CN112924508B - 尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料、电极、电化学传感器、制备方法及在尿酸监测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料、电极、电化学传感器、制备方法及在尿酸监测中的应用。所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料包括尿酸酶和无机离子，所述尿酸酶与无机离子结合形成纳米花状结构。所述电极包括：金纳米粒子，其至少结合于电极本体表面；以及所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其至少与金纳米粒子结合。所述电化学传感器的工作电极采用前述电极。本发明还公开了一种尿酸监测方法。本发明的电化学传感器灵敏度高，特异性强，具有抗干扰、可多次重复使用、稳定性好等优点，可随身携带，操作方便，尿酸检测仅需要二十秒，可用于高尿酸患者在家自我即时监测尿液尿酸含量，在临床上具有非常大的应用价值和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料及其制备方法，尤其涉及一种利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰丝网印刷电极的方法和利用上述修饰的电极开发了一种便携式监测尿液中尿酸含量的电化学尿酸传感平台，属于电化学分析检测领域。
背景技术
尿酸(CsH4N4O3)是嘌呤衍生物在人体内的主要代谢产物。尿酸的前体是黄嘌呤，外源性(约占三分之二)黄嘌呤(存在肥肉、动物内脏和海鲜中)和内源性(约占三分之一)黄嘌呤是人体黄嘌呤的主要来源。在健康状况下，尿液尿酸水平在1.4～4.4mM范围内。由于在古人类进化中，尿酸酶基因发生突变沉默，因此与其他哺乳动物相比，人体尿酸水平较高。尿酸排泄的主要部位是肾脏，正常尿液中尿酸排泄量为每天250～750mg，约占每日尿酸排泄量的70％，90％的高尿酸血症与肾脏尿酸排泄下降有关。尿酸为弱有机酸，难溶于水，当尿酸排泄能力下降后，体内尿酸浓度上升超过其溶解度时，会形成尿酸结晶，沉积在患者泌尿系统中而聚集形成类似泥沙样的结石引发痛风、肾脏疾病和Lesch-Nyhan综合征等。近年来，由于我国经济的高速发展，居民生活水平较高，高嘌呤饮食比如海鲜、鱼类和啤酒成为常态，我国痛风患病率呈现出逐年上升的趋势，作为心血管疾病的独立影响因素，痛风可诱发冠心病、卒中等重大疾病，严重影响人们的生活质量。
实时监测体液中尿酸含量对控制身体状况具有重要意义。尿液分析是诊断痛风，Lesch-Nyhan综合征和高尿酸血症的临床采用的标准方法。多种检测尿酸的方法早有报道，比如荧光分析、比色法、化学发光，高效液相等，然而，这些方法在尿酸测定方面不仅需要昂贵的仪器、复杂的操作和训练有素的人员等问题，都不能用于家庭自我监测。
电化学方法具有灵敏、快捷的优点，采用电化学方法检测尿酸早有研究。尿酸的电化学检测方法主要包括酶法和非酶法。非酶法简便，快速，成本低。然而，非酶法的最大障碍是复杂体液中的抗坏血酸、多巴胺、NADH等的存在很容易干扰检测结果。相比之下，由于所采用的尿酸酶具有出色的选择性，因此该酶法在检测特异性和抗干扰能力方面具有压倒性的优势。然而，修饰尿酸酶到电极表面上是更复杂的过程，这通常不仅花费更长的时间，而且会损失酶的活性。
便携式电化学血尿酸传感器已经开发并商业化，可以快速检测血液中的尿酸含量。尿液中尿酸水平作为痛风患者监测的重要参数之一，需要简便易行的方法在家中进行尿酸监测，但是供高尿酸患者直接用于尿液中尿酸检测的仪器并未见报道。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料及其制备方法，该尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料能够很好的固定化酶且能保持酶活性，以克服现有技术中的不足。
本发明的另一目的还在于提供一种利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料修饰的丝网印刷电极及其制备方法。
本发明的另一目的还在于提供一种可用于家庭尿酸偏高患者尿液中尿酸即时监测的电化学传感器。
本发明的另一主要目的在于提供一种利用该电化学传感器进行尿酸监测的方法。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其包括尿酸酶和无机离子，所述尿酸酶与无机离子结合形成纳米花状结构。
进一步地，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料具有尿酸酶活性。
本发明实施例提供了一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的制备方法，其包括：在磷酸盐缓冲液中使尿酸酶与无机离子反应，获得尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料。
本发明实施例提供了一种电极，包括电极本体，它还包括：
金纳米粒子，其至少结合于电极本体表面；以及
前述的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其至少与金纳米粒子结合。
本发明实施例提供了一种用于尿酸监测的电极的制备方法，其包括：
至少使金纳米粒子结合于选定电极表面，获得金纳米粒子修饰的电极；
至少使前述的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料与所述金纳米粒子修饰的电极结合，获得所述用于尿酸监测的电极。
本发明实施例还提供了由前述方法制备的用于尿酸监测的电极。
本发明实施例还提供了一种用于尿酸监测的电化学传感器，所述电化学传感器的工作电极采用前述的电极或用于尿酸监测的电极。
本发明实施例还提供了一种手持式电化学传感尿酸监测系统，其包括前述用于尿酸监测的电化学传感器。
本发明实施例还提供了一种尿酸监测方法，其包括：
采用计时电流法，使含尿酸的待监测样品与前述的用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极接触并发生电催化反应，通过氧化电流大小来测得待监测样品中尿酸的浓度。
与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：
1)本发明制备的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料通过金纳米粒子的高静电吸附作用，范德华力、氢键、静电引力等修饰在丝网印刷电极上，与以往的尿酸酶电极相比，蛋白无机纳米花修饰的电极具有修饰方便快捷且不需要特殊试剂，固定稳固，酶活性值保留高，能重复使用等优点；
2)本发明提供的基于尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的手持式电化学传感尿酸监测系统灵敏度高，特异性强，可随身携带，操作方便，无任何知识背景人员也可熟练使用，每次尿液中尿酸检测仅需要二十秒，可用于高尿酸患者在家自我即时监测尿液尿酸含量，在临床上具有非常大的应用价值和市场价值；
3)本发明的用于监测尿酸的电极重复使用12次以上，检测灵敏度和响应速度基本无变化；
4)本发明提供的尿酸监测方法是针对尿液中的尿酸含量的监测，与血液检测相比，尿液检测是非侵入性的，是无创的，对高尿酸血症的分型具有参考意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一典型实施方案中尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的合成示意图；
图2为本发明一典型实施方案中尿酸在丝网印刷电极上发生的电化学反应图；
图3为本发明一典型实施方案中尿液尿酸监测仪的使用说明图；
图4为本发明一典型实施方案中采用尿液尿酸监测仪监测尿液中尿酸含量的标准曲线图；
图5为本发明一典型实施方案中采用尿液尿酸监测仪监测尿液中尿酸含量的抗干扰研究结果图；
图6a为本发明一典型实施方案中尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的SEM图像，图6b为SPCE工作电极的FE-SEM图像，图6c-图6e分别是沉积25秒、50秒和75秒时金纳米粒子修饰于SPCE工作电极上的FE-SEM图像，图6f为尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料修饰在金纳米粒子修饰的电极上的FE-SEM图像。
具体实施方式
如前所述，鉴于现有技术存在的问题，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，即提出了一种有效的解决方案，提供一种可供家庭使用的尿液尿酸即时监测装备提供给高尿酸患者进行餐后尿液尿酸水平监测，对控制高嘌呤饮食提供参考依据。在此，本发明提供了一种专用的电化学感应平台，本案发明人称之为个人尿液尿酸仪(PUM)，亦即下文记载的手持式电化学传感尿酸监测系统，可用于24小时实时监测尿液中的尿酸，因此，本发明开发的PUM对高尿酸血症的临床治疗具有重要指导意义。
综上，本发明提出了利用蛋白无机杂化纳米花(NFs)修饰丝网印刷电极的方法，并发明了一种直接用于尿液中尿酸监测的手持式电化学传感尿酸仪，以及一种实时定量即监测尿液中尿酸含量的新方法。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明实施例的一个方面提供了一种尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其包括尿酸酶和无机离子，所述尿酸酶与无机离子结合形成纳米花状结构。
进一步地，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料具有尿酸酶活性。
在一些优选实施方式中，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的粒径为1～5μm。
在一些优选实施方式中，所述无机离子包括钙离子，但不限于此。
在一些优选实施方式中，所述尿酸酶与无机离子的质量比为1：0.25～1：1。
本发明实施例的一个方面提供了一种尿酸酶蛋白无机纳米花材料(NFs)的制备方法，亦即，利用蛋白无机杂化纳米花固定化尿酸酶的新方法，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料能够很好的固定化酶且能保持酶活性。
进一步地，尿酸酶蛋白无机纳米花材料的制备采用一锅生物启发方法合成，所用的蛋白为尿酸酶，所用的无机成分为可溶性钙盐，所用的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
具体的，请参阅图1所示，所述尿酸酶蛋白无机纳米花材料的制备方法包括：在磷酸盐缓冲液中，使尿酸酶与作为无机离子反应，获得具有尿酸酶活性的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料。
在一些优选实施方式中，所述制备方法包括：向含有尿酸酶的磷酸盐缓冲液中加入可溶性钙盐溶液，并于室温下静置3～72h，反应获得所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为3～10mmol/L。
进一步地，所述尿酸酶的浓度为1～10mg/mL。
进一步地，所述可溶性钙盐溶液包括氯化钙溶液，但不限于此。
进一步地，所述可溶性钙盐溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。
进一步地，所述尿酸酶与可溶性钙盐溶液的质量体积比为0.2～0.8mg：10～40μL。
其中，通过采用钙离子与尿酸酶进行杂化反应，利用钙离子的优异生物亲和性，基于其制备的纳米花材料在固定化酶过程中，不但不会抑制酶活性，而且能够增加酶的稳定性。同时，基于钙离子所组装形成的纳米花在保存稳定性方面也得到提高。
在此发明中，本案发明人成功的制备了尿酸酶蛋白质-无机杂合纳米花，其能够很好的固定化酶，且能保持酶催化的专一性，特别是能使酶活性长久保持。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种电极，包括电极本体，它还包括：
金纳米粒子，其至少结合于电极本体表面；以及
前述的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其至少与金纳米粒子结合。
在一些优选实施方式中，所述金纳米粒子的粒径为20～50nm。
在一些优选实施方式中，所述金纳米粒子与尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的数量之比大于100，优选为100～1000。
进一步地，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料占金纳米粒子与尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料两者总质量的60～90％。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于直接尿酸监测的电极的制备方法，其包括：
至少使金纳米粒子结合于选定电极表面，获得金纳米粒子修饰的电极；
至少使前述的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料与所述金纳米粒子修饰的电极结合，获得所述用于尿酸监测的特异性功能传感电极。
在一些优选实施方式中，所述制备方法包括：
以氯金酸作为金源，以所述选定电极作为阴极，并以对电极作为阳极，配合形成电化学反应体系，通过恒电位沉积法在所述选定电极上沉积金纳米粒子，制得金纳米粒子修饰的电极。
在一些更为优选的实施方式之中，所述制备方法具体包括：向含有0.2～0.8mg尿酸酶的3～10mmol/L磷酸盐缓冲液中，加入10～40μL0.2mol/L氯化钙溶液，在室温下静置3小时，8500rpm离心五分钟，用超纯水洗涤3次，重悬于100μL超纯水中。
在一些优选实施方式中，所述选定电极、对电极包括丝网印刷碳电极，优选为石墨碳电极。
进一步地，所述电化学反应体系还包括参比电极，所述参比电极包括银/氯化银电极，但不限于此。
在一些优选实施方式中，所述制备方法包括：采用恒电位沉积法，以氯金酸作为金源，以丝网印刷碳电极作为对电极和工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，从而在丝网印刷碳电极表面沉积金纳米粒子，制得金纳米粒子修饰的电极。
进一步地，本发明中金纳米粒子修饰丝网印刷电极采用的方法为恒电位沉积法，采用的2～5mmol/L金源为氯金酸，采用的电极为丝网印刷电极，对电极和工作电极为石墨碳电极，其参比电极为银/氯化银电极。与传统方法相比，恒电位沉积法具有金纳米粒子固定便捷、稳定的特点。
进一步地，所述氯金酸来源于氯金酸溶液，所述氯金酸溶液的浓度为2～5mmol/L。
进一步地，所述恒电位沉积法采用的工艺条件包括：沉积电位为-0.2～-0.6V，优选为-0.2～-0.4V，沉积时间为25～100s。
进一步地，所述金纳米粒子的粒径为20～50nm。
在一些优选实施方式中，所述制备方法包括：采用滴涂法使所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料与所述金纳米粒子修饰的电极结合。
进一步地，本发明中利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰丝网印刷电极工作电极的方法为滴涂法，所述的丝网印刷电极工作电极为石墨碳电极，且是用金纳米粒子修饰过的电极。
在一些更为优选的实施方式之中，所述制备方法具体包括：将包含尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的溶液滴加到金纳米粒子修饰的电极上，并于室温干燥1～3h，获得尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰的电极。
本发明实施例的另一个方面还提供了由前述方法制备的用于尿酸监测的电极。
在本发明以上实施例中，利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花与金纳米粒子之间的作用，包括但不限于高静电吸附作用、范德华力、氢键、静电引力等，可以简单、快速、稳定的将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到电极上，获得能用于检测尿酸的电极，该用于检测尿酸的电极具有易于制备，使用方便快捷且不需要特殊试剂，酶活性值高且保持时间长，能重复使用等优点。
在本发明以上实施例中，所述用于检测尿酸的电极是基于尿酸酶催化尿酸发生氧化反应的过程的电化学信号，实现目标尿酸的检测，其具有较好的特异性、专一性和抗多种干扰物质的能力，能够实现对尿液等样品中尿酸的直接检测。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种用于尿酸监测的电化学传感器，所述电化学传感器的工作电极采用前述的用于尿酸监测的电极。
进一步地，所述电化学传感器为手持式电化学传感器，该传感器用于尿液中尿酸的直接监测，插上电极即进入待机状态，拔掉电极即关机，采用的电化学方法为计时电流法。
进一步地，所述手持式电化学传感器提供的恒定电压，监测实时电流变化，采用的电源为纽扣电池。
进一步地，本发明中利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰的丝网印刷碳电极的用途为用于尿液中尿酸的定量监测或用于监测尿液中尿酸含量产品中的用途。
本发明实施例还提供了一种手持式电化学传感尿酸监测系统，其包括前述用于尿酸监测的电化学传感器。
本发明实施例还提供了一种尿酸监测方法，其包括：
采用计时电流法，使含尿酸的待监测样品与前述的用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极接触并发生电催化反应，通过氧化电流大小来测得待监测样品中尿酸的浓度。
进一步地，将所述用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极插入含尿酸的待监测样品中，计时20～50s后读取电流值，并根据电流值大小计算待监测样品中尿酸的浓度。
亦即，本发明实施例的另一方面还提供了一种手持式电化学传感器结合上述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰的丝网印刷电极对尿液中尿酸含量进行监测的方法。
进一步地，所述的手持式电化学传感器所用的电化学技术为恒定电压测电流，即在恒定工作电压检测电流的大小。
进一步地，所述的手持式电化学传感器提供的恒定电压为+0.5V，电流检测范围为0～99μA，所用电源为CR2302纽扣电池。
进一步地，所述待监测样品包括尿液或血液，优选为尿液，但不限于此。
在一些更为优选的实施方式之中，所述方法具体包括：
将一系列不同浓度的标准尿酸溶液与前述的用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极接触并发生电催化反应，以不同浓度的尿酸为横坐标，以电流值大小为纵坐标，建立尿酸监测的标准曲线；
使含尿酸的待监测尿液样品与所述的用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极接触并发生电催化反应，所得电流值与所述标准曲线对照，通过氧化电流大小来测得待监测尿液样品中尿酸的浓度。
本发明实施例的另一方面提供的监测尿液中尿酸的方法包括：(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的制备方法；(2)丝网印刷电极电沉积金纳米粒子的方法；(3)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰丝网印刷电极的方法；(4)利用手持式电化学传感平台监测尿液中尿酸含量的方法。
在一些优选实施方式中，本发明中利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花和手持式电化学传感器相结合监测尿液中尿酸的方法为：
(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的制备采用一锅生物启发方法合成，蛋白成分为尿酸酶，利用尿酸酶在磷酸盐缓冲液中，钙离子作为无机成分，合成具有尿酸酶活性的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料。
(2)丝网印刷电极沉积金纳米粒子，采用的沉积方法为恒电位沉积法，所用金源为氯金酸溶液，得到金纳米粒子修饰的丝网印刷碳电极。
(3)采用滴涂法将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料固定到金纳米粒子修饰的丝网印刷电极的工作电极上，得到尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰的丝网印刷电极。
(4)尿酸的监测：将修饰好的丝网印刷电极插在手持式电化学传感器(即尿液尿酸仪)上，将尿液滴加到电极上，等待一段时间(20-50秒)后记录显示屏上的氧化电流值，根据氧化电流值大小计算尿液中尿酸含量。
本发明的监测原理为：
尿酸的监测采用计时电流法，电极上负载的尿酸酶蛋白纳米花催化尿酸产生尿囊酸和过氧化氢，过氧化氢电催化氧化产生氧化电流，尿酸浓度越高，产生的过氧化氢越多，氧化电流越大，通过氧化电流的大小定量尿酸浓度。请参阅图2所示，为尿酸在丝网印刷电极上发生的电化学反应图，电极上发生的电化学反应方程式为：
进一步地，本发明利用尿酸酶蛋白无机杂化纳米花和手持式电化学传感器相结合监测尿酸的方法的具体操作步骤如下：
步骤1)向含有0.2～0.8mg尿酸酶的3～10mmol/L磷酸盐缓冲液中，加入10～40μL0.1～0.4mol/L氯化钙溶液，在室温下静置3小时，8500rpm离心五分钟，用超纯水洗涤3次，重悬于100uL超纯水中。
步骤2)丝网印刷电极上沉积金纳米粒子过程为：将50～100μL氯金酸溶液滴加到丝网印刷电极上，采用-0.2～-0.6V沉积。
步骤3)丝网印刷电极修饰纳米花过程为：将上述制备的纳米花溶液重悬，吸取5～10微升滴加到修饰了金纳米粒子的丝网印刷电极的工作电极上，在28℃烘箱中干燥1～3小时。
步骤4)对于尿液尿酸的监测过程：将修饰好的丝网印刷电极插在手持式电化学传感器上，在电极上滴上50～100μL尿液，等待20～50秒记录氧化电流，根据氧化电流大小计算尿液中尿酸含量。
更进一步地，步骤4)具体包括：
取样：取1-3mL尿样于4mL离心管中，注意，尿样要现取现用，由于尿酸难溶，放置过久的尿样会产生尿酸沉淀，导致测量误差较大。
检测：将修饰好尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的电极插到手持式电化学传感器的接口上，手持式电化学传感器即进入待机状态，将电极插入尿样中并及时计时，20-50秒后读取手持式电化学传感器显示屏上的电流值，每次测试三次取平均值，根据电流值大小计算尿液中尿酸含量。
综上所述，本发明主要是利用钙离子和磷酸盐作为无机成分，尿酸酶作为蛋白组分，制备蛋白无机杂化纳米花并用其修饰丝网印刷电极的方法，与以往的尿酸酶电极相比，纳米花固定化尿酸酶具有便捷，酶活性高的特点。本发明提供的便捷式电化学传感器主要用于尿液中尿酸含量的监测，与血液检测相比，尿液检测是非侵入性的，无创的。
藉由前述技术方案，本发明的蛋白无机杂化纳米花材料为利用尿酸酶制备的，采用恒电位沉积法将金纳米粒子沉积到丝网印刷电极上，采用滴涂法将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到丝网印刷电极上，手持式电化学传感平台采用的电化学技术为计时电流法。所采用的原理是负载了尿酸酶的蛋白无机杂化纳米花催化尿液中的尿酸分解为尿囊酸和过氧化氢，过氧化氢在电极表面发生了电催化反应，产生氧化电流并通过手持式电化学传感平台记录下来，通过氧化电流大小来定量监测尿液中尿酸含量。此手持式电化学传感器灵敏度高，特异性强，可随身携带，操作方便，无任何知识背景人员也可熟练使用，每次尿液中尿酸监测仅需要二十秒，可用于高尿酸患者在家自我即时监测尿液尿酸含量，在临床上具有非常大的应用价值和市场价值。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。
实施例1
(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花(NFs)的制备
将20μL CaCl2(浓度为0.2mol/L)溶液添加到0.25mg尿酸酶(浓度为1mg/mL)的0.5×PBS(pH值＝7.2-7.4)中，并用涡旋仪充分混合均匀，将混合物在室温条件下温育3小时，然后以8000rpm离心5分钟以去除上清液，沉淀用超纯水洗涤3次，最后重悬于200μL超纯水中，并干燥保存在4℃下。该步骤最终所获尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的SEM图像如图6a所示。
(2)金纳米粒子(AuNPs)修饰丝网碳印刷电极(SPCE)
采用恒电位沉积法对SPCE电极进行金纳米粒子修饰，详细地说，为了获得SPCE的最佳稳定性，首先将SPCE在无水乙醇溶液中超声处理。然后，用超纯水冲洗3次以去除SPCE表面上的有机杂质，此时该SPCE的FE-SEM图像如图6b所示。将50-100μL，3mM HAuCl4滴到SPCE表面，然后以该SPCE作为阴极，另一SPCE作为阳极，配合银/氯化银参比电极构成三电极体系，再以恒定电压-0.4V沉积100s，在该SPCE表面沉积AuNPs。然后用超纯水冲洗该SPCE以去除多余的HAuCl4，之后在5mM Zobell溶液中用20循环伏安法(CV)对修饰有AuNPs的SPCE(定义为SPCE-AuNPs)进行电化学清洗，以去除SPCE表面上未结合的AuNPs和其他杂质。最后，将该SPCE/AuNPs用双蒸馏水冲洗3次，以用于后续实验。
图6c-图6e分别是AuNPs沉积时间分别为25秒、50秒和75秒时所获SPCE-AuNPs的FE-SEM图像。
(3)将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到SPCE-AuNPs上
将制备的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花充分涡旋，然后滴到上述SPCE-AuNPs上并室温下干燥，用超纯水冲洗三次，以去除未结合的纳米花。修饰好尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的一种电极(定义为SPCE-AuNPs-NFs)的SEM图像如图6f所示，可以将其在室温下保存，用于后续的测量研究。
(4)利用手持式电化学尿酸仪进行监测
取3ml尿样于4ml离心管中，注意：尿样要现取现用，由于尿酸难溶，放置过久的尿样会产生尿酸沉淀，导致测量误差较大。
请参阅图3所示，将前述SPCE-AuNPs-NFs插到手持式电化学传感器的接口上，手持式电化学传感器即进入待机状态，将SPCE-AuNPs-NFs插入尿样中并计时，20秒后读取手持式电化学传感器显示屏上的电流值，每次测试三次取平均值，根据电流值和标准曲线计算尿液中尿酸含量。
采用本实施例所述的工艺过程及控制过程，本案发明人成功的监测出尿液中的尿酸含量，检测范围为0-5mmol/L，在相关系数R2＝0.9989的条件下，线性回归方程为I＝0.32+9.05C，LOD为0.1060mmol/L。请参阅图4，为本实施例中采用尿液尿酸监测仪监测尿液中尿酸含量的标准曲线图。
实施例2
(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花(NFs)的制备
将20μL CaCl2(浓度为0.2mol/L)溶液添加到0.25mg尿酸酶(浓度为2mg/mL)的0.5×PBS(pH值＝7.2-7.4)中，并用涡旋仪充分混合均匀，将混合物在室温条件下温育12小时，然后以8000rpm离心5分钟以去除上清液，沉淀用超纯水洗涤3次，最后重悬于200μL超纯水中，并干燥保存在4℃下。
(2)金纳米粒子(AuNPs)修饰丝网碳印刷电极(SPCE)
采用恒电位沉积法对SPCE电极进行金纳米粒子修饰，详细地说，为了获得SPCE的最佳稳定性，首先将SPCE在无水乙醇溶液中超声处理。然后，用超纯水冲洗3次以去除SPCE表面上的有机杂质。将50-100μL，3mmol/L HAuCl4滴到SPCE表面上，然后以该SPCE作为阴极，另一SPCE作为阳极，配合银/氯化银参比电极构成三电极体系，再以恒定电压-0.4V沉积100s，在该SPCE表面沉积AuNPs。然后用超纯水冲洗该SPCE以去除多余的HAuCl4，之后在5mmol/L Zobell溶液中用20循环伏安法(CV)对修饰有AuNPs的SPCE(定义为SPCE-AuNPs)进行电化学清洗，以去除SPCE表面上未结合的AuNPs和其他杂质。最后，将该SPCE/AuNPs用双蒸馏水冲洗3次，以用于后续实验。
(3)将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到SPCE-AuNPs上
将制备的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花充分涡旋，然后滴到上述SPCE-AuNPs上并室温下干燥，用超纯水冲洗三次，以去除未结合的纳米花。将修饰好尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的电极(定义为SPCE-AuNPs-NFs)在室温下保存，用于后续的测量研究。
(4)利用手持式电化学尿酸仪进行监测
取3ml尿样于4ml离心管中，注意：尿样要现取现用，由于尿酸难溶，放置过久的尿样会产生尿酸沉淀，导致测量误差较大。
请参阅图3所示，将前述SPCE-AuNPs-NFs插到手持式电化学传感器的接口上，手持式电化学传感器即进入待机状态，将前述SPCE-AuNPs-NFs插入尿样中并计时，20秒后读取手持式电化学传感器显示屏上的电流值，每次测试三次取平均值，根据电流值和标准曲线计算尿液中尿酸含量。
采用本实施例所述的工艺过程及控制过程，本案发明人成功的监测出尿液中的尿酸含量，检测范围为0-5mmol/L，在相关系数R2＝0.9976的条件下，线性回归方程为I＝0.35+9.01C，LOD为0.1250mmol/L。
实施例3
(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花(NFs)的制备
将10μL CaCl2(浓度为0.1mol/L)溶液添加到0.2mg尿酸酶(浓度为5mg/mL)的0.5×PBS(pH值＝7.2-7.4)中，并用涡旋仪充分混合均匀，将混合物在室温条件下温育24小时，然后以8000rpm离心5分钟以去除上清液，沉淀用超纯水洗涤3次，最后重悬于200μL超纯水中，并干燥保存在4℃下。
(2)金纳米粒子(AuNPs)修饰丝网碳印刷电极(SPCE)
采用恒电位沉积法对SPCE电极进行金纳米粒子修饰，详细地说，为了获得SPCE的最佳稳定性，首先将SPCE在无水乙醇溶液中超声处理。然后，用超纯水冲洗3次以去除SPCE表面上的有机杂质。将50-100μL，2mmol/L HAuCl4滴到SPCE表面上，然后以该SPCE作为阴极，另一SPCE作为阳极，配合银/氯化银参比电极构成三电极体系，再以恒定电压-0.2V沉积50s，在该SPCE表面沉积AuNPs。然后用超纯水冲洗该SPCE以去除多余的HAuCl4，之后在5mmol/L Zobell溶液中用20循环伏安法(CV)对修饰有AuNPs的SPCE(定义为SPCE-AuNPs)进行电化学清洗，以去除SPCE表面上未结合的AuNPs和其他杂质。最后，将该SPCE/AuNPs用双蒸馏水冲洗3次，以用于后续实验。
(3)将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到SPCE-AuNPs上
将制备的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花充分涡旋，然后滴到上述SPCE-AuNPs上并室温下干燥，用超纯水冲洗三次，以去除未结合的纳米花。将修饰好尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的电极(定义为SPCE-AuNPs-NFs)在室温下保存，用于后续的测量研究。
(4)利用手持式电化学尿酸仪进行监测
取3ml尿样于4ml离心管中，注意：尿样要现取现用，由于尿酸难溶，放置过久的尿样会产生尿酸沉淀，导致测量误差较大。
请参阅图3所示，将前述SPCE-AuNPs-NFs插到手持式电化学传感器的接口上，手持式电化学传感器即进入待机状态，将SPCE-AuNPs-NFs插入尿样中并计时，20秒后读取手持式电化学传感器显示屏上的电流值，每次测试三次取平均值，根据电流值和标准曲线计算尿液中尿酸含量。
采用本实施例所述的工艺过程及控制过程，本案发明人成功的监测出尿液中的尿酸含量，检测范围为0-5mmol/L，在相关系数R2＝0.9896的条件下，线性回归方程为I＝0.29+9.06C，LOD为0.1100mmol/L。
实施例4
(1)尿酸酶蛋白无机杂化纳米花(NFs)的制备
将40μL CaCl2(浓度为0.5mol/L)溶液添加到0.8mg尿酸酶(浓度为10mg/mL)的0.5×PBS(pH值＝7.2-7.4)中，并用涡旋仪充分混合均匀，将混合物在室温条件下温育72小时，然后以8000rpm离心5分钟以去除上清液，沉淀用超纯水洗涤3次，最后重悬于200uL超纯水中，并干燥保存在4℃下。
(2)金纳米粒子(AuNPs)修饰丝网碳印刷电极(SPCE)
采用恒电位沉积法对SPCE电极进行金纳米粒子修饰，详细地说，为了获得SPCE的最佳稳定性，首先将SPCE在无水乙醇溶液中超声处理。然后，用超纯水冲洗3次以去除SPCE表面上的有机杂质。将50-100μL，5mmol/L HAuCl4滴到SPCE表面上，然后以该SPCE作为阴极，另一SPCE作为阳极，配合银/氯化银参比电极构成三电极体系，再以恒定电压-0.6V沉积25s，在该SPCE表面沉积AuNPs。然后用超纯水冲洗该SPCE以去除多余的HAuCl4，在5mmol/LZobell溶液中用20循环伏安法(CV)对修饰有AuNPs的SPCE(定义为SPCE-AuNPs)进行电化学清洗，以去除SPCE表面上未结合的AuNPs和其他杂质。最后，将该SPCE/AuNPs用双蒸馏水冲洗3次，以用于后续实验。
(3)将尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰到SPCE-AuNPs上
将制备的尿酸酶蛋白无机杂化纳米花充分涡旋，然后滴到上述SPCE-AuNPs上并室温下干燥，用超纯水冲洗三次，以去除未结合的纳米花。将修饰好尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的电极(定义为SPCE-AuNPs-NFs)在室温下保存，用于后续的测量研究。
(4)利用手持式电化学尿酸仪进行监测
取3ml尿样于4ml离心管中，注意：尿样要现取现用，由于尿酸难溶，放置过久的尿样会产生尿酸沉淀，导致测量误差较大。
请参阅图3所示，将前述SPCE-AuNPs-NFs插到手持式电化学传感器的接口上，手持式电化学传感器即进入待机状态，将SPCE-AuNPs-NFs插入尿样中并计时，20秒后读取手持式电化学传感器显示屏上的电流值，每次测试三次取平均值，根据电流值和标准曲线计算尿液中尿酸含量。
采用本实施例所述的工艺过程及控制过程，本案发明人成功的监测出尿液中的尿酸含量，检测范围为0-5mmol/L，在相关系数R2＝0.9996的条件下，线性回归方程为I＝0.30+8.9C，LOD为0.1020mmol/L。
请参阅图5，为本发明一典型实施方案中采用尿液尿酸监测仪监测尿液中尿酸含量的抗干扰研究图，其中，a为尿酸，b为蔗糖，c为葡萄糖，d为果糖，e为半胱氨酸，f为赖氨酸，g为抗坏血酸，h为多巴胺，i为尿酸。
所有结果都充分证明了在电极表面进行金纳米粒子沉积和尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料固定后，沉积的稳定性和传感性能的提高。
对比例1：直接用尿酸酶修饰金纳米粒子沉积的电极进行尿酸检测
该对比例1与实施例1基本相同，区别在于：未包含步骤(1)，且步骤(3)中是采用尿酸酶溶液替换了尿酸酶蛋白无机杂化纳米花的分散液，即直接将尿酸酶滴加在金沉积的SPCE上，干燥后，对检测体系中的尿酸进行检测。
本对比例测试结果显示：(1)直接尿酸酶修饰的电极，不能保护尿酸酶的活性，在长期保存后，一周后检测电流就开始下降，尿酸酶的活性下降，导致尿酸检测方法稳定性较差；(2)尿酸酶直接滴加修饰电极，尿酸酶容易从电极表面脱落，电极批间差较大，重复性较差；而基于尿酸酶-蛋白纳米花复合材料修饰的电极不容易脱落，方法学重复性稳定性好。
对比例2：直接用SPCE-AuNPs非酶电极对尿酸进行直接检测
该对比例1与实施例1基本相同，区别在于：未包含步骤(1)、步骤(3)。
本对比例仅仅是利用AuNP粒子修饰的SPCE非酶电极直接对检测体系中的尿酸直接进行检测，没有涉及实际复杂样品中尿酸检测工作。
相比之下，本发明在利用蛋白纳米花固载尿酸酶的技术条件下，即保证了尿酸酶的活性，又确保了基于酶催化专一性的特异性，确保检测方法的可靠性。
进一步地，相较于现有技术中利用壳聚糖基碳纳米管-金复合膜修饰丝网印刷电极作为电化学传感器，本发明是基于尿酸酶催化尿酸发生氧化反应的过程的电化学信号，实现目标尿酸的检测，其具有较好的特异性、专一性，其他物质的干扰因素较小，因此，所建立的便携式电化学传感器具有抗多种干扰物质能力，成功实现尿液中尿酸的直接检测。
进一步地，相较于现有技术中采用二价铜离子制备的纳米花来固定化酶，本发明所利用的离子为钙离子，钙离子作为一种重要的生物亲和性生命元素，基于其制备的纳米花材料在固定化酶过程中，不但不会抑制酶活性，而且能够增加酶的稳定性。同时，基于钙离子所组装形成的纳米花在保存稳定性方面也得到提高。
进一步地，相较于现有技术中采用超微纳米磷酸银/二氧化钛纳米复合材料制备的电化学传感器，本发明所利用的是离子诱导蛋白组装纳米花结构作为载体，对尿酸酶进行固定，其起本质作用的仍然是尿酸酶对尿酸特异性的催化氧化作用，实现对目标尿酸的检测。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。
Claims (15)
1.一种直接用于尿液尿酸含量检测的电极，包括电极本体，其特征在于还包括：
金纳米粒子，其至少结合于电极本体表面，所述金纳米粒子的粒径为20~50nm；以及
尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料，其至少与金纳米粒子结合；所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料包括尿酸酶和无机离子，所述尿酸酶与无机离子结合形成纳米花状结构；所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料具有尿酸酶活性；所述无机离子为钙离子，所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的粒径为1~5μm；所述尿酸酶与无机离子的质量比为1:0.25~1：1；
所述金纳米粒子与尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的数量之比大于100；
所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料占金纳米粒子与尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料两者总质量的60~90%。
2.如权利要求1所述的直接用于尿液尿酸含量检测的电极的制备方法，其特征在于包括：
至少使金纳米粒子结合于选定电极表面，获得金纳米粒子修饰的电极；
至少使尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料与所述金纳米粒子修饰的电极结合，获得所述直接用于尿液尿酸含量检测的电极。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括：向含有尿酸酶的磷酸盐缓冲液中加入可溶性钙盐溶液，并于室温下静置3~72h，反应获得尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料；所述磷酸盐缓冲液的浓度为3~10mmol/L；所述尿酸酶的浓度为1~10mg/mL；所述可溶性钙盐溶液包括氯化钙溶液；所述可溶性钙盐溶液的浓度为0.1~0.5mol/L；所述尿酸酶与可溶性钙盐溶液的质量体积比为0.2~0.8mg：10~40μL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括：以氯金酸作为金源，以所述选定电极作为阴极，并以对电极作为阳极，配合形成电化学反应体系，通过恒电位沉积法在所述选定电极上沉积金纳米粒子，制得金纳米粒子修饰的电极；所述恒电位沉积法采用的工艺条件包括：沉积电位为-0.2~-0.6V，沉积时间为25~100s。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述氯金酸来源于氯金酸溶液，所述氯金酸溶液的浓度为2~5 mmol/L。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述恒电位沉积法采用的沉积电位为-0.2~-0.4V。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述选定电极、对电极为丝网印刷碳电极。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述选定电极、对电极为石墨碳电极。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述电化学反应体系还包括参比电极，所述参比电极为银/氯化银电极。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括：采用滴涂法使所述尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料与所述金纳米粒子修饰的电极结合。
11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：将包含尿酸酶蛋白无机杂化纳米花材料的溶液滴加到金纳米粒子修饰的电极上，并于室温干燥1~3h，获得尿酸酶蛋白无机杂化纳米花修饰的电极。
12.一种用于尿酸监测的电化学传感器，其特征在于，所述电化学传感器的工作电极采用权利要求1所述的直接用于尿液尿酸含量检测的电极。
13.一种手持式电化学传感尿酸监测系统，其特征在于包括权利要求12所述的用于尿酸监测的电化学传感器。
14.一种尿液中尿酸的监测方法，其特征在于包括：
采用计时电流法，使含尿酸的待监测样品与权利要求12所述的用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极接触并发生电催化反应，通过氧化电流大小来测得待监测样品中尿酸的浓度。
15.根据权利要求14所述的监测方法，其特征在于，包括：将所述用于尿酸监测的电化学传感器的工作电极插入含尿酸的待监测样品中，计时20~50s后读取电流值，并根据电流值大小计算待监测样品中尿酸的浓度；
所述用于尿酸监测的电化学传感器采用的恒定电压为0.5V，电流检测范围为0~99μA。
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