CN112999220B

CN112999220B - α-硫辛酸在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN112999220B
Application number: CN202110371383.3A
Authority: CN
Inventors: 姜志辉; 石磊; 张冰; 何羡霞; 杨琰; 袁进; 杨晨; 关慧; 李康; 张强
Original assignee: Southern Theater Command General Hospital of PLA
Current assignee: Southern Theater Command General Hospital of PLA
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-12-13
Anticipated expiration: 2041-04-07
Also published as: CN112999220A

Abstract

本发明属于医药领域，公开了α‑硫辛酸在作为和/或制备金属β‑内酰胺酶抑制剂中的应用。本发明首次公开了α‑硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备金属β‑内酰胺酶抑制剂中的应用，α‑硫辛酸和/或其盐对金属β‑内酰胺酶具有良好的抑制作用，可以保护抗生素不被细菌降解，提高细菌对抗生素敏感性，逆转细菌对抗生素的耐药；同时，α‑硫辛酸和/或其盐与抗生素联用具有良好的协同效果，可作为抑制细菌的药物。并且α‑硫辛酸是天然化合物，在正常临床使用剂量下对人体基本无毒副作用，且在临床作为治疗糖尿病周围神经病变引起的感觉异常的药物已很多年，具有很好的安全性。

Description

α-硫辛酸在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及α-硫辛酸在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素以其高效低毒的特性成为临床上最常用的一类抗生素，在控制和治疗革兰阴性细菌感染中起着十分重要的作用。然而，长期不合理的使用甚至滥用抗生素使细菌产生了严重的耐药性，这对世界各地的公共卫生问题造成了严重的威胁。

细菌最主要的耐药机制是产生β-内酰胺酶，其通过水解β-内酰胺类抗生素的内酰胺环使抗生素失效，从而对抗生素产生耐药性。根据β-内酰胺酶的氨基酸序列可以将β-内酰胺酶分为A-D四类，其中B类β-内酰胺酶的活性位点包括1-2个锌离子，因此又称为金属β-内酰胺酶(MBLs)。

根据氨基酸序列的不同,MBLs可进一步分为3个亚类,B1类、B2类和B3类，而B1类的新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)有比其他亚型金属β-内酰胺酶更加广谱的底物范围，几乎可以水解所有β-内酰胺类抗生素，包括被称为“最后一道防线”的碳青霉烯类抗生素。其基因既可以通过质粒快速进行跨菌种的传播，也十分容易因为质粒的重排等作用产生变异，同时可以通过整合到细菌的染色体上，使其遗传和耐药性更加稳定。目前临床尚无有效的金属β-内酰胺酶抑制剂上市。因此，金属β-内酰胺酶抑制剂的研发迫在眉睫。

α-硫辛酸(α-lipoic acid，LA)是一种具有生物活性的天然产物，是丙酮酸脱氢酶和甘氨酸脱羧酶的辅酶。α-硫辛酸的二硫五元环结构使其具有很强的抗氧化作用，能够清除体内的活性氧自由基，同时提高细胞内的谷胱甘肽等抗氧化剂的水平，大大加强抗氧化作用。α-硫辛酸还能够改善糖尿病患者的血糖控制，减少患者对胰岛素和降糖药物的依赖；保护糖尿病患者神经组织，帮助治疗末梢神经病变；对其他多种慢性病，如心血管疾病、肝肾病变等，也具有正面的助益。近年来，α-硫辛酸因在多种疾病治疗中起到重要作用而受到国内外生物学界的高度关注，但是目前尚未见α-硫辛酸作为金属β-内酰胺酶抑制剂方面的报道。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供α-硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供α-硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供抗生素和α-硫辛酸和/或其盐在制备抑制细菌的药物中的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种包含抗生素及α-硫辛酸和/或其盐的药物。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供α-硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用。

α-硫辛酸是一种具有生物活性的天然产物，是丙酮酸脱氢酶和甘氨酸脱羧酶的辅酶，其分子式为C₈H₁₄O₂S₂，CAS号为1077-28-7，结构式如式(I)所示。

优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种；进一步优选地，所述金属β-内酰胺酶为NDM-1型金属β-内酰胺酶。

优选地，所述金属β-内酰胺酶的来源包括自然界中提取或者从基因工程菌株中制备获得。

本发明的第二个方面，提供α-硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用。

优选地，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶的耐药细菌；进一步优选地，所述细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，所述β-内酰胺类抗生素为分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林、阿莫西林中的至少一种。

优选地，所述金属β-内酰胺酶为IMP-7型金属β-内酰胺酶、NDM-1型金属β-内酰胺酶和VIM-2型金属β-内酰胺酶中的至少一种。

本发明的第三个方面，提供抗生素和α-硫辛酸和/或其盐在制备抑制细菌的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种药物，包含：

(1)抗生素；和

(2)α-硫辛酸和/或其盐。

优选地，所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，所述β-内酰胺类抗生素为分子结构中含有β-内酰胺环的抗生素；进一步优选地，所述抗生素为青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、硫霉素类和碳青霉烯类抗生素中的至少一种；更进一步优选地，所述抗生素为美罗培南、、亚胺培南、厄他培南、头孢氨苄、头孢呋辛、头孢地尼、头孢曲松、头孢他啶、氨苄西林、阿莫西林中的至少一种。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料优选包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂中的至少一种。

优选地，所述药物的制剂类型包括固体制剂、液体制剂和半固体制剂。

优选地，所述固体制剂包括片剂、颗粒剂、粉剂和胶囊剂。

优选地，所述液体制剂包括注射剂。

优选地，所述半固体制剂包括软膏剂和霜剂。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了α-硫辛酸和/或其盐在作为和/或制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用，α-硫辛酸和/或其盐对金属β-内酰胺酶具有良好的抑制作用，可以保护抗生素不被细菌降解，提高细菌对抗生素敏感性，逆转细菌对抗生素的耐药；同时，α-硫辛酸和/或其盐与抗生素联用具有良好的协同效果，可作为抑制细菌的复合药物。α-硫辛酸是天然化合物，在正常临床使用剂量下对人体基本无毒副作用，且在临床作为治疗糖尿病周围神经病变引起的感觉异常的药物已很多年，具有很好的安全性。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1α-硫辛酸对金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

底物被酶水解后会引起吸光度值的下降，因此，可以通过吸光度的变化来表征底物水解程度，从而判断酶的活性。以美罗培南(50μM)为报告底物，在300nm波长处测定底物在被金属β-内酰胺酶水解后的吸光度变化。金属β-内酰胺酶的浓度为2nM，缓冲液为50mMHEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，0.1mM ZnSO₄，pH＝7.2，反应温度为25℃，具体实验方法如下：

1.α-硫辛酸对IMP-7型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)将α-硫辛酸溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、1、10、50、100、200、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL IMP-7型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为2nM)，于25℃孵育15min，使α-硫辛酸与酶充分结合。

(2)体系转入至石英比色皿中，加入50μL美罗培南(终浓度为50μM)后迅速测定吸光度值的变化，记录数据。

(3)计算不同浓度的α-硫辛酸对IMP-7型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对抑制率作图，通过拟合曲线计算得到IC₅₀值。

2.α-硫辛酸对NDM-1型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)将α-硫辛酸溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、1、10、50、100、200、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL NDM-1型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为2nM)，于25℃孵育15min，使α-硫辛酸与酶充分结合。

(3)计算不同浓度的α-硫辛酸对NDM-1型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对抑制率作图，通过拟合曲线计算得到IC₅₀值。

3.α-硫辛酸对VIM-2型金属β-内酰胺酶抑制活性的测定

(1)将α-硫辛酸溶解于HEPES缓冲液中并配制成不同浓度(分别为0.1、1、10、50、100、200、300、500μM)，每个浓度设三个复孔，加入10μL VIM-2型金属β-内酰胺酶溶液(终浓度为2nM)，于25℃孵育15min，使α-硫辛酸与酶充分结合。

(3)计算不同浓度的α-硫辛酸对VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制率，以化合物的浓度对抑制率作图，通过拟合曲线计算得到IC₅₀值。

α-硫辛酸对IMP-7型、NDM-1型和VIM-2型金属β-内酰胺酶的抑制活性的结果如表1、表2所示：α-硫辛酸对NDM-1型金属β-内酰胺酶的IC₅₀为62.75±15.53μM，Ki值为36.29±8.98μM；对VIM-2型和IMP-7型金属β-内酰胺酶的IC₅₀均大于500μM；可见，α-硫辛酸对NDM-1型金属β-内酰胺酶具有良好的抑制作用。

表1α-硫辛酸对MBLs的IC₅₀值(μM)

表2α-硫辛酸对MBLs的抑制常数(Ki，μM)

实施例2α-硫辛酸与美罗培南联用抑制产MBLs耐药菌效果的评价

采用微量肉汤稀释法测定α-硫辛酸与美罗培南联用对产MBLs耐药菌株的最小抑菌浓度(MIC)。实验所用的产MBLs的菌株为购买自上海生工生物科技有限公司的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-7菌、E.coli BL21(DE3)/pET28a-VIM-2菌和E.coliBL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌。

FICI用于判断两种药物联合使用时的相互作用，根据以下方程定义:FICI＝FIC_A+FIC_B＝C_A/MIC_A+C_B/MIC_B，其中MIC_A和MIC_B分别是化合物A和B单独使用的MIC值，而C_A和C_B是化合物A和B在有效组合中的药物浓度。若FICI≤0.5则认为两药具有协同作用，0.5＜FICI≤4说明两药协同作用较弱或无相关作用，FICI≥4则认为两药具有拮抗作用。FICI越小，则药物的协同作用越强。

具体实验方法如下：

1.α-硫辛酸与美罗培南联用抑制产IMP-7型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28a-IMP-7菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10⁶CFU/mL。

(2)在96孔平板的第2-12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(α-硫辛酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或α-硫辛酸对产IMP-7型耐药菌的MIC，每组实验重复三次。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤2，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625-128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(α-硫辛酸)，终浓度为2-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(α-硫辛酸)联用对产IMP-7型MBLs耐药菌的MIC，每组实验重复三次。

(4)每组实验设三组平行对照：以大肠杆菌ATCC25922作为质控标准，卡托普利为阳性对照，同时设置无菌孔和无药孔；96孔平板置于37℃恒温培养箱培养24h，观察结果并记录MIC值。

2.α-硫辛酸与美罗培南联用抑制产VIM-2型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28a-VIM-2菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10⁶CFU/mL。

(2)在96孔平板的第2-12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(α-硫辛酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或α-硫辛酸对产VIM-2型耐药菌的MIC，每组实验重复三次。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤2，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625-128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(α-硫辛酸)，终浓度为2-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(α-硫辛酸)联用对产VIM-2型MBLs耐药菌的MIC。

3.α-硫辛酸与美罗培南联用抑制产NDM-1型耐药菌效果的评价

(1)在无菌操作条件下，将超低温保存的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28a-NDM-1菌)接种于无菌LB固体培养基中，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单个菌落转接至3mL LB液体培养基(含50mg/mL卡那霉素)中，于37℃恒温培养箱中培养至对数生长期得到细菌混悬液；用麦氏比浊仪调整菌液浓度至0.5麦氏浓度，LB液体培养基稀释100倍，细菌数目约为1×10⁶CFU/mL。

(2)在96孔平板的第2-12列加入100μL LB液体培养基，并在第1列加入100μL美罗培南溶液(256μg/mL)或抑制剂(α-硫辛酸，256μg/mL)，第2列药液充分混匀后吸取100μL加入至第3列再次混匀，以此倍比稀释法依次稀释药液，得到药物浓度为0.0625-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定单独使用美罗培南或α-硫辛酸对产NDM-1型耐药菌的MIC，每组实验重复三次。

(3)在96孔平板上按照横、纵两个方向联合稀释药液，横排为美罗培南的梯度稀释，方法同步骤2，但加入的LB液体培养基和美罗培南体积均为50μL(美罗培南的终浓度为0.0625-128μg/mL)，纵列加入50μL提前经倍比稀释的不同浓度的抑制剂(α-硫辛酸)，终浓度为2-128μg/mL；每孔加入100μL稀释好的菌液，以此测定美罗培南与抑制剂(α-硫辛酸)联用对产NDM-1型MBLs耐药菌的MIC，每组实验重复三次。

美罗培南与α-硫辛酸联用对表达NDM-1、VIM-2或IMP-1耐药菌的抗菌活性的结果如表3所示：抑制剂(α-硫辛酸、卡托普利)可以提高美罗培南的抗菌活性：当抑制剂浓度为128μg/mL时，α-硫辛酸与美罗培南联合使用，可提高美罗培南对多种表达MBLs耐药菌的抑菌效果，且与单独使用美罗培南相比，联合用药能够有效降低美罗培南对耐药菌株的MIC值，最高可降低8倍，效果均优于卡托普利。

α-硫辛酸或卡托普利与美罗培南联用对表达MBLs的耐药菌的协同抗菌指数如表4所示：α-硫辛酸与与美罗培南联用对表达MBLs的耐药菌的FICI均小于等于0.5，表明两者具有良好的协同作用；而卡托普利与美罗培南联用对表达MBLs的耐药菌的FICI均大于α-硫辛酸，表明其与美罗培南的协同效果不如α-硫辛酸与与美罗培南的协同效果。

上述结果表明：与美罗培南联用下，α-硫辛酸对多种表达金属β-内酰胺酶的耐药菌具有有效的协同抗菌活性，说明α-硫辛酸可以作为MBLs抑制剂，能够逆转碳青霉烯耐药菌的耐药性，有效保护美罗培南不被MBLs水解，提高美罗培南对产MBLs耐药菌的抗菌活性，从而维持对美罗培南的敏感性。因此，α-硫辛酸可以作为金属β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素制备成复合制剂。

表3α-硫辛酸或阳性对照药物卡托普利与美罗培南联用对表达MBLs耐药菌的MIC值(μg/mL)

表4α-硫辛酸或阳性对照药物卡托普利与美罗培南联用对表达MBLs的耐药菌的协同抗菌指数(FICI)

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.α-硫辛酸和/或其盐作为唯一活性成分在制备金属β-内酰胺酶抑制剂中的应用；所述金属β-内酰胺酶为NDM-1型金属β-内酰胺酶。

2.α-硫辛酸和/或其盐作为唯一活性成分在制备提高细菌对抗生素敏感性的药物中的应用；所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶的耐药细菌。

3.组合物在制备抑制细菌的药物中的应用；所述组合物为抗生素和α-硫辛酸和/或其盐；所述抗生素为β-内酰胺类抗生素，所述细菌为表达金属β-内酰胺酶的耐药细菌。

4.一种药物，由以下组分组成：

(1)抗生素；和

(2)α-硫辛酸和/或其盐；

所述抗生素为β-内酰胺类抗生素；

所述药物用于抑制细菌；

所述细菌为表达金属β-内酰胺酶的耐药细菌。