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CN113024670A - Ctla-4抗体及其制备方法 - Google Patents

Ctla-4抗体及其制备方法 Download PDF

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CN113024670A
CN113024670A CN201911363904.XA CN201911363904A CN113024670A CN 113024670 A CN113024670 A CN 113024670A CN 201911363904 A CN201911363904 A CN 201911363904A CN 113024670 A CN113024670 A CN 113024670A
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苏紫琪
秦超
俞金泉
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Bio Thera Solutions Ltd
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Abstract

本文公开了CTLA‑4单克隆抗体以及该抗体的制备和用途，本发明CTLA‑4抗体具有毒性更低和活性更佳的优点；另外，本发明CTLA‑4抗体还具有低含量的高甘露糖糖型和/或低含量的唾液酸化糖型，有助于延长抗体的半衰期和/或降低免疫原性。

Description

CTLA-4抗体及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种CTLA-4单克隆抗体，其制备及应用。
背景技术
免疫系统是防止癌症发展和进展(progression)的重要防御手段。免疫疗法，如IL-2和自体肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移，可以诱导患者亚组持续的肿瘤反应，从而使得预后不良的患者获得长期存活(Atkins MB，et al.(1999)，J Clin Oncol.17(7)：2105-2116)。随着对于抗肿瘤免疫的启动和效应阶段的重要性的进一步理解，基于检查点阻断的治疗方法最近开始为患者提供持久的益处，并似乎适用于广泛的恶性肿瘤。
免疫系统受到严格的调节，以响应适当的抗原，而不会对自身产生反应(Bretscher P，Cohn M.(1970)，Science.169(3950)：1042-1049)。T细胞是免疫反应的关键介质之一，需要共刺激才能激活，并且可以通过抑制信号使其失活(Sharpe AH，Abbas AK.(2006)，N Engl J Med.355(10)：973-975)。细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)就是这样一种影响T细胞功能的关键抑制性受体，在免疫应答的启动阶段发挥关键作用(ScalapinoKJ1，Daikh DI.(2008)，Immunol Rev.223：143-155)。当抗原被MHC-I类或II类抗原提呈细胞运输到T细胞受体(TCR)时，TCR上的信号就会放大，并被共刺激分子抵消。T细胞上的CD28与抗原提呈细胞上的B7-1(CD80)和B7-2(CD86)结合后，会发出一种需要T细胞全激活的信号。这种CD28/B7的结合导致白介素2及其他刺激性的细胞因子产生的增加，提高代谢，促进细胞周期进程，上调细胞存活基因，最终使T细胞得到增殖和分化。当CD28结合并引起T细胞增殖后，CTLA-4被运送并表达在T细胞表面(Linsley PS，et al.(1996)，Immunity.4(6)：535-543)。通过TCR的激活信号越强烈，就越多CTLA-4运送并表达。当在细胞表面上时，CTLA-4的抑制信号就被传播(Egen JG，Allison JP(2002)，Immunity.16(1)：23-25)。与CD28相比，CTLA-4与B7有更高的亲和力，并能阻碍更进一步的共激活(Krummel MF，AllisonJP(1995)，J Exp Med.182(2)：458-465)。并且，CTLA-4表达的细胞能通过内吞作用捕获和降解B7-1和B7-2(Qureshi OS，et a1.(2011)，Science.332(6029)：600-603)。
除了CTLA-4，目前已经报道了其他一些可以调节T细胞应答的刺激性或抑制性的受体和配体。刺激性受体包括诱导性T细胞共刺激子(ICOS)(Tremble LF，et a1.(2018)，Cancer Lett.420：109-115)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)(Schaer DA，et al.(2013)，Cancer Immunol Res.1(5)：320-331)、CD27(Buchan SL，et al.(2018)，Blood.131(1)：39-48)、4-1BB(Eun SY，et al.(2015)，J Immunol.194(1)：134-141)、CD40(RichmanLP，Vonderheide RH.(2014)，Cancer Immunol Res.2(1)：19-26)、DNAX配件分子-1(DNAM-1)(Kearney CJ，et al.(2016)，Oncoimmunology.5(8)：e1196308)，抑制性受体包括细胞程序性死亡受体-1(PD-1)(Dong H，et al.(1999)，Nat Med.5(12)：1365-1369)、淋巴细胞激活基因-3(LAG-3)(Di CE，et al.(2005)，J Pathol.205：82-91)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM3)(Sáánchez-Fueyo A，et al.(2003)，Nat Immunol.4(11)：1093-1101)、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)(Lines JL，et al.(2014)，Cancer Res.74(7)：1924-1932)、CD47(Liu X，et al.(2015)，Nat Med.21(10)：1209-1215)、吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)(Friberg M，et al.(2002)，Cancer.101：151-155)、CD94/NKG2A(Muntasell A，etal.(2017)，Curr Opin Immunol.45：73-81)、杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)(Tu MM，etal.(2016)，Front Immunol.7：116)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)(JohnstonRJ，et al.(2014)，Cancer Cell.26：923-937)。这些刺激性的受体和配体，即目前研究领域热论的“免疫检查点”，在免疫系统的自我调节中起到至关重要的作用，使免疫系统的功能保持在正常范围内而不至于过度活化。在癌症机体中，利用激动剂靶向刺激性受体或利用抑制剂阻断抑制性受体，就能调节免疫应答，使免疫系统识别和攻击肿瘤细胞，达到治疗的效果。对于上述免疫检查点，目前有一部分已开发出临床中或上市的治疗性药物(Elad S，et al.(2014)，Chin J Cancer.33(9)：434-444)，其中CTLA-4阻断剂就是第一个应用于临床癌症治疗的单克隆抗体药物。
目前较为人所知的CTLA-4单克隆抗体是百时美施贵宝公司的伊匹单抗(Ipilimumab，
Figure BDA0002335952660000031
)，以及阿斯利康公司尚处于临床阶段的曲美母单抗(Tremelimumab)。它们的机理都是通过阻断CTLA-4与B7的结合，解放B7蛋白使其能跟CD28结合，从而增强T细胞的增殖反应。在临床前几种已建立的小鼠模型中阻断CTLA-4/B7相互作用，已经显示出对可移植肿瘤的排斥，包括结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤和肾癌(KormanAJ，et al.(2006)，Adv Immunol.90：297-339)。然而，这种作用机制推广到人体上，仅对一小部分治疗患者提供了有限的临床益处。因此，人们认为应该存在与宿主依赖因子相关的未知机制(Romano E，et a1.(2015)，Proc Natl Acad Sci USA.112(19)：6140-6145)。
发明内容
基于此，有必要提供一种毒性更低、活性更佳的新型CTLA-4单克隆抗体药物。本发明的上述目的通过以下技术手段实现：
本发明提供一种低含量的高甘露糖糖型和/或低含量的唾液酸化糖型的抗CTLA-4抗体，有助于延长抗体的半衰期和/或降低免疫原性。在一些实施方案中，所述抗体为ADCC增强的抗CTLA-4抗体，用于靶向病患细胞或组织，增大药物的抗肿瘤效果。
具体地，一方面，本发明提供了针对CTLA-4的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含
(1)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：12所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
重链CDR2，其包含SEQ ID NO：13所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
重链CDR3，其包含SEQ ID NO：14所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：15所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：17所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
或
(2)重链可变区，其包含SEQ ID NO：18所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：19所示的序列，与所述序列具有至少80％，优选至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个(优选1个、2个或3个)保守氨基酸突变(优选置换，插入或缺失)的氨基酸序列，或由其组成；
所述单克隆抗体具有降低的岩藻糖基化水平。
在具体的实施方案中，所述单克隆抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％，优选至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，或由其组成；
所述轻链包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％，优选至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，或由其组成。
在具体的实施方案中，所述重链由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ IDNO：3的核苷酸序列具有至少80％，优选至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列编码，所述轻链由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少80％，优选至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列编码。
在具体的实施方案中，所述岩藻糖基化水平为0％-20％，比如0％，1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％或20％，或在其中任意两个数值之间的范围内(包括终点数值)。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的高甘露糖糖型总量＜5％和/或唾液酸化糖型总量＜3％。在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的高甘露糖糖型总量为约0.1％、约0.3％、约0.9％、约1.18％、约1.7％、约2.6％、约3.3％、约4.1％、约4.9％、约4.99％，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。在一些实施方案中，所述抗单克隆抗体Fc区的唾液酸化糖型总量为约0.1％、0.2％、约0.36％、约0.8％、约1.5％、约2.2％、约2.7％、约2.9％、2.99％，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体为IgG1，所述单克隆抗体CH2区的高甘露糖糖型总量＜5％和/或唾液酸化糖型总量＜3％。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的高甘露糖糖型总量＜3％和/或唾液酸化糖型总量＜2％。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为IgG1，所述单克隆抗体CH2区的高甘露糖糖型总量＜3％和/或唾液酸化糖型总量＜2％。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的高甘露糖糖型总量＜2％和/或唾液酸化糖型总量＜1％。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为IgG1，所述单克隆抗体CH2区的高甘露糖糖型总量＜2％和/或唾液酸化糖型总量＜1％。在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的岩藻糖基化水平为0％-10％。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为IgG1，所述单克隆抗体CH2区的岩藻糖基化水平为0％-10％。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体Fc区的岩藻糖基化水平为0％-5％。在一些实施方案中，所述抗单克隆抗体Fc区的岩藻糖基化含量为约0、约0.1％、约0.3％、约0.4％、约0.6％、约1.3％、约1.9％、约2.2％、约2.8％、约3.3％、约3.7％、约4.1％、约4.5％、约5％，或任何两个数值之间的范围(包括终点值)。在一些实施方案中，所述单克隆抗体为IgG1，所述单克隆抗体CH2区的岩藻糖基化水平为0％-5％。在一些实施方案中，所述糖化水平是通过以下方式实现的：
(1)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在敲降或敲除FUT8基因的CHO宿主细胞中表达，所述单克隆抗体的高甘露糖糖型和唾液酸化糖型含量相比于在正常CHO宿主细胞中表达的单克隆抗体的含量低；
(2)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在敲降GDP-岩藻糖4，6-脱水酶(GMD)的CHO-DG44细胞中表达，所述单克隆抗体的高甘露糖糖型和唾液酸化糖型含量相比于在正常CHO-DG44宿主细胞中表达的单克隆抗体的含量低；或
(3)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在CHO细胞中表达，然后用糖基转移酶抑制剂如2F-过乙酰基-岩藻糖去岩藻糖基化，所述单克隆抗体的高甘露糖糖型和唾液酸化糖型含量相比于未用糖基转移酶抑制剂如2F-过乙酰基-岩藻糖去岩藻糖基化的单克隆抗体的含量低。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体由保藏编号：CCTCC NO：C2017127的CHO-BAT-KF细胞表达。
另一方面，本发明提供了药物组合物或融合蛋白，其包含本发明所述的单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述药物组合物为适于通过口服、注射、输液、肠外、静脉、黏膜、舌下、肌肉、皮内、鼻腔、腹腔、动脉内、皮下吸收给药的形式。在一些实施方案中，所述药物组合物为适于全身给药的形式。
另一方面，本发明提供了抗体偶联物，其包括本发明所述的单克隆抗体，以及与所述单克隆抗体偶联的偶联部分，所述偶联部分为纯化标签(如His标签)、细胞毒性剂，延长所述单克隆抗体半衰期的结构部分，或可检测的标记，优选地，所述偶联部分为放射性同位素、化学发光剂、酶、血清白蛋白(例如人或鼠血清白蛋白)、或聚乙二醇。
在一些实施方案中，本发明抗CTLA-4抗体为单价抗体或多价抗体。在另一方面，本发明提供了多特异性抗体(例如双特异性抗体)，其包含本发明所述的单克隆抗体，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
在又一个方面，本发明提供了试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体，抗体偶联物、多特异性抗体或融合蛋白。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，细胞毒性剂，化疗剂，放疗剂，所述第二抗体特异性识别所述单克隆抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如荧光素、金属离子、生物素、放射性同位素、化学发光物质、酶或聚乙二醇。
在又一个方面，本发明提供了所述的单克隆抗体，融合蛋白，抗体偶联物或多特异性抗体，其用于治疗癌症或用于排斥可移植的肿瘤，例如黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤或肾癌。
在又一个方面，本发明提供了制备具有提高ADCC活性的单克隆抗体的方法，包含：
(1)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在敲降或敲除FUT8基因的CHO宿主细胞(例如保藏编号：CCTCC NO：C2017127的CHO-BAT-KF细胞)中表达；
(2)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在敲降GDP-岩藻糖4，6-脱水酶(GMD)的CHO-DG44细胞中表达；或
(3)将包含SEQ ID NO：12的重链CDR1，SEQ ID NO：13的重链CDR2，SEQ ID NO：14的重链CDR3，SEQ ID NO：15的轻链CDR1，SEQ ID NO：16的轻链CDR2和SEQ ID NO：17的轻链CDR3的单克隆抗体在CHO细胞中表达，然后用糖基转移酶抑制剂(如2F-过乙酰基-岩藻糖)去岩藻糖化。
在又一个方面，本发明提供了治疗癌症或用于排斥可移植的肿瘤，例如黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤或肾癌的方法，包括给患者给予有效量的所述的单克隆抗体，融合蛋白，抗体偶联物或多特异性抗体。
在又一个方面，本发明提供了增强T细胞的增殖反应的方法，其包含利用本发明所述的单克隆抗体，融合蛋白，抗体偶联物或多特异性抗体阻断CTLA-4与B7的结合。
在又一个方面，本发明提供了降低患者体内肿瘤浸润表达CTLA-4的Treg细胞的方法，包括给患者给予治疗有效量的所述的单克隆抗体，融合蛋白，抗体偶联物或多特异性抗体。
在又一个方面，本发明提供了所述的单克隆抗体，融合蛋白，抗体偶联物或多特异性抗体在制备用于治疗癌症或用于排斥可移植的肿瘤，例如黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤或肾癌的药物中的应用。
附图说明
图1显示了抗体2与抗体1糖型的对比图；其中三角形代表岩藻糖，抗体2中基本不含岩藻糖。
图2显示了抗体2、抗体1与CTLA-4抗原的ELISA结合曲线。
图3显示了
Figure BDA0002335952660000091
抗体2、抗体1与CTLA-4抗原在Biacore上的结合曲线。
图4显示了抗CTLA-4抗体的体外生物学活性模型示意图；图中promotor表示为启动子，luciferase表示为荧光素酶。
图5显示了pCMV2-OKT3的质粒图谱。
图6显示了抗体2、抗体1均在活性模型上表现出增强T细胞功能的活性作用；图中sample表示为抗体样品。
图7显示了抗体2、抗体1与FcγRIIIa 158V的结合解离传感曲线。
图8显示了pCDH-FcγRIIIa 158V FL-Puro的质粒图谱。
图9显示了抗体2在ADCC报告基因模型上比抗体1有更高的体外ADCC活性。
图10A和图10B分别显示了抗体2、抗体1在CTLA-4人源化MC38荷瘤小鼠上给药后小鼠体重变化趋势图和抑制肿瘤效果；图中箭头代表各次给药时间。
图11A、图11B、图11C、图11D分别显示了在CTLA-4人源化MC38荷瘤小鼠上，
Figure BDA0002335952660000092
抗体1、抗体2给药后外周血单个核细胞中的CD4+、CD8+、Treg细胞占CD45细胞的比例以及CD8+/Treg的比值。
保藏信息
CHO-BAT-KF细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为：2017年8月10日，保藏编号：CCTCC NO：C2017127，分类命名为：中国仓鼠卵巢细胞CHO-BAT-KF fut8(-/-)。专利CN201910469740.2已公开上述保藏信息。
术语
除非另作说明，否则下列的每一个术语应当具有下文所述的含义。
“抗体”(Ab)，应包括但不限于免疫球蛋白，是主要由浆细胞产生的大的“Y”形蛋白，其被免疫系统用于中和病原体如病原细菌和病毒。抗体通过Fab的可变区识别病原体上的一种称为“抗原”的独特分子。抗体的“Y”结构的每个尖端含有对抗原上一个特定表位的互补位，允许这两个结构精确地结合在一起。使用这种结合机制，抗体可以标记微生物或受感染的细胞，使免疫系统对其进行攻击，或者可以直接中和目标。抗体与免疫系统的其他组分通信的能力是通过其Fc区介导的，Fc区包含参与这些相互作用的保守糖基化位点。抗体的产生是体液免疫系统的主要功能。
抗体可以有不同的种类，称为同种型或类别。在胎盘哺乳动物中，有五种抗体同种型，称为IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。它们各自以“Ig”前缀命名，代表免疫球蛋白(有时可与“抗体”互换使用)，其生物学特性、功能位置和处理不同抗原的能力不同。抗体同种型的不同后缀表示抗体含有的不同类型的重链，每个重链类别按字母顺序命名：α、γ、δ、ε、和μ，分别对应产生IgA，IgG，IgD，IgE和IgM。而在哺乳动物中有两种类型的免疫球蛋白轻链，称为λ(λ)和κ(κ)。一般来说，每种抗体含有两条相同的轻链；在哺乳动物中每种抗体仅存在一种类型的轻链κ或λ。
免疫球蛋白G(IgG)是抗体的一种。IgG是人体中大约75％的血清抗体，是血液循环中最常见的抗体类型。人体中有四种IgG亚类(IgG1、2、3和4)，按其在血清中的丰度顺序命名(IgG1是最丰富的)。
抗体的某些部分具有相同的功能。例如，“Y”的臂包含可以与抗原结合的位点以识别特定的外来物体。该抗体区域称为Fab区域。它由抗体的每条重链和轻链的一个恒定区和一个可变区组成。可变结构域也称为FV区，并且是结合抗原的最重要区域。具体而言，轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)上的各三个区域负责与抗原结合，这些区域称为互补决定区(CDR)。“Y”的基部在调节免疫细胞活性中起作用。该区域称为Fc区，由两条重链组成，根据抗体的类别，它们贡献两个或三个恒定区域。因此，Fc区通过结合特定类别的Fc受体和其他免疫分子(例如补体蛋白)确保每种抗体对给定抗原产生适当的免疫应答。通过这样，它介导不同的生理效应，包括识别调理颗粒(与FcγR结合)，细胞裂解(与补体结合)，以及肥大细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞(与FcεR结合)的脱粒。
“抗原”在免疫学中，是指与抗体或T淋巴细胞抗原受体特异性结合的物质。它们是刺激抗体产生或被抗体识别的物质。有时抗原是自身免疫性疾病中宿主自身的一部分。术语抗原最初描述的是与抗体特异性结合的结构分子。后它被扩展为指可被适应性免疫系统的高度可变抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别的任何分子或线性分子片段。
“单克隆抗体”(mAb)是由相同的免疫细胞制备的抗体，所述免疫细胞是单一亲本细胞的所有克隆。单克隆抗体可以具有单价亲和力，因为它们结合相同的表位(抗体识别的抗原部分)。相反，多克隆抗体与多个表位结合，并且通常由几种不同的浆细胞分泌。还可以通过将一种单一单克隆抗体的治疗靶标增加至两个表位来改造成双特异性单克隆抗体。单克隆抗体可以通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其他技术制造。
“人源化”抗体是指来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加它们与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”过程通常应用于为人类施用而开发的单克隆抗体(例如，作为抗癌药物开发的抗体)。当开发特异性抗体的过程涉及在非人免疫系统(例如小鼠中)中产生时，也需要进行人源化。人源化小鼠是携带功能性人类基因、细胞、组织和/或器官的小鼠。人源化小鼠通常用作人类治疗的生物学和医学研究中的小动物模型。免疫缺陷小鼠通常用作人细胞或组织的接受者，因为它们由于缺乏宿主免疫力而可以相对容易地接受异源细胞。这种人源化小鼠模型可用于在健康和病理情况下模拟人体免疫系统，并且可以在与人体生理学相关的体内环境中评估治疗候选物。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是细胞介导的免疫防御机制，其中免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，其膜表面抗原被特异性抗体结合。它是抗体作为体液免疫反应的一部分，可以通过其作用来限制和控制感染。
ADCC独立于免疫补体系统，该系统也溶解靶标但不需要任何其他细胞。ADCC需要一种效应细胞，其已知是通常与IgG抗体相互作用的天然杀伤(NK)细胞。然而，巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导ADCC，例如嗜酸性粒细胞通过IgE抗体杀死某些被称为蠕虫的寄生虫。另外，ADCC是适应性免疫应答的一部分，因为它依赖于先前的抗体应答。
“Fc区”，是抗体的尾区，其与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。该特性允许抗体激活免疫系统。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定区；IgM和IgE Fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。IgG的Fc区具有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性是必需的，且不同的糖型对治疗性抗体的药学性质有不同的影响。高甘露糖糖型会导致抗体在血液中快速清除，半衰期缩短；G0F促进补体通路作用，加快清除速率；唾液酸修饰对静脉注射免疫球蛋白的炎症作用影响明显；岩藻糖基化的降低导致ADCC活性明显增强。因此，根据治疗性抗体的主要作用机制和药物用途，设计和优化抗体的糖链是有必要的。本专利中，“Fc”或“Fc段”或“Fc结构域”的含义等同于“Fc区”。
“Fc受体”或“FcR”是在某些细胞表面发现的蛋白质，这些细胞包括B淋巴细胞，滤泡树突细胞，自然杀伤细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞，人血小板和肥大细胞等，它们都有助于保护免疫系统的功能。Fc受体的名称来源于其对抗体的Fc区域的结合特异性。Fc受体与附着于受感染细胞或入侵病原体的抗体结合。它们的活性通过吞噬细胞和细胞毒性细胞破坏微生物、或通过抗体介导的吞噬作用去感染细胞、或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性去发挥作用。一些病毒如黄病毒通过称为抗体依赖性感染增强的机制使用Fc受体来帮助它们感染细胞。
有几种不同类型的Fc受体，其基于它们识别的抗体类型进行分类。用于识别抗体类型的拉丁字母被转换为相应的希腊字母，该字母位于名称的“Fc”部分之后。例如，结合最常见类别的抗体IgG的那些称为Fc-γ受体(FcγR)，结合IgA的那些称为Fc-α受体(FcαR)，结合IgE的那些称为Fc-ε受体(FcεR)。FcR的类别还通过表达它们的细胞(巨噬细胞，粒细胞，天然杀伤细胞，T细胞和B细胞)和每种受体的信号传导特性来区分。
所有Fcγ受体(FcγR)都属于免疫球蛋白超家族，是诱导微生物吞噬作用的最重要的Fc受体。该家族包括几个成员，FcγRI(CD64)，FcγRIIA(CD32)，FcγRIIB(CD32)，FcγRIIIA(CD16a)，FcγRIIIB(CD16b)，由于它们的分子结构不同，它们的抗体亲和力不同。例如，FcγRI比FcγRII或FcγRIII更强地结合IgG。FcγRI还具有由三个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的细胞外部分，比FcγRII或FcγRIII具有更多的结构域。这种性质允许FcγRI结合唯一的IgG分子(或单体)，但所有Fcγ受体必须结合免疫复合物中的多个IgG分子才能被激活。Fc-γ受体对IgG的亲和力不同，而不同的IgG亚类对每种Fcγ受体具有独特的亲和力。这些相互作用通过IgG的位置CH2-84.4处的聚糖(寡糖)进一步调节。例如，通过产生空间位阻，含有CH2-84.4聚糖的岩藻糖降低了对FcγRIIIA的IgG亲和力。
“癌症”是指一组涉及异常细胞生长的疾病，有可能侵入或扩散到身体的其他部位。癌症与良性肿瘤形成对比，良性肿瘤不会扩散到身体的其他部位。可能的体征和症状包括肿块，异常出血，长期咳嗽，原因不明的体重减轻和排便改变。
“荷瘤小鼠”分为原发模型和移植瘤模型。研究中最常使用的是移植瘤模型，主要包括原位移植瘤和皮下移植瘤。简而言之，就是将相关的肿瘤细胞通过原位注射或者通过皮下注射入小鼠体内，使其致瘤。
“给药”指的是药物可能通过口服、注射、输液、肠外、静脉、黏膜、舌下、肌肉、皮内、鼻腔、腹腔、动脉内、皮下吸收或通过任意其他与现有技术相结合的给药方式完成。在本发明的一个实施方案中，给药是全身性的。
“有效量”指达到治疗目标所需的量。有效量与抗体对其特异抗原的结合亲和力，疾病、紊乱或病症的严重程度、给药途径、在接受给药对象中给予的抗体从自由体积耗尽的速率等有关。作为非限制性示例，本发明的抗体的治疗有效量的可以为从约0.01mg/kg到约15mg/kg患者体重，从约0.1mg/kg到约10mg/kg患者体重，或从约1mg/kg到约5mg/kg患者体重，比如约0.3mg/kg，约1mg/kg，或约3mg/kg患者体重。给药频率可以是例如每周一次到每月一次，比如每三周一次。
“患者”通常指需要诊断、预后或治疗的任何患者，特别是哺乳动物患者，包括人类、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛等。
“糖型”是蛋白质的同种型，其仅在附着的聚糖的数量或类型方面不同。糖蛋白通常由许多不同的糖形式组成，其中附着的糖或寡糖发生改变。这些修饰可能是由于糖基化过程中生物合成的差异，或者是由于糖苷酶或糖基转移酶的作用。可以通过对分离的糖型的详细化学分析或通过凝集素亲和层析和凝集素亲和电泳等来检测糖型。
“糖基化”是碳水化合物(即糖基供体)与另一分子(糖基受体)的羟基或其他官能团连接的反应。在生物学中，糖基化主要特别指将聚糖附着到蛋白质或其他有机分子上的酶促过程。这种酶促过程产生了一种在细胞中发现的基本生物聚合物(以及DNA，RNA和蛋白质)。糖基化是共翻译和翻译后修饰的一种形式。聚糖在膜和分泌蛋白中起着多种结构和功能作用。在粗面内质网中合成的大多数蛋白质经历糖基化。它是一种酶导向的位点特异性过程，与糖化的非酶促化学反应相反。糖基化也作为O-GlcNAc修饰存在于细胞质和细胞核中。常见的糖基化类型包括O-糖基化和N-糖基化。
中国仓鼠卵巢细胞CHO-BAT-KF fut8-/-)可简写为CHO-BAT-KF。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1.抗体1、抗体2制备
准备CHO-BAT(CHO-BAT细胞是CHO-K1细胞株(例如可以来自ATCC CCL-61)经培养适应悬浮生长的中国仓鼠卵巢细胞，发明专利CN109096399A已公开了CHO-BAT细胞)和CHO-BAT-KF(CHO-BAT-KF细胞是适应悬浮生长的敲除α-(1，6)-岩藻糖基转移酶的中国仓鼠卵巢细胞系，该细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2017127)细胞。通过电穿孔方法将含有编码抗CTLA-4抗体的轻链/重链的核苷酸序列的线性化后的质粒分别转染两株细胞，该抗CTLA-4抗体重链CDR1为SEQ ID NO：12，重链CDR2为SEQ ID NO：13，重链CDR3为SEQ ID NO：14，轻链CDR1为SEQ ID NO：15，轻链CDR2为SEQ ID NO：16，轻链CDR3为SEQ ID NO：17，重链可变区序列为SEQ ID NO：18，轻链可变区序列为SEQ ID NO：19，重链序列为SEQ ID NO：1，轻链序列为SEQ ID NO：2，重链的编码序列为SEQ ID NO：3，轻链的编码序列为SEQ ID NO：4。电转条件为：电压300V，1500μF，4mm电转杯，40μg线性化质粒，1000万细胞。转染CHO-BAT细胞的，命名为BAT1(其为表达本文中“抗体1”的细胞)；转染CHO-BAT-KF细胞的，命名为BAT2(其为表达本文中“抗体2”的细胞)。电转染之后分别将两种细胞重悬入含有1×GS(Specialty Media，货号：GSS1016-C)的CHO-AGT(Gibco，货号：12490025)培养基，以每孔1500个细胞的密度均匀分到40块96孔板中，每孔体积为100μL。将细胞培养板放入8％CO2，37℃培养箱培养。48小时后补加100μL CHO-AGT培养基(1×GS和50μM终浓度MSX(甲硫氨酸亚砜胺))继续培养。
提前准备好筛选阳性克隆用的ELISA板(Corning，货号：9018)。将Sigma公司的羊抗人Fc抗体(Sigma，货号：I2136)用PBS稀释至浓度为2μg/mL，每孔100μL加入ELISA板中，37℃孵育2h后，甩掉板中液体并拍干，每孔加入200μL封闭液(含有5％BSA的PBS)，37℃孵育2h后，直接放进-20℃保存备用。96孔细胞培养板中的细胞约16-20天后形成肉眼可见的细胞克隆团。BAT1共挑出1389个克隆，BAT2共挑出852个克隆。检测步骤为解冻包被好羊抗人Fc抗体的ELISA板，用PBST洗板3次，敷上稀释40倍的96孔细胞培养上清，37℃孵育2小时，用PBST洗板5次，加入1∶10000倍稀释的耦联过氧化物酶的山羊抗人Kappa轻链-二抗(Sigma，货号：A7164)，37℃孵育0.5小时，用PBST洗板7次，加入TMB单组分显色液(湖州英创生物，货号：TMB-S-001)避光显色10-15分钟，用0.1M硫酸终止反应，在450nm波长下读数，标记出表达量较高的阳性克隆。阳性克隆转移到24孔板中培养5-7天，培养上清稀释1000倍进行上述ELISA检测。表达量较高且细胞状态良好的阳性克隆转移到6孔板中培养5-7天，培养上清稀释2000倍进行上述ELISA检测。表达量较高且细胞状态良好的阳性克隆转移到125mL小摇瓶，在摇床中培养。待细胞生长状态稳定良好，活力95％以上，且细胞达到一定数量时，以30-50×105细胞/mL密度、30mL体积接种到CHO-AGT培养基中，进行12天的摇瓶培养。培养过程中在第3、6、9天分别取0.5ml培养物测细胞密度及活力，取样后分别加入3ml Feed C(CDEfficientFeed C AGT，生产商：Gibco)，其中第6、9天的培养物离心取上清冻存，取第10、11、12天的培养物测细胞密度及活力，培养物离心取上清冻存。第12天收集所有细胞上清，ProteinA纯化。从BAT1细胞纯化得到的抗体为抗体1，从BAT2细胞纯化得到的抗体为抗体2。对抗体1和抗体2进行测序，抗体和抗体2的重链序列为SEQ ID NO：1，轻链序列为SEQ IDNO：2。得到的蛋白进行各项质量分析，其中在蛋白糖型的分析上，由于抗体2在敲除了α-(1，6)-岩藻糖基转移酶的细胞系CHO-BAT-KF中表达，因此糖型与抗体1有差异(如图1)，抗体2主要糖型均为去岩藻糖基化糖型。前面所述冻存的第6、9、10、11、12天上清则进行HPLC检测蛋白表达量。
另外，测定
Figure BDA0002335952660000161
(伊匹单抗，购自百时美施贵宝公司，在本发明中，
Figure BDA0002335952660000162
也表示为_930395)、抗体1和抗体2的CH2区中糖型含量，结果是高甘露糖糖型总量＜5％，唾液酸化糖型总量＜3％；其中，一组高甘露糖糖型、唾液酸化糖型的测定结果如表1所示：
表1.部分糖型百分含量
Figure BDA0002335952660000163
影响抗体免疫原性风险的糖型有唾液酸化糖型：唾液酸化糖型含量从高到低依次是
Figure BDA0002335952660000164
抗体1、抗体2，本发明抗体2中低含量的唾液酸化糖型有利于降低免疫原性的风险；高甘露糖糖型含量从高到低依次是
Figure BDA0002335952660000165
抗体2、抗体1，本发明抗体2中低含量的高甘露糖糖型有利于延长抗体的半衰期。
实施例2.抗体2蛋白与CTLA-4抗原在体外的结合活性
把用于表达CTLA-4抗原的胞外区和人类IgG1抗体重链Fc段的序列(SEQ ID NO：6，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5)的质粒瞬时转染到293F细胞中。
293F细胞用CD 293 TGE Medium(BPM Cell Culture，货号：CM-1156)培养，待细胞活力在95％以上时，用新鲜培养基将细胞传代到80-100×105细胞/mL，24h后细胞密度大概在150-200×105细胞/mL时，可进行转染。先将质粒在65℃水浴30分钟，每100×105细胞用1μg质粒，每1μg质粒用3μL的PEI(Polysciences，货号：24765-2)。分别将质粒和PEI用培养基稀释(两个溶液的体积加起来是总体积的5％)，室温静置5分钟。然后把PEI溶液加到质粒溶液中，混匀，室温静置20分钟。将复合物溶液加入到细胞中，37℃摇床培养24小时后，加入总体积比为10％的CD Feed X Supplement(BPM Cell Culture，货号：CF-1116)到细胞中。5天后收获细胞上清，上清用ProteinA进行纯化，得到CTLA-4-ECD-Fc抗原蛋白。
CTLA-4-ECD-Fc抗原蛋白包被ELISA板，4℃过夜。第二天用5％BSA封闭液于37℃封闭2小时。洗板后分别加上从1μg/mL开始3倍梯度稀释的抗体2、抗体1蛋白，一共稀释12个浓度(最后一个为空白0浓度)，每个浓度做3个复孔，37℃孵育2小时。洗板后加入1∶10000倍稀释的耦联过氧化物酶的山羊抗人Kappa轻链二抗(Sigma，货号A7164)，37℃孵育0.5小时。洗板后加入TMB单组分显色液避光显色10-15分钟，用0.1M硫酸终止反应，在450nm波长下读数，抗体2、抗体1与CTLA-4抗原的ELISA结合曲线如图2。
同时在BIAcore(T200，GE Healthcare)上也进行了抗体2、抗体1蛋白与CTLA-4-His(义翘神州，11159-H08H)抗原在体外的结合活性检测。将待测抗体：抗体2、抗体1、
Figure BDA0002335952660000171
用HBS-EP(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％P20，pH 7.4)稀释至5μg/mL，抗原CTLA-4-His用HBS-EP稀释至100nM，并以此为起始浓度作2倍梯度稀释，得100、50、25、12.5、6.25、3.125nM的CTLA-4-His稀释液。用Protein A芯片(GE Healthcare)进行检测，5μg/ml药物稀释液以10μl/min的流速通过实验流路(Fc2、Fc4)，捕获15s使捕获量约为600RU；之后流速调为30μL/min，依次进分析物不同浓度的CTLA-4-His稀释液(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100nM)，同时经过实验流路(Fc2、Fc4)和参比流路(Fc1、Fc3)表面，结合时间180s，解离时间600s，最后进Glycine 1.5缓冲液60s对芯片进行再生并进入下一个循环。用数据分析软件Evaluation Software3.1对试验结果进行分析，将样品试验流路采集所得传感信号进行参比流路、样品空白双扣减，并选用动力学“1∶1”模型进行拟合，得出各抗体样品对CTLA-4亲和结合的动力学参数，见表2。Biacore曲线拟合见图3(其中
Figure BDA0002335952660000181
_930395为
Figure BDA0002335952660000182
Y20180901为抗体1，181110-B14-2-CEX为抗体2)。
表2.抗体2、抗体1、
Figure BDA0002335952660000183
对CTLA-4亲和结合的动力学参数
Figure BDA0002335952660000184
注：ka：结合速率；kd：解离速率；KD：结合解离平衡常数，也即亲和力。
结论：抗体2、抗体1蛋白与CTLA-4抗原的结合，在ELISA和BIAcore上均显示出相似的结合活性。说明在抗CTLA-4抗体上进行ADCC的增强并没有改变其与CTLA-4抗原的结合能力。
实施例3.抗体2和抗体1蛋白在体外的生物学活性
抗CTLA-4抗体的体外生物学活性模型示意图如图4。
构建pCMV2-OKT3(其中OKT3部分为抗体的ScFv形式，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示，OKT3的重链氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示)质粒，质粒图谱分别如图5。
通过电转的方法，把pCMV2-OKT3转染到Raji细胞中，用潮霉素加压筛选，通过与Jurkat-IL2-luciferase细胞相互混合并刺激6个小时，加入荧光素酶底物用酶标仪检测自发荧光的方法，筛选出能刺激Jurkat-IL2-luciferase细胞(Promega，JA3005)产生自发荧光的阳性单克隆，命名为Raji-OKT3细胞。
用含有1％FBS的1640培养基作为该实施例中的Buffer，把Raji-OKT3细胞与Jurkat-IL2-luciferase-CTLA4FL细胞(Promega，JA3005)分别稀释成400×105细胞/mL的密度，于96孔白板(Corning，货号：3917)每孔各加入25μL的Raji-OKT3与25μL的Jurkat-IL2-luciferase-CTLA4FL。把抗体2和抗体1用Buffer分别稀释到100μg/mL，以此为起始浓度，3倍梯度稀释，一共稀释10个浓度(最后一个为空白0浓度)。往上述已加入两种细胞的孔中，加入不同浓度的抗体溶液，每孔加入25μL，每个浓度做3个复孔。此时每孔中共有75μL的细胞抗体混合液。把白板放入37℃培养箱孵育6个小时后，取出白板，于室温放置10分钟。每孔加入75μL已平衡至室温的萤火虫荧光素酶底物(Promega)，将白板放入酶标仪，震荡5s，10分钟后读取荧光值。结果见图6。
结论：抗体2、抗体1在活性模型上均表现出相似的增强T细胞功能的活性作用。说明在抗CTLA-4抗体上进行ADCC的增强并没有改变其与CTLA-4抗原在体外的生物学活性。
实施例4.抗体2蛋白与FcγRIIIa的结合
SA传感器(Fertebio)置于PBS中预湿10分钟备用，将生物素标记的FcγRIIIa158V(ACRO Biosystems)、FcγRIIIa 158F(ACRO Biosystems)用pH为6.8的含有0.5％BSA的PBST(以下简称稀释缓冲液)稀释至1μg/mL，将SA传感器在FcγRIIIa 158-Biotin中固化至信号约为0.6nm。将待测抗体2、抗体1用稀释缓冲液稀释至500nM，并以此为起始浓度作2倍梯度稀释，一共准备7个浓度点(500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.812nM)。将稀释缓冲液、梯度浓度的药物抗体稀释液、再生缓冲液(pH为8.4的1M MgCl2)、中和缓冲液(PBST)依次加入96孔板相应列中，运行如下步骤：①Baseline：在稀释缓冲液中检测基线60秒；②Association：在抗体梯度稀释液及样品空白(稀释缓冲液)中结合90秒；③Dissociation：在稀释缓冲液中解离90秒；④Regeneration：在再生缓冲液中再生5秒；⑤Neutralization：在中和缓冲液中中和5秒；⑥Regeneration和Neutralization循环进行3次。
用Data Analysis 8.2对数据进行处理分析，样品数据经参比(样品空白)信号扣减后进行拟合，得到亲和常数KD。与FcγRIIIa 158F的亲和力结果统计见表3，与FcγRIIIa158V的亲和力结果统计见表4，其中抗体2、抗体1与FcγRIIIa 158V的结合解离传感图见图7(0-240s为抗体1与FcγRIIIa 158V的结合解离，270-510s为抗体2与FcγRIIIa 158V的结合解离)。
表3.抗体2、抗体1对FcγRIIIa 158F亲和结合的动力学参数
Figure BDA0002335952660000201
注：kon：结合速率；kdis：解离速率；KD：结合解离平衡常数，也即亲和力。
表4.抗体2、抗体1对FcγRIIIa 158V亲和结合的动力学参数
Figure BDA0002335952660000202
注：kon：结合速率；kdis：解离速率；KD：结合解离平衡常数，也即亲和力。
结论：结果表明，经过ADCC增强的抗体2，其与FcγRIIIa的亲和力比抗体1的更强。
实施例5.抗体1蛋白在ADCC报告基因模型上的体外生物学活性
构建pCDH-FcγRIIIa 158V FL-Puro质粒，质粒图谱如图8。构建过程如下：合成SEQ ID NO：10所示FcγRIIIa 158V FL cDNA序列，氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，放于pUC-57载体中，命名为Puc-57-FcγRIIIa 158V FL cDNA。合成SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的正反向PCR引物(用于扩增FcγRIIIa 158V FL cDNA片段并在片段两端带上EcoRI和NotI酶切位点)。以Puc-57-FcγRIIIa 158V FL cDNA为模板，用上述正反向引物进行PCR，得到扩增后的FcγRIIIa 158V FL cDNA片段。用EcoRI和NotI分别对pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro质粒(常规质粒，例如可以购自优宝生物编号VT1482)和引物扩增后的FcγRIIIa158V FL cDNA进行双酶切，酶切产物进行胶回收，胶回收的产物进行连接、转化大肠杆菌、测序，正确克隆命名为pCDH-FcγRIIIa 158V FL-Puro。
用慢病毒包装系统pLP1、pLP2、pLP/VSV-G(例如可以购自invitrogen)及pCDH-FcγRIIIa 158V FL-Puro进行病毒的包装，然后感染Jurkat细胞。48h后加入0.3μg/mL嘌呤霉素作为筛选压。转染两周后待细胞长起来，用FITC标记的抗FcγRIIIa的抗体(Invitrogen，货号：MHCD1601)通过流式细胞仪检测FcγRIIIa 158V的表达情况，筛选出阳性单克隆。
通过电转的方法，把pGL4.30-luc2P-NFAT-RE-Hygro质粒(购自Promega)转染到上述FcγRIIIa 158V表达阳性的Jurkat单克隆细胞中，用潮霉素加压筛选。通过PMA(50μg/mL)和离子霉素(1μg/mL)刺激6个小时并加入荧光素酶底物用酶标仪检测自发荧光的方法，筛选出能被PMA和离子霉素刺激而发出自发荧光的阳性单克隆，命名为Jurkat-NFAT-luciferase-FcγRIIIa 158V细胞。
用含有1％FBS的1640培养基作为该实施例中的缓冲液，把Jurkat-NFAT-luciferase-FcγRIIIa 158V细胞与Jurkat-IL2-luciferase-CTLA4FL细胞分别稀释成200×105细胞/mL的密度，于96孔白板(Corning，货号：3917)每孔各加入25μL的Jurkat-NFAT-luciferase-FcγRIIIa 158V与25μL的Jurkat-IL2-luciferase-CTLA4FL。把抗体2和抗体1用缓冲液分别稀释到100ng/mL，以此为起始浓度，3倍梯度稀释，一共稀释10个浓度(最后一个为空白0浓度)。往上述已加入两种细胞的孔中，加入不同浓度的抗体溶液，每孔加入25μL，每个浓度做3个复孔。此时每孔中共有75μL的细胞抗体混合液。把白板放入37℃培养箱孵育6个小时后，取出白板，于室温放置10分钟。每孔加入75μL已平衡至室温的萤火虫荧光素酶底物，将白板放入酶标仪，震荡5s，10分钟后读取荧光值。结果见图9。
结论：在ADCC报告基因模型上，抗体2比抗体1显示出更强的体外ADCC活性，从EC50值上看，抗体2在体外模型上的ADCC活性约为抗体1的12倍。
实施例6.抗体2在小鼠体内的抗肿瘤药效
将MC38细胞以5×105个/0.1mL浓度接种于B-hCTLA4人源化雌性小鼠的右侧皮下，待肿瘤生长到约125mm3时按肿瘤体积随机分组，每组8只，共8组，分别为：G1对照组(0.9％氯化钠注射液溶剂)、G2组(
Figure BDA0002335952660000211
1mg/kg)、G3组(抗体1，0.3mg/kg)，、G4组(抗体1，1mg/kg)、G5组(抗体1，3mg/kg)、G6组(抗体2，0.3mg/kg)、G7组(抗体2，1mg/kg)组和G8组(抗体2，3mg/kg)组。所有组给药途径均为腹腔注射，每3天给药1次，连续给药6次，末次给药12天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，动物安乐死，剥取肿瘤称重、拍照，计算相对肿瘤抑制率(TGI％)。
整个实验过程中，所有实验动物在给药期间活动和进食状态良好，实验动物体重均有一定程度的上升。实验过程中无小鼠死亡。抗体2、抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠体重的影响见表5，给药后动物体重变化趋势图见图10A。而抗体2、抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠肿瘤体积的影响见表6，给药后肿瘤体积增长趋势图见图10B。
表5.抗体2、抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠体重的影响
Figure BDA0002335952660000221
注：a：平均数±标准误；b：给药组体重与溶剂对照组体重在给药27天后统计学比较，t-test。
表6.抗体2、抗体1对MC38细胞移植B-hCTLA4小鼠肿瘤体积的影响
Figure BDA0002335952660000222
Figure BDA0002335952660000231
注：a：平均数±标准误；b：给药组体重与溶剂对照组体重在给药27天后统计学比较，t-test。
结论：在本实验药效模型上，受试抗体：抗体2和受试抗体：抗体1均有显著抑制肿瘤生长效果，且与阳性对照药品市售CTLA-4抗体
Figure BDA0002335952660000232
的抑瘤效果相当。并且在发挥抗肿瘤生长作用的同时受试药物未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。值得注意的是，在相同剂量中、高剂量组，药效似已达到饱和，因此比较不出差异，但在低剂量组0.3mg/kg下，经过ADCC增强的抗体2明显比未经ADCC增强的抗体1有更优的抑瘤效果。
实施例7.抗体2对小鼠血液中CD4+、CD8+、Treg细胞的影响
在实施例6提到的药效实验中，给药21天后，对每只小鼠通过眼眶内眦静脉丛采集150μL抗凝血，流式检测其中CD4、CD8阳性细胞及Treg细胞，统计各自占CD45阳性细胞比例。其中用到的抗体包括anti-CD45(Biolegend，货号：103138)、anti-CD4(Biolegend，货号：100438)、anti-CD8(Biolegend，货号：100759)、anti-Foxp3(eBioscience，货号：17-5773-82)抗体。
结果显示，给药后21天，G4组和G5组小鼠血液中CD4阳性细胞比例显著增加(P＜0.05，P＜0.01)，G6组、G7组和G8组小鼠血液中CD4阳性细胞比例极显著增加(P＜0.01)；抗体1各给药组小鼠血液中CD8阳性细胞比例无显著变化，而G6组、G7组和G8组小鼠血液中CD8阳性细胞比例极显著增加(P＜0.01)；G3组、G4组、G5组、G6组、G7组和G8组小鼠血液中Treg细胞比例显著降低(P＜0.05，P＜0.01)；G3组、G4组、G5组小鼠血液中CD8细胞/Treg细胞比值显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。各组比较的示意图见图11A-D。
结论：ADCC增强后，抗体2的CD4、CD8阳性细胞比例极显著增加，Treg细胞比例显著降低，CD8细胞/Treg细胞比值显著增加。提示在ADCC增强后的CTLA-4抗体下，T细胞得到更强的激活，从而可对CTLA-4人源化荷瘤小鼠产生更强的抗肿瘤效力。
序列表
SEQ ID NO：1，抗CTLA-4抗体重链氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000241
SEQ ID NO：2，抗CTLA-4抗体轻链氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000242
SEQ ID NO：3，抗CTLA-4抗体重链核酸序列
Figure BDA0002335952660000243
Figure BDA0002335952660000251
SEQ ID NO：4，抗CTLA-4抗体轻链核酸序列
Figure BDA0002335952660000252
SEQ ID NO：5，CTLA-4-ECD-FC氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000253
SEQ ID NO：6，CTLA-4-ECD-FC核酸序列
Figure BDA0002335952660000254
Figure BDA0002335952660000261
SEQ ID NO：7，OKT3 ScFv核酸序列
Figure BDA0002335952660000262
SEQ ID NO：8，OKT3重链氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000263
SEQ ID NO：9，OKT3轻链氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000264
SEQ ID NO：10，FcγRIIIa 158V FL cDNA核酸序列
Figure BDA0002335952660000265
Figure BDA0002335952660000271
SEQ ID NO：11，FcγRIIIa 158V FL氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000272
SEQ ID NO：12，抗CTLA-4抗体重链CDR1氨基酸序列
SYTMH
SEQ ID NO：13，抗CTLA-4抗体重链CDR2氨基酸序列
FISYDGNNKYYADSVKG
SEQ ID NO：14，抗CTLA-4抗体重链CDR3氨基酸序列
TGWLGPFDY
SEQ ID NO：15，抗CTLA-4抗体轻链CDR1氨基酸序列
RASQSVGSSYLA
SEQ ID NO：16，抗CTLA-4抗体轻链CDR2氨基酸序列
GAFSRAT
SEQ ID NO：17，抗CTLA-4抗体轻链CDR3氨基酸序列
QQYGSSPWT
SEQ ID NO：18，抗CTLA-4抗体重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000273
SEQ ID NO：19，抗CTLA-4抗体轻链可变区氨基酸序列
Figure BDA0002335952660000274
SEQ ID NO：20，FcγRIIIa 158V FL cDNA正向引物(下划线为限制性内切酶的酶切位点)
Figure BDA0002335952660000275
SEQ ID NO：21，FcγRIIIa 158V FL cDNA反向引物(下划线为限制性内切酶的酶切位点)
Figure BDA0002335952660000276

Claims (10)

1.针对CTLA-4的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含
(1)重链CDR1，其包含SEQ ID NO：12所示的序列，或由其组成，
重链CDR2，其包含SEQ ID NO：13所示的序列，或由其组成，
重链CDR3，其包含SEQ ID NO：14所示的序列，或由其组成，
轻链CDR1，其包含SEQ ID NO：15所示的序列，或由其组成，
轻链CDR2，其包含SEQ ID NO：16所示的序列，或由其组成，和
轻链CDR3，其包含SEQ ID NO：17所示的序列，或由其组成；
或
(2)重链可变区，其包含SEQ ID NO：18所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成，和
轻链可变区，其包含SEQ ID NO：19所示的序列，与所述序列具有至少80％、90％、优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，或与所述序列相比具有一个或多个保守氨基酸突变的氨基酸序列，或由其组成；
其特征在于所述单克隆抗体Fc区的高甘露糖糖型总量＜5％和/或唾液酸化糖型总量＜3％。
2.权利要求1的单克隆抗体，其包含重链和轻链，
所述重链包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，或由其组成；
所述轻链包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，与SEQ ID NO：2的氨基酸序列具有至少80％，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的序列，或由其组成。
3.权利要求1或2的单克隆抗体，其中所述重链由SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有至少80％，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列编码，所述轻链由SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO：4的核苷酸序列具有至少80％，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列编码。
4.权利要求1-3任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体Fc区的岩藻糖基化水平为0％-5％。
5.权利要求1-4任一项的单克隆抗体，其由保藏编号：CCTCC NO：C2017127的CHO-BAT-KF细胞表达。
6.药物组合物或融合蛋白，其包含权利要求1-5任一项的单克隆抗体。
7.多特异性抗体(例如双特异性抗体)，其包含权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体，以及针对其他抗原和/或其他抗原表位的抗体或抗原结合片段。
8.试剂盒，其包括权利要求1-5任一项所述的单克隆抗体，权利要求7所述的多特异性抗体或权利要求6所述的药物组合物或融合蛋白。
9.权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒还包括第二抗体，细胞毒性剂，化疗剂或放疗剂，所述第二抗体特异性识别所述单克隆抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如荧光素、金属离子、生物素、放射性同位素、化学发光物质、酶或聚乙二醇。
10.权利要求1-5任一项的单克隆抗体，权利要求6所述的药物组合物或融合蛋白，或权利要求7所述的多特异性抗体在制备用于治疗癌症或用于排斥可移植的肿瘤，例如黑色素瘤，非小细胞肺癌，膀胱癌，肝癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤或肾癌的药物中的应用。
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