CN113025630A - 狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立 - Google Patents

Abstract

本发明公开了狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本发明中的一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆，是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述的反向遗传操作系统，是由含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达HBF‑1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。通过本发明的反向遗传操作系统拯救获得的重组病毒rHBF‑1与亲本病毒wtHBF‑1相比具有相似的生长特性，且大小、形态与典型的犬瘟热病毒的一致。本发明的提出为狐源犬瘟热病毒强毒HBF‑1株的拯救以及深入探索犬瘟热病毒的致病致弱分子机制提供了基础和技术手段。

Description

狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传 系统的建立

技术领域

本发明涉及一种病毒的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立，特别涉及一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立。本发明属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus，CDV)的自然感染宿主不断增多，对世界范围内的多种陆生和水生食肉动物都存在生命威胁。CDV对不同易感宿主致病性不同，可引起不同程度的全身性疾病，致死率也有不同。其中，家猫发病死亡率为0％，家养犬为50％，雪貂达到100％。犬瘟热对毛皮动物养殖业和野生动物保护业造成了巨大经济损失。目前，我国人均拥有的宠物犬猫数量逐年增多，犬瘟热对人类公共卫生的影响已不容忽视。而且，已经证实CDV融合蛋白和血凝素蛋白在Paget's疾病中促进破骨细胞的形成，人类可能成为CDV的新宿主。

CDV为副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，是单股负链、不分节段RNA病毒。根据血凝素(H)基因的遗传多样性，CDV被划分为7个基因型，但只有1个血清型。CDV基因组从3’端到5’端依次为：3’端非编码区(3’UTR)、核基因(N)、磷基因(P)(内部含有两个非结构蛋白基因C和V)、基质基因(M)、融合基因(F)、血凝素基因(H)、大聚合酶基因(L)和5’端非编码区(5’UTR)。CDV基因组RNA在核蛋白N的包裹下，聚合酶蛋白(L)及其辅助因子磷蛋白(P)共同作用，形成核衣壳(RNP)，这是CDV最小感染单位，遵循“6碱基原则”的顺序合成加帽和启动病毒转录与翻译，产生子代病毒。

由于RNA病毒的基因组难以在体外任意操作，反向遗传技术的发明，为体外改造病毒RNA基因组提供了强有力的工具。目前，国内外学者建立了多个CDV反向遗传系统，但主要针对CDV弱毒疫苗株。CDV弱毒疫苗株与CDV强毒株在核苷酸序列上存在较大差异，并且，弱毒疫苗株一般不引起动物发病和死亡，不适合用于阐述犬瘟热病毒的致病机理。此外，CDV强毒虽然能导致动物发病和死亡，但体外分离和培养较为困难。CDV强毒无法感染野生型Vero细胞，只能感染表达信号淋巴细胞活化分子(Signaling lymphocyte activationmolecule,SLAM)的稳定细胞系，从而实现体外大量增殖。随着CDV强毒对细胞的适应和传代次数增加，可能会导致CDV强毒毒力和致病性下降。CDV强毒的这些特性，极大地限制了其反向遗传系统的建立，及CDV强毒相关重组病毒的拯救和增殖。因此，本发明构建了狐源犬瘟热病毒强毒株HBF-1的反向遗传系统。犬瘟热病毒强毒株HBF-1为从北极狐病料样品中分离的一株强毒(犬瘟热病毒强毒株HBF-1株的培育及致病性研究，高晗等，中国预防兽医学报，2012年12月，第32卷，第12期)。为了区别野生型CDV病毒wtHBF-1株，我们在pcDNA3.2-HBF-1中人为添加了遗传标记位点。比较了重组病毒rHBF-1与wtHBF-1的体外生长特性。数据结果显示：本研究利用构建的狐源CDV强毒HBF-1反向遗传系统，成功拯救获得重组病毒rHBF-1，rHBF-1具有与野生型wtHBF-1相似的生长特性。本发明的提出为未来深入研究CDV的致病机理和发病机制、致病性和新型疫苗提供了强有力的平台和工具。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；

本发明的目的之二在于建立一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传系统；

本发明的目的之三在于提供所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及其反向遗传系统在狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株拯救以及反向遗传学研究中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以适应Vero-dSlam细胞的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株为模板，构建了狐源犬瘟热病毒感染性cDNA克隆。获得病毒的全基因组序列后，用RT-PCR方法，分4个长片段扩增犬瘟热病毒的全基因组，通过酶切连接和无缝克隆的有机结合，将4个长片段顺次拼接、插入到真核表达载体pcDNA3.2(由pcDNA3.1改造多克隆位点而获得)的多克隆酶切位点处。经过酶切鉴定，确定获得狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的全长cDNA重组质粒(pcDNA3.2-HBF-1)，同时构建表达犬瘟热病毒强毒HBF-1株N、P、L蛋白的三个辅助质粒(pcDNA3.1-HBF-N、pcDNA3.1-HBF-P和pcDNA3.1-HBF-L)。经酶切和序列测定鉴定，全长重组质粒pcDNA3.2-HBF-1序列与预期一致。将全长质粒pcDNA3.2-HBF-1 5μg和三个辅助质粒pcDNA3.1-N 1μg，pcDNA3.1-P 0.8μg和pcDNA3.1-L 0.5μg，转染试剂X-treme GENE HP DNA 22μL，共转染BSR细胞，3天后，将细胞悬液接种到Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO₂培养5-10天，观察到犬瘟热病毒引起的典型合胞体病变。经过RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)，电镜观察鉴定，证实拯救出重组病毒rHBF-1株。因此，本发明成功建立了狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传系统，为狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的拯救以及深入探索犬瘟热病毒的致病致弱分子机制提供了基础和技术手段。

因此，在上述研究的基础上，首先，本发明提出了一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，所述的感染性cDNA克隆是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其次，本发明还提出了一种获得所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，包括以下步骤：

(1)提取HBF-1病毒悬液的总RNA；

(2)对获得的RNA进行反转录，获得cDNA。

(3)利用四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收；

F1 5’-GCGGCCGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAGACAAAGTTGGCTAAG-3’

R1 5’-GCGTACGTGAAAGCAGTTTTGAGCCT-3’

F2 5’-CTGCTTTCACGTACGCTTAAAAGCAATTATAAAAAACTTAGG-3’

R2 5’-GTTTAAACGCTTTTGAAGGAAATTAGGCGGGACT-3’

F3 5’-TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG-3’

R3 5’-GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA-3’

F4 5’-GGGATGATGACCGTGTTAATTAATCCCTTACCGATGATTGAATT-3’

R4 5’-CGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAGACAAAGCTGGGTATGATAAC-3’

(4)真核表达载体pcDNA3.1的改造

对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2；

(5)将F1、F2、F3、F4片段分别依次连接至pEASY-Blunt，测序，将测序正确的各基因片段分别连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的质粒。

其中，优选的，步骤(2)获得的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，步骤(4)中带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示。

再次，本发明还提出了所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆在拯救重组狐源犬瘟热病毒强毒rHBF-1株中的应用。

进一步的，本发明还提出了一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，所述的操作系统由含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。

其中，优选的，编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。

其中，优选的，所述的含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒通过以下方法制备得到：

(1)真核表达载体pcDNA3.1的改造

对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2，其中，带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含CDV HBF-1株全基因组的质粒。

其中，优选的，所述的表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒是通过将编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1的CMV启动子下游，获得表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N、P、L蛋白的三个辅助质粒。

再进一步的，本发明还提出了所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统在拯救狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株以及对狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株进行反向遗传学研究中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种拯救狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的方法以及由该方法获得的重组狐源犬瘟热病毒强毒rHBF-1株，所述的方法包括以下步骤：

将含有本发明所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒转染到BSR细胞中，优选的，含有所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒按照5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染；转染72h后，取细胞悬液，添加至Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO₂培养5-10天，观察CDV引起的典型合胞体病变(CPE)，待出现CPE后，收集细胞及上清，并在Vero-dSlam细胞中继续传代，培养6-7d，收获病毒，获得拯救的重组病毒，命名为rHBF-1。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本研究首次建立了犬科动物北极狐源CDV强毒HBF-1株的反向遗传操作系统。CDV强毒HBF-1能感染犬科动物，并引起其死亡。但在机体外，HBF-1却无法感染普通Vero细胞，要实现其大量增殖培养，必须利用表达Slam受体分子的Vero-dSlam细胞，这极大地限制了对HBF-1毒株的培养和深入研究，也为病毒拯救工作带来了难题。因此，本发明以适应Vero-dSlam细胞的HBF-1毒株为模式病毒，构建了HBF-1的全基因组重组质粒pcDNA3.2-HBF-1和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1 N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒。通过优化确定各个质粒转染比例与拯救条件，成功建立犬科动物狐源CDV强毒HBF-1株的反向遗传操作平台。将四质粒系统共转染BSR细胞，将各个质粒pCDV3.2-HBF-1、pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P、pcCDV3.1-L按照5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染，转染试剂用量为质粒用量的3倍。转染72h后，将BSR细胞悬液接种至Vero-dSlam细胞，共培养6-8d，可看见犬瘟热病毒典型的合胞体细胞病变。

考虑到HBF-1的强毒特性，为明确重组病毒rHBF-1的传代稳定性和生长特性。本发明将rHBF-1接种至Vero-dSlam细胞，传代9次，rHBF-1对Vero-dSlam细胞存在逐渐适应过程，从第4代起，rHBF-1病毒滴度达到10⁵TCID₅₀/mL。在病毒的传代中rHBF-1最高滴度可稳定在10^5.667TCID₅₀/mL，wtHBF-1的病毒滴度可稳定在10^5.3TCID₅₀/mL。将rHBF-1同wtHBF-1病毒悬液按MOI＝0.1接种到Vero-dSlam细胞上，于不同时间点收获上清和细胞，分别测定病毒滴度。结果可见，重组病毒rHBF-1与亲本病毒wtHBF-1相比具有相似的生长特性。亲本病毒和重组病毒相比，上清和细胞相关病毒滴度均可在72h达到最高滴度。电镜观察也可见到，rHBF-1大小、形态与典型的犬瘟热病毒的一致。

附图说明

图1为HBF-1株全长感染性cDNA克隆的构建策略；

图2为质粒pcCDV3.2-HBF-1的酶切鉴定结果；

M：DL5000 DNA marker 1:NotⅠ、BsiwⅠ2:PacⅠ、CpoⅠM:DL15000 marker；

图3为辅助质粒的鉴定结果；

1：NheⅠ2:PmeⅠ3:MluⅠM:DL 15000 DNA marker；

图4为重组病毒rHBF-1的鉴定；

(A)rHBF-1在Vero-dSlam细胞上形成的细胞病变(×40)；(B)阴性Vero-dSlam细胞(×40)；(C)rHBF-1免疫荧光染色(×40)；(D)阴性Vero-dSlam细胞免疫荧光染色(×40)；

图5为重组病毒rHBF-1遗传标记的酶切鉴定；

(A)RT-PCR以及酶切鉴定结果；(B)测序结果；

1.wtHBF-1 PCR鉴定产物；2.wtHBF-1 PCR鉴定产物Bsiw I酶切结果；3.rHBF-1PCR鉴定产物；4.rHBF-1 PCR鉴定产物Bsiw I酶切结果；M:DL 2,000 DNA marker；

图6为电镜下rHBF-1毒株的病毒粒子形态；

图7为rHBF-1的生长特性；

(A)rHBF-1的传代稳定性；(B)wtHBF-1和rHBF-1的一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但该实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立

1材料与方法

1.1病毒、细胞、载体

适应Vero-dSlam细胞的北极狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株，表达Slam受体的非洲绿猴肾细胞(Vero-dSlam)(可参见文献：稳定表达貉犬瘟热病毒细胞受体SLAM的Vero细胞系的建立及应用，赵建军等，《微生物学报》2012年12期)、仓鼠肾细胞(BSR)由中国农业科学院特产研究所特种动物疫病防控研究室保存；pcDNA3.1购自invitrogen公司。

1.2主要试剂

总RNA提取试剂盒RNeasy mini kit购自QIAGEN；反转录试剂盒SuperscripTMⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix购自invitrogen；高保真酶TransStart FastPfu DNAPolymerase，pEASY-Blunt Cloning Kit，感受态细胞Trans1-T1均购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自Axygen；质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN；T4 DNA连接酶和其他限制性内切酶均购自Thermo Scietific；0.25％胰酶购自全式金；培养基使用为含10％和2％胎牛血清的DMEM购自Corning；X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂购自Roche；CDV N单克隆抗体(MAB)购自RMRD；绿色荧光标记的羊抗鼠的二抗购自Proteintech。

1.3引物设计与合成

利用本发明人自行研发的不同CDV毒株通用特异性扩增反应系统，对狐源CDV强毒HBF-1的全基因组进行了扩增和序列测定。用DNAMAN软件分析全基因组序列的单一性酶切位点，用Primer Premier 5.0软件设计四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，在F1片段上游引入锤头状核酶序列(HamRz)，在F4片段末端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HdvRz)以确保转录产物末端序列的准确，为了便于全基因组片段的拼接，引物添加相应酶切位点，具体序列见表1，并设计了用于扩增CDV强毒HBF-1 N、P和L基因的上下游引物，送由上海生工生物技术公司合成。

表1.扩增用引物序列

注：加方框部分为酶切位点依次为NotⅠ、BsiwⅠ、Pme1、PacⅠ、CpoⅠ，加粗部分锤头状核酶(HamRz)序列，单下划线部分为丁型肝炎病毒核酶(HdvRz)部分序列。

1.4含有狐源CDV强毒HBF-1株感染性cDNA克隆的重组质粒与三个辅助质粒的构建

为了便于全基因组的拼接，对选用的真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列(SEQ ID NO.3所示)连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2。根据QIAGEN总RNA试剂盒的说明，提取HBF-1病毒悬液的总RNA。依据SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix试剂盒的操作说明，对RNA进行反转录，获得cDNA(SEQ ID NO.2所示)。利用Primer Premier 5.0设计的四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4(表1)，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶(Trans Start FastPfu DNA Polymerase)将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收。将F1、F2、F3、F4片段分别连接至pEASY-Blunt，送至上海生工生物技术公司测序。将测序正确的各基因片段分别依次连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含CDV HBF-1株感染性cDNA克隆的质粒pcCDV3.2-HBF-1(图1)，其中所述的CDV HBF-1株感染性cDNA克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。以相同方法，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，使用表1中扩增CDV HBF-1株N、P和L基因的上下游引物N-F/N-R、P-F/P-R、L-F/L-R、分别扩增CDV HBF-1株的N、P、L的ORF框，将扩增得到的CDV HBF-1株的N、P、L的ORF框克隆至真核表达载体pcDNA3.1的CMV启动子下游，获得表达CDV N、P、L蛋白的三个辅助质粒pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P、pcCDV3.1-L，其中，编码CDVHBF-1株的N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。经测序鉴定正确后，用QIAGEN质粒大量提取试剂盒制备高纯度质粒，于-80℃冰箱保存备用。

1.5病毒拯救

待六孔板中BSR细胞长至90％开始转染，使用X-treme GENE HP DNA转染试剂22μL，以pcCDV3.2-HBF-1、pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P、pcCDV3.1-L分别按5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染，转染方法参照说明书。转染72h后，取细胞悬液大约300μL，添加至密度约为80％的Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO₂培养5-10天，观察CDV引起的典型合胞体病变(CPE)。待出现CPE后，收集细胞及上清，并在Vero-dSlam细胞中继续传代，培养6-7d，收获病毒，获得拯救的重组病毒，命名为rHBF-1。

1.6重组病毒rHBF-1的间接免疫荧光(IFA)鉴定

将收获的rHBF-1病毒液，接种于Vero-dSlam细胞，待细胞出现CPE后，以4％多聚甲醛固定40min，将CDV N蛋白单克隆抗体1:500倍稀释作为一抗，以1:100倍稀释FITC标记羊抗鼠IgG为二抗，进行IFA检测，最后，DAPI进行核染色，在荧光显微镜中观察绿色荧光。

1.7重组病毒rHBF-1的RT-PCR鉴定

利用RNA提取试剂盒，分别提取wtHBF-1和经Vero-dSlam细胞传代的rHBF-1，反转录为cDNA。在rHBF的酶切位点BsiwⅠ上下300bp处设计引物(上游5-GGTATCGCCTTGGGTTCA-3,下游5-AGGCAGCGATCCAAATGT-3)，以各自的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物一部分送往公司测序，一部分做PmeⅠ酶切。rHBF-1的基因组中人为添加了Pme I酶切位点，wtHBF-1中无此位点识别序列。

1.8病毒生长特性

将wtHBF-1和rHBF-1分别按照MOI＝0.1接种于Vero-dSlam细胞，在感染后12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h，分别收获细胞和上清，冻存于-80℃冰箱。取不同时间点收获的病毒悬液100μL进行10倍系列稀释。96孔板中每个稀释度分别做4个重复，每孔接种100μLVero-dSlam细胞(5×10⁴个)，感染后第6-8d，观察CPE，分别计算不同时间点，上清和细胞相关的病毒滴度(TCID₅₀/mL)。利用软件GrapPad Prism 6绘制病毒生长曲线。

2结果

2.1 HBF-1株全基因组序列测定与分析

用RT-PCR方法获得覆盖HBF-1全基因组的11个基因片段，经1％琼脂糖凝胶电泳，11个目的条带，大小与预期结果相符。HBF-1株全基因组测序结果与GenBank中Hebei株序列比对发现：有13处氨基酸发生变异，其中，P蛋白突变率为0.39％，H蛋白突变率为0.33％，是变异率最高的二个结构蛋白。

2.2 HBF-1全长质粒鉴定

含有HBF-1株感染性cDNA克隆的重组质粒pcCDV3.2-HBF-1，分别经NotⅠ和BsiwⅠ、PacⅠ和CpoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，得到大小分别为17300bp、3500bp和14100bp、6700bp目的条带，与预期结果相符(图2)。

2.3辅助质粒鉴定

辅助质粒pcCDV3.1-N、pcCDV3.1-P、pcCDV3.1-L分别经NheⅠ、PmeⅠ、MluⅠ限制性酶切位点进行酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳，获得6600bp、5000bp、1700bp、12000bp的目的条带，与预期结果一致(图3)。

2.4重组病毒rHBF-1的鉴定

2.4.1免疫荧光检测

将重组病毒rHBF-1感染Vero-dSlam细胞，观察到典型细胞病变情况(图4A)，同时空白对照无病变(图4B)，用犬瘟热N蛋白单克隆抗体进行免疫荧光，进一步确定。结果发现，发生病变的细胞能与CDV-NP抗体特异性结合，呈阳性信号(图4C)，空白对照组无荧光，为阴性(图4D)。

2.4.2 RT-PCR检测结果

分别提取wtHBF-1和重组病毒rHBF-1的总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，进行RT-PCR和酶切鉴定。结果显示，野生型wtHBF-1不能被PmeⅠ切割，PCR片段和酶切结果均显示600bp大小的目的条带(图5A)。重组病毒rHBF-1的PCR扩增产物，则可以被BsiwⅠ酶切。PCR产物大小约为600bp，Pme I酶切后，被截断为两个大小约为300bp的目的条带。由于2个目的条带大小均为300bp，因此，电泳凝胶结果显示为1条带(图5A)。rHBF-1的RT-PCR鉴定产物，测序结果也验证了遗传标记Bsiw I识别序列的存在(图5B)。

2.4.3 rHBF-1的形态鉴定

重组病毒rHBF-1的上清液用于负染，在电子显微镜下观察。结果可见，病毒粒子外部有一层囊膜包裹，囊膜上含有纤突，是副黏病毒的形态特征(图6)。

2.4.4重组病毒与亲本毒株在Vero-dSlam细胞上的生长特性比较

将拯救获得的rHBF-1在Vero-dSlam细胞上传代9次，测定每一代病毒悬液所含病毒滴度。结果可见，从第4代起，病毒滴度有明显上升，达到10⁵TCID₅₀/mL(图7A)，同野生型wtHBF-1的滴度较为接近。将wtHBF-1与rHBF-1感染以MOI＝0.1感染Vero-dSlam细胞，不同时间点收集上清与细胞，并测定各个时间段的病毒滴度，绘制出生长曲线。可见，与wtHBF-1相比，rHBF-1存在基本一致的生长特性(图7B)。

序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆及反向遗传系统的建立

<130> KLPI190859

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15690

<212> DNA

<213> Canine Distemper Virus

<400> 1

accagacaaa gttggctaag gatagttaaa ttattggata ttttattaaa aacttagggt 60

caatgatcct accttagaga acaaggtcag ggttcagacc taccagtatg gctagccttc 120

tcaagagcct cacattgttc aagaggactc gggaccaacc cccacttgcc tcgggctccg 180

gaggagcaat aagagggata aagcatgtca ttatagtcct aatcccgggt gattcaagca 240

ttgttacaag gtctcgacta ctggatagac ttgttagatt ggtcggtgat ccggaaatca 300

acggacctaa attaactggg attttaatca gtatcctctc cttgttcgtg gaatcccctg 360

gacagttgat ccagaggatc atagacgacc ctgatgtaag catcaagtta gtagaggtaa 420

tcccaagcat caactctggt tgtggtctta catttgcatc cagaggagca agtttggatt 480

ctgaggcaga tgagttcttc aaaattgtag acgaagggtc gaaagctcaa ggacaattag 540

gctggttgga gaataaggat attgtagaca tagaagttga tgatgctgag caattcaata 600

tattgctagc ttccatcttg gcccaaattt ggatcctgct cgctaaagca gtgactgctc 660

ctgatactgc agccgactcg gaaatgagga ggtggattaa gtatacccaa cagagacgtg 720

tggtcgggga atttagaatg aacaaaatct ggcttgatat tgttagaaac aggattgctg 780

aggacctatc tttgaggcga ttcatggtgg cactcatctt ggacatcaaa cgatccccag 840

ggaacaagcc tagaattgct gaaatgattt gtgatataga taactacatt gtggaagctg 900

gattagctag tttcatctta actatcaaat ttggcattga aactatgtat ccggctcttg 960

ggttgcatga gttttccgga gagttaacaa ctattgaatc ccttatgatg ctatatcaac 1020

agatgggtga aacagcaccg tacatggtta ttctggaaaa ttctgttcag aacaaattta 1080

gtgcaggatc ctacccactg ctctggagtt atgctatggg agttggtgtt gaacttgaaa 1140

actccatggg agggttaaat ttcggtagat cctactttga tccggcctat ttcaggctcg 1200

ggcaagaaat ggtgagaaga tctgccggca aagtaagctc tgcacttgcc gccgagcttg 1260

gcatcaccaa ggaagaggct cagctagtgt cagaaatagc atccaagaca acggaggacc 1320

ggacgattcg cactgctggt cccaagcaat ctcaaatcac ttttctgcac tcagaaagat 1380

ccgaagtcac caatcaacaa cccccaacca tcaacaagag gtccgaaaac caaggaggag 1440

acaaataccc catccacgtc aatgatgaac ggtttccagg gtacacccct gatgtcaaca 1500

gctccgaatg gagtgaatca cgctatgata cccagactat tcaagatgat ggaaacgacg 1560

atgaccggaa atcgatggaa gcaatcgcca agatgagaat gcttactaag atgctcagtc 1620

aacctgggac cagtgaagag agttctcctg tctataatga tagagagcta ctcaattaaa 1680

tattcaagac cagtgttaca tcagtcacca attatccttc taaactcatt ataaaaaact 1740

taggacccag gtccaacaat cccgatcaac cattcatccg accaaccatt ctatctctaa 1800

atggcagaag agcaggccta tcatgtcaat aaagggctgg aatgcctcaa agccctcaga 1860

gagaatcctc ctgacattga ggagattcaa gaggtcagca gtatcagaga tcaaacccgc 1920

gacccaggcc aagagaatgg aaccgcaagc atgcaggaag aagaggtctc tcaggatctc 1980

gatgaatcac acgagccagc aaaaggatca aactatgtcg gccatgtact ccaaaataat 2040

ccgggatgtg gagagagcaa cactgcgctt gtggaggaag agcagcccgc taaagatgat 2100

gtccaaccag gacctgaaat acgatgttat catgtttatg atcacagtgg tgaagaggtt 2160

aagggaatcg aagatgctga cagtctcgtg gtacctgcag gcgctgtcag taatcgagga 2220

ttcgagagag gagaaggaag ccttgatgat agcactgagg attctggcga agattattcc 2280

gagggaaatg cttcatctaa ctggggatat tctttcggcc ttaaaccaga cagagcggct 2340

gatgtgagca tgctgatgga agaggaattg agtactctgc tcaagacaag cagaaatgtg 2400

gggattaaga aaagggatgg gatgactctg cagttcccac acagtcccga aggtaagaca 2460

gaggatccgg agtgtggatc cattaaaaag ggcacaggag agaggtcagc ctcacatgga 2520

atggggatag ttgctggatc gacaagtggt gcaacccaat ctgcactcaa gtcaactggg 2580

ggatcatcag ggccacgtgt gtctgcggag aatgtccgcc aacctgcaat gaatgcaaag 2640

atgacccaga aatgcaaacc cgagtctggt acgcaactcc ctgccaggac ctcaaatgag 2700

gctgaatctg acagtgagta tgacgatgag cttttttctg aaatacaaga aattcgatct 2760

gctatcacta agctaatgga agataatcaa gcaatacttt ctaaactgga taccctatta 2820

ctgcttaaag gagagactga ttcaattaag aaacaaatta gcaagcaaaa tattgctatt 2880

tccacgattg aggggcatct atcaagcatt atgatagcta tacctggttt tgggaaggac 2940

actggagacc ctacggcaaa tgtcgacatt aacccagagc tccgccctat aatagggagg 3000

gattcaggaa gagcactggc ggaagttctc aagcaacccg catcatcccg cggtaatcgg 3060

aaggacagtg gtatcgcctt gggttcaaaa ggtcaactat tgagagacct ccagctgaaa 3120

cctattgaca aagagtctag ttcggcaatc ggatacaaac cgaaggatac cgcaccttcc 3180

aaagctgtac ttgcatcatt gattagatca agcaaaattg atcaaagtca caaacacaac 3240

atgctggccc ttctcaaaaa tattaagggg gatgacaatc taaacgagtt ctaccagatg 3300

atcaagagta tcacacatgc ttaagctgta gcatttacta atctattaac aggctcaaaa 3360

ctgctttcac gtacgcttaa aagcaattat aaaaaactta ggacacaaga gcctaagtcc 3420

tctccacaaa aatgactgag gtgtacgact tcgatcagtc ttcgtgggac accaaaggtt 3480

ccttggcccc cattttgccc accacctacc ccgatggtag gctagtaccc caagtcagag 3540

tgatagatcc aggactcgga gatcgaaaag atgaatgttt catgtatatt tttctactgg 3600

gtataataga agacaacgat ggcctcggac ccccgattgg aagaacattt ggatcgctgc 3660

ctttaggtgt tgggcgcact acagccagac ctgaagaatt attgaaggaa gccaccttgt 3720

tggacattgt ggtaaggcga actgcaggtg tcaaagaaca actggtattt tacaataaca 3780

ccccattgca catcttaact ccgtggaaga aggtccttac gagcgggagt gtattcagtg 3840

ctaatcaagt ctgtaacgcg gtcaatttaa taccattgga catagcacag agatttaggg 3900

tggtatatat gagcatcact cgactatcag acgatggaag ttacagaatt cctcgcggga 3960

tgtttgaatt ccgctccagg aatgctttag catttaatat tttagtcacc attcaagttg 4020

agggagatgt ctgttcaagc cgagggaatt tgagcatgtt caaagatcac caagtgacat 4080

tcatggtgca tatcggcaac ttcagtcgta agaagaacca agcttactct gctgattact 4140

gtaaacttaa aattgaaaag atgggattag tgtttgctct aggagggata ggaggaacca 4200

gtcttcacat acgatgtact ggtaagatga gcaaggcttt gaatgcccag ctaggattca 4260

agaaaatcct gtgttacccg ctcatggaga tcaacgaaga tttgaatcga tttctatgga 4320

gattagagtg caaaatagta agaatccaag cagtcttgca accatcagtc ccacaagatt 4380

tcagaattta taatgatgtt atcatcagtg atgatcaggg tcttttcaaa attctctaaa 4440

tcattagttc atgaactaaa actcaaatgc cttggtggca ttgtccagga tcccttaatc 4500

ctctcaaaca aggattgagg ctacaagtgt caattgtctc ggtgttgctc ctgcatttta 4560

agcaagttct ataggtttct aaacttctca ttcgtgccta ctattctggt gactctgcaa 4620

tacgaagaca gctgaatcaa accaattcat gctcaagagt aggttgatca ttatcggacc 4680

aagaaatgta tggatgcttg gggttttgaa attcacctct aggaatctca cttaaccaat 4740

tatacctcca cgcgcttgcc tgatctcaag ctattactag tagtcctgtt tcacgaagtt 4800

ctgactgtct atctttctat caccaatcgt taataattaa tcaaaactta ggatccagga 4860

cgcagcaagc caacaggcca accaagtcca ccaatccgag gccgggcagg aaccccaaca 4920

aacagacaag ccccatgcac aacaaaatcc ccaaaaaatc caaacccctg ccacacaccc 4980

gacaagatcc cctccaacaa cacagcacca gatccaccga gaccaagacc tcccaaggac 5040

gatatagcat aacatcggct cagcgatcca cgtaccatag tcctcgaaca tcggacaggc 5100

ccgtccacta cataatgaac aggaccaggt cttgcaagca aactagccac agatcggata 5160

acatcccgcc tcacagagac cacgagggta tcatccatca cacaccagag agtgtcaccc 5220

aaggagcgag ttcctggttc aagaggtggc aatccaatgc aaccaatgca ggctctcaat 5280

gcacctggtt agtcctgtgg tgcatcggaa tagccagtct ctttctttgt tccaaggctc 5340

agatacattg gaataatttg tcaacgattg ggattatcgg aactgacagt gtccattata 5400

agatcatgac taggcccagt caccagtact tggtcataaa actaatgcct aatgtttcac 5460

ttatagataa ttgtaccaaa gcagaattag gtgagtatga gaaattatta aattcagtcc 5520

tggagccaat caaccaagct ttgactctaa tgaccaataa tgtgaagccc ctacagtcag 5580

tagggtcagg taggagacaa aggcgttttg caggagtggt gcttgcaggt gcagctttag 5640

gggtggccac agccgcacaa atcactgcag ggatagcttt acatcagtcc aacctcaatg 5700

ctcaagcaat ccaatctctg agaactagcc ttgaacagtc caacaaggct atagaagaaa 5760

ttagggaggc aacccaggaa accgtcattg ctgttcaggg agtccaggat tacgtcaata 5820

atgaactcgt ccctgctatg caacatatgt cgtgtgagtt agttgggcag agattagggt 5880

taaaactgct taggtattac accgagttgt tgtcaatatt tggcccgagt ttacgtgacc 5940

ctatttcagc cgagatatca attcaagcac tgagttatgc tcttggggga gaaattcata 6000

agatacttga gaagttgggg tattctggta atgatatgat tgcaattttg gagagtcggg 6060

ggataaaaac aaaaataact catgtcgatc tccccgggaa actcatcata ttaagtatct 6120

catacccaac tttatcagaa gtcaaggggg ttatagtcca cagactggaa gccgtttctt 6180

ataacatagg gtcacaggag tggtacacca ctgtcccgaa gtatgttgca actaatggtt 6240

acttaatatc aaactttgat gagtcatcct gtgtattcgt ctcagaatca gccatttgta 6300

gccagaactc tctgtacccc atgagcccga ttctacaaca atgcattagg ggcgatactt 6360

catcttgtgc tcggaccttg gtgtctggga ctatgggcaa caagtttatt ctgtcaaaag 6420

gtaatatcgt tgcaaattgt gcttctatac tatgtaagtg ttatagcaca agcacaatta 6480

tcaatcagag tcctgataag ttgctgacat ttattgcctc cgatacctgc ccactggttg 6540

aaatagatgg tgtaactatc caagttggag ggaggcaata ccctgatatg gtatacgaaa 6600

gcaaagttgc cttaggacct gctatatcac ttgagaggtt ggatgtaggt acaaatttag 6660

ggaacgccct taagaaactg gatgatgcta aagtactgat agactcctct aaccagatcc 6720

ttgagacagt taagcgctct tcctttaatt ttggcagtct cctcagcgtt cccatattaa 6780

tctgtacagc tctggctttg ttgttgctaa tttactgctg taaaagacgc taccgacaga 6840

cattcaagca taatactaag gtcgatccga catttaaacc tgatttgact ggaacttcga 6900

aatcatatgt aagatcactc tgaagcactc tgatcacaag tcttacctga ttgttaggct 6960

tgaaatccat aagtcccgcc taatttcctt caaaagcgtt taaactgcaa caaatagtgg 7020

cgaggactga ctccaattat tataattaaa gaaaacttag ggctcaggta gtccaacaat 7080

gctctcttac caagacaagg tgggtgcctt ctacaaggac aatgcaagag ctaattcatc 7140

caagctgtcc ccagtgaccg aagagcaagg gggacggaga ccaccctatt tgctgtttgt 7200

ccttctcatc ctactgattg gaatcctggc cttgcttgcc atcactggag ttcgatttca 7260

ccaagtatca actagcaata tggaatttag cagattgctg aaagaggata tggagaaatc 7320

agaggccgta catcaccaag tcatagatgt cttgacaccg ctcttcaaaa ttattggaga 7380

tgagattggg ttacggttgc cacaaaaact aaacgagatc aaacaattta tccttcaaaa 7440

gacaaacttc ttcaatccga acagggaatt cgacttccgc gatctccact ggtgcattaa 7500

cccacctagc aagatcaagg tgaattttac taattactgt gatacagttg gggtcaaaaa 7560

atctattgca tcggcagcaa atcccatcat tttatcagca ctctccgggg ccagaggtga 7620

catattcccg ccgtacagat gcagtggagc tactacttca gtaggcaggg tattccccct 7680

atccgtatca ttatccatgt ctttgatatc aagaacatca gagataatca atatgctaac 7740

cgctatctca gacggagtgt atggtaaaac ttatttgcta gtgcctgatt atattgaagg 7800

ggagttcgac tcacaaaaga ttcgagtctt tgagataggg tttatcaaac ggtggctgaa 7860

tgacatgcct ttactccaga caaccaacta tatggtcctc ccggaaactt ccaaagccaa 7920

ggtatgtact atagcagtgg gtgagctgac actagcttcc ttgtgtgtag atgagagcac 7980

cgtattgtta tatcatgaca gcaacggttc acaagatggt attctagtag tgacattggg 8040

aatatttggg gcaacaccta tggatcaagt tgaagaggtg atacctaccg ctcacccatc 8100

agtggagaga atacatataa caaatcaccg tgggttcata aaagactcaa tagtaacctg 8160

gatggtgcct gtattggtct ctgagaaaca agaggagcaa aaaaactgtc tggagtctgc 8220

ttgtcacaga aaatcctacc ctatgtgcaa ccaaacgtca tgggaaccct ttggaggagg 8280

acagttgcct tcttatgggc ggttgacatt acctctagat ccaagcattg accttcaact 8340

taacatatca tttacatatg gtccggttat actgaacgga gacggtatgg attattatga 8400

aagcccactt ttggactccg gatggcttac catacctcct aagaacggga cagtccttgg 8460

attgataaac aaagcaagta gaggagacca gttcactgtg accccccatg tgttgacatt 8520

tgcgcccagg gaatcaagtg gaaattgtta tttgcctatt caaacatccc agattatgga 8580

taaagatgtc cttactgagt ccaatttagt ggtgttacct acacagaatt ttagatatgt 8640

catagcaaca tatgatatat cccggggcga tcatgcaatt gtttattatg tttatgaccc 8700

aatccggacg atttcttata catacccatt tagactaact accaagggta gacctgattt 8760

cctaaggatt gaatgttttg tgtgggatga cgatttgtgg tgtcatcaat tttaccgatt 8820

cgaggctaac atcactaact ctacaaccag tgttgagaat ttagtccgta taagattctc 8880

atgtaaccgt tcaaaacctt gatggtatgc tgatacacat ctcaattgaa ctgagggatg 8940

atgaccgtgt taattaatcc cttaccgatg attgaattaa accatcccca gcattataaa 9000

aaaactaagg atccaggatc cttttagtca tggactctgt ttcagtgaac cagattttat 9060

accctgaggt ccatctagat agcccaattg tgaccaataa gctagtggct attttagagt 9120

atgcacgaat tagacataac tatcgactcc ttgacacaac gttagtgcgt aatatcaaag 9180

agagaatttc agaagggtta tcaaaccaga tgatcattaa ctgtatcgaa attgggagca 9240

ttgttaatca gaccttgtta tcttatccca aacacaacca tgtgatatat ccaaattgca 9300

acaaacttct gtttcatgca caggatcgag tcatctctct gaggttgaga aatatattca 9360

aaagaggaaa tagcatctat agtaaaataa cagacggggt caaaaaatgc ttaaacgata 9420

ttaatcttag tattggttta ggaggtgcat tggataagac tattggggcc aaagttgatg 9480

aagcaggcat aattatgcaa agctcacagt ggttcgaacc tttccttctg tggtttacaa 9540

ttaagacaga aatgagatca gtgattaaat cctctactca caactgtcgc aaacgaaggc 9600

agaatcctgt ctttgtaaga ggtgaatcat ttaatgtgtt agtgtctcgg gatcttgtat 9660

gtatcattga cctcaccagt cacaatgttt attacctaac atttgaaatg gtcctgatgt 9720

attgtgatgt gatagaaggg agattaatga ctgataccgc tatggcaatt gatcaccgtt 9780

actcaacttt gcatgtcaga atcaggtatc tttgggatct aattgatgga tttttcccgg 9840

acttaggaaa ttcgacctat caactggtag ctctgctgga gcctctttca ttggcttact 9900

tgcaattaaa agacatcacc ttctctctca ggggtgcttt tttgagtcac tgctttgctg 9960

aaatccagga gattttacag gacaatggct tctatactga agagacattc caaaccttaa 10020

cccaggctct agactttgtt ttcatcacag aggatataca tataacagga gagatctttt 10080

ccttttttag gagtttcggt cacccaagat tagaagcaat aacagcagca gaaaatgtac 10140

ggaaacacat gaatcaaccc aaagttgtct cctatgagac catgatgaag ggacacgcta 10200

ttttctgtgg gataatcatt aacggttatc gggatagaca tggaggaact tggcctccaa 10260

tggatcttcc tgtccatgca tctcctatca tcaggaatgc tcatgcctca ggagagggaa 10320

tcacctatag tcaatgtata gaaaattgga aatcctttgc aggaattcga tttaaatgct 10380

ttatgcccct ctgcctagac agtgatctga ccatgtattt gaaagataag gctttagcag 10440

cccttaaaaa agagtgggat tcagtgtacc caaaagaatt cctcaggtac aacccacctc 10500

gctccactga atctcggaga cttgttaatg tgtttctaga ggactctcag tttgaccctt 10560

ataatatgat tatgtacgtt atctcaggac aatatctaga cgatcctgac ttcaacctat 10620

catacagtct taaagagaaa gagattaaag aagtggggag gttattcgct aaaatgacat 10680

acaaaatgcg ggcctgtcaa gtcatagcag aaaacttaat atctaatgga attgggaagt 10740

acttcaagga caatgggatg gcaaaggatg aacacgatct cactaaagca ttgcacactc 10800

tggctgtgtc cggggttcct aaagacaaga aagactccca tcgcggcctc actaaccagt 10860

gtaagtctaa aaaactgaca ccttatcgag gagcccttca ctccgtctct tctccaagta 10920

gtagatatat ggacccaaac ccaaattttt gcaccagtag aagagaagac aatgacatag 10980

agatctatga gaccgtaagt gcatttataa ctacagatct caaaaagtac tgtctgaatt 11040

ggcgatatga gaccattagt atatttgctc akagattaaa tgaaatctac ggtctcccct 11100

catttttcca atggttgcac agaagattgg aacagtcgat cctatacgta agtgaccccc 11160

actgccctcc agatctcgat cgccatgtgg acttgaacac agtccctaac tctcaaatat 11220

tcatcaaata cccaatggga ggagtagagg gatattgtca aaagttatgg actattagca 11280

caatacctta tctgtacttg gcagcacatg aaagcggtgt caggattgca tcacttgttc 11340

aaggtgataa ccaaaccatt gctgtcacta aaagagttcc aagcacctgg tcatatgcct 11400

tgaagaagtc tgaagccagt cgagtcacca cagaatactt tatagcctta agacagagat 11460

tacatgatgt cggacatcat ttgaaagcaa atgaaacaat aatatcttcc cacttttttg 11520

tatactcaaa aggaatctat tatgatggga tgttaatttc gcaatccttg aaaagtatag 11580

ctaggtgcgt attttggtca gaaacaatag tggatgagac ccgagccgcc tgtagcaaca 11640

tttcaacaac attggcaaaa gccattgaga aagggtttga ccggtattta gcctatgcgc 11700

tgaatatttt aaaaatcatt caacaagtat taatttcatt aggattcact atcaattcag 11760

ctatgacgcg ggatgtgata gaaccccttt tacaagacca ctgtctcttg accaagatgg 11820

caattcttcc tgcacccata ggtggtctta attacctcaa tatgagtagg ctttttgtca 11880

ggaacatcgg ggatcccgtg acatcttcta ttgctgacct caaacgaatg atccgatcag 11940

gccttctcgg agtagagatt ttacatcaag tcatgaccca atacccaggt gactcttcgt 12000

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gactccttaa aaatattacg gccaggcatg tccttatcaa cagtccaaat cccatgctga 12120

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ttagggcagg tatcagacta ttgtcaggga agggacatga cccactcatc gatcaagact 12420

catgctctgt ccagttagcg agagcattaa ggaaccacat gtgggctaag ttggcgaagg 12480

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taagaagaca tgagtcttgt ttgctttgcg catcaggctc tcataactat ggttggtttt 12600

ttgtaccggc aaattgtcaa ttagatagta ttacagaggg aacatctgca ctgagggtac 12660

catacattgg gtccacaaca gaagaaagaa cagacatgaa attagcattc gtcaaatctc 12720

ctagtaggtc tctaaaatca gcagtgagaa tagcaactgt gtactcatgg gcctatggtg 12780

atgatgacga atcttggcaa gaggcttgga ctttggcaaa acagagagcg aacatctcac 12840

ttgaagaatt acggatgatt accccaattt ctacctctac taatctagct caccggctca 12900

gggacaagag tactcaagtc aaatactcag ggacctctct tatcagagta gcacgttatg 12960

caacaatctc taatgataat ctttcttttg tgatagctga caagaaagtg gacacgaact 13020

ttatttatca gcaaggtatg ctcctggggt tggggattct cgagcacttg tttagactgt 13080

cttcaaccac cggcgacacc aacaccgtac tgcatttaca tgttgaaaca gattgttgcg 13140

taatacccat gagcgaccat ccaagggtcc cagggctcag aaaggtcgtt ataccaagaa 13200

atatttgtac aaatcctttg atctatgaca gtaaccctat tattgagaaa gatgcagtca 13260

ggctttataa ccagagtcac aggaagcaca ttgtagagtt tgtcacatgg acaacagggc 13320

agctttatca tgtactagct aaatctactg ctatgtctat ggttgagatg attacaaagt 13380

ttgaaaaaga ccacctaaat gaagtctccg cgttaattgg cgatgacgat atcaatagct 13440

ttatcactga gtttcttctc gttgagccca ggttatttac tgtgtatcta ggtcaatgtg 13500

ctgcaatcaa ctggggcttt gaaattcatt atcaccgacc ttctggaaag tatcaaatgg 13560

gtgaattgtt gttttctttc ttgagtagaa tgagtaaagg agtcttcaaa attttaacca 13620

atgcattgag tcatcccaaa gtatatagac gattttggga cagtgggatg attgaacctg 13680

tacacggacc ctctcttgac tcccagaacc tacacataac tgtatgcaac ctgatctata 13740

actgttacat gatttaccta gaccttctgt taaatgatga gttagatgat ttctcattca 13800

ttttatgcga aagtgatgag gatatcatac ctgaaagatt tgacaacata caagctaggc 13860

acctatgcat cctgtctgac ctttattgta accctcgtga ttgtccccag attcgtgggt 13920

tgacaccaac acagaaatgt gctgtgttat cgaggtactt aaaatcaaaa gctctagagt 13980

cccatgttgg tctgacatgg aatgacaaac ctatcctgat agatcagtat tcatgttccc 14040

tgacatatct gagaagaggc tcaatcaagc agataagatt gagagtggac cccgggttca 14100

tcactgatgc tgttggatgc ttagaaaagc gacctctgag gaaaagtcct atctctaacg 14160

cctcagaatt aaaatcagaa tttgacccac cgaaagatga cctggttaaa ctcctgagtc 14220

agctatcaac aaggacacac aacttaccta ttacaggatt aggagtccga aactatgagg 14280

ttcactcatt cagaagaatt gggatcaatt caacggcatg ttacaaggca gttgaaatag 14340

tctctgttat taagaacgaa ttcacgtctg aagaacatgg attattccta ggagagggtt 14400

caggtgcaat gctgacagta tataaagagc tattgaggtt gtcaagatgt tattataaca 14460

gtggtgtgtc agcagaggct agaactggac aacgagagat ttcaccttac ccttctgagg 14520

tcagccttgt ggaacatcaa ttaggactcg ataaattggt gactgtgctt ttcaatggga 14580

gaccagaggt aacttgggtt gggagtgttg attgttacaa gtacatacta agtcagatat 14640

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<210> 2

<211> 15690

<212> DNA

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<400> 2

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caatgatcct accttagaga acaaggtcag ggttcagacc taccagtatg gctagccttc 120

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ttgttacaag gtctcgacta ctggatagac ttgttagatt ggtcggtgat ccggaaatca 300

acggacctaa attaactggg attttaatca gtatcctctc cttgttcgtg gaatcccctg 360

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ttatttatca gcaaggtatg ctcctggggt tggggattct cgagcacttg tttagactgt 13080

cttcaaccac cggcgacacc aacaccgtac tgcatttaca tgttgaaaca gattgttgcg 13140

taatacccat gagcgaccat ccaagggtcc cagggctcag aaaggtcgtt ataccaagaa 13200

atatttgtac aaatcctttg atctatgaca gtaaccctat tattgagaaa gatgcagtca 13260

ggctttataa ccagagtcac aggaagcaca ttgtagagtt tgtcacatgg acaacagggc 13320

agctttatca tgtactagct aaatctactg ctatgtctat ggttgagatg attacaaagt 13380

ttgaaaaaga ccacctaaat gaagtctccg cgttaattgg cgatgacgat atcaatagct 13440

ttatcactga gtttcttctc gttgagccca ggttatttac tgtgtatcta ggtcaatgtg 13500

ctgcaatcaa ctggggcttt gaaattcatt atcaccgacc ttctggaaag tatcaaatgg 13560

gtgaattgtt gttttctttc ttgagtagaa tgagtaaagg agtcttcaaa attttaacca 13620

atgcattgag tcatcccaaa gtatatagac gattttggga cagtgggatg attgaacctg 13680

tacacggacc ctctcttgac tcccagaacc tacacataac tgtatgcaac ctgatctata 13740

actgttacat gatttaccta gaccttctgt taaatgatga gttagatgat ttctcattca 13800

ttttatgcga aagtgatgag gatatcatac ctgaaagatt tgacaacata caagctaggc 13860

acctatgcat cctgtctgac ctttattgta accctcgtga ttgtccccag attcgtgggt 13920

tgacaccaac acagaaatgt gctgtgttat cgaggtactt aaaatcaaaa gctctagagt 13980

cccatgttgg tctgacatgg aatgacaaac ctatcctgat agatcagtat tcatgttccc 14040

tgacatatct gagaagaggc tcaatcaagc agataagatt gagagtggac cccgggttca 14100

tcactgatgc tgttggatgc ttagaaaagc gacctctgag gaaaagtcct atctctaacg 14160

cctcagaatt aaaatcagaa tttgacccac cgaaagatga cctggttaaa ctcctgagtc 14220

agctatcaac aaggacacac aacttaccta ttacaggatt aggagtccga aactatgagg 14280

ttcactcatt cagaagaatt gggatcaatt caacggcatg ttacaaggca gttgaaatag 14340

tctctgttat taagaacgaa ttcacgtctg aagaacatgg attattccta ggagagggtt 14400

caggtgcaat gctgacagta tataaagagc tattgaggtt gtcaagatgt tattataaca 14460

gtggtgtgtc agcagaggct agaactggac aacgagagat ttcaccttac ccttctgagg 14520

tcagccttgt ggaacatcaa ttaggactcg ataaattggt gactgtgctt ttcaatggga 14580

gaccagaggt aacttgggtt gggagtgttg attgttacaa gtacatacta agtcagatat 14640

ctgctagcag tcttggattg attcactcgg atatcgagtc actacctgat aaagacataa 14700

ttgaaaaatt ggaagaactg tctgccatat tatcgatgac tttgatatta gggaaggtag 14760

ggtcagtgtt agtaatcaag atcatgcccg ctagtggcga ctgggttcaa ggatttattc 14820

tgtatgcact cccacatttt cttcgaagtt acataattta cccaagatac agcaattttg 14880

tgtcaacaga ggcctacctc gttttcactg gtcttagagc agggagacta gtcaatccgg 14940

aggggattaa acaacagatt ttgcgagtcg gtattcgaac ttcacccgga ttggtagggc 15000

acatcctttc atcaaagcag acagcatgtg tgcaatcttt gcatggacct ccatttcaag 15060

ctaaatcttt taatccttac ctccagggtt taacaagtat tgagaagatt ttgatcaatt 15120

gtgggcttac aattaacggt cttaaagtat gcaaaaacct gcttcaccat gatatctcgt 15180

caggcgagga agggctgaaa ggatctatca caatccttta tagggaactc gcacggttca 15240

aggataacca ccaattttca catggaatgt tccatgcata cccagtttta atcgcaagtc 15300

aggaaaggga gctcgtatcc accattgcaa ggaagtattg tggttatatt ttgctttact 15360

cgggagactt atacgaaatt accaggatag ttcgagacct gaaagccaac cacataattt 15420

ttgacttaca ccggaactta tttatggata acctatccag atctgaccgg tctctcatcc 15480

tgacgacaat cccaaaaagg aattggctct ttcaacttga gaccaaagag ataaaagagt 15540

ggttcaaact gttggggtat agtgcactga ttagaaacca ctgacgggtt ggtctggttc 15600

ctaaccctct gctattcatt gttattaaat ttaattttac gaaaaaaaac aacgattatt 15660

aataagttat catacccagc tttgtctggt 15690

<210> 3

<211> 94

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gcggccgccg tacggtttaa acgttaatta agcacggtcc gacctgggca tccgaaggag 60

gacgcacgtc cactcggatg gctaagggag ggcg 94

<210> 4

<211> 1572

<212> DNA

<213> Canine Distemper Virus

<400> 4

atggctagcc ttctcaagag cctcacattg ttcaagagga ctcgggacca acccccactt 60

gcctcgggct ccggaggagc aataagaggg ataaagcatg tcattatagt cctaatcccg 120

ggtgattcaa gcattgttac aaggtctcga ctactggata gacttgttag attggtcggt 180

gatccggaaa tcaacggacc taaattaact gggattttaa tcagtatcct ctccttgttc 240

gtggaatccc ctggacagtt gatccagagg atcatagacg accctgatgt aagcatcaag 300

ttagtagagg taatcccaag catcaactct ggttgtggtc ttacatttgc atccagagga 360

gcaagtttgg attctgaggc agatgagttc ttcaaaattg tagacgaagg gtcgaaagct 420

caaggacaat taggctggtt ggagaataag gatattgtag acatagaagt tgatgatgct 480

gagcaattca atatattgct agcttccatc ttggcccaaa tttggatcct gctcgctaaa 540

gcagtgactg ctcctgatac tgcagccgac tcggaaatga ggaggtggat taagtatacc 600

caacagagac gtgtggtcgg ggaatttaga atgaacaaaa tctggcttga tattgttaga 660

aacaggattg ctgaggacct atctttgagg cgattcatgg tggcactcat cttggacatc 720

aaacgatccc cagggaacaa gcctagaatt gctgaaatga tttgtgatat agataactac 780

attgtggaag ctggattagc tagtttcatc ttaactatca aatttggcat tgaaactatg 840

tatccggctc ttgggttgca tgagttttcc ggagagttaa caactattga atcccttatg 900

atgctatatc aacagatggg tgaaacagca ccgtacatgg ttattctgga aaattctgtt 960

cagaacaaat ttagtgcagg atcctaccca ctgctctgga gttatgctat gggagttggt 1020

gttgaacttg aaaactccat gggagggtta aatttcggta gatcctactt tgatccggcc 1080

tatttcaggc tcgggcaaga aatggtgaga agatctgccg gcaaagtaag ctctgcactt 1140

gccgccgagc ttggcatcac caaggaagag gctcagctag tgtcagaaat agcatccaag 1200

acaacggagg accggacgat tcgcactgct ggtcccaagc aatctcaaat cacttttctg 1260

cactcagaaa gatccgaagt caccaatcaa caacccccaa ccatcaacaa gaggtccgaa 1320

aaccaaggag gagacaaata ccccatccac gtcaatgatg aacggtttcc agggtacacc 1380

cctgatgtca acagctccga atggagtgaa tcacgctatg atacccagac tattcaagat 1440

gatggaaacg acgatgaccg gaaatcgatg gaagcaatcg ccaagatgag aatgcttact 1500

aagatgctca gtcaacctgg gaccagtgaa gagagttctc ctgtctataa tgatagagag 1560

ctactcaatt aa 1572

<210> 5

<211> 1524

<212> DNA

<213> Canine Distemper Virus

<400> 5

atggcagaag agcaggccta tcatgtcaat aaagggctgg aatgcctcaa agccctcaga 60

gagaatcctc ctgacattga ggagattcaa gaggtcagca gtatcagaga tcaaacccgc 120

gacccaggcc aagagaatgg aaccgcaagc atgcaggaag aagaggtctc tcaggatctc 180

gatgaatcac acgagccagc aaaaggatca aactatgtcg gccatgtact ccaaaataat 240

ccgggatgtg gagagagcaa cactgcgctt gtggaggaag agcagcccgc taaagatgat 300

gtccaaccag gacctgaaat acgatgttat catgtttatg atcacagtgg tgaagaggtt 360

aagggaatcg aagatgctga cagtctcgtg gtacctgcag gcgctgtcag taatcgagga 420

ttcgagagag gagaaggaag ccttgatgat agcactgagg attctggcga agattattcc 480

gagggaaatg cttcatctaa ctggggatat tctttcggcc ttaaaccaga cagagcggct 540

gatgtgagca tgctgatgga agaggaattg agtactctgc tcaagacaag cagaaatgtg 600

gggattaaga aaagggatgg gatgactctg cagttcccac acagtcccga aggtaagaca 660

gaggatccgg agtgtggatc cattaaaaag ggcacaggag agaggtcagc ctcacatgga 720

atggggatag ttgctggatc gacaagtggt gcaacccaat ctgcactcaa gtcaactggg 780

ggatcatcag ggccaagtgt gtctgcggag aatgtccgcc aacctgcaat gaatgcaaag 840

atgacccaga aatgcaaacc cgagtctggt acgcaactcc ctgccaggac ctcaaatgag 900

gctgaatctg acagtgagta tgacgatgag cttttttctg aaatacaaga aattcgatct 960

gctatcacta agctaatgga agataatcaa gcaatacttt ctaaactgga taccctatta 1020

ctgcttaaag gagagactga ttcaattaag aaacaaatta gcaagcaaaa tattgctatt 1080

tccacgattg aggggcatct atcaagcatt atgatagcta tacctggttt tgggaaggac 1140

actggagacc ctacggcaaa tgtcgacatt aacccagagc tccgccctat aatagggagg 1200

gattcaggaa gagcactggc ggaagttctc aagcaacccg catcatcccg cggtaatcgg 1260

aaggacagtg gtatcgcctt gggttcaaaa ggtcaactat tgagagacct ccagctgaaa 1320

cctattgaca aagagtctag ttcggcaatc ggatacaaac cgaaggatac cgcaccttcc 1380

aaagctgtac ttgcatcatt gattagatca agcaaaattg atcaaagtca caaacacaac 1440

atgctggccc ttctcaaaaa tattaagggg gatgacaatc taaacgagtt ctaccagatg 1500

atcaagagta tcacacatgc ttaa 1524

<210> 6

<211> 6555

<212> DNA

<213> Canine Distemper Virus

<400> 6

atggactctg tttcagtgaa ccagatttta taccctgagg tccatctaga tagcccaatt 60

gtgaccaata agctagtggc tattttagag tatgcacgaa ttagacataa ctatcgactc 120

cttgacacaa cgttagtgcg taatatcaaa gagagaattt cagaagggtt atcaaaccag 180

atgatcatta actgtatcga aattgggagc attgttaatc agaccttgtt atcttatccc 240

aaacacaacc atgtgatata tccaaattgc aacaaacttc tgtttcatgc acaggatcga 300

gtcatctctc tgaggttgag aaatatattc aaaagaggaa atagcatcta tagtaaaata 360

acagacgggg tcaaaaaatg cttaaacgat attaatctta gtattggttt aggaggtgca 420

ttggataaga ctattggggc caaagttgat gaagcaggca taattatgca aagctcacag 480

tggttcgaac ctttccttct gtggtttaca attaagacag aaatgagatc agtgattaaa 540

tcctctactc acaactgtcg caaacgaagg cagaatcctg tctttgtaag aggtgaatca 600

tttaatgtgt tagtgtctcg ggatcttgta tgtatcattg acctcaccag tcacaatgtt 660

tattacctaa catttgaaat ggtcctgatg tattgtgatg tgatagaagg gagattaatg 720

actgataccg ctatggcaat tgatcaccgt tactcaactt tgcatgtcag aatcaggtat 780

ctttgggatc taattgatgg atttttcccg gacttaggaa attcgaccta tcaactggta 840

gctctgctgg agcctctttc attggcttac ttgcaattaa aagacatcac cttctctctc 900

aggggtgctt ttttgagtca ctgctttgct gaaatccagg agattttaca ggacaatggc 960

ttctatactg aagagacatt ccaaacctta acccaggctc tagactttgt tttcatcaca 1020

gaggatatac atataacagg agagatcttt tcctttttta ggagtttcgg tcacccaaga 1080

ttagaagcaa taacagcagc agaaaatgta cggaaacaca tgaatcaacc caaagttgtc 1140

tcctatgaga ccatgatgaa gggacacgct attttctgtg ggataatcat taacggttat 1200

cgggatagac atggaggaac ttggcctcca atggatcttc ctgtccatgc atctcctatc 1260

atcaggaatg ctcatgcctc aggagaggga atcacctata gtcaatgtat agaaaattgg 1320

aaatcctttg caggaattcg atttaaatgc tttatgcccc tctgcctaga cagtgatctg 1380

accatgtatt tgaaagataa ggctttagca gcccttaaaa aagagtggga ttcagtgtac 1440

ccaaaagaat tcctcaggta caacccacct cgctccactg aatctcggag acttgttaat 1500

gtgtttctag aggactctca gtttgaccct tataatatga ttatgtacgt tatctcagga 1560

caatatctag acgatcctga cttcaaccta tcatacagtc ttaaagagaa agagattaaa 1620

gaagtgggga ggttattcgc taaaatgaca tacaaaatgc gggcctgtca agtcatagca 1680

gaaaacttaa tatctaatgg aattgggaag tacttcaagg acaatgggat ggcaaaggat 1740

gaacacgatc tcactaaagc attgcacact ctggctgtgt ccggggttcc taaagacaag 1800

aaagactccc atcgcggcct cactaaccag tgtaagtcta aaaaactgac accttatcga 1860

ggagcccttc actccgtctc ttctccaagt agtagatata tggacccaaa cccaaatttt 1920

tgcaccagta gaagagaaga caatgacata gagatctatg agaccgtaag tgcatttata 1980

actacagatc tcaaaaagta ctgtctgaat tggcgatatg agaccattag tatatttgct 2040

cagagattaa atgaaatcta cggtctcccc tcatttttcc aatggttgca cagaagattg 2100

gaacagtcga tcctatacgt aagtgacccc cactgccctc cagatctcga tcgccatgtg 2160

gacttgaaca cagtccctaa ctctcaaata ttcatcaaat acccaatggg aggagtagag 2220

ggatattgtc aaaagttatg gactattagc acaatacctt atctgtactt ggcagcacat 2280

gaaagcggtg tcaggattgc atcacttgtt caaggtgata accaaaccat tgctgtcact 2340

aaaagagttc caagcacctg gtcatatgcc ttgaagaagt ctgaagccag tcgagtcacc 2400

acagaatact ttatagcctt aagacagaga ttacatgatg tcggacatca tttgaaagca 2460

aatgaaacaa taatatcttc ccactttttt gtatactcaa aaggaatcta ttatgatggg 2520

atgttaattt cgcaatcctt gaaaagtata gctaggtgcg tattttggtc agaaacaata 2580

gtggatgaga cccgagccgc ctgtagcaac atttcaacaa cattggcaaa agccattgag 2640

aaagggtttg accggtattt agcctatgcg ctgaatattt taaaaatcat tcaacaagta 2700

ttaatttcat taggattcac tatcaattca gctatgacgc gggatgtgat agaacccctt 2760

ttacaagacc actgtctctt gaccaagatg gcaattcttc ctgcacccat aggtggtctt 2820

aattacctca atatgagtag gctttttgtc aggaacatcg gggatcccgt gacatcttct 2880

attgctgacc tcaaacgaat gatccgatca ggccttctcg gagtagagat tttacatcaa 2940

gtcatgaccc aatacccagg tgactcttcg tacttagatt gggcaagtga cccttattct 3000

gctaatctgc cctgtgtcca gagcataacc cgactcctta aaaatattac ggccaggcat 3060

gtccttatca acagtccaaa tcccatgctg aaaggattgt tccatgatga aagtcaggat 3120

gaggatgaag ctttagctgc tttcttgatg gatagaaaaa ttattatccc aagagctgca 3180

catgaaattc tagataacac gatcactggt gcgagggagg caattgctgg aatgctagat 3240

accacaaagg ggttgataag agcaagcatg aaaagaggag ggctaacccc tagaataata 3300

aaccgtttgt caacttatga ttatgagcaa tttagggcag gtatcagact attgtcaggg 3360

aagggacatg acccactcat cgatcaagac tcatgctctg tccagttagc gagagcatta 3420

aggaaccaca tgtgggctaa gttggcgaag ggtcgtccta tttatggtct agaagtcccg 3480

gacatccttg aatcaatgaa gggctatatg ataagaagac atgagtcttg tttgctttgc 3540

gcatcaggct ctcataacta tggttggttt tttgtaccgg caaattgtca attagatagt 3600

attacagagg gaacatctgc actgagggta ccatacattg ggtccacaac agaagaaaga 3660

acagacatga aattagcatt cgtcaaatct cctagtaggt ctctaaaatc agcagtgaga 3720

atagcaactg tgtactcatg ggcctatggt gatgatgacg aatcttggca agaggcttgg 3780

actttggcaa aacagagagc gaacatctca cttgaagaat tacggatgat taccccaatt 3840

tctacctcta ctaatctagc tcaccggctc agggacaaga gtactcaagt caaatactca 3900

gggacctctc ttatcagagt agcacgttat gcaacaatct ctaatgataa tctttctttt 3960

gtgatagctg acaagaaagt ggacacgaac tttatttatc agcaaggtat gctcctgggg 4020

ttggggattc tcgagcactt gtttagactg tcttcaacca ccggcgacac caacaccgta 4080

ctgcatttac atgttgaaac agattgttgc gtaataccca tgagcgacca tccaagggtc 4140

ccagggctca gaaaggtcgt tataccaaga aatatttgta caaatccttt gatctatgac 4200

agtaacccta ttattgagaa agatgcagtc aggctttata accagagtca caggaagcac 4260

attgtagagt ttgtcacatg gacaacaggg cagctttatc atgtactagc taaatctact 4320

gctatgtcta tggttgagat gattacaaag tttgaaaaag accacctaaa tgaagtctcc 4380

gcgttaattg gcgatgacga tatcaatagc tttatcactg agtttcttct cgttgagccc 4440

aggttattta ctgtgtatct aggtcaatgt gctgcaatca actggggctt tgaaattcat 4500

tatcaccgac cttctggaaa gtatcaaatg ggtgaattgt tgttttcttt cttgagtaga 4560

atgagtaaag gagtcttcaa aattttaacc aatgcattga gtcatcccaa agtatataga 4620

cgattttggg acagtgggat gattgaacct gtacacggac cctctcttga ctcccagaac 4680

ctacacataa ctgtatgcaa cctgatctat aactgttaca tgatttacct agaccttctg 4740

ttaaatgatg agttagatga tttctcattc attttatgcg aaagtgatga ggatatcata 4800

cctgaaagat ttgacaacat acaagctagg cacctatgca tcctgtctga cctttattgt 4860

aaccctcgtg attgtcccca gattcgtggg ttgacaccaa cacagaaatg tgctgtgtta 4920

tcgaggtact taaaatcaaa agctctagag tcccatgttg gtctgacatg gaatgacaaa 4980

cctatcctga tagatcagta ttcatgttcc ctgacatatc tgagaagagg ctcaatcaag 5040

cagataagat tgagagtgga ccccgggttc atcactgatg ctgttggatg cttagaaaag 5100

cgacctctga ggaaaagtcc tatctctaac gcctcagaat taaaatcaga atttgaccca 5160

ccgaaagatg acctggttaa actcctgagt cagctatcaa caaggacaca caacttacct 5220

attacaggat taggagtccg aaactatgag gttcactcat tcagaagaat tgggatcaat 5280

tcaacggcat gttacaaggc agttgaaata gtctctgtta ttaagaacga attcacgtct 5340

gaagaacatg gattattcct aggagagggt tcaggtgcaa tgctgacagt atataaagag 5400

ctattgaggt tgtcaagatg ttattataac agtggtgtgt cagcagaggc tagaactgga 5460

caacgagaga tttcacctta cccttctgag gtcagccttg tggaacatca attaggactc 5520

gataaattgg tgactgtgct tttcaatggg agaccagagg taacttgggt tgggagtgtt 5580

gattgttaca agtacatact aagtcagata tctgctagca gtcttggatt gattcactcg 5640

gatatcgagt cactacctga taaagacata attgaaaaat tggaagaact gtctgccata 5700

ttatcgatga ctttgatatt agggaaggta gggtcagtgt tagtaatcaa gatcatgccc 5760

gctagtggcg actgggttca aggatttatt ctgtatgcac tcccacattt tcttcgaagt 5820

tacataattt acccaagata cagcaatttt gtgtcaacag aggcctacct cgttttcact 5880

ggtcttagag cagggagact agtcaatccg gaggggatta aacaacagat tttgcgagtc 5940

ggtattcgaa cttcacccgg attggtaggg cacatccttt catcaaagca gacagcatgt 6000

gtgcaatctt tgcatggacc tccatttcaa gctaaatctt ttaatcctta cctccagggt 6060

ttaacaagta ttgagaagat tttgatcaat tgtgggctta caattaacgg tcttaaagta 6120

tgcaaaaacc tgcttcacca tgatatctcg tcaggcgagg aagggctgaa aggatctatc 6180

acaatccttt atagggaact cgcacggttc aaggataacc accaattttc acatggaatg 6240

ttccatgcat acccagtttt aatcgcaagt caggaaaggg agctcgtatc caccattgca 6300

aggaagtatt gtggttatat tttgctttac tcgggagact tatacgaaat taccaggata 6360

gttcgagacc tgaaagccaa ccacataatt tttgacttac accggaactt atttatggat 6420

aacctatcca gatctgaccg gtctctcatc ctgacgacaa tcccaaaaag gaattggctc 6480

tttcaacttg agaccaaaga gataaaagag tggttcaaac tgttggggta tagtgcactg 6540

attagaaacc actga 6555

Claims (10)

1.狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆，其特征在于，所述的感染性cDNA克隆是通过反向遗传操作获得的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆；所述感染性cDNA克隆的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种获得权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取HBF-1病毒悬液的总RNA；

(2)对获得的RNA进行反转录，获得cDNA。

(3)利用四对引物F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，以HBF-1基因组RNA的反转录产物cDNA为模板，用高保真DNA聚合酶将HBF-1分4段进行扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，大小正确后进行凝胶回收；

F1 5’-GCGGCCGCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAGACAAAGTTGGCTAAG-3’

R1 5’-GCGTACGTGAAAGCAGTTTTGAGCCT-3’

F2 5’-CTGCTTTCACGTACGCTTAAAAGCAATTATAAAAAACTTAGG-3’

R2 5’-GTTTAAACGCTTTTGAAGGAAATTAGGCGGGACT-3’

F3 5’-TTCCTTCAAAAGCGTTTAAACTGCAACAAATAGTGGCG-3’

R3 5’-GGATTAATTAACACGGTCATCATCCCTCAGTTCAATTGA-3’

F4 5’-GGGATGATGACCGTGTTAATTAATCCCTTACCGATGATTGAATT-3’R4 5’-CGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAGACAAAGCTGGGTATGATAAC-3’

(4)真核表达载体pcDNA3.1的改造

对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2；

(5)将F1、F2、F3、F4片段分别连接至pEASY-Blunt，测序，将测序正确的各基因片段分别依次连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的质粒。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)获得的cDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，步骤(4)中带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆在拯救重组狐源犬瘟热病毒强毒rHBF-1株中的应用。

5.一种狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，其特征在于，所述的操作系统由含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒组成。

6.如权利要求5所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，其特征在于，编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别如SEQID NO.4-6所示。

7.如权利要求5所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统，其特征在于，所述的含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒通过以下方法制备得到：

(1)真核表达载体pcDNA3.1的改造

对真核表达载体pcDNA3.1的多克隆酶切位点进行改造，将制备的带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列连接到通过PmeⅠ酶切过后的pcDNA3.1载体上，将改造后的载体命名为pcDNA3.2；带有NotⅠ、BsiwⅠ、PmeⅠ、PacⅠ、CpoⅠ酶切位点、部分丁型肝炎核酶的序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)将权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆连接到改造后的载体pcDNA3.2的CMV启动子下游，获得含CDV HBF-1株全基因组的重组质粒；

所述的表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒是通过将编码所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的核苷酸序列分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1的CMV启动子下游，获得分别表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N、P、L蛋白的三个辅助质粒。

8.权利要求5-7任一项所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的反向遗传操作系统在拯救狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株以及对狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株进行反向遗传学研究中的应用。

9.一种拯救狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒转染BSR细胞中，优选的，含有权利要求1所述的狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1株的感染性cDNA克隆的重组质粒和表达狐源犬瘟热病毒强毒HBF-1N蛋白、P蛋白和L蛋白的三个辅助质粒按照5μg、1μg、0.8μg、0.5μg的比例进行转染；转染72h后，取细胞悬液，添加至Vero-dSlam细胞上，37℃5％CO₂培养5-10天，观察CDV引起的典型合胞体病变(CPE)，待出现CPE后，收集细胞及上清，并在Vero-dSlam细胞中继续传代，培养6-7d，收获病毒，获得拯救的重组病毒，命名为rHBF-1。

10.一种重组狐源犬瘟热病毒强毒rHBF-1株，其特征在于，由权利要求9所述的方法拯救获得。

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