CN112915193B - Kp-1在制备治疗慢性肺病的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别涉及KP‑1多肽在制备治疗慢性肺病的药物中的用途。本发明发现，小分子多肽(KP‑1)在小鼠动物实验中无明显毒副作用，且对于博莱霉素诱导的肺纤维化有非常好的抑制效果，能够使小鼠的肺脏间质胶原沉积显著减少，I型胶原、纤连蛋白均显著降低，并且TGF‑β信号通路的关键因子表达明显下调，因此，KP‑1多肽有望用于治疗和/或预防肺纤维化。

Description

KP-1在制备治疗慢性肺病的药物中的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及KP-1(多肽)在制备治疗慢性肺病的药物中的用途。

背景技术

慢性肺病，过去被称作支气管肺发育不良，是一组多种原因引起的肺部疾患。临床上常见的慢性肺病主要包括反复呼吸道感染、变应性鼻炎、慢性咳嗽、支气管哮喘、慢性支气管炎、肺间质纤维化等临床常见疾病。肺纤维化作为一种慢性间质性肺疾病，是各种慢性肺病的最终结局。肺纤维化的病理特点主要是肺泡上皮细胞炎性损伤、成纤维细胞过度增殖、细胞外基质(ECM)异常沉积、肺组织异常修复和重塑，从而导致肺功能进行性下降，最终导致呼吸衰竭而死亡。

目前，对于肺纤维化的治疗，包括：1)抗炎治疗，用大环内酯类抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂进行抗炎治疗，糖皮质激素具备抗炎功能，可以减轻肺泡炎，减缓肺纤维化进程；大环内酯类抗生素具备抗炎和免疫调节功能，用红霉素等激素进行治疗，可抑制肺泡巨噬细胞核因子活性，抑制肺组织白细胞介素-1β和转化生长因子-β的表达，显著减轻肺泡炎症状。2)抗纤维化治疗，可以用秋水仙碱、吡非尼酮、血管紧张素转换酶抑制剂等进行治疗，秋水仙碱可有效地抑制肺部胶原沉积，减少肺部纤维化因子生成。吡非尼酮可抑制转化生长因子-β的胶原合成，减少肺细胞外基质产生，阻断血小板衍生因子的有丝分裂，从而抑制肺纤维化进程。3)抗氧化剂治疗，主要包括烟酸、氨溴索、牛磺酸等，烟酸、牛磺酸可以调节肺部细胞因子表达，从而减少胶原沉积；氨溴索有助于通过清除肺部氧自由基来减轻肺细胞损伤，并抑制肿瘤坏死因子-α在肺部的生成及释放，减缓纤维化进程。

然而，肺纤维化的发病机制并不明确，涉及多因子、多信号通路相互作用，与细胞因子的异常表达、上皮细胞的损伤与修复、新生血管增多、基质金属蛋白酶的异常表达或氧化应激等因素有一定相关性。目前治疗仍然没有突破性的进展，延缓肺纤维化的病程进展、降低肺间质纤维化发病率，是呼吸系统疾病防治所面临的巨大挑战和重大需求。因此对肺纤维化发生机制和有效的药物防治研究则具有非常重要的科学价值。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明人发现KP-1多肽能够极大程度缓解博来霉素诱导肺纤维化模型小鼠的肺纤维化，使小鼠肺脏间质胶原沉积显著减少，I型胶原、纤连蛋白均显著降低，并且TGF-β信号通路的关键因子表达明显下调，因此，KP-1多肽有望用于治疗和/或预防肺纤维化。

本发明的技术方案如下文所示。

本发明的一方面提供了KP-1多肽在制备预防和/或治疗慢性肺病的药物中的用途，其中，所述KP-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

根据本发明的一些实施方式，所述慢性肺病是以纤维化为特征的慢性肺病。

根据本发明的一些实施方式，所述慢性肺病为药物诱发性间质性肺疾病。

根据本发明的一些实施方式，所述慢性肺病为肺纤维化。

根据本发明的一些实施方式，所述药物中还包括其他治疗肺纤维化的活性成分；所述其他治疗肺纤维化的活性成分可以是秋水仙碱、吡非尼酮、血管紧张素转换酶抑制剂、大环内酯类抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等。

根据本发明的一些实施方式，所述KP-1多肽的给药剂量为0.5～2mg/kg/d，优选为1mg/kg/d。

根据本发明的一些实施方式，所述药物还可以包括药用辅料。所述药用辅料为本领域常规药用载体，可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料；优选地，包括药学上可接受的崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂或防腐剂。所述崩解剂可以为玉米淀粉、马铃薯淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙或藻酸。所述稀释剂可以为乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、磷酸钙、柠檬酸钙或结晶纤维素。所述润滑剂可以为微粉硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、滑石粉或无水硅胶。所述粘合剂可以为阿拉伯胶、明胶、糊精、羟丙基纤维素、甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮。所述湿润剂可以为十二烷基硫酸钠。所述矫味剂可以为阿斯巴甜、甜菊甙、蔗糖、麦芽糖醇或柠檬酸。所述助悬剂可以为阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素或硬脂酸铝凝胶。所述表面活性剂可以为卵磷脂、山梨糖醇酐单油酸酯或单硬脂酸甘油酯。所述防腐剂可以为对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯。

根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为本领域常规的各种剂型，优选地为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更优选地为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、注射剂或输注剂。

根据本发明的一些实施方式，所述药物的给药方式可以为本领域常规的给药方式，包括但不限于注射给药或口服给药。所述注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。

本文所述的术语“给药剂量”为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以随被治疗的具体疾病以及其它因素而定，其它因素包括年龄、体重、健康状况、症状的严重程度、给药途径、治疗的频率和在治疗期间是否伴随其它的药物。

本文所述的术语“预防”是指在可能的慢性肺病或肺纤维化因素的存在下，使用后防止或降低慢性肺病或肺纤维化的产生。

本文所述的术语“治疗”是指减轻慢性肺病或肺纤维化的程度，或者治愈慢性肺病或肺纤维化使之正常化，或者减缓慢性肺病或肺纤维化的进程。

本发明的有益效果：

本发明人经过科学研究发现了KP-1多肽用于预防和/或治疗肺纤维化相关的肺部疾病的新用途，实验表明，KP-1多肽在无明显毒副作用，且对于博莱霉素诱导的肺纤维化有非常好的抑制效果，能够使小鼠的肺脏间质胶原沉积显著减少，I型胶原、纤连蛋白均显著降低，并且TGF-β信号通路的关键因子表达明显下调，因此，KP-1多肽有望用于治疗和/或预防肺纤维化。

附图说明

图1为不同组别小鼠的肺脏Masson染色图；

图2为不同组别小鼠的肺组织纤连蛋白的免疫染色图；

图3为不同组别小鼠肺脏p-Smad3及其下游纤维化指标蛋白水平的免疫印记图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

KP-1多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司人工合成。

实施例1KP-1多肽对于小鼠博莱霉素(BLM)模型肺纤维化的抑制作用1、实验动物：C57小鼠，雄性，体重20-22g，SPF级。

先将动物称重、编号，选择健康、体重在20-22g的小鼠18只，随机分为3组，每组6只。包括空白对照组、模型组及实验组。

2、造模及分组

博来霉素(BLM)是一种用于治疗癌症的糖肽类抗生素。主要通过与包括铁在内的重金属产生螯合物，后者与氧作用产生超氧自由基与氢氧自由基，造成DNA链断裂，促进脂质过氧化与细胞其他分子的氧化，产生氧化应激。博来霉素在临床上伴随有肺纤维化的不良反应，由它产生的肺纤维化动物模型具有临床患者的病理特征，因而自1974年以来大量应用于肺纤维化的研究中，被认为是经典的造模方法。

1)空白对照组：室温，1％戊巴比妥钠以5mL/公斤体重麻醉小鼠后，将麻醉后的小鼠四肢伸展，用胶布固定在手术台上，连同鼠前齿也用皮筋固定好，使颈前皮肤充分绷直便于手术。剪去小鼠颈前区域的毛，充分暴露气管前的皮肤，碘伏消毒颈前皮肤3次气管滴注：沿颈前正中线，自胸骨角上方约0.5cm处，做一个长约0.5cm的纵切口，用眼科镊钝性分离气管前的肌层，暴露气管。将50μL生理盐水按照相同方法气管内滴注。气管内滴注完液体后，迅速将小鼠立起，以身体为中轴快速旋转，使生理盐水通过离心力均匀分布在两肺内。观察小鼠气管周围有无渗血、渗液，若有则需将渗出物清除干净。将颈前皮肤对合整齐，水平缝合，再次用碘伏消毒皮肤。注意观察切口周围是否有肿胀、出血等异常情况，若小鼠出现呼吸异常，紫绀等情况，及时拆除缝线并做相应的处理。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

2)模型组：同上麻醉、消毒。将麻醉后的小鼠四肢伸展，用胶布固定在手术台上，连同鼠前齿也用皮筋固定好，使颈前皮肤充分绷直便于手术。剪去小鼠颈前区域的毛，充分暴露气管前的皮肤，碘伏消毒颈前皮肤3次气管滴注：沿颈前正中线，自胸骨角上方约0.5cm处，做一个长约0.5cm的纵切口，用眼科镊钝性分离气管前的肌层，暴露气管。按照5mg/kg计算BLM溶液用量，并用移液器吸取相应体积的溶液加入无菌离心管中，再用注射器吸取离心管中的药物，一手用眼科镊固定气管，另一手持注射器沿平行于气管方向，向心脏方向缓慢刺入气管，再向前水平贴气管方向推进约一个针尖斜面长度，将注射器稍微回抽确保针道通畅且在气管内，再将药物滴入气管内。气管内滴注完液体后，迅速将小鼠立起，以身体为中轴快速旋转，使药物通过离心力均匀分布在两肺内。观察小鼠气管周围有无渗血、渗液，若有则需将渗出物清除干净。将颈前皮肤对合整齐，水平缝合，再次用碘伏消毒皮肤。注意观察切口周围是否有肿胀、出血等异常情况，若小鼠出现呼吸异常，紫绀等情况，及时拆除缝线并做相应的处理。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

3)实验组：同上麻醉、消毒。将麻醉后的小鼠四肢伸展，用胶布固定在手术台上，连同鼠前齿也用皮筋固定好，使颈前皮肤充分绷直便于手术。剪去小鼠颈前区域的毛，充分暴露气管前的皮肤，碘伏消毒颈前皮肤3次气管滴注：沿颈前正中线，自胸骨角上方约0.5cm处，做一个长约0.5cm的纵切口，用眼科镊钝性分离气管前的肌层，暴露气管。按照5mg/kg计算BLM溶液用量，并用移液器吸取相应体积的溶液加入无菌离心管中，再用注射器吸取离心管中的药物，一手用眼科镊固定气管，另一手持注射器沿平行于气管方向，向心脏方向缓慢刺入气管，再向前水平贴气管方向推进约一个针尖斜面长度，将注射器稍微回抽确保针道通畅且在气管内，再将药物滴入气管内。气管内滴注完液体后，迅速将小鼠立起，以身体为中轴快速旋转，使药物通过离心力均匀分布在两肺内。观察小鼠气管周围有无渗血、渗液，若有则需将渗出物清除干净。将颈前皮肤对合整齐，水平缝合，再次用碘伏消毒皮肤。注意观察切口周围是否有肿胀、出血等异常情况，若小鼠出现呼吸异常，紫绀等情况，及时拆除缝线并做相应的处理。局部消毒后，核实标记，置于相应鼠笼。

造模结束：28天后，用1％戊巴比妥钠(约0.1～0.2m1)腹腔注射麻醉小鼠，等待小鼠完全麻醉。打开腹腔，找到腹主动脉，剪开放血后，再打开胸腔，用注射器将0.1～0.2mL的PBS溶液注射进右心房，稍微灌注冲洗心肺组织，取左肺用于制作组织切片，右肺保存在液氮中用于组织蛋白质提取。

3.药物干预

KP-1多肽水溶性的粉末用无菌的0.01mol/L冰醋酸溶液稀释为11.36mg/mL的工作浓度。实验各组分笼饲养。空白对照组仅观察。实验组予以气管注射1周后植入Alzet微量渗透压泵给予1mg/kg/d剂量的KP-1多肽干预3周。模型组仅给予等量0.01mol/L的冰醋酸作对照。

4.观察指标

在病理上，通常采用Masson染色，来观察组织细胞外胶原蛋白沉积情况。而更具体的组织纤维化则常常应用纤连蛋白和I型胶原的免疫染色和免疫印迹方法(Westernblotting)来定性、定量观察和评估。

饲养4周后均取肺脏，分别予以10％中性缓冲甲醛固定及液氮冷冻组织。甲醛固定组织在经脱水、包埋、切片、制片后，分别予以天狼星红染色及I型胶原、纤连蛋白免疫染色。冰冻组织匀浆后提取蛋白，用免疫印迹法(Western Blot)检测p-Smad3、p-Smad2及其下游纤维化指标蛋白水平。

5.实验结果

(1)小鼠肺脏胶原蛋白沉积情况

如图1所示，为不同组别小鼠的肺脏Masson染色图，可以看出，空白对照组(CTL)肺组织结构正常，在BLM诱导肺纤维化模型组(BLM)小鼠肺脏中，Masson染色显示肺间质区域存在大量胶原蛋白沉积，而实验组(BLM/KP1)可以看出KP-1减轻了肺间质胶原蛋白积累和沉积，说明，KP-1多肽能够改善肺纤维化小鼠的胶原蛋白沉积情况。

(2)小鼠肺组织纤连蛋白的变化情况

如图2所示，为不同组别小鼠的肺组织纤连蛋白的免疫染色图，可以看出，空白对照组(CTL)肺组织结构正常，在BLM诱导肺纤维化模型组(BLM)小鼠肺脏中，纤连蛋白的免疫染色结果显示肺间质区域存在纤连蛋白积累，而实验组(BLM/KP1)可以看出KP-1减轻了间质纤连蛋白沉积，说明，KP-1多肽能够明显降低肺纤维化小鼠肺组织的纤连蛋白水平。

(3)小鼠肺脏纤维化指标变化情况

如图3所示，为不同组别小鼠肺脏p-Smad3及其下游纤维化指标蛋白水平的免疫印记图；其中，A图为通过Western blot免疫印记检测肺脏中纤连蛋白和I型胶原以及p-Smad3蛋白的表达，Western blot结果显示BLM诱导肺纤维化模型组(BLM)中的纤连蛋白和I型胶原以及p-Smad3蛋白明显升高，而实验组(BLM/KP1)则证明了KP-1能很好地抑制这三个指标；B图为半定量分析结果，经统计分析后显示模型组(BLM)纤维化指标较空白对照组(Ctrl)差异有统计学意义，实验组(BLM/KP1)较模型组(BLM)差异有统计学意义。

综上所述，KP-1可以明显减少BLM小鼠肺间质胶原蛋白沉积，显著降低BLM小鼠肺间质纤连蛋白、I型胶原表达水平，并可以明显抑制肺纤维化模型中的异常活化的TGF-β信号通路。因此，KP-1可以成为有效抑制肺纤维化进展的新药。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学南方医院

<120> KP-1在制备治疗慢性肺病的药物中的用途

<130> 111

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly Phe Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp Gln Gln His Gly Lys

20 25

Claims (6)

1.KP-1多肽在制备预防和/或治疗慢性肺病的药物中的用途，其特征在于，所述KP-1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述慢性肺病为肺纤维化。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述KP-1多肽的给药剂量为0.5~2mg/kg/d。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物还包括药用辅料；所述药用辅料包括药学上可接受的崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂或防腐剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为固体、半固体或液体的形式。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液或注射剂。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物的给药方式为注射给药或口服给药。

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