CN112979850B - 基于葡聚糖的新型纳米载体、制备方法及其对药物的包载方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于葡聚糖的新型纳米载体、制备方法及其对药物的包载方法，包括：制备葡聚糖大分子链转移剂；将葡聚糖大分子链转移剂溶于水中，再加入甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入钌联吡啶配体溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应，得到基于葡聚糖的新型纳米载体。本发明的纳米载体具有良好的稳定性，低细胞毒性；并以三种不同的物质对纳米粒子进行了包载测试，均得到了实现，还发现纳米粒子对生物大分子有一定的保护作用，证实其在药物输送等方面有很好的应用潜能。

Description

基于葡聚糖的新型纳米载体、制备方法及其对药物的包载 方法

技术领域

本发明属于化学类有机高分子化合物领域，具体涉及一种基于天然高分子葡聚糖作为骨架，丙烯酸酯类单体进行后续聚合得到的具有一定保护能力的纳米载体及其制备方法。

背景技术

聚合物纳米材料由于其形貌的多样性，在催化、化学分离、生物矿化以及药物传递等领域具有广泛的应用。聚合物纳米材料的制备通常采用选择性溶剂自组装的方法，可得到微球、纤维、片状、囊泡等形貌。但这种方法制备出来的聚合物浓度较低，并且需要进一步的处理，限制了其大规模应用.而近十年来，发展了一种基于可逆-加成断裂链转移自由基活性聚合(Reversible Addition-Fra gmentation chain Transfer，RAFT)的聚合诱导自组装(polymerization-induced self-assembly，PISA)体系，聚合物纳米材料固含质量分数可高达50％。使用PISA方法，可合成球形、囊泡、柱状等各种拓扑结构的聚合物纳米材料。随着活性自由基聚合的发展，PISA方法得到进一步发展，可使用各种官能性单体，得到各种功能化聚合物微球，制备聚合物纳米材料，可实现高固含量生产。目前进行的RAFT聚合诱导自组装研究，大多都是基于一种可溶性大分子链转移剂来使可溶性单体聚合形成不溶的聚合物嵌段，在形成两亲性嵌段共聚物的过程中自组装成不同形貌的纳米粒子。在文献中，大分子链转移剂都是由小分子聚合而成的可溶性大分子链转移剂，结构相对单一，缺乏生物活性和复杂的功能性。因此，可以设想将具有生物活性的大分子，例如葡聚糖、蛋白质等引入这种体系，则所获得的材料将会具有某些特殊的功能性和生物活性。同时通过调控生物大分子与小分子的比例将会制得不同形貌具有不同功能的纳米粒子。

聚合引发的自组装(PISA)可以在高聚合物浓度(高达50％固含量)下进行反应，合成出不同形貌的纳米粒子，由于是在聚合过程中进行组装，因此省去了中间复杂的制备过程。而随着活性/可控自由基聚合的发展，尤其是将可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)技术和聚合诱导自组装技术相结合，极大促进了自组装技术的应用范围，使之成为一种经济环保的纳米材料合成方法。同时可通过调控参数，改变链转移剂与接枝大分子的亲疏水特性来合成具有不同形貌的纳米粒子，采用光引发作为引发手段，条件温和可控，不会由于温度等的原因破坏生物大分子材料的生物活性，使生物大分子在经过修饰之后仍可投入作为功能性材料使用，为以后的生物工程制药方向提供一种条件温和，高浓度条件下方便生产纳米粒子的方法手段，在未来制药方面有重大研究意义。

同时由于葡聚糖具有亲水性，因此可使用具有能合成疏水性的聚合物的原料作为小分子单体，通过调控参数得到亲疏水不同的高分子纳米粒子。同时由于葡聚糖具有一定的生物活性，在生物体内可以起到修复细胞，提高免疫细胞活性，清除自由基等功效。葡聚糖不仅在胞内，在生物组织内也能起到很高的功效。因此，可以合成具有生物活性和复杂功能性的两亲性高分子纳米材料。所以以葡聚糖为基底进行聚合诱导自组装行为具有很高的实用价值。与之前的有机两亲性嵌段高分子纳米材料相比，这种高分子纳米粒子具有更好的应用前景，也在生物医药和微型反应器方面具有重要意义。

目前，聚合诱导自组装技术在高分子领域中，主要是将可控聚合技术和分散聚合的方法有效结合起来制备高分子纳米粒子。PISA可分为RAFT水相乳液聚合和RAFT分散聚合，大部分RAFT水相乳液聚合只能得到球形形貌。而RAFT分散聚合可在水、乙醇、非极性溶剂甚至聚乙二醇介质中制备多种形貌(如微球、纤维、囊泡等)的聚合物纳米材料，适用条件广泛。

但是目前，有关于RAFT水相分散自组装的研究，大多数文献所报道的都是通过热引发的手段进行。相对于热引发，光引发能在室温下进行，反应速率较快而且可实现反应过程的即时操控：通过光源的开闭控制反应的进行与停止。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是提供一种新型的基于天然大分子的纳米载体。目的是对某些药物进行包载，保护以及运输。使药物在某些特殊环境下释放后仍可保持其活性。本发明解决的另一个技术问题是提供一种新型的基于天然大分子的纳米载体的制备方法。

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于葡聚糖的新型纳米载体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备葡聚糖大分子链转移剂；

步骤二、将葡聚糖大分子链转移剂溶于水中，再加入甲基丙烯酸羟丙酯HPMA；待完全溶解后，加入钌联吡啶配体溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应，得到基于葡聚糖的新型纳米载体。

优选的是，所述葡聚糖大分子链转移剂的制备包括以下步骤：

步骤a、按重量份，将1份葡聚糖和2.4～2.5份氢氧化钠溶于12～18份水中，在60～80℃下搅拌溶解，然后滴加1.7～1.9份氯乙酸，继续在60～80℃下反应1.5～2.5h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至180～250份乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于8～12份水中，透析，冷冻干燥得到羧基化葡聚糖；

步骤b、按重量份，将0.1～0.2份羧基化葡聚糖溶于4～6份水中，得到羧基化葡聚糖水溶液；将0.003～0.004份己二胺溶于8～12份水中，得到己二胺溶液，用4～6mol/L的HCl溶液调节己二胺溶液pH至5.5～6.5；再将羧基化葡聚糖的水溶液以1份/min的速度至己二胺溶液中，待稳定后，再次调节pH至5.5～6.5，然后加入0.15～0.17份1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDAC，搅拌，常温下反应3～5h后再加入0.1～0.13份1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，继续搅拌反应7～9h；过滤后透析3～5天，冷冻干燥得到白色絮状产物；

步骤c、按重量份，取0.04～0.05份步骤b的白色絮状产物溶于25～30份水中，然后将0.001～0.0015份RAFT试剂溶于3mLDMSO中，将两者混合均匀后常温下遮光反应20～30h，然后透析2～4天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂。

优选的是，所述RAFT试剂的制备方法包括以下步骤：

步骤Ⅰ、按重量份，4～4.5份将4，4'-偶氮二(4-氰基戊酸)和4.2～4.7份2-巯基噻唑溶解在180～250份二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧25～45min；将6.5～7份二环己基碳二亚胺和0.08～1.12份4-二甲氨基吡啶溶解在80～120份二氯甲烷中，之后在室温下以1份/min的速度到除氧后的溶液中；搅拌，反应18～24h，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末；

步骤Ⅱ、按重量份，使用恒压漏斗向12～14份甲醇钠中加入5.5～6.5份丙硫醇，搅拌溶解10min后，控制反应温度在0℃时溶于甲醇；将溶液继续搅拌10min，加入6～6.5份二硫化碳，反应22～26h，除去溶剂得到粗产品；用氢氧化钠溶液调节pH至13，乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，HCl溶液调节pH至2，乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；所述氢氧化钠溶液的配制方法为：按重量份，取5～7份氢氧化钠加入180～220份水中；所述HCl溶液的配制方法为：按体积份，取8～12份盐酸溶解在180～220份水中；

步骤Ⅲ、按重量份，将8～12份铁氰化钾溶于40～60份水中，用恒压漏斗加入步骤Ⅱ的产物，反应10～14h后得到红棕色油状物；取产物用石油醚与乙酸乙酯的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析分离得到纯化的产品；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为1：3；

步骤Ⅳ、按重量份，取1.2～1.5份步骤Ⅲ的产品和2.5～3.5份步骤Ⅰ黄色固体粉末产物溶解在140～160份乙酸乙酯中，除氧1h，在80～85℃下加热回流反应15～20h；旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析分离得到纯化的产物，即RAFT试剂。

优选的是，所述步骤二中，按重量份，将0.002～0.004份葡聚糖大分子链转移剂溶于0.8～1.2份水中，再加入0.04～0.06份甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入0.015～0.025份钌联吡啶配体溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应5～7h，得到基于葡聚糖的新型纳米载体。

优选的是，所述钌联吡啶配体溶液的浓度为8～12mg/L；所述钌联吡啶配体溶液为氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液。

本发明还提供一种如上述的基于葡聚糖的新型纳米载体的制备方法制备的新型纳米载体，所述的新型纳米载体具有对所包载物质的保护能力，在加热过后，释放出来的药物仍具有其功能性。

优选的是，所述包载物质为盐酸阿霉素、葡萄糖氧化酶、尼罗红中的任意一种。

本发明还提供一种如上述的基于葡聚糖的新型纳米载体的制备方法制备的新型纳米载体对包载物质的包载方法，包括：按重量份，将0.002～0.004份葡聚糖大分子链转移剂溶于0.8～1.2份水中，再加入0.04～0.06份甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入0.015～0.025份钌联吡啶配体溶液和0.008～0.15份包载物质溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应5～8h，得到包载有包载物质的新型纳米载体。

优选的是，所述包载物质溶液的浓度为0.1～1.5mg/mL；所述包载物质溶液为盐酸阿霉素溶液、葡萄糖氧化酶溶液、尼罗红溶液中的任意一种。

本发明至少包括以下有益效果：本发明合成了一种α-端巯基噻唑啉酯活化的RAFT试剂，再以70kDa的葡聚糖为基元进行修饰，使葡聚糖表面接上氨基；通过氨基与RAFT试剂上的活泼酯反应以得到葡聚糖大分子链转移剂；以HPMA为单体，加入氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物作为引发剂，在蓝光下引发，进行RAFT可控聚合；由于疏水链增长，聚合物整体的亲疏水性的改变，葡聚糖-PHPMA耦合体在溶液中进行自组装得到大小均匀的球形纳米粒子；在应用方面，所制得的纳米粒子具有良好的稳定性，低细胞毒性；并以三种不同的物质对纳米粒子进行了包载测试，均得到了实现，还发现纳米粒子对生物大分子有一定的保护作用，证实其在药物输送等方面有很好的应用潜能。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明：

图1为本发明实施例1中步骤三所合成产物的核磁表征；

图2为本发明实施例1中步骤四所合成羧基化葡聚糖的红外表征；

图3a为实施例1中步骤四不同浓度羧基化葡聚糖和铜离子反应后紫外吸收曲线；

图3b为实施例1中步骤四紫外吸收265nm处拟合曲线；

图4为实施例1中步骤五所合成氨基化葡聚糖的红外表征；

图5a为实施例1中步骤五不同浓度甘氨酸和TNBS反应后紫外吸收曲线；

图5b为实施例1中步骤五甘氨酸紫外吸收特征峰拟合曲线；

图6a为实施例1中步骤五不同浓度氨基化葡聚糖和TNBS反应后紫外吸收曲线；

图6b为实施例1中步骤五氨基化葡聚糖紫外吸收特征峰拟合曲线；

图7a为实施例1中步骤六标准三硫键的紫外吸收拟合曲线；

图7b为实施例1中步骤六中三硫键紫外吸收拟合曲线；

图8为实施例1中步骤七所合成的纳米载体SEM形貌表征；

图9为实施例1中步骤七所合成的纳米载体TEM形貌表征；

图10为实施例1中步骤七所合成的纳米载体反应不同时间下DLS粒径柱状图；

图11为实施例1中步骤八所合成的纳米载体在不同浓度下和酵母菌细胞共培养24h后的细胞存活率柱状图；

图12为实施例2中被包覆和未被包覆的尼罗红染料的荧光发射光谱；

图13为实施例3中包覆了盐酸阿霉素的纳米粒子被破坏后，离心得到的上清液的荧光光谱图；

图14a为实施例4中葡萄糖氧化酶的紫外特征吸收峰标准曲线；

图14b为实施例4中破坏的纳米粒子所释放的葡萄糖氧化酶的紫外吸收曲线；(其中，上方曲线为反应前，下方曲线为稀释两倍反应后体系的紫外吸收曲线)

图15为被纳米粒子包载与未被纳米粒子包载的葡萄糖氧化酶高温处理后与葡萄糖混合后的pH变化曲线图。

具体实施方式：

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1：

步骤一、将4.01g的4，4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)和4.50g的2-巯基噻唑溶解在200mL二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧气30min；将6.82g二环己基碳二亚胺和0.10g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100mL二氯甲烷中，之后在室温下缓慢滴加到上述溶液中；搅拌，反应20h后，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液再过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末ACVA-ACPM3.83g；

步骤二：合成二(丙基磺酰基硫羰基)二硫化物；称量13.686g甲醇钠，使用恒压漏斗加入5.9g丙硫醇，搅拌溶解10min后，控制反应温度在0℃时溶于50mL甲醇；将溶液继续搅拌10min，然后加入6.12g二硫化碳，反应24h后，旋转蒸发得到粗产品；再用6g/200mL的氢氧化钠调节pH至碱性，用乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，再用10mL/200mL的HCl溶液调节pH至酸性，使用乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；将10g铁氰化钾溶于50mL水中，用恒压漏斗加入粗产品，反应12h后得到红棕色油滴；取产物用石油醚与乙酸乙酯(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)分离得到纯化的产品1.39g；

步骤三、取步骤二产物(1.39g)和步骤一产物ACVA-ACPM(3.0g)溶解在150mL乙酸乙酯中，除氧1h后，在83℃下加热回流反应18h；旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:5，体积比)分离得到纯化的产物560mg，即RAFT试剂；并对产物进行核磁共振氢谱测试，如图1所示；

步骤四、称取1g葡聚糖和2.4g氢氧化钠于圆底烧瓶，溶于15mL水中，在70℃下搅拌溶解；完全溶解后，向烧瓶中加入1.8g氯乙酸，继续在70℃下反应2h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至200mL乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于20mL水中，透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物980mg，并对其进行红外表征，证实了羧基接枝在葡聚糖表面，如图2；再对其进行羧基数计算，使用Cu(II)法测试羧基含量，所得葡聚糖紫外吸光吸收如图3(其中图3a中，配好的Dextran-COOH溶液分别置于22个离心管中，分别加入2mmol/L的硫酸铜溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL、1.0mL、1.1mL、1.2mL、1.3mL、1.4mL、1.5mL、1.6mL、1.8mL、2.0mL、2.2mL、2.4mL、2.6mL、2.8mL，并用水稀释到5mL，然后再测定所有样品的紫外吸收；)计算得到表面平均有羧基64.8个；

步骤五、称取115mg羧基化葡聚糖于锥形瓶中，溶于5mL水；再取3.45mg己二胺溶于10mL水中，用5M的HCl溶液调节pH至5.95；再将羧基化葡聚糖的水溶液缓慢滴加至己二胺溶液中，待稳定后，再次调节pH至5.92；加入160mg 1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDAC，搅拌，常温下反应4h后加入EDAC 120mg，继续搅拌反应8h；将溶液过滤后透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物94.2mg；并对其进行红外表征，证实了氨基接枝在葡聚糖表面，如图4；再对其进行氨基数计算，使用TNBS法测试氨基含量，甘氨酸标准结果如图5，氨基化葡聚糖测试曲线如图6，计算得到表面平均有氨基24.9个；

步骤六、取45mg步骤五得到的白色絮状产物溶于27mL水中，使其与1.1mg RAFT试剂(溶于3mL DMSO)常温下反应24h，然后透析3天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂41mg；利用紫外/可见光谱仪测定了一种只含有三硫键一种发色团的RAFT试剂4-氰基-4-(((丙硫基)羰基硫基)硫基)戊酸的紫外吸收光谱，其5种不同浓度(0.1mg/mL、0.075mg/mL、0.05mg/mL、0.0375mg/mL、0.25mg/mL)的紫外吸收光谱，然后取不同浓度RAFT试剂在320nm处的吸光度值绘制曲线，得到三硫键的摩尔吸光系数ε后，将葡聚糖大分子链转移剂配成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL的水溶液，利用紫外/可见光谱仪得到不同浓度葡聚糖RAFT链转移剂的紫外吸收光谱，然后取相应浓度葡聚糖RAFT试剂在320nm处的吸光度值(A320 nm)，绘制曲线如图7a所示，并进行拟合，得到其标准曲线如图7b所示，最终计算得到平均每个葡聚糖RAFT链转移剂上有3个RAFT基团；

步骤七、将3mg葡聚糖大分子链转移剂溶于1mL水中，再加入50μL HPMA；待完全溶解后，加入20μL的10mg/mL氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液，同时进行遮光处理；再将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，最后将反应瓶放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应6h，得到产物，即纳米载体；

步骤八、对所得到的纳米载体进行SEM和TEM测试以及反应不同时间下所得纳米粒子的DLS分析，数据如图8，9，10所示，可得纳米载体的基本形貌，观察到纳米载体基本结构尺寸都相对稳定，同时将不同浓度的纳米载体与酵母菌细胞共培养24h，所得酵母菌细胞存活率如图11所示，可见其良好的生物相容性。

实施例2：

步骤一、将4.07g的4，4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)和4.53g的2-巯基噻唑溶解在200mL二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧气30min；将6.77g二环己基碳二亚胺和0.10g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100mL二氯甲烷中，之后在室温下缓慢滴加到除氧后的溶液中；搅拌，反应20h后，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液再过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末ACVA-ACPM3.78g；

步骤二、合成二(丙基磺酰基硫羰基)二硫化物；称量13.721g甲醇钠，使用恒压漏斗加入5.92g丙硫醇，搅拌溶解10min后，控制反应温度在0℃时溶于50mL甲醇；将溶液继续搅拌10min，然后加入6.18g二硫化碳，反应24h后，旋转蒸发得到粗产品；再用6g/200mL的氢氧化钠调节pH至碱性，用乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，再用10mL/200mL的HCl溶液调节pH至酸性，使用乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；将10g铁氰化钾溶于50mL水中，用恒压漏斗加入粗产品，反应12h后得到红棕色油滴；取产物用石油醚与乙酸乙酯(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)分离得到纯化的产品1.40g；

步骤三、取步骤二产物(1.40g)和步骤一产物ACVA-ACPM(3.0g)溶解在150mL乙酸乙酯中，除氧1h后，在83℃下加热回流反应18h；旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:5，体积比)分离得到纯化的产物621mg，即RAFT试剂；

步骤四、称取1.02g葡聚糖和2.47g氢氧化钠于圆底烧瓶，溶于15mL水中，在70℃下搅拌溶解；完全溶解后，向烧瓶中加入1.78g氯乙酸，继续在70℃下反应2h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至200mL乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于20mL水中，透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物995mg，即羧基化葡聚糖；

步骤五、称取113mg羧基化葡聚糖于锥形瓶中，溶于5mL水；再取3.40mg己二胺溶于10mL水中，用5M的HCl溶液调节pH至5.92；再将羧基化葡聚糖的水溶液缓慢滴加至己二胺溶液中，待稳定后，再次调节pH至5.92；加入180mg EDAC，搅拌，常温下反应4h后加入EDAC100mg，继续搅拌反应8h；将溶液过滤后透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物93.1mg；

步骤六、取44mg步骤五的白色絮状产物溶于27mL水中，使其与1.2mg RAFT试剂(溶于3mL DMSO)常温下反应24h，然后透析3天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂36.7mg；

步骤七、将3mg葡聚糖大分子链转移剂溶于1mL水中，再加入50μL HPMA；待完全溶解后，加入20微升的10mg/mL氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液并加入10μL的0.2mg/mL的尼罗红四氢呋喃溶液，同时进行遮光处理；再将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，最后将反应瓶放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应6h；

步骤八、取溶液稀释后进行荧光测试；同时配出尼罗红四氢呋喃溶液，也进行荧光测试；将两者测试后得到的曲线进行对比，如图12，可以看出，在尼罗红的四氢呋喃溶液与601nm处有荧光吸收峰，而在聚合生成纳米载体并使用蒸馏水洗涤之后的葡聚糖纳米粒子溶液里，通过测定得到的尼罗红的荧光峰出现在637nm，相比两条曲线的差别，可以发现尼罗红的荧光峰发生了明显的偏移，这种现象可以说明尼罗红已经成功在葡聚糖纳米粒子自组装过程中被包载。

实施例3：

步骤一、将4.00g的4，4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)和4.47g的2-巯基噻唑溶解在200mL二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧气30min；将6.85g二环己基碳二亚胺和0.11g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100mL二氯甲烷中，之后在室温下缓慢滴加到上述除氧气后的溶液中；搅拌，反应20h后，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液再过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末ACVA-ACPM3.92g；

步骤二、合成二(丙基磺酰基硫羰基)二硫化物；称量13.842g甲醇钠，使用恒压漏斗加入5.89g丙硫醇，搅拌溶解10min后，控制反应温度在0℃时溶于50mL甲醇；将溶液继续搅拌10min，然后加入6.21g二硫化碳，反应24h后，旋转蒸发得到粗产品；再用6g/200mL的氢氧化钠调节pH至碱性，用乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，再用10mL/200mL的HCl溶液调节pH至酸性，使用乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；将10g铁氰化钾溶于50mL水中，用恒压漏斗加入粗产品，反应12h后得到红棕色油滴；取产物用石油醚与乙酸乙酯(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)分离得到纯化的产品1.43g；

步骤三：取步骤二产物(1.43g)和步骤一产物ACVA-ACPM(3.03g)溶解在150mL乙酸乙酯中，除氧1h后，在83℃下加热回流反应18h；旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:5，体积比)分离得到纯化的产物582mg；即RAFT试剂；

步骤四、称取1.0g葡聚糖和2.42g氢氧化钠于圆底烧瓶，溶于15mL水中，在70℃下搅拌溶解；完全溶解后，向烧瓶中加入1.81g氯乙酸，继续在70℃下反应2h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至200mL乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于20mL水中，透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物973mg；即羧基化葡聚糖；

步骤五、称取118mg羧基化葡聚糖于锥形瓶中，溶于5mL水；再取3.60mg己二胺溶于10mL水中，用5M的HCl溶液调节pH至5.88；再将羧基化葡聚糖的水溶液缓慢滴加至己二胺溶液中，待稳定后，再次调节pH至5.90；加入180mgEDAC，搅拌，常温下反应4h后加入EDAC100mg，继续搅拌反应8h。将溶液过滤后透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物93.1mg；

步骤六、取46mg步骤五的白色絮状产物溶于27mL水中，使其与1.3mg RAFT试剂(溶于3mL DMSO)常温下反应24h，然后透析3天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂35.8mg；

步骤七、将3mg葡聚糖链转移剂加入900μL水中，再加入45μL HPMA；待完全溶解后，加入20μL的10mg/mL氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液并加入100μL的1mg/mL的盐酸阿霉素水溶液，同时进行遮光处理；再将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，最后将反应瓶放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应6h；

步骤八、将步骤七的产物进行离心，得到纳米载体之后，用清水洗净；将纳米载体在水中分散后，加入适量的淀粉酶，室温下反应20h将纳米粒子的结构破坏，释放其包载的盐酸阿霉素；反应一段时间之后，取上层清液稀释10倍，取500μL进行荧光测试；同时将其中荧光阿霉素的激发波长为475nm，发射波长为595nm；所得到的荧光光谱如图13，根据所测得的荧光光谱，可以说明盐酸阿霉素已经成功的包载进入葡聚糖纳米粒子内部。

实施例4：

步骤一、将4.05g的4，4'-偶氮二(4-氰基戊酸)(ACVA)和4.53g的2-巯基噻唑溶解在200mL二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧气30min；将6.81g二环己基碳二亚胺和0.110g4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解在100mL二氯甲烷中，之后在室温下缓慢滴加到上述除氧后的溶液中；搅拌，反应20h后，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液再过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末ACVA-ACPM3.95g；

步骤二、合成二(丙基磺酰基硫羰基)二硫化物；称量13.654g甲醇钠，使用恒压漏斗加入5.93g丙硫醇，搅拌溶解10min后，控制反应温度在0℃时溶于50mL甲醇；将溶液继续搅拌10min，然后加入6.22g二硫化碳，反应24h后，旋转蒸发得到粗产品；再用6g/200mL的氢氧化钠调节pH至碱性，用乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，再用10mL/200mL的HCl溶液调节pH至酸性，使用乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；将10g铁氰化钾溶于50mL水中，用恒压漏斗加入粗产品，反应12h后得到红棕色油滴；取产物用石油醚与乙酸乙酯(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:3，体积比)分离得到纯化的产品1.54g；

步骤三、取上步产物(1.54g)和第一步产物ACVA-ACPM(3.05g)溶解在150mL乙酸乙酯中，除氧1h后，在83℃下加热回流反应18h。旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析(乙酸乙酯:石油醚＝1:5，体积比)分离得到纯化的产物730mg；即RAFT试剂；

步骤四、称取1.0g葡聚糖和2.41g氢氧化钠于圆底烧瓶，溶于15mL水中，在70℃下搅拌溶解；完全溶解后，向烧瓶中加入1.79g氯乙酸，继续在70℃下反应2h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至200mL乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于20mL水中，透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物1005mg；即羧基化葡聚糖；

步骤五、称取120mg羧基化葡聚糖于锥形瓶中，溶于5mL水；再取3.70mg己二胺溶于10mL水中，用5M的HCl溶液调节pH至5.90；再将羧基化葡聚糖的水溶液缓慢滴加至己二胺中，待稳定后，再次调节pH至5.94；加入180mg EDAC，搅拌，常温下反应4h后加入EDAC100mg，继续搅拌反应8h；将溶液过滤后透析4天，冷冻干燥得到白色絮状产物95.2mg；

步骤六、取45mg步骤五的白色絮状产物溶于27mL水中，使其与1.2mg RAFT试剂(溶于3mL DMSO)常温下反应24h，然后透析3天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂39.6mg；

步骤七、取3mg葡聚糖大分子链转移剂溶于900μL水中，再加入55μL HPMA；待完全溶解后，加入20μL的10mg/mL氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液并加入100μL的1mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液，同时进行遮光处理；再将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，最后将反应瓶放入装有460nm紫外光灯的暗室中反应6h；

步骤八、将步骤七的产物进行离心，取上清液稀释2倍后对其进行紫外测试；根据资料，葡萄糖氧化酶在377nm处以及455nm处有紫外吸收峰；取葡萄糖氧化酶，分别配成浓度为0.25mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL，4mg/mL测定其标准吸收曲线如图14所示；根据对比，可以计算出，葡聚糖纳米载体包载的葡萄糖氧化酶的浓度为0.0564mg/mL，而初始的葡萄糖氧化酶的浓度为0.25mg/mL。根据计算公式包载率＝c_Entrapped/c_feed×100％因此得到葡萄糖氧化酶的包载率为22.57％。

步骤九、试验纳米载体对葡萄糖氧化酶的保护作用，根据资料，葡萄糖氧化酶的失活温度为75℃；将包载了酶的纳米载体以及葡萄糖氧化酶的水溶液各2mL分别置于两只EP管中，一同在水浴锅中加热至80℃并维持15min；之后将两只EP管取出，分别加入4mg葡萄糖，测试其pH，如图15。由pH-T图可以发现，在14h后，装有纳米粒子的EP管溶液pH降低至4.39，而装有葡萄糖氧化酶的溶液的EP管的pH仍然为7.0。说明纳米粒子能够一定程度上保护酶，使得酶维持原有的功能。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (7)

1.一种基于葡聚糖的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备葡聚糖大分子链转移剂；

步骤二、将葡聚糖大分子链转移剂溶于水中，再加入甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入钌联吡啶配体溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10 min后，将反应器放入装有460 nm紫外光灯的暗室中反应，得到基于葡聚糖的纳米载体；

所述葡聚糖大分子链转移剂的制备包括以下步骤：

步骤a、按重量份，将1份葡聚糖和2.4~2.5份氢氧化钠溶于12~18份水中，在60~80℃下搅拌溶解，然后滴加1.7~1.9份氯乙酸，继续在60~80℃下反应1.5~2.5h；降至室温后加入乙酸调节溶液pH至中性；再将液体沉淀至180~250份乙醇中，除去上层清液后将沉淀溶于8~12份水中，透析，冷冻干燥得到羧基化葡聚糖；

步骤b、按重量份，将0.1~0.2份羧基化葡聚糖溶于4~6份水中，得到羧基化葡聚糖水溶液；将0.003~0.004份己二胺溶于8~12份水中，得到己二胺溶液，用4~6mol/L的HCl溶液调节己二胺溶液pH至5.5~6.5；再将羧基化葡聚糖的水溶液以1份/min的速度滴加至己二胺溶液中，待稳定后，再次调节pH至5.5~6.5，然后加入0.15~0.17份1-乙基3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐EDAC，搅拌，常温下反应3~5 h后再加入0.1~0.13份1-乙基3-(3-二甲氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐，继续搅拌反应7~9h；过滤后透析3~5天，冷冻干燥得到白色絮状产物；

步骤c、按重量份，取0.04~0.05份步骤b的白色絮状产物溶于25~30份水中，然后将0.001~0.0015份RAFT试剂溶于3mLDMSO中，将两者混合均匀后常温下遮光反应20~30h，然后透析2~4天并冷冻干燥，得到葡聚糖大分子链转移剂；

所述RAFT试剂的制备方法包括以下步骤：

步骤Ⅰ、按重量份，4~4.5份将4，4'-偶氮二（4-氰基戊酸）和4.2~4.7份2-巯基噻唑溶解在180~250份二氯甲烷中，然后在氩气条件下除氧25~45min；将6.5~7份二环己基碳二亚胺和0.08~1.12份4-二甲氨基吡啶溶解在80~120份二氯甲烷中，之后在室温下1份/min的速度滴加到除氧后的溶液中；搅拌，反应18~24h，抽滤，取溶液进行旋转蒸发浓缩；再将浓缩后的溶液过冷乙醚中进行沉淀；再次抽滤，取固体，将固体进行真空干燥，得到黄色固体粉末；

步骤Ⅱ、按重量份，使用恒压漏斗向12~14份甲醇钠中加入5.5~6.5份丙硫醇，搅拌溶解10 min后，控制反应温度在0℃时溶于甲醇；将溶液继续搅拌10 min，加入6~6.5份二硫化碳，反应22~26h，除去溶剂得到粗产品；用氢氧化钠溶液调节pH至13，乙醚萃取未反应的反应物，收集水相，HCl溶液调节pH至2，乙醚萃取，取乙醚相；重复多次以上步骤后将最终产物溶于水相；所述氢氧化钠溶液的配制方法为：按重量份，取5~7份氢氧化钠加入180~220份水中；所述HCl溶液的配制方法为：按体积份，取8~12份盐酸溶解在180~220份水中；

步骤Ⅲ、按重量份，将8~12份铁氰化钾溶于40~60份水中，用恒压漏斗加入步骤Ⅱ的产物，反应10~14 h后得到红棕色油状物；取产物用石油醚与乙酸乙酯的混合溶液萃取，再用无水硫酸钠洗涤，旋转蒸发后通过柱层析分离得到纯化的产品；所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为1：3；

步骤Ⅳ、按重量份，取1.2~1.5份步骤Ⅲ的产品和2.5~3.5份步骤Ⅰ黄色固体粉末产物溶解在140~160份乙酸乙酯中，除氧1 h，在80~85℃下加热回流反应15~20 h；旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析分离得到纯化的产物，即RAFT试剂。

2.如权利要求1所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，按重量份，将0.002~0.004份葡聚糖大分子链转移剂溶于0.8~1.2份水中，再加入0.04~0.06份甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入0.015~0.025份钌联吡啶配体溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460 nm紫外光灯的暗室中反应5~7h，得到基于葡聚糖的纳米载体。

3.如权利要求1所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法，其特征在于，所述钌联吡啶配体溶液的浓度为8~12mg/L；所述钌联吡啶配体溶液为氯化三(2，2'-联吡啶)钌(II)六水合物溶液。

4.一种如权利要求1~3任一项所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法制备的纳米载体，其特征在于，所述的纳米载体具有对所包载物质的保护能力，在加热过后，释放出来的药物仍具有其功能性。

5.如权利要求4所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法制备的纳米载体，其特征在于，所述包载物质为盐酸阿霉素、葡萄糖氧化酶、尼罗红中的任意一种。

6.一种如权利要求1~3任一项所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法制备的纳米载体对包载物质的包载方法，其特征在于，包括：按重量份，将0.002~0.004份葡聚糖大分子链转移剂溶于0.8~1.2份水中，再加入0.04~0.06份甲基丙烯酸羟丙酯；待完全溶解后，加入0.015~0.025份钌联吡啶配体溶液和0.008~0.15份包载物质溶液；将反应物在氩气条件下遮光除氧10min后，将反应器放入装有460 nm紫外光灯的暗室中反应5~8h，得到包载有包载物质的纳米载体。

7.如权利要求6所述的基于葡聚糖的纳米载体的制备方法制备的纳米载体对包载物质的包载方法，其特征在于，所述包载物质溶液的浓度为0.1~1.5mg/mL；所述包载物质溶液为盐酸阿霉素溶液、葡萄糖氧化酶溶液、尼罗红溶液中的任意一种。

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