组合。
135.如权利要求132所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与提高表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。
136.如权利要求132-135中任一项所述的方法，其中与施用了有效量的表达抗MUC16嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
137.如权利要求132-136中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与改善与施用表达TFP分子的细胞相关联的一种或多种副作用的剂组合施用。
138.如权利要求132-137中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与治疗与MUC16相关联的疾病的剂组合施用。
139.如权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子、权利要求82所述的多肽分子、表达权利要求82所述的多肽分子的细胞、权利要求83-91中任一项所述的重组TFP、权利要求92-100中任一项所述的核酸、权利要求101-106中任一项所述的载体、权利要求113-121中任一项所述的复合物或权利要求107-112和122-125中任一项所述的细胞，用作药剂。
140.一种治疗患有与MUC16表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求51-81中任一项所述的重组核酸分子、权利要求82所述的多肽分子、表达权利要求82所述的多肽分子的细胞、权利要求83-91中任一项所述的重组TFP分子、权利要求92-100中任一项所述的核酸、权利要求101-106中任一项所述的载体，或权利要求107-112和122-125中任一项所述的细胞，其中与施用了有效量的表达抗MUC16嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
141.一种药物组合物，所述药物组合物包含
(I)来自人受试者的T细胞，其中所述T细胞包含编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，
(ii)TCR跨膜结构域，和
(iii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗原结合结构域；以及
(II)药学上可接受的载体；
其中所述TCR亚基与所述抗IL13Rα2结合结构域可操作地连接；
其中当在所述T细胞中表达时，所述TFP与TCR功能性地相互作用。
142.如权利要求141所述的药物组合物，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3δ或CD3γ。
143.如权利要求141所述的药物组合物，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
144.如权利要求141-143中任一项所述的药物组合物，其中与不含所述TFP的T细胞相比，所述T细胞对表达与所述抗IL13Rα2结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞表现出增强的细胞毒性。
145.如权利要求141-144中任一项所述的药物组合物，其中编码所述抗IL13Rα2结合结构域的所述序列通过编码接头的序列与编码所述TCR胞外结构域的所述序列连接。
146.如权利要求145所述的药物组合物，其中所述接头包含(G4S)n，其中G为甘氨酸，S为丝氨酸，并且n为1至4的整数。
147.如权利要求141-146中任一项所述的药物组合物，其中所述抗IL13Rα2结合结构域包含
(i)重链(HC)CDR1序列GFTSDYYI或GFASDDYI，
(ii)HC CDR2序列ISSKYANT或ISSRYANT，和
(iii)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS。
148.如权利要求141-147中任一项所述的药物组合物，其中所述抗IL13Rα2结合结构域包含与SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQID NO:76具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的序列。
149.如权利要求148所述的药物组合物，其中使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为1的存在惩罚和为11的扩展惩罚来确定所述序列同一性。
150.如权利要求141-148中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物基本上不含血清。
151.如权利要求141-150中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是scFv。
152.如权利要求141-150中任一项所述的药物组合物，其中所述抗原结合结构域是单结构域抗体。
153.如权利要求152所述的药物组合物，其中所述单结构域抗体是VH结构域。
154.如权利要求141-153中任一项所述的药物组合物，其中所述编码的抗IL13Rα2结合结构域包含抗IL13Rα2结合结构域，并且其中所述T细胞具有比CD8+T细胞或CD4+T细胞更大或更高效的细胞毒性活性，所述CD8+T细胞或CD4+T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述嵌合抗原受体包含(a)所述抗IL13Rα2结合结构域，其与(b)CD28胞外结构域的至少一部分、(c)CD28跨膜结构域、(d)CD28胞内结构域的至少一部分和(e)CD3ζ胞内结构域可操作地连接。
155.如权利要求141-154中任一项所述的药物组合物，其中当在所述T细胞中表达时，所述编码的TFP分子与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。
156.如权利要求141-155中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是原代T细胞。
157.如权利要求141-156中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是人CD4+T细胞。
158.如权利要求141-156中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞是人CD8+T细胞。
159.如权利要求141-158中任一项所述的药物组合物，其中所述T细胞还包含编码第一多肽的核酸，所述第一多肽包含选自由PD-1和BTLA组成的组的抑制性分子的至少一部分，其中所述抑制分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
160.如权利要求159所述的药物组合物，其中所述第二多肽包含来自选自由以下组成的组的蛋白质的共刺激结构域和初级信号传导结构域：CD28、CD27、ICOS、CD3ζ、41-BB、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160和B7-H3。
161.如权利要求141-160中任一项所述的药物组合物，其中与不含所述TFP的T细胞相比，在表达与所述抗IL13Rα2结合结构域特异性相互作用的抗原的细胞存在的情况下，由所述T细胞产生的IL-2或IFNγ增加。
162.如权利要求141-161中任一项所述的药物组合物，其中所述细胞是人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的单个T细胞包含至少两种TFP分子，或者所述群的至少两种T细胞共同包含至少两种TFP分子；其中所述至少两种TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；并且其中所述至少两种TFP分子中的至少一种与内源TCR复合物、至少一种内源TCR多肽或其组合功能性地相互作用。
163.如权利要求141-162中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3ε。
164.如权利要求141-162中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3γ。
165.如权利要求141-162中任一项所述的药物组合物，其中所述TCR亚基仅源自CD3δ。
166.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗IL13Rα2结合结构域的抗原结合结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且
其中与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子水平较低。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述抗体结构域是与示于SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的VHH结构域。
168.如权利要求167所述的方法，其中使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定所述序列同一性。
169.如权利要求166-168中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
170.如权利要求166-168中任一项所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
171.如权利要求166-170中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
172.一种治疗患有与IL13Rα2的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCR胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)抗体结构域，所述抗体结构域包含为抗IL13Rα2结合结构域的抗原结合结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且
其中与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的细胞因子水平相比，治疗后释放的细胞因子水平较低。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述抗体结构域是与示于SEQ ID NO:51、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的VHH结构域。
174.如权利要求173所述的方法，其中使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定所述序列同一性。
175.如权利要求172-174中任一项所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
176.如权利要求172-174中任一项所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
177.如权利要求166-176中任一项所述的方法，其中所述TFP的TCR亚基还包含TCR跨膜结构域。
178.如权利要求177所述的方法，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
179.如权利要求177所述的方法，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
180.如权利要求166-179中任一项所述的方法，其中所述TCR胞内信号传导结构域源自CD3ε或CD3γ。
181.如权利要求172-180中任一项所述的方法，其中与IL13Rα2的表达相关联的所述疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤和与IL13Rα2的表达相关联的非癌症相关适应症。
182.如权利要求172-181中任一项所述的方法，其中所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：胶质母细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、输尿管癌、肾癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、胃癌及其任何组合。
183.如权利要求172-181中任一项所述的方法，其中所述疾病是选自由以下组成的组的癌症：胶质母细胞瘤、间皮瘤、乳头状浆液性卵巢腺癌、透明细胞性卵巢癌、混合苗勒管卵巢癌、子宫内膜样粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、子宫浆液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食管腺癌、结直肠腺癌、乳腺癌、与IL13Rα2表达相关联的疾病及其任何组合。
184.如权利要求166-183中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与提高表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。
185.如权利要求166-184中任一项所述的方法，其中对于给定的细胞因子，与用包含所述相同抗体结构域的CAR-T细胞治疗的哺乳动物的所述给定的细胞因子的量相比，治疗后释放的所述给定的细胞因子的量减少至少10％。
186.如权利要求185所述的方法，其中所述给定的细胞因子包括选自由以下组成的组的一种或多种细胞因子：IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、IL-6、IL-13、IL-5、IL-10、sCD137、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β及其任何组合。
187.如权利要求166-186中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物中的肿瘤生长被抑制，使得在治疗至少8天后，所述肿瘤的尺寸为用不表达所述TFP的T细胞治疗的哺乳动物中的肿瘤尺寸的至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％或至多60％，其中用表达TFP的T细胞治疗的所述哺乳动物和用不表达所述TFP的T细胞治疗的所述哺乳动物在所述治疗前具有相同的肿瘤尺寸。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制。
189.如权利要求188所述的方法，其中所述哺乳动物的肿瘤生长被完全抑制至少20天、至少30天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更多天。
190.如权利要求166-189中任一项所述的方法，其中与包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞相比，所述用TFP转导的T细胞群杀伤相似量的肿瘤细胞。
191.如权利要求166-190中任一项所述的方法，其中所述用所述TFP转导的T细胞群与包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞相比具有不同的基因表达谱。
192.如权利要求191所述的方法，其中基因在用所述TFP转导的所述T细胞中的表达水平不同于所述基因在包含所述相同抗体结构域的所述CAR-T细胞中的表达水平。
193.如权利要求192所述的方法，其中所述基因在抗原呈递、TCR信号传导、动态平衡、代谢、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、toll样受体信号传导、MMP和粘附分子信号传导或TNFR相关信号传导方面具有功能。
194.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3ε的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
195.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3γ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
196.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
197.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRα的胞内信号传导结构域的刺激结构域；和
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
198.一种编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自TCRβ胞内信号传导结构域的刺激结构域；和
(b)包含抗IL13Rα2结合结构域的抗体结构域；
其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，并且
其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中。
199.如权利要求194-198中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域是人或人源化抗体结构域。
200.如权利要求194-199中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的抗原结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
201.如权利要求200所述的重组核酸分子，其中所述编码的接头序列包含(G4S)n，其中n＝1至4。
202.如权利要求194-201中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞外结构域。
203.如权利要求194-202中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR跨膜结构域。
204.如权利要求194-203中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞内结构域。
205.如权利要求194-204中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含(i)TCR胞外结构域，(ii)TCR跨膜结构域，和(iii)TCR胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两个来自同一TCR亚基。
206.如权利要求194-205中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含选自CD3ε、CD3γ或CD3δ的胞内信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。
207.如权利要求194-206中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TCR亚基包含胞内结构域，所述胞内结构域包含选自4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域的刺激结构域，或对其具有至少一个修饰的氨基酸序列。
208.如权利要求194-207中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域包含抗体片段。
209.如权利要求194-208中任一项所述的重组核酸分子，其中所述抗体结构域包含scFv或VH结构域。
210.如权利要求194-209中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码
(i)重链(HC)CDR1序列GFTSDYYI或GFASDDYI，
(ii)HC CDR2序列ISSKYANT或ISSRYANT，和
(iii)HC CDR3序列AADTRRYTCPDIATMHRNFDS或AMDSRRVTCPEISTMHRNFDS。
211.如权利要求194-210中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子编码与示于SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ IDNO:76中的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的序列同一性的重链可变结构域。
212.如权利要求211所述的重组核酸分子，其中使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定所述序列同一性。
213.如权利要求194-212中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的胞外结构域，所述胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
214.如权利要求194-213中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段，以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
215.如权利要求194-214中任一项所述的重组核酸分子，其中所述编码的TFP包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRβ链、TCRζ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD28、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
216.如权利要求194-215中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。
217.如权利要求216所述的重组核酸分子，其中所述共刺激结构域是从选自由OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
218.如权利要求194-217中任一项所述的重组核酸分子，其中所述对其的至少一个但不超过20个修饰包括介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或响应于配体与所述TFP结合而被磷酸化的氨基酸的修饰。
219.如权利要求194-218中任一项所述的重组核酸分子，其中所述分离的核酸分子是mRNA。
220.如权利要求194-219中任一项所述的重组核酸分子，其中所述TFP包括TCR亚基的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，所述ITAM包含选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基、TCRζ链、Fcε受体1链、Fcε受体2链、Fcγ受体1链、Fcγ受体2a链、Fcγ受体2b1链、Fcγ受体2b2链、Fcγ受体3a链、Fcγ受体3b链、Fcβ受体1链、TYROBP(DAP12)、CD5、CD16a、CD16b、CD22、CD23、CD32、CD64、CD79a、CD79b、CD89、CD278、CD66d组成的组的蛋白质的ITAM或其部分、其功能性片段，以及其对其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
221.如权利要求220所述的重组核酸分子，其中所述ITAM替代CD3γ、CD3δ或CD3ε的ITAM。
222.如权利要求221所述的重组核酸分子，其中所述ITAM选自由CD3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组，并替代选自由D3ζTCR亚基、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基组成的组的不同ITAM。
223.如权利要求194-222中任一项所述的重组核酸分子，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
224.如权利要求223所述的重组核酸分子，其中所述核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
225.如权利要求194-224中任一项所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子还包含前导序列。
226.一种重组多肽分子，所述重组多肽分子由权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子编码。
227.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
228.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够与内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
229.一种重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其中所述TFP分子能够功能性地掺入内源TCR复合物中。
230.如权利要求227所述的重组TFP分子，所述重组TFP分子包含抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
231.如权利要求227-230中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗IL13Rα2结合结构域是scFv、VHH或VH结构域。
232.如权利要求227-231中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗IL13Rα2结合结构域包含与示于SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:76中的氨基酸序列具有95-100％同一性的重链、其功能性片段或其具有至少一个但不超过30个修饰的氨基酸序列。
233.如权利要求232所述的重组TFP分子，其中使用BLAST算法，利用为6的字长、BLOSUM62矩阵、为11的存在惩罚和为1的扩展惩罚来确定所述序列同一性。
234.如权利要求227-233中任一项所述的重组TFP分子，所述重组TFP分子包含TCR胞外结构域，所述TCR胞外结构域包含选自由TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基、CD3δTCR亚基组成的组的蛋白质的胞外结构域或其部分、其功能性片段以及其具有至少一个但不超过20个修饰的氨基酸序列。
235.如权利要求227-234中任一项所述的重组TFP分子，其中所述抗IL13Rα2结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
236.如权利要求235所述的重组TFP分子，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
237.一种核酸，所述核酸包含编码权利要求227-236中任一项所述的TFP的序列。
238.如权利要求237所述的核酸，其中所述核酸选自由DNA和RNA组成的组。
239.如权利要求237或238所述的核酸，其中所述核酸是mRNA。
240.如权利要求237-239中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含核苷酸类似物。
241.如权利要求240所述的核酸，其中核苷酸类似物选自由以下组成的组：2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)、2'-O-氨基丙基、2'-脱氧、T-脱氧-2'-氟、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)、2'-O-二甲基氨基乙基(2'-O-DMAOE)、2'-O-二甲基氨基丙基(2'-O-DMAP)、T-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)、2'-O-N-甲基乙酰氨基(2'-O-NMA)修饰的、锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)、肽核酸(PNA)、1',5'-脱水己糖醇核酸(HNA)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2'-氟N3-P5'-亚磷酰胺。
242.如权利要求237-241中任一项所述的核酸，所述核酸还包含启动子。
243.如权利要求237-242中任一项所述的核酸，其中所述核酸是体外转录的核酸。
244.如权利要求237-243中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含编码poly(A)尾的序列。
245.如权利要求237-244中任一项所述的核酸，其中所述核酸还包含3’UTR序列。
246.一种载体，所述载体包含编码权利要求227-236中任一项所述的TFP的核酸分子。
247.如权利要求246所述的载体，其中所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤病毒(RSV)载体或逆转录病毒载体。
248.如权利要求246或247所述的载体，所述载体还包含启动子。
249.如权利要求246-248中任一项所述的载体，其中所述载体是体外转录的载体。
250.如权利要求246-249中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含poly(A)尾。
251.如权利要求246-250中任一项所述的载体，其中所述载体中的核酸序列还包含3’UTR。
252.一种细胞，所述细胞包含权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、权利要求227-236中任一项所述的TFP分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体。
253.如权利要求252所述的细胞，其中所述细胞是人T细胞。
254.如权利要求253所述的细胞，其中所述人T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
255.如权利要求252-254中任一项所述的细胞，所述细胞还包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽，所述抑制性分子的至少一部分与包含来自胞内信号传导结构域的阳性信号的第二多肽缔合。
256.如权利要求255所述的细胞，其中所述抑制性分子包含含有PD1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
257.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
258.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含：
i)TFP分子，所述TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和
ii)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
259.如权利要求258所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基的蛋白质的胞外结构域或其部分。
260.如权利要求258或259所述的蛋白质复合物，其中所述抗IL13Rα2结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
261.如权利要求260所述的蛋白质复合物，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
262.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含
(a)TFP，所述TFP由权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子编码，和
(b)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
263.一种蛋白质复合物，所述蛋白质复合物包含：
iii)TFP分子，所述TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域；和
iv)至少一种内源TCR亚基或内源TCR复合物。
264.如权利要求263所述的蛋白质复合物，其中所述TCR包含选自由TCRα链、TCRβ链、CD3εTCR亚基、CD3γTCR亚基和CD3δTCR亚基的蛋白质的胞外结构域或其部分。
265.如权利要求263或264所述的蛋白质复合物，其中所述抗IL13Rα2结合结构域通过接头序列与所述TCR胞外结构域连接。
266.如权利要求265所述的蛋白质复合物，其中所述接头区包含(G4S)n，其中n＝1至4。
267.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的TFP蛋白每权利要求258-266中任一项所述的蛋白质复合物。
268.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞，其包含至少两种不同的由权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子编码的TFP分子。
269.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种TFP分子，所述TFP分子包含抗IL13Rα2结合结构域、TCR胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述TFP分子能够与人CD8+T细胞或CD4+T细胞中、其表面处和/或其表面上的内源TCR复合物和/或至少一种内源TCR多肽功能性地相互作用。
270.一种人CD8+T细胞或CD4+T细胞的群，其中所述群的T细胞单独或共同包含至少两种由权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子编码的TFP分子。
271.一种制备细胞的方法，所述方法包括用权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸或权利要求246-251中任一项所述的载体转导T细胞。
272.一种产生RNA工程化的细胞群的方法，所述方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞，其中所述RNA包含编码权利要求227-236中任一项所述的重组TFP分子的核酸。
273.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、表达权利要求226所述的多肽分子的细胞、权利要求227-236中任一项所述的重组TFP分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体或权利要求252-257和267-270中任一项所述的细胞。
274.如权利要求273所述的方法，其中所述细胞是自体T细胞。
275.如权利要求273所述的方法，其中所述细胞是同种异体T细胞。
276.如权利要求273-275中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
277.一种治疗患有与IL13Rα2的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求194-225中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、表达权利要求226所述的多肽分子的细胞、权利要求227-236中任一项所述的重组TFP分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体或权利要求252-257和267-270中任一项所述的细胞。
278.如权利要求277所述的方法，其中与IL13Rα2表达相关联的所述疾病选自由以下组成的组：增殖性疾病、癌症、恶性肿瘤、骨髓发育不良、骨髓增生异常综合征、白血病前期、与IL13Rα2表达相关联的非癌症相关适应症。
279.如权利要求277所述的方法，其中所述疾病是胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌或其任何组合。
280.如权利要求277所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与提高表达TFP分子的细胞的功效的剂组合施用。
281.如权利要求277-280中任一项所述的方法，其中与施用了有效量的表达抗IL13Rα2嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
282.如权利要求277-281中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与改善与施用表达TFP分子的细胞相关联的一种或多种副作用的剂组合施用。
283.如权利要求277-282中任一项所述的方法，其中将所述表达TFP分子的细胞与治疗与IL13Rα2相关联的疾病的剂组合施用。
284.如权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、表达权利要求226所述的多肽分子的细胞、权利要求227-236中任一项所述的重组TFP、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体、权利要求258-266中任一项所述的复合物或权利要求252-257和267-270中任一项所述的细胞，用作药剂。
285.一种治疗患有与IL13Rα2的表达相关联的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、表达权利要求226所述的多肽分子的细胞、权利要求227-236中任一项所述的重组TFP分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体，或权利要求252-257和267-270中任一项所述的细胞，其中与施用了有效量的表达抗IL13Rα2嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的哺乳动物相比，在所述哺乳动物中释放的细胞因子较少。
286.一种治疗患有包含表达IL13Rα2的细胞的实体瘤的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的权利要求194-225中任一项所述的重组核酸分子、权利要求226所述的多肽分子、表达权利要求226所述的多肽分子的细胞、权利要求227-236中任一项所述的重组TFP分子、权利要求237-245中任一项所述的核酸、权利要求246-251中任一项所述的载体，或权利要求252-257和267-270中任一项所述的细胞，其中所述肿瘤的体积减小或所述肿瘤的生长被抑制。
287.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用有效量的用编码T细胞受体(TCR)融合蛋白(TFP)的重组核酸分子转导的T细胞群，所述T细胞受体融合蛋白包含
(a)TCR亚基，所述TCR亚基包含
(i)TCR胞外结构域的至少一部分，和
(ii)TCR胞内结构域，所述TCR胞内结构域包含来自胞内信号传导结构域的刺激结构域；及
(b)人或人源化抗体结构域，所述人或人源化抗体结构域包含为抗间皮素结合结构域的抗原结合结构域；其中所述TCR亚基与所述抗体结构域可操作地连接，其中当在T细胞中表达时，所述TFP掺入TCR中，并且其中所述T细胞群，相较于具有较低间皮素表达的肿瘤细胞，优先杀伤具有较高间皮素表达的肿瘤细胞。
288.如权利要求287所述的方法，其中所述TCR亚基还包含TCR跨膜结构域。
289.如权利要求287或288所述的方法，其中所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
290.如权利要求287或288所述的方法，其中所述TCR亚基的所述TCR胞外结构域、所述TCR跨膜结构域和所述TCR胞内结构域源自TCR复合物的单个亚基，其中所述单个亚基是TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ或CD3δ。
291.如权利要求287-290中任一项所述的方法，其中所述TCR胞内信号传导结构域源自CD3ε或CD3γ。
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