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CN112970746A - 一种解淀粉芽孢杆菌液态原药的制备方法 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌液态原药的制备方法 Download PDF

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张俊
王敏
熊仁科
左建英
景飞江
杨怀亮
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Sichuan Lomon Bio Technology Co ltd
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Abstract

本发明涉及到解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)1841菌株，以及该菌发酵生产所产生的具有植物抑菌活性、促生长性发酵产物的原药分离制备方法。所述分离纯化方法包括以下步骤：(1)前处理：向所述含有抑菌物质的发酵液中加入防腐剂，添加比例为0.5‑2g/L，使用有机酸将pH调整至2‑6；(2)分离：将步骤(1)经前处理的含有抑菌物质的发酵液经膜过滤得到液态原药，滤余液为分离出的芽孢杆菌菌体，可以加溶剂及填料进行喷雾干燥。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌液态原药的制备方法
技术领域
本发明属于利用有益微生物对植物病害进行生物防治的领域，具体涉及到解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)1841菌株，以及该菌发酵生产所产生的具有植物抑菌活性、促生长性发酵产物的原药分离制备方法。
背景技术
植物病害病原物是能侵染寄生于植物体并导致侵染性病害发生的生物。多为异养型的非专性寄生物。病原物虽具有致病能力，但不是形成植物病害的决定因素，更不是唯一的因素。能否导致发病，还决定于寄主植物、病原物和环境条件三者相互作用的结果，通常引起植物病害的病原物包括由生物引起，有传染性，病原体多种，如真菌、细菌、病毒、线虫或寄生性种子植物等，而解淀粉芽孢杆菌所产生的抑菌物质主要针对细菌、真菌性植物病害。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)属于细胞生物，细菌界，厚壁菌门，芽孢杆菌纲，芽孢杆菌目，芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌的一个亚种，菌落呈白色，半透明状，光滑湿润，杆状，革兰氏阳性菌。抑菌促生的作用机理主要包含分泌抗菌物质、产生拮抗作用、营养空间竞争、诱导寄主产生抗性和促进植物生长等。
解淀粉芽孢杆菌在生长过程中会产生多种抑菌物质及植物促生物质，如抑菌物质表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、丰原素(Fengycin)等，而这些通过非核糖体途径合成的分子量小、稳定型号、耐受蛋白酶水解及有机溶剂作用的脂肽类抗生素，在生物防治中应用于细菌、真菌、病毒、线虫的抑制起到主要作用。
同时，解淀粉芽孢杆菌可以产生如赤霉素、促生物质PGRs：反式玉米素(T-zeatin)、吲哚乙酸(IAA)、S-诱抗素(ABA)等生理活性物质，促进植物根系及植株生长，增强植物抗病性，从而间接减少病害发生。
目前，解淀粉芽孢杆菌菌剂原药通常为固体菌剂，是在发酵液中菌体芽孢化后进行制备，其主要生产目标为具有活性的芽孢杆菌芽孢，其制备方法均为将发酵液添加保护剂后进行喷雾干燥，喷雾在高温条件下进行，未针对发酵液中已产生的活性物质进行单独处理。经过喷雾干燥，以上活性物质(多为蛋白、多肽类大分子物质)失活，在原药中失去相应的抑菌和促生作用，影响成品菌剂作用，可以说是一种浪费。
因此，有必要提供一种芽孢杆菌液态原药的分离方法，将抑菌、植物促生原药的分离纯化。
发明内容
本发明提供一种芽孢杆菌液态原药的分离方法，具体是一种发酵法生产抑菌、植物促生原药的分离纯化方法，通过精制处理，能够使抑菌、促生物质与菌体分离，制备成为单独的液体抑菌剂、促生菌剂原药，菌体可单独制作喷粉。此外，分离纯化条件温和，分离纯化过程环保，有利于此液态原药的产业化生产。
本发明提供以下方案：
一种芽孢杆菌液态原药的分离制备方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)前处理：在膜过滤前，向所述含有抑菌物质的发酵液中加入防腐剂，添加比例为0.5-2g/L；加入有机酸，将pH调制2-6；
(2)分离：将步骤(1)经前处理的含有抑菌、促生物质的发酵液经膜过滤得到液态原药；
(3)菌体收集：将步骤(2)分离剩余的过滤余液进行收集，用于喷雾干燥制备芽孢杆菌菌粉，因相当于进行了菌体浓缩(体积缩减60％-75％)，喷雾干燥所需时间和能耗均减少。
优选地，膜过滤包括有微滤工序，在微滤工序中，孔径为10-50nm、压力为1.0-4.5MPa，过滤温度不大于15-30℃，所得滤液为含有抑菌物质及促生物质的液态原药，滤余液为芽孢杆菌菌体。
优选地，防腐剂为焦亚硫酸钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠，有机酸为苹果酸、柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)有效地分离发酵液中的抑菌物质、促生物质，得到相关水剂原药，用于制备抑菌水剂；
(2)通过添加防腐剂并分离菌体，抑制原药中微生物生长，保存原药活性物质不受到微生物降解；保证其促生、抑菌作用；
(3)降低发酵液含水量，提高了发酵液固含物比例，为喷雾干燥减少了处理体积，降低能耗减少了处理时间。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌B10脂肽粗提物中Surfactin的HPLC图谱
图2本发明的制备流程
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本申请实施例的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
实施例1
一种芽孢杆菌液态原药的分离制备方法，其包括以下步骤：
(1)物料为培养时间94h芽孢杆菌发酵液50.2L，按照1g/L比例添加偏重亚硫酸钠搅拌均匀，防止氧化；
(2)将发酵液放入实验陶瓷膜设备，3.2-3.5kg压力，11.8-15℃条件进行过滤，收集上清液；过滤后收集滤余液；
(3)经过滤，3h收集上清液7.7kg，收集滤余液38.2kg。
抑菌活性物质收集：
(1)用2mol/L稀盐酸调整pH至2.0，4℃静置一夜；
(2)10000g离心，离心时间5min；
(3)弃上清液，收集沉淀烘干称重，所得脂肽含量5.49mg/mL。
抑菌活性物质检测：
(1)EA提取，滤纸过滤；
(2)减压蒸馏，温度45℃，压力-0.85Mpa；
(3)25ml甲醇溶解
(4)标准液制备：
准确称取标2mg Surfactin准品,溶解于10ml甲醇中,制成标准母液(200mg/L)。根据实验需要,稀释100mg/L、80mg/L、40mg/L、20mg/L、10mg/L 5个不同浓度的标准溶液。
(5)色谱条件
色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-II(4.6×250mm日本NACALAI公司)
进样量：20μL；
柱温：35℃；
检测波长：210nm；流速：0.84mL/min；
流动相：
A：乙腈(含0.1％TFA)B：水(含0.1％TFA)
采用梯度洗脱，具体梯度表如下表3：
表3 梯度洗脱表
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 60 40
9 93 7
20 93 7
植物调节剂提取及检测：
(1)1g/L比例添加焦亚硫酸钠，陶瓷微滤膜过滤：孔径50nm，压力3.0-3.5Mpa，温度25-28℃；
(2)加无水柠檬酸调整pH至3，4℃静置24h，8000rpm 5min，收集上层水层；
(3)EA提取，同体积提取2次；
(4)减压蒸馏，温度45℃，压力-0.85Mpa；
(5)25ml甲醇溶解
检测结果：反式玉米素21ppm、吲哚乙酸3ppm、S-诱抗素4ppm；
解淀粉芽孢杆菌代谢过程中产生少量脂肽类杀真菌并诱导植物系统抗性的化合物，在产脂肽培养基发酵条件下能够产生较高产量的脂肽。该类化合物对多种植物病原菌具有较强杀菌活性，应用范围广，为该菌生物防治植物真菌病害的主要作用物质，同时具有对植物诱导抗性活性。
本发明通过膜过滤法进行可溶抗菌脂肽与菌体分离，保护了抗菌脂肽、植物调节剂相关活性，为制备相关液体菌剂提供了基础。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种芽孢杆菌液态原药的分离制备方法，所述分离纯化方法包括以下步骤：
(1)前处理：向所述含有抑菌物质的发酵液中加入防腐剂，添加比例为0.5-2g/L，使用有机酸将pH调整至2-6；
(2)分离：将步骤(1)经前处理的含有抑菌物质的发酵液经膜过滤得到液态原药，滤余液为分离出的芽孢杆菌菌体，可以加溶剂及填料进行喷雾干燥。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌液态原药的分离制备方法，其特征在于：所述膜过滤包括有微滤工序，在微滤工序中滤膜材质为无机陶瓷滤膜，孔径为10-50nm、压力为1.0-4.5MPa，过滤温度不大于15-30℃。
3.如权利要求1所述的芽孢杆菌液态原药的分离制备方法，其特征在于：所述的防腐剂为焦亚硫酸钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠中的一种或多种，有机酸为苹果酸、柠檬酸、顺乌头酸、异柠檬酸中的一种或多种。
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