CN112921012B

CN112921012B - 谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112921012B
Application number: CN202110291856.9A
Authority: CN
Inventors: 吴静; 谭旭; 刘佳; 宋伟; 陈修来; 高聪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-18
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-03-18
Also published as: CN112921012A

Abstract

本发明公开了谷氨酸棒杆菌meso‑2,6‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过结合定点饱和突变、组合突变以及迭代饱和突变对CgDAPDH的蛋白质进行改造，克服了亲本酶因为氢原子转移距离较长而导致的催化活性低的局限，获得的突变体CgDAPDH^{BC621/D120S/W144S/I169P}比酶活和k_cat/K_m值分别为亲本酶的38和120倍。将CgDAPDH^{BC621/D120S/W144S/I169P}与PmL‑AAD、SambHmaS和PaMDH偶联后，以L‑酪氨酸为底物，D‑HPG产量达到6.33g/L，为D‑HPG的工业化生产提供了潜在的生产方法。

Description

谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)作为一种重要的手性化合物，被广泛应用于医药、食品和化工等领域。在医药领域被作为一种重要的医药中间体，主要被用于半合成β-内酰胺类抗生素，如青霉素类的羟氨苄青霉素(阿莫西林)，头孢菌素类的头孢羟氨苄(氨羟苄头孢菌素)、头孢拉丁和头孢哌酮等。由于该类抗生素抗菌谱广、副作用小、口服效果佳等优点，在临床上应用越来越广泛，目前国内年需求量过万吨。此外，D-HPG还被用于合成肽类激素和农药的侧链，它是合成肌肽、泛酸及辅酶A的重要前体物质。

D-HPG可以通过化学法以及酶法合成。化学法包括Bucherer-Bergs法、尿素法、乙醛酸法以及Strecker法。其中，国内大部分的生产企业基本采用乙醛酸工艺生产，即在酸性条件下利用乙醛酸、尿素和苯酚的缩合反应制备而成。这类方法不仅会在生产过程中产生具有毒性的氰化物，而且原料昂贵、产量低、反应时间长。因而学者们开始研究用酶法生产D-HPG。酶法生产主要分为两个部分。首先以DL-对羟基苯海因为底物，利用D-海因酶(EC3.5.2.2)先将底物水解为N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后再用N-氨基甲酰基-酰胺水解酶(EC3.5.1.6)脱去氨甲酰基得到D-HPG。化学酶联用法是先利用化学法将苯酚、乙醛酸和尿素率先合成DL-对羟基苯海因，再利用D-海因酶将其不对称水解为中间体N-氨基甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。在碱性条件下，剩余的L-对羟基苯乙内酰脲在原位定量消旋化，导致D，L-对羟基苯乙内酰脲总转化为对映体纯的N-氨基甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。后者通过在酸性条件下使用亚硝酸钠的化学方法进一步转化为D-HPG。不幸的是，通过尿素，苯酚和乙醛酸缩合得到底物DL-HPH的低生产率极大地限制了其工业应用。

作为替代方案，目前有多种生产D-氨基酸的方法，例如包括外消旋体拆分，α-酮酸和D-氨基酸之间的氨基转移以及α-酮酸的不对称还原胺化。其中，α-酮酸的直接不对称还原胺化过程因其高特异性及高原子经济性为合成D-氨基酸提供了一种有前途的方法。近年来，关于α-酮酸的不对称还原胺化的研究主要集中在meso-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，EC1.4.1.16)上。作为一种NADPH依赖的氧化还原酶，DAPDH不仅对天然底物meso-二氨基庚二酸表现出高特异性，而且对其他芳香族D-氨基酸也表现出一点的催化活性。例如，来自谷氨酸棒杆菌的DAPDH突变体(CgDAPDH^BC621)可以从10mM对氯苯基丙酮酸中以>99％的转化率和>99％ee产生10mM D-对氯苯基丙氨酸。尽管如此，基于生物质材料的D-HPG合成方法仍然很少。

发明内容

本发明提供了一种可以高效制备D-HPG的CgDAPDH突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化D-对羟基苯乙醛酸制备D-HPG，以及进一步将得到的突变体与L-氨基酸脱氨酶、对羟基扁桃酸合成酶和(S)-对羟基扁桃酸脱氢酶偶联，以生物质材料L-酪氨酸制备D-HPG。

本发明提供了谷氨酸棒杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酸棒杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH为出发序列，对第120、144、169和223位氨基酸进行了突变。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第120位天冬氨酸(D)突变为丝氨酸(S)，获得突变体D120S。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第169位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，获得突变体I169P。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第223位酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)，获得突变体Y223C。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第120位天冬氨酸(D)突变为丝氨酸(S)，并将第169位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，获得突变体D120S/I169P。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第169位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，并第223位酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)，获得突变体I169P/Y223C。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第144位色氨酸(W)突变为丝氨酸(S)，并将第169位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，获得突变体W144S/I169P。

在一种实施方式中，所述突变体相对于CgDAPDH亲本，将其第120位天冬氨酸(D)突变为丝氨酸(S)，并将第144位色氨酸(W)突变为丝氨酸(S)，并将第169位异亮氨酸(I)突变为脯氨酸(P)，获得突变体D120S/W144S/I169P。

在一种实施方式中，所述突变体I169P、D120S、Y223C、D120S/I169P、W144S/I169P、I169P/Y223C、D120S/W144S/I169P的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15所示。

本发明还提供了编码所述突变体的基因。

在一种实施方式中，编码所述突变体I169P、D120S、Y223C、D120S/I169P、W144S/I169P、I169P/Y223C、D120S/W144S/I169P的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16所示。

本发明提供了一种获得所述CgDAPDH突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)以携带SEQ ID NO.2所示meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将步骤(1)构建的质粒载体转化进宿主细胞，挑选阳性克隆；

(3)挑选步骤(2)制备的阳性克隆进行发酵培养，并纯化meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH。

本发明还提供了表达所述突变体的微生物细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌和真菌细胞。

在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌，包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了携带所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述载体为pETDuet-1或pRSFDuet-1。

在一种实施方式中，所述载体还含有如下至少一种基因：铜绿假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因、奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmL-AAD基因、产二素链霉菌的SambHmaS基因。

在一种实施方式中，所述载体含有编码CgDAPDH突变体I169P的基因以及铜绿假单胞菌的(S)-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因的重组载体；所述重组载体是将如SEQ ID NO.4所示CgDAPDH突变体I169P基因以及如SEQ ID NO.19所示PaMDH基因整合至表达载体pRSFDuet-1，从而得到共表达载体pRSFDuet-PaCg。

在一种实施方式中，所述载体含有编码奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmL-AAD以及产二素链霉菌的SambHmaS的重组载体；所述重组载体是将如SEQ ID NO.17所示PmL-AAD基因以及如SEQ ID NO.18所示SambHmaS基因整合至表达载体pETDuet-1，从而得到共表达载体pETDuet-PmSamb。

本发明还提供了一种含有共表达载体pRSFDuet-PaCg和共表达载体pETDuet-PmSamb的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞的构建方法为：将构建成的pRSFDuet-PaCg以及pETDuet-PmSamb载体共同导入BL21(DE3)感受态细胞，最终构建成BL21-PSPC菌株。

本发明还提供了一种制备D-HPG的方法，所述方法以L-酪氨酸为反应底物，以BL21-PSPC细胞作为催化剂，在Tris-HCl缓冲液、pH 6.0～9.0、20～35℃条件下反应10～15h。

在一种实施方式中，所述pH为7.5～9.0。

本发明还提供了一种所述CgDAPDH突变体或重组大肠杆菌BL21-PSPC在制备含D-HPG的产品，或以D-HPG为原料生产的产品中的应用。

有益效果：本发明构建了一种谷氨酸棒杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH的突变体，用于催化生产D-HPG。本发明突变体的比酶活(5.32U·mg^-1·protein)和k_cat/K_m(1.08)较对照分别提高了38倍和120倍，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本。本发明所述的双质粒表达菌株可以通过培养来大批量获得，且不需要细胞破碎，直接用于转化反应，操作简便。在1L反应体系中以L-酪氨酸为底物时D-HPG的产量可达6.33g/L，转化率68.6％，加快了酶转化法生产D-HPG的工业化进程。

附图说明

图1为CgDAPDH^BC621和CgDAPDH^{BC621/I169P/D120S/W144S}的分子动力学模拟，(A)：基于分子动力学模拟计算出的CgDAPDH^BC621和CgDAPDH^{BC621/I169P/D120S/W144S}的RMSD值；(B)：基于分子动力学模拟计算出的CgDAPDH^BC621和CgDAPDH^{BC621/I169P/D120S/W144S}的残基的RMSD值。

图2为pH对D-HPG产量的影响。

图3为转化温度对D-HPG产量的影响。

具体实施方式

基因来源：本专利所涉及到的生物酶CgDAPDH基因来源于Corynebacteriumglutamicum，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，pETDuet-1和pRSFDuet-1质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，限制性内切酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。标样购自SIGMA。CgDAPDH突变体均为分子改造所得，其余试剂均为市场购买所得。

配制LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。

配制发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物(安琪酵母粉802)24g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.31g/L和K₂HPO₄ 12.31g/L。

配制20mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液，具体配方见《工业微生物实验技术手册》(中国轻工业出版社，诸葛健主编)。

比酶活测定方法：采用HPLC法测DAPDH的酶活。1个单位的DAPDH的酶活被定义为生成1μmol D-HPG产物所需的酶量(U)。通过测定D-HPG的含量即可计算酶活力。

比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U·mg-1·protein)。

HPLC法测定D-HPG含量的样品制备：取1mL转化后的转化溶液，在12000rpm下离心10min，取上清液稀释后，经过0.45μm滤膜过滤，过滤液供液相色谱分析。

HPLC法测定D-HPG的含量：戴安高效液相色谱仪(配紫外可见检测器)，采用大赛璐

CR-I(+)(150×3mm，5μm)色谱柱，流动相为高氯酸：乙腈＝9：1的稀硫酸(高氯酸调pH 1.5)，流动相经0.22μm滤膜过滤，超声脱气，流速为0.2mL/min，柱温为25℃，在紫外检测波长245nm下检测。

实施例1：单突突变体的构建和筛选

(1)单突突变体构建：设计CgDAPDH^BC621/I169P、CgDAPDH^BC621/I169Y、CgDAPDH^BC621/D120S及CgDAPDH^BC621/Y223C突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒PCR进行突变体构建。

表1单突变体突变引物序列

构建反应PCR扩增体系：PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、模板(SEQ ID NO.2所示CgDAPDH^BC621)4μL、水32.5μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。

将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，化学转化法具体步骤：

(a)将10μl同源重组产物导入100μl BL21感受态细胞；

(b)冰浴15-30min；

(c)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

(d)加入800μl无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

(e)5000rpm离心2min收菌；

(f)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。

(g)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。

(2)突变体的筛选：将测序正确的突变体菌株接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h左右，分别以5％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在200rpm、37℃培养至OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为4g/L的IPTG诱导，诱导条件为200rpm、25℃诱导14h。将诱导表达后的菌液6000rpm离心10min收集。

转化条件为：转化温度37℃，反应pH为8.0，转化时间为12h，转速为200rpm。

将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定D-HPG的产量，并计算比酶活。结果如表2所示，突变体CgDAPDH^BC621/I169P效果最好。

表2单突变体摇瓶筛选结果

实施例2：双突变体及三突变体的构建和筛选

(1)双突突变体构建：在突变体CgDAPDH^BC621/I169P的基础上，利用突变引物D120S-S和D120S-A以及Y223C-S和Y223C-A，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，具体实施方式参见实施例1中步骤(1)，所用引物如表3所示，制备得到四种双突突变体CgDAPDH^BC621 ^/I169P/D120S、CgDAPDH^{BC621/I169P/Y223C}、CgDAPDH^{BC621/I169Y/D120S}及CgDAPDH^{BC621/I169Y/Y223C}。

在突变体CgDAPDH^BC621/I169P的基础上，利用突变引物W144-S和W144-A，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，具体实施方式参见实施例1中步骤(1)，制备得到双突突变体CgDAPDH^{BC621/I169P/W144S}。

表3双突变体突变引物序列

(2)三突突变体的构建：在突变体CgDAPDH^{BC621/I169P/D120S}的基础上，利用突变引物W144S-S和D144S-A(表4)，通过全质粒PCR进行三突变体的构建，具体实施方式参见实施例1，制备得到三突突变体CgDAPDH^{BC621/I169P/D120S/W144S}。

表4三突变体突变引物序列

实施例3：突变体酶的表达纯化方法

将实施例2制备得到的突变体重组菌株阳性转化子接种至LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时加入终浓度0.1mM IPTG诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导时间14h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm、离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM Tris、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入高压原浆破碎机中，破碎条件为：850Mpa，60s。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、11000rpm离心15min，得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

利用AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化。首先，用20％乙醇以5mL/min的流速冲洗系统15min。然后用结合液A以5mL/min的流速平衡系统15min。上柱子之后，在用结合液A以3mL/min的流速平衡柱子30min。待系统基线稳定后，以3mL/min的流速上样。上样结束后，继续用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡。基线平衡后，利用洗脱程序通过洗脱液B(20mM Tris、500mM咪唑用HCl调pH至8.5)进行洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。

分别测定了突变亲本CgDAPDH^BC621及突变体CgDAPDH^BC621/I169P、CgDAPDH^BC621 ^/I169P/W144S和CgDAPDH^{BC621/I169P/W144S/D120S}在30℃下的动力学参数。k_cat/K_m通过在30℃条件下测定不同浓度的对羟基苯乙醛酸所产生的D-HPG的初始利率计算。

如表5所示，所有的突变体与CgDAPDH^BC621相比，比酶活均提高，其中CgDAPDH^BC621 ^{/I169P/W144S/D120S}为5.32U·mg^-1·protein，比CgDAPDH^BC621的0.14U·mg^-1·protein提高了38倍。与之一致的是各突变体的k_cat/K_m与CgDAPDH^BC621相比均得到提高。CgDAPDH^BC621 ^{/I169P/W144S/D120S}的k_cat/K_m是1.08为CgDAPDH^BC621的0.009的120倍。

表5 CgDAPDH亲本酶及其突变体的动力学参数

实施例4：CgDAPDH^BC621亲本酶和突变体分子动力学模拟

CgDAPDH^BC621亲本酶和突变体的分子动力学模拟是通过GROMACS进行，运用GROMOS96 54a7力场，模拟时间为20ns，模拟结果用GROMACS自带工具进行分析。

结果如图1所示，与亲本酶CgDAPDH^BC621相比，CgDAPDH^{BC621/I169P/W144S/D120S}的RMSD值呈中等程度的降低，表明CgDAPDH^BC621突变这三个关键残基后，蛋白的整体稳定性提高。此外，CgDAPDH^{BC621/I169P/W144S/D120S}的A区域的RMSD值显著降低，表明与CgDAPDH^BC621相比这些区域报的残基灵活性显著降低。

实施例5：构建PmL-AAD、SambHmaS、PaMDH和CgDAPDH共表达菌株

将如SEQ ID NO.16所示CgDAPDH突变体D120S/W144S/I169P的基因以及如SEQ IDNO.19所示PaMDH基因按顺序串联于pRSFDuet-1载体从而得到共表达载体pRSFDuet-PaCg。同理，将如SEQ ID NO.17所示PmL-AAD基因以及如SEQ ID NO.18所示SambHmaS基因按顺序串联于pETDuet-1载体从而得到共表达载体pETDuet-PmSamb，采用片段和载体一步同源重组连接的方式，具体引物如表6所示，下划线处为酶切位点，斜体为RBS序列。

表6引物序列

将两个重组质粒导入同一株大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体转化步骤参见实施例1用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，最终构建成BL21-ER菌株。

实施例6：1L体系水平优化L-酪氨酸生产D-HPG

将在含有氨苄青霉素和卡那霉素两种抗性的LB平板中长出的实施例5制备的BL21-ER单菌落接种至含0.05mg/mL卡那霉素/氨苄霉素抗性LB中，200rpm、37℃培养10h，以体积比3％的接种量接种至TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD₆₀₀为0.8时加入0.1g/L终浓度IPTG诱导，诱导温度为25℃，诱导时间14h后以6,000×g离心8min收集细胞。

(1)不同缓冲液对D-HPG浓度的影响

在10mL的反应体系中加入终浓度10g/L的L-酪氨酸、20g/L的重组菌株，0.5mMCoSO₄、0.7mM NADP⁺以及20mM NH₄Cl。分别利用碳酸盐缓冲液、MOPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液以及磷酸盐缓冲液作为反应体系的缓冲液。在37℃、200rpm的条件下转化24h。反应结束后取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。当缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，D-HPG浓度最高可以达到5.23g/L。

(2)不同转化反应pH对D-HPG浓度的影响

具体步骤同(1)，利用20mM Tris-HCl缓冲液作为反应缓冲液，且将转化反应过程中的pH分别控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0。结果如表7所示，在微碱性的条件更适合D-HPG的合成，因此选择转化pH控制在8.5左右，此时D-HPG浓度为6.19g/L。

表7转化pH优化结果

(3)不同转化温度对D-HPG浓度的影响

具体步骤同(1)，利用20mM Tris-HCl缓冲液作为反应缓冲液，将转化pH控制为8.5。控制转化温度分别为，20℃、25℃、30℃以及35℃。结果如表8所示，当温度为30℃时，反应24h后可以生成6.33g/L D-HPG。

表8转化温度优化结果

对比例1

具体实施方式参见实施例6，不同之处在于，将突变体CgDAPDH^{BC621/I169P/W144S/D120S}替换为亲本酶CgDAPDH^BC621。按照实施例6的方法进行发酵与转化实验。pH控制为8.5，温度为30℃时，反应24h后，取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC色谱图结果显示D-HPG产量为0.14g/L，转化率为1.5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

<130> BAA210101A

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg

1 5 10 15

Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly

20 25 30

Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp

35 40 45

Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu

50 55 60

Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala

65 70 75 80

Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro

85 90 95

Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val

100 105 110

Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

115 120 125

Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp

130 135 140

Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly His Ser Gly Ala Leu Arg Arg Ile Pro

145 150 155 160

Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Ile Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu

165 170 175

Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr

180 185 190

His Lys Met Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg

195 200 205

Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu

210 215 220

Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr

225 230 235 240

Gly Met Pro Asn Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly

245 250 255

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cacaccttct ggggcccagg tttgtcactg ggccactccg gcgctttgcg acgcatccct 480

ggcgttcaaa aggccgtcca gtacccgctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540

cgtggcgaag ccggcgacct aaccggaaag caaacccaca agatgcaatg cttcgtggtt 600

gccgatgccg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc cgactacttc 660

gttggctgtg aagtcgaagt gaactttatt gatgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720

ggcatgccaa acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcctccgc gcagattgcc 840

tttggccgtg cagctcatcg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc 900

gaagttgcac catacctgct ctccccagaa aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 15

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg

1 5 10 15

Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly

20 25 30

Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp

35 40 45

Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu

50 55 60

Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala

65 70 75 80

Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro

85 90 95

Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val

100 105 110

Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Ser Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

115 120 125

Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Ser

130 135 140

Gly Pro Gly Leu Ser Leu Gly His Ser Gly Ala Leu Arg Arg Ile Pro

145 150 155 160

Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Pro Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu

165 170 175

Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr

180 185 190

His Lys Met Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg

195 200 205

Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu

210 215 220

Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr

225 230 235 240

Gly Met Pro Asn Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly

245 250 255

Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp

260 265 270

Phe Thr Ala Ser Ala Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met

275 280 285

Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro

290 295 300

Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val

305 310 315 320

<210> 16

<211> 963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgaccaaca tccgcgtagc tatcgtgggc tacggaaacc tgggacgcag cgtcgaaaag 60

cttattgcca agcagcccga catggacctt gtaggaatct tctcgcgccg ggccaccctc 120

gacacaaaga cgccagtctt tgatgtcgcc gacgtggaca agcacgccga tgacgtagac 180

gtgctgttcc tgtgcatggg ctccgccacc gatatccctg agcaggcacc aaagttcgcg 240

cagttcgcct gcaccgtaga cacctacgac aaccaccgcg acatcccacg ccaccgccag 300

gtcatgaacg aagccgccac cgcagccggc aacgtcgcac ttgtctccac cggctggagc 360

ccaggaatgt tctccatcaa ccgcgtctac gcagcggcag tcttagccga gcaccagcag 420

cacaccttca gcggcccagg tttgtcactg ggccactccg gcgctttgcg acgcatccct 480

ggcgttcaaa aggccgtcca gtacccgctc ccatccgaag acgccctgga aaaggcccgc 540

cgtggcgaag ccggcgacct aaccggaaag caaacccaca agatgcaatg cttcgtggtt 600

gccgatgccg ccgatcacga gcgcatcgaa aacgacatcc gcaccatgcc cgactacttc 660

gttggctatg aagtcgaagt gaactttatt gatgaagcaa ccttcgactc cgagcacacc 720

ggcatgccaa acggtggcca cgtgattacc accggcgaca ccggtggctt caaccacacc 780

gtggaataca tcctcaagct ggaccgaaac ccagatttca ccgcctccgc gcagattgcc 840

tttggccgtg cagctcatcg catgaagcag cagggccaaa gcggtgcctt caccgtcctc 900

gaagttgcac catacctgct ctccccagaa aacttggacg atctgatcgc acgcgacgtc 960

taa 963

<210> 17

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60

ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatctaga 120

gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180

ggtgccggta ttcaggggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240

actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttacc aaacatcacc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360

cgtggcatga atgagaaaat tggtgcagat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420

gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480

gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540

cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660

atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720

gtgagtgaga aaggggcgat taaaacttct caagttgtac tcgccggggg tatctggtca 780

cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatctcaa 840

caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900

catttccgcg agcaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960

atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020

ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080

tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140

acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200

tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260

atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320

accgaaggcc cagcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380

attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422

<210> 18

<211> 1158

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atgacccatg ccccgaacac cggccttcac gaggacgcgc cgcgcgacga cgcgcccgtc 60

gaagatctcc ggctggacca cgtggaactc tacgtcgagg acctcgaccg caaggtcgcc 120

gactggaccg gcggttacgg cttcaccgtc gtcggtaccg ccggctccgc cgcggagggc 180

ttccgcagtg tcgccctgcg ccagggccgg attctcctgg tactgacgga gagcacctct 240

gacgagcacc cggccgccgc ctacgtccac tcgcacgggg acggcgtggc ccgcatcgcc 300

ctgcgggctc cggacgtggc ggcggtcttc gaccacgccg tgcgcaacgg tgcccggcct 360

cttgcggagc cggtgcgcca cgagggtccc ggcgtggtcg tcaccgcgac ggtgtcgggc 420

ttcggcgacg tcgtgcactc cctcgtgcag cgggccgagg aggacccctc ggggctcccg 480

gagggcttcg tgccggccga cgccgaggcg gacgggccgt acgccggcgg gagccggtcc 540

tcggcggacc tcccggggct cgtcgaggtc gatcacttcg ccgtgtgcgt gaacatcggt 600

gagctggacg acaccatcgc gttctaccgg caggctctgg gtttccggga gatcttcgag 660

gagcgcatcg tcgtgggcac ccaggcgatg ctgtcgaagg tggtgcagag ccggtccggc 720

gacatcacct tcaccgtcat ccagccggac ccggtggccg atgccggtca gatcgacgag 780

ttcctcaaga accacgacgg tccgggcgtc cagcacatcg ccttctccag cgatgacgcc 840

gcccgttcgg tccgcaccct gggcgggtcc ggggtggagt tcctcaccac tcccgcgacc 900

tactacgaac tgctcgggca gcgggtgcag ttgcgcaagc acgacctcgc cgagctgggt 960

gagctgaaca tcctcgtcga cgaggaccac ggcggccagc tgttccagat cttcacgcgc 1020

tcgacgcact cgcggcggac cctgttcttc gaggtcatcg agcggctcgg cgcggagacg 1080

ttcggttcgt ccaacatcaa ggcgctgtac gaggccgtgg agctggaacg gcatcgggag 1140

aacggctggt ccaggtga 1158

<210> 19

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgagccaga atctctttaa cgttgaggac tatcgcaagc tcgcgcaaaa gcgcttgccc 60

aaaatggtgt acgactatct ggaaggtggg gctgaagacg aatacggggt gaaacacaac 120

cgcgacgtct ttcagcaatg gcgattcaaa ccaaagcggc tggtagatgt cagccgccgc 180

agtcttcaag cggaagtgct tggaaagagg cagtcaatgc ctctcttgat tggcccaact 240

gggctgaatg gtgcgctctg gcctaaaggg gatctcgccc ttgctcaagc agcaaccaag 300

gccggcatcc cgttcgtgct gtcgaccgcc tccaacatgt ccattgaaga cctcgctcgt 360

cagtgtgatg gcgatctatg gttccagctc tatgtgatcc accgagagat cgcgcagggg 420

atggtgctca aagccctgca ctccggttac accacactgg tactcacaac agacgtcgca 480

gttaatggct atcgcgagcg agacctgcac aaccgattca agatgccgat gagctacacc 540

ccaaaggtga tgctggacgg atgcctgcat ccacgctggt cgctcgatct ggtgcgccac 600

ggcatgccgc aactggccaa cttcgtcagc agtcaaacgt ccagcttaga gatgcaggca 660

gcattgatga gccgccaaat ggatgccagt ttcaactggg aggcattgag atggctgcgt 720

gacctctggc cgcacaaact cctcgtaaag gggttactca gtgctgaaga cgccgatcat 780

tgcatcgctg aaggtgccga cggcgtgatc ctgtcaaacc acggcggtcg ccaactcgat 840

tgcgcggtat cgccaatgga agttttggct caatcggtag cgaaaactgg aaaaccagtg 900

cttatcgata gcggcttccg acggggttcg gacatcgtta aagcgcttgc gctaggtgct 960

gaggctgtac tcctgggacg tgcaactttg tatggccttg cagcacgagg tgaaacgggt 1020

gttgacgagg tgctaaccct cctcaaagcg gatatcgacc gcaccttggc ccagattgga 1080

tgccctgaca tcacctccct ttctcctgat tacctccaaa gcgagggagt gactagcacc 1140

gctccagtcg atcacctcat tggtaaagga acacacgcat ga 1182

Claims

1.谷氨酸棒杆菌来源的meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH的第120位天冬氨酸突变为丝氨酸，并第144位色氨酸突变为丝氨酸，并将第169位异亮氨酸突变为脯氨酸。

2.编码权利要求1所述meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，携带权利要求2所述的基因和铜绿假单胞菌的（S）-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因；所述铜绿假单胞菌的（S）-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .19所示。

5.表达权利要求1所述meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体的微生物细胞。

6.表达权利要求2所述基因的微生物细胞。

7.含有权利要求3或4所述载体的微生物细胞。

8.一种微生物细胞，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，含有携带权利要求2所述基因和铜绿假单胞菌的（S）-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因的质粒pRSFDuet-1，和携带奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶PmL-AAD、产二素链霉菌的SambHmaS基因的质粒pETDuet-1；所述（S）-扁桃酸脱氢酶PaMDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述L-氨基酸脱氨酶PmL-AAD的基因序列如SEQ ID NO.17所示；所述SambHmaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

9.一种D-对羟基苯甘氨酸的制备方法，其特征在于，以权利要求8所述的微生物细胞为催化剂，催化L-酪氨酸生产D-对羟基苯甘氨酸。

10.权利要求1所述的meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3~4任一所述的载体，或权利要求5~8任一所述的微生物细胞，或权利要求9所述方法在制备含D-对羟基苯甘氨酸的产品中的应用。