CN112946040A - 电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考中的应用。本发明的电化学发光免疫传感器，包括电化学发光探针，其包括Cu₂S纳米片，Cu₂S纳米片通过化学键连接有氟苯尼考抗体；电化学发光电极，其包括电极本体，电极本体上修饰有CeO₂@TiO₂纳米复合材料，CeO₂@TiO₂纳米复合材料通过化学键连接有氟苯尼考包被抗原。本发明开发了一种基于能量共振转移的竞争型ECL免疫传感器，使用CeO₂@TiO₂纳米复合材料和Cu₂S纳米片分别作为能量供体及能量受体与免疫探针，用于超灵敏定量检测氟苯尼考。

Description

电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考中的应用

技术领域

本发明涉及氟苯尼考检测技术领域，尤其涉及一种电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考中的应用。

背景技术

氯霉素类抗生素(包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考)以抗菌谱广、机体易吸收、用药成本低等优点广泛应用于动物细菌病的防治，经多年使用通过食物链对人体毒副作用日益凸显，尤其是氯霉素易导致人体和动物发生再生障碍性贫血而倍受关注，为此包括中国在内的许多国家明文规定肉禽蛋奶水产品中氯霉素不得检出。鉴于氯霉素被禁用，以甲砜基替代氯霉素分子苯环上硝基的衍生物第二代氯霉素类抗生素：甲砜霉素、氟苯尼考对动物与人体的毒副作用大大地降低，仍以其广谱、高效、吸收迅速、分布广泛安全、动物专用等特点作为氯霉素替代药物在国内外畜牧和水产养殖细菌病治疗中迅速获得广泛推广使用，尽管其毒副作用远远小于氯霉素，仍对机体一定毒副作用如甲砜霉素对机体免疫系统发育的抑制。

氟苯尼考(Florfenicol，FF)是在八十年代后期成功研制的一种新的兽医专用氯霉素类合成抗生素，具有抗菌谱广、吸收迅速、用药后体内分布广泛、残留低等优点，被广泛应用于治疗呼吸系统感染和肠道感染。但在现阶段，畜禽或水产养殖户在使用过程中容易发生超剂量使用、给药途径和给药间隔不正确、与其他抗生素类药物混用、重复用等问题。且由于其胚胎毒性，可造成禽蛋早期胚胎死亡。氟苯尼考的不正确使用、频繁滥用，致使其使用量高于推荐剂量，对畜禽等产生一定的免疫抑制作用。人类食用氟苯尼考残留超标的动物源性产品，容易损害人体骨髓造血机能，引起粒细胞缺乏、溶血性贫血，甚至死亡等。为此我国规定动物源可食部分中两种药物最高残留标准均小于100-1000ppb。

目前对动物源性食品中氟苯尼考残留量的测定方法主要有气相色谱法、气相色谱－质谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱－串联质谱法。气相色谱法和气相色谱－质谱法目前处理较复杂，需要对样品进行衍生化处理，检测效率不理想；而高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法是目前国内外较常用的检测方法。此法虽然具有定量相对准确、线性关系良好、出峰时间稳定、无杂质干扰等优点，但是高效液相色谱-串联质谱法仪器昂贵、操作繁琐、成本较高，因而普及较难。上述方法虽然可以解决一些问题，但是在检测的时长、成本及灵活性方面也都存在一些缺点和不足，已经无法满足人们的需要。

电化学发光(ECL)由于其灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、操作简便等优点已经在分析领域引起广泛关注，电化学发光免疫分析法(ECLIA)是电化学发光和免疫分析法的有效结合，集中了电化学发光和免疫学的各种优点，因此具有很多独特的优势。随着研究的不断深入，基于纳米材料的ECL生物传感器在分析应用中显示出比传统的传感器更好的前景。而ECL系统中的能量共振转移(ECL-RET)现象是一种较为新颖的ECL生物传感策略，它通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体，使供体发光强度降低，当受体的紫外吸收光谱与供体的ECL发射光谱有较大重叠时，且距离满足一定条件时就会发生。ECL-RET方法具有不需要激发光源，从而避免了光散射、自发荧光和背景信号高等问题，而且与荧光能量共振转移相比，ECL-RET可以在相对较长的距离之间发生。

因此，有必要开发一种氟苯尼考的ECL-RET检测方法，以提高其检测灵敏度、降低操作难度。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种电化学发光免疫传感器及其在检测氟苯尼考中的应用，本发明开发了一种基于能量共振转移的竞争型ECL免疫传感器，使用CeO₂@TiO₂纳米复合材料和Cu₂S纳米片分别作为能量供体及能量受体与免疫探针，用于超灵敏定量检测氟苯尼考。

本发明的第一个目的是提供一种电化学发光(ECL)免疫传感器，包括：

电化学发光探针，其包括Cu₂S纳米片，Cu₂S纳米片通过化学键连接有氟苯尼考抗体；

电化学发光电极，其包括电极本体，电极本体上修饰有CeO₂@TiO₂纳米复合材料，CeO₂@TiO₂纳米复合材料通过化学键连接有氟苯尼考包被抗原。

进一步地，电化学发光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将硫脲与铜盐在胺类溶液中混匀，并在60-120℃(优选80℃)下反应，反应完全后得到雪花状的Cu₂S纳米片，然后用含巯基的羧酸修饰Cu₂S纳米片，得到羧基化的Cu₂S；

(2)用交联剂活化羧基化的Cu₂S，然后将活化后的Cu₂S与氟苯尼考抗体孵育，使氟苯尼考抗体通过酰胺键与活化后的Cu₂S连接，得到电化学发光探针。

进一步地，在步骤(1)中，含巯基的羧酸为巯基乙酸。

进一步地，在步骤(1)中，胺类为乙二胺。

进一步地，在步骤(2)中，交联剂为NHS和EDC。

进一步地，电化学发光探针中，Cu₂S纳米片和氟苯尼考抗体的质量比为100:1。

进一步地，电化学发光电极的制备方法包括以下步骤：

(S1)利用凝胶-溶胶法，将二氧化铈粉末的酸性溶液与钛酸四丁酯溶液混匀后老化，得到凝胶，然后将凝胶在400-500℃(优选450℃)下煅烧，煅烧完毕后得到CeO₂@TiO₂纳米复合材料；

(S2)用含巯基的羧酸修饰CeO₂@TiO₂纳米复合材料，得到羧基化的CeO₂@TiO₂；

(S3)用交联剂活化羧基化的CeO₂@TiO₂，然后将活化后的CeO₂@TiO₂修饰到电极本体上，然后将电极本体在氟苯尼考包被抗原中孵育，使氟苯尼考包被抗原通过酰胺键与羧基化的CeO₂@TiO₂连接，得到电化学发光电极。

进一步地，在步骤(S1)中，用氨水调节六水合硝酸铈的水溶液和过氧化氢的混合物的 pH，将产物离心洗涤干燥，再经过煅烧后得到二氧化铈(CeO₂)粉末。

进一步地，在步骤(S2)中，含巯基的羧酸为巯基乙酸。

进一步地，在步骤(S3)中，电极本体为玻碳电极。

进一步地，在步骤(S3)中，交联剂为NHS和EDC。

进一步地，在步骤(S3)中，将活化后的CeO₂@TiO₂滴加在经过抛光的电极本体表面，干燥后再向电极本体表面滴加氟苯尼考包被抗原。

进一步地，在步骤(S3)中，孵育温度为4℃。

进一步地，在步骤(S3)之后，用BSA封阻，消除电极的非特异性吸附。

进一步地，电化学发光电极中，CeO₂@TiO₂纳米复合材料和氟苯尼考包被抗原的质量比为50:1。

本发明制备的电化学发光探针和纳米复合材料修饰的电化学发光电极，由此构建的电化学发光免疫传感器较传统的ELISA法具有更高灵敏度(100倍以上)。

本发明的第二个目的是公开电化学发光免疫传感器在定量或定性检测氟苯尼考中的应用。

本发明的第三个目的是公开一种利用上述电化学发光免疫传感器检测氟苯尼考的方法，包括以下步骤：

(a1)将电化学发光探针的溶液离心去掉上清液，再将沉淀物与不同浓度的氟苯尼考标准溶液混合均匀，氟苯尼考标准溶液的浓度为0.001-1000ng mL^-1，将得到的混合溶液与电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗未与电化学发光电极结合的电化学发光探针及氟苯尼考；

(a2)以经步骤(a1)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立ECL发光强度与氟苯尼考浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

(a3)向待测溶液中加入电化学发光探针，将得到的混合溶液与电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗电化学发光电极；

(a4)以经步骤(a3)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系进行循环伏安扫描，根据测得电位-发光强度关系，结合步骤(a2)建立的ECL发光强度与氟苯尼考浓度对数值的线性关系和线性回归方程得出待测溶液中氟苯尼考的浓度。

进一步地，在步骤(a1)中，电化学发光探针的溶液的浓度为0.5mg/mL。

进一步地，在步骤(a1)中，电化学发光探针的溶液在离心前的浓度为0.5mg/mL，离心前的电化学发光探针的溶液与氟苯尼考标准溶液的体积比为1:1。

进一步地，在步骤(a3)中，待测溶液所用溶剂为乙酸乙酯。

进一步地，在步骤(a2)中，在-1.8～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压600～800V，扫速0.2V/s，进行循环伏安扫描，ECL信号将随着氟苯尼考标准溶液浓度的改变而改变。

进一步地，在步骤(a2)和(a4)中，化学发光免疫传感器的电化学发光电极中，用TiO₂纳米颗粒包裹CeO₂纳米颗粒以形成CeO₂@TiO₂纳米复合材料，解决了由TiO₂的宽带隙引起的限制，提高了供体的ECL发射信号，经过化学键与氟苯尼考包被抗原(FF-Ag)结合。同样通过酰胺键将氟苯尼考抗体(FF-Ab)与雪花状的Cu₂S纳米片探针相连。

利用上述电化学发光免疫传感器检测氟苯尼考时，定量基础是氟苯尼考与FF-Ag竞争有限的FF-Ab。

当氟苯尼考不存在时，供体激发态能量会被通过抗原抗体特异性结合而连接到电极上的 Cu₂S纳米片受体吸收，ECL被削弱；当氟苯尼考存在时，受体和检测物相连，从而显示强的ECL信号。当氟苯尼考标准溶液浓度增大时，连接到电极上的电化学发光探针减少，此时 ECL信号增强。由于显著的猝灭效应和简单的装配过程，该免疫传感器具有出色的灵敏度、精确度和重现性，对于氟苯尼考的检测具有重要的现实意义。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明的电化学发光免疫传感器包括电化学发光探针及电化学发光电极，其中的Cu₂S 纳米片作为能量受体与免疫探针，CeO₂@TiO₂纳米复合材料作为能量供体，分别利用氟苯尼考单克隆抗体与抗原修饰能量受体与能量供体，基于上述原理开发出基于电化学发光能量共振转移灵敏检测氟苯尼考的免疫分析方法，利用CeO₂@TiO₂和Cu₂S之间的能量共振转移机制，以及氟苯尼考单克隆抗体与抗原之间的特异性免疫反应来定量检测氟苯尼考，提高了对目标检测物的选择性，该免疫传感器使用仪器设备简单，操作简便，检测效率高，样品处理较简单，且具有高的灵敏度和宽的线性范围，便于普及且成本较低，具有高的实用价值。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

生物材料保藏：

杂交瘤细胞株2D2-C1，于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201870。

小鼠源杂交瘤细胞株9D₄-FF，于2019年3月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201945。

附图说明

图1是电化学发光免疫传感器的制备过程及对氟苯尼考的检测原理图；

图2是CeO₂@TiO₂纳米复合材料的TEM图像和Cu₂S雪花状纳米片的SEM图像；

图3是不同浓度氟苯尼考的ECL-电位曲线图和发光强度与氟苯尼考浓度对数的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明以下实施例中，FF包被抗原和FF-Ab抗体均受赠于苏州大学邓安平教授课题组。其中，FF-Ab抗体是由氟苯尼考杂交瘤细胞株(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.C201945，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学)分泌的单克隆抗体(联合保藏编号为CCTCC No.C2018070，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学)，氟苯尼考杂交瘤细胞株由FF包被抗原制备。FF-Ab 抗体对氟苯尼考有较高的交叉反应，而且对氟苯尼考具有极高的检测灵敏度(ELISA法IC₅₀为1.35ppb)和较高工作滴度。此FF包被抗原由氟苯尼考(半抗原)溶解于吡啶后与戊二酸酐(五碳链联接臂)反应被修饰成氟苯尼考戊二酸半醛，氮气吹干后转入二甲基甲酰胺/1,4- 二氧六环混合溶剂中经氯甲酸异丁酯/正三丁胺活化再与牛血白蛋白中游离-NH₂交联而成。

实施例1

基于CeO₂@TiO₂纳米复合材料和的Cu₂S雪花状纳米片的电化学发光免疫传感器的详细制备方案如下：

(1)CeO₂@TiO₂纳米复合材料的制备

CeO₂纳米颗粒的制备：在20mL的超纯水中加入0.87g的六水合硝酸铈，搅拌分散均匀后加入0.1ml的过氧化氢水溶液，用2mol L^-1的氨水调节pH至9.5，离心后用超纯水洗涤三次，在70℃的环境下放入烘箱干燥一夜。第二天将产物研磨充分后用马弗炉在450℃的条件下煅烧1h。

接着，利用溶胶-凝胶法制备CeO₂@TiO₂纳米复合材料：在冰水浴的条件下将2mL钛酸四丁酯缓慢滴加到6mL无水乙醇和1mL冰醋酸的混合溶液中，搅拌30min后得到溶液a。用硝酸溶液将3mL无水乙醇和1mL超纯水溶液调节pH至2.3，再加入0.17g二氧化铈粉末搅拌得到混合物b。在冰水浴的条件下将混合物b缓慢匀速滴加到溶液a中，搅拌3h。然后加入1mL的聚乙二醇，老化直至黄色凝胶形成，将凝胶在70℃的条件下真空干燥，将干燥后的凝胶研磨充分并在450℃煅烧30min，得到淡黄色的CeO₂@TiO₂纳米复合物粉末，储存于干燥器中备用。

然后用巯基乙酸(TGA)修饰纳米复合物后得到羧基化的CeO₂@TiO₂悬浮液：在圆底烧瓶中加入0.04g CeO₂@TiO₂纳米复合材料，20mL超纯水，20μL的0.1M的氯化钠水溶液和667μL的3mM巯基乙酸溶液，混合搅拌三小时后用乙醇和超纯水洗涤三次后分散在水溶液中备用。

(2)电化学发光探针的制备

Cu₂S雪花状纳米片的合成步骤如下：将1mmol氯化铜在30mL乙二胺溶剂中超声溶解完全，加入3mmol硫脲搅拌2h后转移到50mL高压釜中加热到80℃反应8h，离心洗涤后真空干燥得到黑色粉末，置于4℃条件下储存。利用与步骤(1)同样的方法，使硫化亚铜羧基化后储存于零下4℃备用。

在10μL羧基化的Cu₂S悬浊液中加入5μL 8mg mL^-1的NHS和5μL 8mg mL^-1EDC在4℃下酸化1h，离心后加入10μL的超纯水分散均匀，加入10μL FF-Ab过夜反应，通过酰胺键使氟苯尼考抗体与Cu₂S相连。反应完全后，加入10μL 5％的BSA，封阻1小时后，将其离心，得到生物缀合物(Ab-Cu₂S雪花状纳米片)再分散在10μL的0.01M PBS中于4℃储存。

(3)电化学发光免疫传感器的组装

首先，在麂皮上用α-Al₂O₃粉末对玻碳电极(GCE)进行抛光，使其成镜面状，并用乙醇和超纯水依次冲洗，并用氮气吹干后，滴加10μL的CeO₂@TiO₂悬浮液并在空气中干燥。再向干燥后的电极上滴加10μL的FF包被抗原(FF-Ag)并在4℃环境中孵育过夜，通过酰胺键固定FF-Ag。随后滴加10μL的5％BSA封阻以阻断剩余的活性位点，消除非特异性结合。一小时后，用PBS冲洗并将ECL免疫传感器储存在4℃下。

图2A、B分别是CeO₂@TiO₂纳米复合材料的TEM图像和Cu₂S雪花状纳米片的SEM 图像。

实施例2

对实施例1制备的电化学发光免疫传感器进行氟苯尼考的定量检测，步骤如下：

(1)首先将10μL的Ab-Cu₂S生物缀合物溶液离心去除上清液后，然后取下层沉淀物添加到10μL的不同浓度(0.001ng mL^-1,0.01ng mL^-1,0.1ng mL^-1,1ng mL^-1,10ng mL^-1,100ng mL^-1,1000ng mL^-1)的氟苯尼考标准溶液中，然后将上述混合物涂覆在传感器上，在这个过程中，FF-Ag和FF都可以和FF-Ab结合。1小时后，用PBS冲洗去未与FF-Ag结合的 Ab-Cu₂S和过量的FF。最后，将上述组装好的电化学免疫传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，Ag/AgCl作为参比电极，组成三电极体系，在ECL检测缓冲溶液(0.1M K₂S₂O₈的pH＝7.4的PBS缓冲液)中，在-2～0V的电化学窗口范围内，光电倍增管高压680V，扫速0.2V/s，进行循环伏安扫描。记录电位-发光强度曲线，建立ECL发光强度与氟苯尼考浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：I＝7008.3+1368.4logC(ng mL^-1)，回归系数为0.9932，此外，根据3SB/m，检测限为0.33pg mL^-1，线性范围是0.001-1000ng mL^-1。

图3A、B分别为不同浓度氟苯尼考的ECL-电位曲线图和发光强度与氟苯尼考浓度对数的标准曲线，图3A中，自左向右，每相邻的两个峰所对应的氟苯尼考标准溶液的浓度依次为0.001ng mL^-1,0.01ng mL^-1,0.1ng mL^-1,1ng mL^-1,10ng mL^-1,100ng mL^-1,1000ng mL^-1。

(2)模拟检测肉类中的氟苯尼考：

为了测试免疫分析方法的应用性，从中国苏州的菜市场随机收集的三种不同的不含氟苯尼考的肉类(鸡肉，鸭肉和虾肉)用于加标回收实验。将样品捣碎装于50mL离心管中，取 2g样品分别加入200μL的0.01ng mL^-1、1ng mL^-1、100ng mL^-1的氟苯尼考标准溶液和超纯水(空白样)，再分别加入3g的无水硫酸镁混匀。再加入20mL的乙酸乙酯混合均匀并振荡10min，超声五分钟，然后以6000rpm离心4min。吸取上清液，在45℃氮吹干燥，最后加入1mL超纯水复溶，再加入3mL的正己烷涡旋，以10000rpm离心5min，最后将上层正己烷吸走，下层清液过滤膜待检测。将10μLAb-Cu₂S生物缀合物溶液离心去掉上清液，然后加入10μL经过滤膜得到的清液混合均匀，然后涂覆于实施例1中的上述传感器上进行检测，结果如表1所示，该传感器对加标样品中的FF回收率在82.2％-116.0％范围内，RSD 在2.47％-13.3％范围内(n＝3)，表明该方法可用于实际样品中较为准确地检测氟苯尼考。

表1.ECL免疫传感器对实际样品中氟苯尼考加标回收测定结果

N.D.＝未检出。

因此，根据上述结果，当检测未知样品中的氟苯尼考含量时，只需要将样品与探针Ab-Cu₂S生物缀合物混合，然后涂覆在传感器上进行测试后与标准曲线比对即可。

以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种电化学发光免疫传感器，其特征在于：包括

电化学发光探针，其包括Cu₂S纳米片，所述Cu₂S纳米片通过化学键连接有氟苯尼考抗体；

电化学发光电极，其包括电极本体，所述电极本体上修饰有CeO₂@TiO₂纳米复合材料，所述CeO₂@TiO₂纳米复合材料通过化学键连接有氟苯尼考包被抗原。

2.根据权利要求1所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述电化学发光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)将硫脲与铜盐在胺类溶液中混匀，并在60-120℃下反应，反应完全后得到雪花状的Cu₂S纳米片，然后用含巯基的羧酸修饰Cu₂S纳米片，得到羧基化的Cu₂S；

(2)用交联剂活化羧基化的Cu₂S，然后将活化后的Cu₂S与氟苯尼考抗体孵育，使所述氟苯尼考抗体通过酰胺键与活化后的Cu₂S连接，得到所述电化学发光探针。

3.根据权利要求1所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于：所述电化学发光探针中，Cu₂S纳米片和氟苯尼考抗体的质量比为100:1。

4.根据权利要求1所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于，所述电化学发光电极的制备方法包括以下步骤：

(S1)利用凝胶-溶胶法，将二氧化铈粉末的酸性溶液与钛酸四丁酯溶液混匀后老化，得到凝胶，然后将所述凝胶在400-500℃下煅烧，煅烧完毕后得到CeO₂@TiO₂纳米复合材料；

(S2)用含巯基的羧酸修饰所述CeO₂@TiO₂纳米复合材料，得到羧基化的CeO₂@TiO₂；

(S3)用交联剂活化羧基化的CeO₂@TiO₂，然后将活化后的CeO₂@TiO₂修饰到电极本体上，然后将电极本体在氟苯尼考包被抗原中孵育，使所述氟苯尼考包被抗原通过酰胺键与羧基化的CeO₂@TiO₂连接，得到所述电化学发光电极。

5.根据权利要求1所述的电化学发光免疫传感器，其特征在于：所述电化学发光电极中，CeO₂@TiO₂纳米复合材料和氟苯尼考包被抗原的质量比为50:1。

6.权利要求1-5中任一项所述的电化学发光免疫传感器在定量或定性检测氟苯尼考中的应用。

7.一种利用权利要求1-5中任一项所述的电化学发光免疫传感器检测氟苯尼考的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a1)将所述电化学发光探针的溶液离心去掉上清液，再将沉淀物与不同浓度的氟苯尼考标准溶液混合均匀，所述氟苯尼考标准溶液的浓度为0.001-1000ng mL^-1，将得到的混合溶液与所述电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗未与电化学发光电极结合的电化学发光探针及氟苯尼考；

(a2)以经步骤(a1)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系中进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线，建立ECL发光强度与氟苯尼考浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程；

(a3)向待测溶液中加入电化学发光探针，将得到的混合溶液与电化学发光电极共同孵育，孵育完全后，用缓冲液清洗电化学发光电极；

(a4)以经步骤(a3)处理后的电化学发光电极作为工作电极，利用三电极体系中进行循环伏安扫描，根据测得电位-发光强度关系，结合步骤(a2)建立的ECL发光强度与氟苯尼考浓度对数值的线性关系和线性回归方程得出待测溶液中氟苯尼考的浓度。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(a1)中，所述电化学发光探针的溶液的浓度为0.5mg/mL。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(a1)中，所述电化学发光探针的溶液在离心前的浓度为0.5mg/mL，离心前的电化学发光探针的溶液与氟苯尼考标准溶液的体积比为1:1。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤(a3)中，待测溶液所用溶剂为乙酸乙酯。

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