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CN112969783A - 包含酮酸的培养基 - Google Patents

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CN112969783A CN201980074128.3A CN201980074128A CN112969783A CN 112969783 A CN112969783 A CN 112969783A CN 201980074128 A CN201980074128 A CN 201980074128A CN 112969783 A CN112969783 A CN 112969783A
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Abstract

本发明涉及一种培养基，优选细胞培养基，其包含选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一种酮酸和/或这些酮酸的盐。本发明进一步涉及本发明的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。本发明的另一方面涉及一种制造细胞培养产物的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。

Description

包含酮酸的培养基
发明领域
本发明涉及生物技术生产方法。更具体地，本发明涉及用于生物技术生产方法中的改善的培养基，使用这样的改善的培养基的方法，以及从使用该改善的培养基的方法获得的产品。
发明背景
生物技术方法被广泛用于生产生物产品。这些方法通常涉及在允许培养的细胞的生长和产物形成的条件下在培养基中培养细胞。可用于生物技术生产的细胞是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞以及动物或植物来源的细胞。
长期以来，动物细胞培养已用于生产生物产品，例如治疗性蛋白质、多肽、寡肽或其他生物分子，例如治疗性多糖。在这样的细胞培养过程中，通常经过基因修饰以产生所需产物的动物细胞在液体、固体或半固体培养基中培养以用于细胞增殖和产物形成。细胞培养的一个显著优点是动物细胞和植物细胞能够对初级产物进行翻译后修饰，例如多肽的折叠和翻译后修饰。
在生物技术生产方法中，特别是在动物细胞培养中，细胞培养条件的控制和优化对于细胞增殖和产物形成至关重要。一个决定性因素是培养基组成。最终细胞培养产物的浓度和质量在很大程度上取决于培养基组成。就所需的营养组成和培养条件而言，动物和植物细胞培养是特别有需要的。所需的营养物不仅包括碳、氮和能量的基本来源，例如糖和氨，还包括更复杂的营养物，例如必需氨基酸、生长因子和维生素。由于这个原因，向动物细胞培养基补充复杂的营养成分例如血清已用于向动物细胞提供广泛多样的营养物。但是，监管和安全问题以及与可用血清来源的异质性相关的问题已导致业界努力从工业细胞培养过程中消除血清和其他成分不确定的培养基。但是，在无血清培养基中生长的细胞培养物通常显示营养不足。由于这个原因，已经付出了很多努力来鉴定复杂培养基的那些营养成分及其最佳浓度，这是细胞培养物中令人满意的生长和蛋白质形成所必需的。克服营养不足的一种常用策略是在培养过程中进料用过的培养基成分。用于补给的高度浓缩的溶液被称为进料培养基。与基础培养基一起优化它们的组成遵循相同的逻辑。
一个具体的应用子集是生产病毒作为疫苗或作为用于基因治疗的载体。在这两种情况下，细胞培养过程均显示出明显的分离成两个阶段。第一阶段是病毒的制造，旨在最大化病毒产率。第二阶段是使用载体转染细胞。在此，培养基理想地支持高转染效率。
向细胞培养物提供氨基酸已知对生长速率和产量具有显著作用。谷氨酰胺常规用于细胞培养基和进料，因为它是培养的细胞的重要碳、氮和能量来源。已经证明，动物细胞培养物的最佳生长所必需的谷氨酰胺的量是其他氨基酸的量的3至10倍(Eagle等人，Science 130：432-37)。然而，谷氨酰胺作为营养物当在升高的温度下(例如热灭菌条件)溶解于水中时不稳定，因为在加热下形成焦谷氨酸和氨(Roth等人，1988,In VitroCellular&Developmental Biology 24(7):696-98)。因此，通常在细胞培养基中使用谷氨酸代替谷氨酰胺(Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-basedTherapies,52,Sadettin等人编辑，Taylor and Francis Group,2006)。
以前已经描述了在细胞培养应用中在L-谷氨酰胺代谢和Krebs能量循环中均起关键作用的戊二酸的酮衍生物α-酮戊二酸(AKG)的用途(Hassel&Butler,Journal of CellScience 96,501-508,Evonik Nutrition&Care GmbH,Scientific overview:cQrexTM AKG,February 2016)。可以证明，在CHO和杂交瘤细胞系的情况下，通过将AKG加入商购可得的培养基，最大活细胞密度(VCD)可以增加超过30％，并且整体活细胞密度(IVCD)可以增加超过50％。
尽管上述现有技术中描述的细胞培养基为某些细胞培养过程提供了令人满意的性能和特性，但是现有技术的培养基仍然不是最佳的。仍然需要在生物技术生产过程中促进更好的生长和产物形成的进一步改良的培养基。这对于基于细胞的病毒生产(无论是作为疫苗还是用于治疗)的新兴领域尤其相关。通常，该领域的关键挑战是去除血清以改善增殖性能并提高病毒差率。后者对于这两种应用是特别相关的。在流行病的情况下，需要在很短的时间内制作大量的疫苗。对于基因治疗，最小化起始载体生产和施用之间的时间是确保治疗成功的关键参数。
因此，本发明的目的是提供一种高级培养基，其促进各种细胞系的更好的生长和产物形成，并且另外减少毒性氨的量。
发明概述
本发明解决了已知培养基的上述缺点。本发明由所附独立权利要求的术语限定。本发明的优选实施方案由从属权利要求限定。
因此，本发明涉及一种培养基，优选地为细胞培养基，其包含选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一种酮酸和/或这些酮酸的盐。
本发明进一步涉及本发明的培养基用于培养细胞，优选植物细胞、动物细胞或哺乳动物细胞的用途。
本发明的另一方面涉及一种制造细胞培养产物的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与根据本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或所述细胞获得所述细胞培养产物。
在本发明的以下详细描述中进一步详细描述了本发明的优选实施方案。
附图的简要说明
图1描述了在不存在和存在根据本发明的支链酮酸(BCKA)钾盐的混合物的情况下，人胚肾(HEK)细胞中9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体滴度。
图2描述了在不存在和存在根据本发明的支链酮酸(BCKA)钾盐的混合物的情况下，HEK细胞中9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体感染力(通过萤光素酶活性测量)。
图3描绘了在含有不同量的酮亮氨酸而不是L-亮氨酸的细胞培养基中培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的第三次传代的整体活细胞密度。
图4显示了在含有不同量的酮亮氨酸而不是L-亮氨酸的细胞培养基中培养的CHO细胞产生的抗体的相对浓度。
图5显示了在除了L-缬氨酸之外还包含不同量的酮缬氨酸的细胞培养基中培养的CHO细胞的最大活细胞密度。
图6显示了在除了L-缬氨酸之外还包含不同量的酮缬氨酸的细胞培养基中培养的CHO细胞产生的抗体的相对浓度。
发明详述
α-酮酸在新陈代谢中具有不同的功能。支链氨基酸的酮酸类似物在氨基酸代谢中起着重要作用，尤其是在骨骼肌和肝脏中。肌肉蛋白的三分之一由人体无法形成但必须与饮食一起摄取的支链氨基酸组成。在肌肉中，特别是在体育锻炼的情况下，蛋白质不断合成并分解，其中在氨基酸的分解过程中，相应的α-酮酸是通过将氨基转移到载体上而形成的。然后可以将所得的酮酸进一步酶促氧化以用于能量产生。载体被运输到肝脏，并在那里释放出氨，氨被转化为尿素并通过肾脏排泄。
早已知道将衍生自支链氨基酸的α-酮酸用于药物目的。例如，α-酮异己酸酯(酮亮氨酸)尤其可用于减少肌肉中的蛋白质分解，和用于减少由肌肉手术后的蛋白质分解导致的尿素形成(US 4,677,121)。还描述了酮亮氨酸在营养不良、肌肉营养不良或尿毒症以及其他疾病中的用途，这些疾病是肌肉中蛋白质分解的次要结果。酮亮氨酸在这样的情况下通过静脉内施用。另外，已经提出对必须维持减少蛋白质的饮食(例如由于肾衰竭)的患者施用亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的α-酮酸(US 4,100,161)。关于各种医学适应症，α-酮酸在蛋白质代谢中的作用也描述于Walser,M.等人,Kidney International,Vol.38(1990),pp.595-604。
相比之下，在功能性食品领域，支链氨基酸被直接用于支持肌肉堆积，例如在运动员中(Shimomura,Y.等人,American Society for Nutrition)。在US 6,100,287中描述了亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的α-酮酸用于改善肌肉性能并且还用于支持疲劳后的肌肉恢复的用途，其中使用相应的阴离子酮酸与阳离子氨基酸的盐作为抗衡离子，例如精氨酸或赖氨酸。然而，作为结果，还形成了多胺，已知它们可导致细胞凋亡(程序性细胞死亡)。多胺的分解产物的排泄通过肾脏进行，因此肾脏承受进一步的压力。
然而，到目前为止，在培养的细胞中还没有显示出任何作用。
根据本发明，“培养基”应理解为含有营养物的液体或固体培养基，该培养基适合于滋养和支持培养物中细胞的生命和/或产物形成。根据本发明，培养的细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、动物细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞和/或植物细胞例如藻类。通常，培养基提供细胞维持生命、生长和/或产物形成所需的必需和非必需氨基酸、维生素、至少一种能源、脂质和微量元素。培养基还可以包含在最小速率以上促进生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。培养基优选具有支持细胞的生命、生长和/或产物形成的pH和盐浓度。根据本发明的培养基优选地包含维持细胞培养物的生命和增殖所必需的所有营养物。培养基可以是成分确定的或成分不确定的。优选的培养基是成分确定的培养基。
根据本发明，“成分确定的培养基”是不包含细胞提取物、细胞水解产物或蛋白质水解产物的培养基。优选的成分确定的培养基不包含未知组成的组分。如本领域技术人员通常所理解的，成分确定的培养基通常不含动物来源的组分。优选地，成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构。优选的成分确定的培养基是无血清培养基。其他优选的成分确定的培养基是合成培养基。除“成分确定的培养基”以外的其他培养基被称为“复杂的”培养基。
“细胞培养基”应被理解为适合于维持动物细胞和/或植物细胞的生命、增殖和/或产物形成的培养基。在某些实施方案中，可以区分基础培养基和进料培养基。
“基础培养基”应被理解为是含有营养物的溶液或物质，在其中起始细胞的培养。“进料培养基”应理解为是在培养过程开始后用其喂养细胞的溶液或物质。在某些实施方案中，进料培养基包含基础培养基中不存在的一种或多种组分。进料培养基还可以缺少基础培养基中存在的一种或多种组分。优选地，进料培养基中营养物的浓度超过基础培养基中的浓度，以避免由于稀释而导致生产力的损失。
根据本发明，“营养物”是细胞存活和生长所需的化合物或物质。营养物优选地由细胞从环境吸收。营养物可以是“有机营养物”和“无机营养物”。有机营养物包括碳水化合物、脂肪、蛋白质(或其构建模块，例如氨基酸)和维生素。无机营养物是无机化合物，例如饮食矿物质和微量元素。“必需营养物”是细胞自身不能合成的营养物，因此必须由培养基提供给细胞。
根据本发明，“细胞培养产物”应理解为由细胞在细胞培养物中产生的任何有用的生物化合物。本发明优选的细胞培养产物是治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、治疗性多糖例如肝素、抗体例如单克隆抗体、生长因子、白介素、肽激素、酶、以及病毒包括但不限于病毒载体和疫苗。在其他实施方案(包括但不限于用于治疗用途的干细胞的培养)中，细胞本身应理解为细胞培养产物。
在本发明的上下文中，“氨基酸”应被理解为包含氨基官能团(-NH2)和羧酸官能团(-COOH)以及对各自氨基酸特异的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是如下的20种“天然氨基酸”：
Figure BDA0003059236700000061
Figure BDA0003059236700000071
在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括以上列出的20种氨基酸的L-形式和D-形式。然而，L形式是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。
根据本发明，“游离氨基酸”应理解为具有游离形式的其氨基和其(α-)羧基官能团为的氨基酸，即不与其他分子共价键合，例如不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸还可以以盐或水合物形式存在。当将氨基酸称为寡肽的一部分或在寡肽中时，应理解为是指根据生物化学和肽生物合成的已知机制衍生自相应氨基酸的相应寡肽结构的该部分。
根据本发明，“支链氨基酸”(BCAA)应理解为具有带有支链的脂族侧链(结合至三个或更多个碳原子的中心碳原子)的氨基酸。在蛋白质性氨基酸中，有三种BCAA：亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸。非蛋白质性BCAA包括2-氨基异丁酸。
根据本发明，“酮酸”应理解为是包含羧酸基和酮基的有机化合物。
“α-酮酸”应理解为具有与羧酸相邻的酮基的酮酸。根据本发明的酮酸选自氨基酸的酮类似物，即酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸和/或这些酮酸的盐。酮酸的盐还应包括这类酮酸的混合盐。这样的混合盐可以通过不同的酮酸的共结晶来产生。
根据本发明，“支链酮酸”(BCKA)应理解为BCAA的酮类似物，即酮亮氨酸、酮缬氨酸和酮异亮氨酸和/或这些BCKA的盐。BCKA的盐还应包括此类BCKA的混合盐。此类混合盐可通过不同BCKA的共结晶产生。
根据本发明，“生长因子”应被理解为能够刺激细胞生长、增殖和细胞分化的任何天然存在的物质。优选的生长因子为蛋白质或类固醇激素的形式。根据本发明的一个实施方案，表述“生长因子”应被解释为涉及选自以下的生长因子：成纤维细胞生长因子(FGF)、包括酸性FGF和碱性FGF、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)包括TGFα和TGFβ、细胞因子例如白介素1、2、6、粒细胞刺激因子和白细胞抑制因子(LIF)。
营养物组合物、培养基、细胞培养基等的“无菌形式”应理解为定义在所述组合物、培养基、细胞培养基等中不存在任何活物。
在本发明的上下文中，“固体培养基”应理解为任何非液体或非气体培养基。本发明优选的固体培养基是凝胶状培养基，例如琼脂(agar-agar)、角叉菜胶或明胶。
在本发明的上下文中，“细胞的传代”(也称为细胞的传代培养或分瓶(splitting))应理解为是指将少量细胞转移到新的培养容器中。如果定期分瓶，则细胞可以培养更长的时间，因为它避免了与延长的高细胞密度有关的衰老。悬浮培养物很容易用少量的培养物(其含有稀释在较大体积的新鲜培养基中的少量细胞)传代。
本发明一般涉及培养基，优选细胞培养基，所述培养基包含选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一种酮酸和/或这些酮酸的盐。酮酸优选选自支链酮酸酮亮氨酸、酮缬氨酸和酮异亮氨酸。
在一个具体的实施方案中，培养基包含两种或更多种酮酸的混合盐。在该实施方案中，使选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的两种或更多种游离酮酸与一种或多种碱土金属盐共结晶，所述碱土金属盐优选选自碳酸钙、氢氧化钙、乙酸钙、氯化钙、氧化钙、氢氧化镁和乙酸镁。
在本发明的优选配置中，培养基包含约2:1:1的近似比例的酮亮氨酸、酮缬氨酸和酮异亮氨酸。
进一步优选使用所述酮酸的碱金属盐或碱土金属盐。优选的盐是所述酮酸的Na+、K+、Ca2+和Mg2+盐。特别优选的是所述酮酸的Na+或K+盐。
在一个实施方案中，培养基还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。在一个特别优选的实施方案中，培养基包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和至少一种维生素中的全部。
根据本发明的另一个实施方案，培养基为液体形式，为凝胶、粉末、颗粒、丸剂的形式或为片剂形式。
在优选的实施方案中，本发明的培养基是成分确定的培养基或无血清培养基。例如，可以将本发明的酮酸补充至Miltenyi Biotech(Bergisch Gladbach,Germany)的CHOMACS CD培养基、可从LONZA(Basel,Switzerland)获得的PowerCHO-2CD培养基、PAA的Acti-CHO P培养基(PAA Laboratories，Pasching，Austria)、可从SAFC获得的Ex-Cell CDCHO培养基、ThermoFisher(Waltham,USA)的SFM4CHO培养基和CDM4CHO培养基。本发明的酮酸也可以补充到DMEM培养基(Life Technologies Corp.,Carlsbad,USA)中。但是，本发明不限于上述培养基的补充。
在其他优选的实施方案中，培养基是相对于所述培养基的使用浓度的2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用相应体积的无菌水简单稀释浓缩培养基来制备“即用型”培养基。这样的浓缩形式的本发明的培养基还可以通过将其添加至培养物(例如在分批进料培养过程中)来使用。
本发明的培养基优选包含持续生长和产物形成所需的所有营养物。用于制备培养基，特别是细胞培养基的配方是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Cell CultureTechnology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies,
Figure BDA0003059236700000101
and Wei-ShouHu eds.,Taylor and Francis Group 2006)。各种培养基可从各种来源商购获得。
本发明的培养基优选包括碳水化合物源。细胞培养基中使用的主要碳水化合物是葡萄糖，常规以5至25nM补充。另外，可以使用任何己糖，例如半乳糖、果糖或甘露糖或组合。
培养基通常还至少包含必需氨基酸(即His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Try、Val)以及某些非必需氨基酸。如果细胞系不能够合成氨基酸，或者如果细胞系不能产生足够量的氨基酸以支持最大生长，则通常在细胞培养基中包括非必需氨基酸。另外，哺乳动物细胞也可以使用谷氨酰胺作为主要能源。谷氨酰胺通常以比其他氨基酸(2-8mM)更高的浓度包含在内。但是，如上所述，谷氨酰胺可自发分解以形成氨，并且某些细胞系更快地产生有毒的氨。
本发明的培养基优选包含盐。将盐添加到细胞培养基中以维持等渗条件并防止渗透失衡。本发明的培养基的重量克分子渗透压浓度为约300mOsm/kg，尽管许多细胞系可以耐受该值的约10％或更高的变化。一些昆虫细胞培养物的重量克分子渗透压浓度倾向于高于300mOsm/kg，并且这可以比300mOsm/kg高0.5％、1％、2至5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％。细胞培养基中最常用的盐包括Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-和HCO3-(例如CaCl2、KCl、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4)。
培养基中可以存在其他无机元素。它们包括Mn、Cu、Zn、Mo、Va、Se、Fe、Ca、Mg、Si和Ni。这些元素中的许多都涉及酶促活性。它们可以以盐的形式提供，例如CaCl2、Fe(NO3)3、MgCl2、MgSO4、MnCl2、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4以及微量元素例如硒、钒和锌的离子。这些无机盐和微量元素可以例如从Sigma(Saint Louis,Missouri)商购获得。
本发明的培养基优选包含维生素。维生素通常被细胞用作辅助因子。每种细胞系对维生素需求差异很大，尽管如果细胞培养基包含很少或没有血清，或者如果细胞以高密度生长，则通常需要额外的维生素。优选存在于本发明的培养基中的示例性维生素包括生物素、氯化胆碱、叶酸、i-肌醇、烟酰胺、D-Ca++-泛酸酯、吡哆醛、核黄素、硫胺素、吡哆醇、烟酰胺、A、B6、B12、C、D3、E、K和对氨基苯甲酸(PABA)。
本发明的培养基还可以包含血清。血清是凝结的血液的上清液。血清成分包括附着因子，微量营养物(例如微量元素)，生长因子(例如激素、蛋白酶)和保护性元素(例如抗毒素、抗氧化剂、抗蛋白酶)。血清可从多种动物来源获得，包括人、牛或马血清。当包含在根据本发明的细胞培养基中时，通常以5-10％(体积)的浓度添加血清。优选的细胞培养基是无血清的。
为了促进在不存在血清的情况下或在血清减少的培养基中的细胞生长，可以将一种或多种以下多肽添加到本发明的细胞培养基中：例如，成纤维细胞生长因子(FGF)包括酸性FGF和碱性FGF、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、上皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子(TGF)包括TGFα和TGFβ、任何细胞因子如白介素1、2、6、粒细胞刺激因子、白细胞抑制因子(LIF)等。
在其他实施方案中，培养基不包含多肽(即，具有超过20个氨基酸的肽)。
本发明的培养基还可包含较短链的肽：实例包括谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的二肽。
还可以将一种或多种脂质添加到本发明的培养基中，例如亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、棕榈油酸、油酸、多烯酸和/或12、14、16、18、20或24个碳原子的脂肪酸，每个碳原子是分支或不分支的)，磷脂，卵磷脂(磷脂酰胆碱)和胆固醇。这些脂质中的一种或多种可以作为补充剂包括在无血清培养基中。磷脂酸和溶血磷脂酸刺激某些锚定依赖性细胞(例如MDCK、小鼠上皮和其他肾细胞系)的生长，而磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇刺激人成纤维细胞在无血清培养基中的生长。乙醇胺和胆固醇也被显示促进某些细胞系的生长。在某些实施方案中，细胞培养基不含脂质。
还可以将一种或多种载体蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)或转铁蛋白，添加到培养基中。载体蛋白可以帮助某些营养物或微量元素的运输。BSA通常用作不溶于水溶液的脂质(例如亚油酸和油酸)的载体。此外，BSA还可以用作某些金属(例如Fe、Cu和Ni)的载体。在不含蛋白质的制剂中，非动物来源的BSA替代物(例如环糊精)可用作脂质载体。
还可以将一种或多种附着蛋白(例如纤连蛋白、层粘连蛋白和pronectin)添加到细胞培养基中，以帮助促进锚定依赖性细胞与基底的附着。
培养基可以任选地包含一种或多种缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于N-[2-羟乙基]-哌嗪-N'-[2-乙磺酸](HEPES)、MOPS、MES、磷酸盐、碳酸氢盐和适用于细胞培养应用的其他缓冲剂。合适的缓冲剂是提供缓冲能力而对培养的细胞没有实质性细胞毒性的缓冲剂。合适的缓冲剂的选择在细胞培养领域的普通技术人员的能力范围内。
可以将聚阴离子或聚阳离子化合物添加到培养基中，以防止细胞结块并促进悬浮液中细胞的生长。
在一个优选的实施方案中，培养基为液体形式。但是，培养基也可以是固体培养基，例如凝胶状培养基，例如含琼脂的培养基、含角叉菜胶的培养基或含明胶的培养基。
优选地，培养基为无菌形式。
在本发明的优选实施方案中，酮酸在所述培养基中以0.01至10g/l、或0.1至5g/l、或0.1至0.5g/l的浓度，优选0.01至0.2g/l的浓度存在。
上述浓度以非浓缩培养基中的浓度(即实际培养物中存在的浓度)给出。浓缩培养基可包含X倍更高的浓度。
在本发明的一个替代实施方案中，将酮酸分别补充到含有缺乏的非酮类似物的培养基中。在一个具体的实施方案中，培养基包含酮亮氨酸和亮氨酸两者和/或酮缬氨酸和缬氨酸两者和/或酮异亮氨酸和异亮氨酸两者和/或酮苯丙氨酸和苯丙氨酸两者。在另一个实施方案中，氨基酸被培养基中的酮类似物取代。在一个具体的实施方案中，培养基包含酮亮氨酸代替亮氨酸和/或包含酮缬氨酸代替缬氨酸和/或包含酮异亮氨酸代替异亮氨酸和/或包含酮苯丙氨酸代替苯丙氨酸。
本发明的培养基可以是浓缩形式。它可以是例如2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍浓缩的形式(相对于支持细胞的生长和产物形成的浓度)。这样的浓缩培养基有助于通过用水性溶剂例如水稀释浓缩培养基来制备供使用的培养基。这样的浓缩培养基可以用于分批培养，但是也可以有利地用于分批进料或连续培养，其中将浓缩的营养成分添加到正在进行的细胞培养中，例如以补充培养期间细胞消耗的营养物。
在本发明的其他实施方案中，培养基为干燥形式，例如为干粉形式，或为颗粒形式，或为丸剂形式，或为片剂形式。
本发明还涉及本发明的培养基用于培养细胞的用途。本发明的另一方面涉及本发明的培养基用于产生细胞培养产物的用途。
本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的培养基用于培养动物细胞或植物细胞，最优选的哺乳动物细胞的用途。在特定的实施方案中，待培养的细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。本发明优选的细胞是CHO细胞和HEK细胞。
培养细胞的方法也包括在本发明的范围内，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的细胞培养基接触。在本发明的一个实施方案中，培养细胞的方法包括在支持细胞培养的条件下使细胞与基础培养基接触，并用根据本发明的浓缩培养基补充基础细胞培养基。在优选的实施方案中，在超过一天的时间里向基础培养基补充浓缩的进料或培养基。
另一方面涉及产生根据本发明的培养基的方法，其中所述培养基包含根据本发明的至少一种酮酸。产生根据本发明的培养基的方法包括将本发明的至少一种酮酸添加到培养基中的至少一个步骤。类似地，本发明的一个方面涉及本发明的酮酸用于产生细胞培养基的用途。
另一方面涉及修饰培养基的方法，其中所述培养基的所述修饰包括向所述培养基添加本发明的至少一种酮酸。
另一个方面涉及产生液体培养基的方法，所述方法包括提供根据本发明的固体培养基(例如为干粉形式、或为颗粒形式、或为丸剂形式或为片剂形式)；和将所述固体培养基溶解在水性介质例如水中。
本发明的另一方面涉及本发明的酮酸在用于培养细胞的培养基中的用途。本发明的另一方面涉及根据本发明的酮酸用于细胞培养的用途。
本发明还涉及制造细胞培养产物的方法，其包括以下步骤：(i)提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；(ii)使所述细胞与本发明的培养基接触；和(iii)从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。类似地，本发明涉及根据本发明的酮酸用于制备细胞培养产物的用途。
在优选的方法中，细胞培养产物是治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、多糖例如肝素、抗体、单克隆抗体、生长因子、白介素、病毒、病毒样颗粒或酶。
根据本发明的细胞培养可以以分批培养、分批进料培养或连续培养进行。
实施例
实施例1：在人胚胎肾(HEK)细胞中产生9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关 病毒(AAV2)的病毒载体
在无血清培养基(FreeStyle 293表达培养基，Thermo Fisher Scientific)中在添加或不添加钾盐形式的1mM BCKA混合物的情况下培养人胚肾(HEK 293T)细胞。所使用的混合物包含比例为2:1:1的支链酮酸酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸的K+盐。在存在或不存在支链酮酸混合物的情况下，用质粒DNA转染细胞以产生9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体。使用定量实时聚合酶链反应(qPCR)确定在HEK 293T细胞中产生的质粒数量。
为了进行qPCR分析，从孔中刮出培养的细胞，并通过以1,500rpm离心5分钟沉淀。除去上清液至剩余1.0ml培养基；将细胞重悬并冷冻在-80℃。为了确保细胞的裂解，将它们冷冻并融化三遍。在最后的解冻后，将细胞以1,000×g离心5分钟，然后将上清液转移至新试管中。为了从完整的病毒颗粒去除任何未包封的游离病毒DNA和衣壳，用DNA酶和蛋白酶K处理上清液。进行实时qPCR以检测AAV DNA的多聚A区域。
图1显示了在不存在和存在支链酮酸(BCKA)钾盐混合物的情况下，9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体滴度。将在不添加BCKA的无血清培养基中测得的病毒载体滴度标准化至1，以显示与向培养基添加BCKA相比，病毒载体滴度的变化。出乎意料的是，向用于培养细胞的无血清培养基添加BCKA钾盐混合物导致对于AAV2的2.3倍更高的病毒载体滴度，和对于AAV9的3.7倍更高的病毒载体滴度。
实施例2：用9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体感染 人胚肾(HEK)细胞
收获由实施例1中所述的经转染的HEK 293T细胞产生的病毒颗粒，并且在不存在或存在于也实施例1中使用的BCKA钾盐混合物的情况下，在无血清培养基中将新鲜的HEK293T细胞与病毒上清液一起孵育。使用萤光素酶测定法分析病毒颗粒的感染性。萤光素酶基因还被掺入到病毒载体中，并且检测到的萤光素酶活性与产生的萤光素酶的量成比例，并且用作病毒颗粒在细胞中的摄取的读出。
图2显示了在不存在和存在BCKA钾盐混合物的情况下9型腺相关病毒(AVV)(AAV9)和2型腺相关病毒(AAV2)的病毒载体感染力(通过萤光素酶活性测量)。将在不添加BCKA的无血清培养基中测定的感染力标准化至1，以显示与向培养基中添加BCKA相比，病毒载体感染力的变化。出乎意料的是，向用于培养细胞的无血清培养基中添加BCKA钾盐混合物导致对于AAV2 1.5倍增加的感染力，和对于AAV9 1.65倍增加的感染力。
实施例3：在不同浓度的酮亮氨酸的存在下在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生抗体
将产生抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(DG44亚克隆)在摇瓶中(分别具有50ml或100ml培养体积的125ml或250ml)在含有8mM L-谷氨酰胺的TC42/CHOMACS CD培养基(TeutoCell AG)中培养。通过混合两种溶液来制备培养基。第一种包含常规培养基制剂(包含L-亮氨酸和氯化钙)。在第二种中，用作为钙盐的等摩尔量的酮亮氨酸(178mg/l)取代培养基中的氨基酸L-亮氨酸。这些溶液以不同的比例混合。将在不同混合物中培养的细胞的生长与在常规培养基中培养的细胞进行比较。
图3显示了在含有不同量的酮亮氨酸而不是L-亮氨酸的培养基中培养的CHO细胞的整体活细胞密度。X轴显示每毫升106个细胞中的整体活细胞密度(VCD)。A对应于在含有178mg/L酮亮氨酸的培养基中培养的细胞，B对应于含有30％(v/v)的酮亮氨酸溶液的混合物，C对应于含有5％(v/v)的酮亮氨酸溶液的混合物和参照物仅含L-亮氨酸。最终培养基中酮亮氨酸的最终浓度示于表1。对于含有酮亮氨酸而不是L-亮氨酸的培养基，活细胞密度略有降低。然而，可以清楚地证明氨基酸L亮氨酸可以被酮类似物酮亮氨酸取代。
表1：最终培养基中的酮亮氨酸(keto-leu)浓度
条件 最终keto-leu浓度
A 178 mg/L
B 53.4 mg/L
C 8.9 mg/L
参照物 0 mg/L
图4显示了在含有不同量的酮亮氨酸而不是L-亮氨酸的培养基中培养的CHO细胞(如图3所示)产生的抗体的相对浓度。在含有L-亮氨酸的参照物培养基(参照物)中培养的细胞产生的抗体浓度标准化至1.0。这清楚地表明，在用于产生抗体的培养的CHO细胞中L-亮氨酸可以被支链酮酸酮亮氨酸取代。
实施例4：在不同浓度的酮缬氨酸的存在下在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生抗体
将产生抗体的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(DG44亚克隆)在摇瓶中(分别具有50ml或100ml培养体积的125ml或250ml)在含有8mM L-谷氨酰胺的TC42/CHOMACS CD培养基(TeutoCell AG)中培养。通过混合两种溶液来制备培养基。第一种包含常规培养基制剂(包含L-缬氨酸和氯化钙)。在第二种中，将作为钙盐的163mg/L的酮酸keto-val添加到常规培养基中。这些溶液以不同的比例混合。
图5显示了在除了L-缬氨酸之外还包含不同量的酮缬氨酸的培养基中培养的CHO细胞的最大活细胞密度。X轴显示每毫升106个细胞中的最大活细胞密度(VCD)。A代表含有L-缬氨酸和163mg/L的酮缬氨酸的溶液。B是含有70％(v/v)的具有酮缬氨酸的培养基和30％(v/v)的常规培养基的混合物。C是具有55％(v/v)的具有酮缬氨酸的培养基和45％(v/v)的常规培养基的混合物。D包含5％(v/v)的酮缬氨酸溶液，而参照物对应于如上文所述的常规培养基。最终培养基中酮缬氨酸的最终浓度如表2所示。
表2：最终培养基中的酮缬氨酸(keto-val)浓度
最终keto-val浓度
A 163 mg/L
B 114.1 mg/L
C 89.65 mg/L
D 8.15 mg/L
参照物 0 mg/L
图6显示了在含有不同量的酮缬氨酸和L-缬氨酸的培养基中培养的CHO细胞(如图5所示)产生的抗体的相对浓度。将在参照物中培养的细胞产生的抗体的浓度标准化至1.0。可以清楚地表明，与在不存在酮缬氨酸的情况下培养的细胞相比，在存在酮缬氨酸的情况下抗体产生得以增强。
实施例5：BCKA对细胞因子分泌的作用
首先，通过分化从THP-1单核细胞获得巨噬细胞。在研究预防方案时，在通过LPS诱导免疫反应前24小时，添加包含2:1:1的比例的支链酮酸酮亮氨酸:酮异亮氨酸:酮缬氨酸(BCKA)的Ca+盐的BCKA混合物。对于用BCKA进行的处理，在之前和不断地选择不同的时间段。当开始LPS处理时停止使用BCKA的处理(LPS刺激之前的BCKA处理)或继续进行使用BCKA的处理(对LPS刺激持续的BCKA处理)。为了评估免疫反应的水平，在细胞培养上清液中测量促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6。用BCKA处理的细胞的促炎细胞因子的表达如图1所示。
图7显示了100μg/ml BCKA对三种促炎细胞因子的分泌的影响。在三个独立的测定中测量细胞因子的量，每个测定一式三份，并将其标准化至每个相应样品中的细胞数。误差棒代表标准偏差。
阳性对照和阴性对照在任何时候都不暴露于BCKA，并显示出相对刺激的基线的脂多糖触发的细胞因子释放。用BCKA处理然后用LPS作为炎症刺激处理的细胞标记为“炎症前(+)”，未暴露于LPS但同样用BCKA处理的细胞标记为“炎症前(-)”。后者用作检查BCKA本身是否引起细胞因子释放或以另一种方式干扰测定的对照。这被排除在外，因为用天然化合物处理的细胞显示出与阴性对照相同的细胞因子谱。在LPS刺激之前用BCKA进行预处理的情况下，可以观察到细胞因子释放的显著减少。这证实了先前和持续用BCKA处理对免疫反应的显著作用。此外，使用单一酮酸酮缬氨酸、酮亮氨酸和酮异亮氨酸也获得了相似的结果。
用酮缬氨酸处理的细胞的促炎细胞因子的表达示于图8。图9显示了用酮亮氨酸处理的促炎细胞因子的表达。在图10中，用酮异亮氨酸处理细胞。
图8显示了100μg/ml的酮缬氨酸对三种促炎细胞因子的分泌的影响。在三个独立的测定中测量细胞因子的量，每个测定一式两份，并将其标准化至每个相应样品中的细胞数。误差棒代表标准偏差。
图9显示了100μg/ml的酮亮氨酸对三种促炎细胞因子分泌的影响。在三个独立的测定中测量细胞因子的量，每个测定一式两份，并将其标准化至每个相应样品中的细胞数。
图10显示了100μg/ml的酮异亮氨酸对三种促炎细胞因子分泌的影响。在三个独立的测定中测量细胞因子的量，每个测定一式两份，并将其标准化至每个相应样品中的细胞数。误差棒代表标准偏差。

Claims (16)

1.一种培养基，例如细胞培养基，其包含选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一种酮酸和/或这些酮酸的盐。
2.权利要求1的培养基，其中所述酮酸是选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸的支链酮酸。
3.前述权利要求中任一项的培养基，其中所述培养基包含2:1:1的大致比例的酮亮氨酸、酮缬氨酸和酮异亮氨酸。
4.前述权利要求中任一项的培养基，其包含所述酮酸的碱金属盐或碱土金属盐。
5.前述权利要求中任一项的培养基，其包含所述酮酸的Na+、K+、Ca2+和Mg2+盐，优选Na+或K+盐。
6.前述权利要求中任一项的培养基，所述培养基还包含至少一种碳水化合物、至少一种游离氨基酸、至少一种无机盐、缓冲剂和/或至少一种维生素。
7.前述权利要求中任一项的培养基，其中所述培养基为液体形式、凝胶、粉末、颗粒、丸剂的形式或片剂的形式。
8.前述权利要求中任一项的培养基，其中所述培养基是无血清培养基或成分确定的培养基。
9.前述权利要求中任一项的培养基，其中所述酮酸以0.01至10g/l、或0.1至5g/l、或0.1至0.5g/l的浓度，优选0.01至0.2g/l的浓度存在于所述培养基中。
10.前述权利要求中任一项所述的培养基，其中所述培养基相对于所述培养基的使用浓度是2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩的形式。
11.权利要求1-9中任一项的培养基用于培养细胞的用途。
12.权利要求11的用途，其中所述细胞是动物细胞或植物细胞，优选哺乳动物细胞。
13.权利要求12的用途，其中所述细胞选自：CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HEK细胞、HELA细胞、AE-1细胞、昆虫细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、神经细胞、干细胞、皮肤细胞、内皮细胞和杂交瘤细胞。
14.选自酮亮氨酸、酮缬氨酸、酮异亮氨酸和酮苯丙氨酸的至少一种酮酸和/或这些酮酸的盐在培养基中用于培养细胞的用途。
15.一种制造细胞培养产物的方法，其包括以下步骤：
提供能够产生所述细胞培养产物的细胞；
使所述细胞与权利要求1-9中任一项的培养基接触；和
从所述培养基或从所述细胞获得所述细胞培养产物。
16.权利要求15的方法，其中所述细胞培养产物选自：治疗性蛋白质、诊断性蛋白质、多糖例如肝素、抗体、单克隆抗体、生长因子、白介素、病毒、病毒样颗粒和酶。
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