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CN112867712B - 作为泛素特异性蛋白酶抑制剂的羧酰胺 - Google Patents

作为泛素特异性蛋白酶抑制剂的羧酰胺 Download PDF

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CN112867712B CN201980066884.1A CN201980066884A CN112867712B CN 112867712 B CN112867712 B CN 112867712B CN 201980066884 A CN201980066884 A CN 201980066884A CN 112867712 B CN112867712 B CN 112867712B
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Abstract

本公开涉及至少一种选自USP28和USP25的途径的调节剂如抑制剂，包含所述抑制剂的药物组合物，以及使用所述抑制剂的方法。所述至少一种选自USP28和USP25的途径的调节剂如抑制剂可用于治疗癌症以及其他病痛。

Description

作为泛素特异性蛋白酶抑制剂的羧酰胺
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年8月9日提交的PCT国际申请第PCT/US2018/046061号、于2018年8月9日提交的美国临时申请第62/716,744号、于2019年1月4日提交的美国临时申请第62/788,204号以及于2019年2月13日提交的美国临时申请第62/805,118号的优先权；所述申请各自的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及至少一种选自泛素特异性蛋白酶28(USP28)和/或泛素特异性蛋白酶25(USP25)的途径的调节剂，所述调节剂可用于治疗与至少一种选自USP28和USP25酶的途径相关的疾病或病症。具体来说，本公开涉及抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的化学实体和组合物，治疗与至少一种选自USP28和USP25的途径相关的疾病或病症的方法，以及这些化合物的合成方法。
背景技术
USP28和USP25是含有以下三个不同结构域的DUB的USP子家族的半胱氨酸异肽酶：N末端UBA样结构域；一对泛素相互作用基序(UIM)；和USP结构域，其预计具有USP子家族的保守折叠(Nijman等人，Cell 2005,123,773-786；Komander等人，Mol.Cell Bio.2009,10,550-563)。USP28和USP25经由调控众多细胞蛋白的稳定性来发挥其作用。USP28已表征为肿瘤促进因子并且已发现其可稳定许多致癌蛋白。USP25已表征为肿瘤促进因子以及与自身免疫疾病、炎症和感染性疾病(例如病毒和细菌)有关的细胞反应的调控因子。
已在多个癌症类型(包括乳腺癌、AML、卵巢癌和结直肠癌)中鉴定出USP28的扩增、缺失和突变。(cbioportal；http://www.cbioportal.org；Diefenbacher等人，J.ofClin.Investi.2014,124,3407-3418；Popov等人，Nat.Cell.Biol.2007,9,729-731)。此外，USP28过表达与患有胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌和膀胱癌的患者中的不良预后相关，从而表明USP28在这些肿瘤类型的肿瘤形成中发挥重要作用。(Wang等人，Exp.Biol.Med.2016,255-264；Zhang等人，J.Cell.Mol.Med.2015,19,799-805；Guo等人，Tumor Bio.2014,35,4017-4022)。
大规模shRNA筛选还已鉴定出USP28在控制MYC蛋白的稳定性中的作用。(Popov,Nat.Cell.Biol.,765-774)。MYC是涉及细胞生长、增殖和细胞凋亡的基因的转录的主要调控因子并且对于许多肿瘤类型中的肿瘤启动和维持至关重要。(Meyer等人，Nat.Rev.Cancer2008,8,976-990；Conacci-Sorrell等人，Cold SpringHarb.Perspect.Med.2014,4,1-24；Huang等人，Cold Spring Harb.Perspect.Med.2013；Roussel等人，Cold Spring Harb.Perspect.Med.2013；Gabay等人，Cold SpringHarb.Perspect.Med.2014；Schmitz等人，Cold Spring Harb.Perspect.Med.2014)。另外，MYC是人类癌症中的最常扩增致癌基因，在许多肿瘤类型(包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌)中具有改变。(Beroukhim等人，Nature 2010,463,899-905)。已显示USP28基因敲低可导致MYC蛋白减少以及一组人类癌细胞系的体外生长的相关抑制。(Popov,Nat.Cell Biol.,765-774)。
还已报道，需要USP28来赋予LSD1(赖氨酸特异性脱甲基酶1)蛋白稳定性。(Wu等人，Cell Rep.2013,5,224-236)。LSD1是组蛋白脱甲基酶，其与许多伴侣蛋白复合以控制细胞多能性和分化。(Metzger等人，Nature2005,437,436-439；Toffolo等人，J.Neurochem.2014128,603-616,2014；Periz等人，PloS Biology2015)。已显示肿瘤细胞中的USP28敲低可使LSD1蛋白去稳定，阻抑体外癌症干细胞(CSC)样特性，并且抑制体内肿瘤生长。(Wu,Cell Rep.,224-236)。LSD1小分子抑制剂已在AML和尤文氏肉瘤(Ewingsarcoma)的模型中显示抗肿瘤活性。(Sankar等人，“Reversible LSD1inhibitioninterferes with global EWS/ETS transcriptional activity and impedes Ewingsarcoma tumor growth”Clin Cancer Res.2014 4584-4597；Schenk等人，Nat.Med.2012,18,605-611)。因此，USP28抑制代表靶向这些肿瘤类型中的LSD1的替代方法。
还已表明，USP28抑制可减小NICD1水平并抑制NOTCH途径活性。(Diefenbacher等人)。NOTCH信号传导控制众多细胞分化决定并驱动某些肿瘤类型中的肿瘤形成。NOTCH1是一种强效T细胞致癌基因，其中>50％的T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)病例携载NOTCH1的活化突变。(Weng等人，Science 2004,306,269-271)。增加的NOTCH1蛋白水平也与结肠癌中的疾病进展相关。(Meng等人，Cancer Res.2009,69,573-582)。NOTCH1重排导致组成型途径活化并驱动许多癌症类型(包括三阴性乳腺癌)中的肿瘤形成。(Stoeck等人，Cancer Discov.2014,4,1154-1167)。
USP28的其他报道底物包括c-Jun、细胞周期蛋白E、HIF-1α、克拉普因(Claspin)、53BP1和Mdc1，其中的许多底物在人类肿瘤形成中发挥重要作用。(Diefenbacher等人；Flügel等人，Blood2012,119,1292-1301；Zhang等人，“A role for the deubiquitinatingenzyme USP28in control of the DNA-damage response”Cell 2006,126,529-542)。有趣的是，许多USP28底物由FBW7识别，后者是SCF(FBW7)E3泛素连接酶的底物识别亚基。(Diefenbacher等人)。FBW7以磷酸化依赖性方式识别USP28底物并靶向其以用于泛素化，最终导致其蛋白酶体降解。USP28和FBW7对其共用致癌蛋白底物的拮抗作用指示了蛋白质稳定性控制的复杂性质并且可提供癌症治疗的其他治疗机会。
具有USP28种系敲除的小鼠已显示为可存活并且可生育的，从而证实USP28活性并非正常发育和生殖功能所需。(Knobel等人，Molecular and Cellular Biology 2014,34,2062-2074)。小鼠肠中的条件性USP28敲除可导致致癌蛋白(包括c-Myc、活性NOTCH(NICD1)和c-JUN)减少，这与肠细胞增殖降低和分化增强相关。更重要的是，可使用急性USP28消耗来有效地阻断通过APC突变诱导的肠肿瘤形成，从而表明USP28可为减小肿瘤负荷和改善肠癌存活的有吸引力的靶标。(Diefenbacher等人)。
总而言之，USP28和USP25在促进细胞中的肿瘤形成和调节免疫反应中发挥重要作用。其主要作用在于使众多致癌蛋白以及表观遗传驱动因子和免疫调节蛋白以及其他细胞因子的去泛素化和稳定化，这是人类中的免疫反应以及肿瘤启动和生长所需的。因此，使用小分子抑制剂抑制USP28和/或USP25可被研发用于医学用途，例如用于治疗癌症(例如肺癌)。出于这个原因，仍亟需USP28和/或USP25的新颖和强效小分子抑制剂。
发明内容
本公开提供式(I)化合物：
或其药学上可接受的形式，其中
Y选自C(R3)和N；
R'选自H和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-11元杂芳基；
R2选自N连接的4-12元杂环基和C连接的4-12元杂环基，其中所述杂环基任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R2基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R3(如果存在)独立地选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
每个R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6(如果存在)选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R7(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3，
其条件是所述化合物不存在于图1的表C中。
所述式(I)化合物可为化合物或其药学上可接受的形式，其中：
Y选自C(R3)和N；
R'选自H和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8-11元杂芳基；
R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的4-12元杂环基；
R3独立地选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自氘、卤素、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；
R4选自H、氘、(C1-C4)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自卤素、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6(如果存在)选自-N(C1-C6)烷基-芳基、-N(C1-C6)烷基-杂芳基和-N(C1-C6)烷基-杂环基，其中所述基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且
n是0、1、2或3，
其条件是所述化合物不存在于图1的表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(VI)化合物
或其药学上可接受的盐，
其中：
X选自C(R)(R”)和O；
Y1、Y2和Y3中的每一者独立地选自C(R3)和N；
R'选自H、氘和-CH3；
R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基，R和R”与其连接的碳一起形成任选地被一个或多个Ri取代的螺环环丙基，其中作为或含有氢的任何R、R”或Ri基团可独立地具有一个或多个被氘置换的氢；
每个Ri独立地选自卤素、-OH和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-12元稠合或非稠合杂芳基，并且此外其中任何含氢的R1基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
R2选自N连接的4-12元杂环基、C连接的4-12元杂环基和-O连接的4-12元杂环基，其中所述4-12元杂环基任选地被一个或多个R5(其可与R1的一个或多个R5相同或不同)取代，并且此外其中R2基团中的任何氢可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
R4选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6独立地选自-氨基烷基-芳基、-氨基烷基-杂芳基、-氨基烷基-环基和-氨基烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R7独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3，
其条件是所述化合物不存在于表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(II)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
X、R1、R2、R3、R7和n中的每一者如式(VI)中所定义；
R4选自H、(C1-C6)烷基、卤素和-OH；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
每个R6独立地选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，
其条件是所述化合物不存在于表C中。
在另一方面、所述化合物可为式(II)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
X、R1、R2、R3、R7和n中的每一者如式(VI)中所定义；
R4选自H、(C1-C6)烷基、卤素和-OH；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
每个R6独立地选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，
其中所述化合物不存在于表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(IIaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1选自被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8-9元杂芳基，其中每个R5和R6独立地如式(II)中所定义；R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的6-12元杂环基或C连接的6-12元杂环基，其中R5如式(II)中所定义；并且
R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、卤素和-CN，其中所述(C1-C6)烷基任选地被R7取代，其中每个R7独立地如式(VI)中所定义，
其中所述化合物不存在于图1的表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(IIb')的如权利要求1所述的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R'选自H和CH3；
R1选自被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8-9元杂芳基，其中每个R5和/或R6(如果存在)独立地如式(VI)中所定义；
R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的6-12元杂环基或C连接的6-12元杂环基，其中每个R5独立地如式(VI)中所定义；并且
R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、卤素和-CN，其中所述(C1-C6)烷基任选地被R7取代，其中每个R7独立地如式(VI)中所定义，并且
其中所述化合物不存在于表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(VI)、(II)、(IIaa)和(IIb')中的任一者的化合物，其中任选地被R5和/或R6取代的R1选自表A，其中所述化合物不存在于表C中。
在另一方面，所述化合物可为式(VI)、(II)、(IIaa)和(IIb')中的任一者的化合物，其中任选地被R5取代的R2选自表B，其中所述化合物不存在于表C中。
在另一方面，所述化合物可为实施例2-38、3-17、3-18、10-15、10-16、14-15、14-16、14-17、14-18、14-19、14-20、14-21、14-22、14-23、14-24、22-5、22-6、23-1、23-2、24-1、24-2、25、26-1、26-2；27-1、27-2、28-1、28-2、29-1、29-2、30-1、30-2、31-1、31-2、31-3、31-4、32-1、32-2、33-3、33-4、34、35、表21和表25的化合物，其条件是所述化合物不存在于表C中。
其他目的和优点将在下面的描述中部分阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可通过实践学习。所述目的和优点将通过所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和达到。
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅是示例性和解释性的，并且不限制权利要求。
附图说明
为了使本公开易于理解，现在将参考附图以示例的方式给出其各种形式的描述，在所述附图中：
图1是表C，其描绘了许多化合物的结构；并且
图2是异种移植研究的图示，其说明了本公开的化合物对肿瘤大小的影响。
具体实施方式
本文公开可用于抑制USP 28和/或USP25的化合物，包括如本文所定义的USP25抑制剂化合物、USP28抑制剂化合物和USP28/25抑制剂化合物。USP28/25抑制剂、USP28抑制剂和/或USP25抑制剂化合物可为本文所公开的化合物，包括式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物和/或式(VII)化合物。这些化学实体可能不包括表C中所示的化合物。
如本文所用的术语“USP28抑制剂”化合物是指在本文如实施例A-1(a)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定和/或如实施例A-1(b)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定中IC50为2微摩尔浓度或更小的本文所公开化合物(例如式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物和/或式(VII)化合物)。举例来说，USP28抑制剂可为使用如实施例A-1(a)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度并且更优选地0.001-0.05微摩尔浓度范围内的IC50值)的本文所公开式的化合物。USP28抑制剂可为使用如实施例A-1(b)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度、更优选地0.001-0.05微摩尔浓度范围内的IC50值)的本文所公开式的化合物。USP28抑制剂可为使用如实施例A-1(a)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定和如实施例A-1(b)中所阐述的USP28的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在两个测定中0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度、更优选地0.001-0.05微摩尔浓度的IC50值)的本文所公开式的化合物。
如本文所用的术语“USP25抑制剂”是指在本文如实施例A-2中所阐述的USP25的泛素-罗丹明110测定中IC50为2微摩尔浓度或更小的本文所公开化合物(例如式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物和/或式(VII)化合物)。举例来说，USP25抑制剂可为使用如实施例A-2中所阐述的USP25的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度、更优选地0.001-0.05微摩尔浓度范围内的IC50值)的本文所公开式的化合物。USP25抑制剂可为使用如实施例A-2中所阐述的USP25的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度、更优选地0.001-0.05微摩尔浓度范围内的IC50值)的本文所公开式的化合物。USP25抑制剂可为使用如实施例A-2中所阐述的USP25的泛素-罗丹明110测定和如实施例A-2中针对USP25所阐述的泛素-罗丹明110测定IC50值至多为2微摩尔浓度(包括在两个测定中在0.001-2微摩尔浓度、优选地0.001-0.2微摩尔浓度、更优选地0.001-0.05微摩尔浓度范围内的IC50值)的本文所公开式的化合物。
如本文所用的术语“USP28/25抑制剂”是指作为如本文所定义的USP28抑制剂或USP25抑制剂或者USP28抑制剂和USP25抑制剂二者的本文所公开的化合物(例如式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物和/或式(VII)化合物)。
任选地，式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物、式(V)化合物、式(VI)化合物和/或式(VII)化合物中的任何一个或多个氢原子可独立地被氘或其他氢同位素置换。
在本公开的第一方面，化学实体选自式(I)化合物：
并且描述了其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体，其中X、Y、R1、R2、R3、R4和n如上文所阐述。
本公开细节陈述于下文所附说明中。尽管在本公开的实践或测试中可使用与本文所阐述的那些类似或等效的方法和材料，但现在将阐述说明性方法和材料。根据描述和权利要求书，本公开的其他特征、目的和优点将显而易见。在说明书和所附权利要求书中，除非上下文另外明确指示，否则单数形式还包括复数。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本公开所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。本说明书中所引用的所有专利和公开都通过引用整体并入本文。
本公开所用的冠词“一个”和“一种”是指所述冠词的语法对象的一个或一个以上(例如是指至少一个)。举例来说，“一个元件”意指一个元件或一个以上元件。
除非另外指示，否则术语“和/或”在本公开中用于指“和”或“或”。
术语“任选地被取代”应理解为意指，给定化学部分(例如烷基)可(但未必)键结其他取代基(例如杂原子)。例如，任选地被取代的烷基可为完全饱和的烷基链(例如纯烃)。或者，相同的任选地被取代的烷基可具有非氢取代基。例如，其可在沿链的任一点结合至卤素原子、羟基或本文所阐述的任何其他取代基。因此，术语“任选地被取代”意指，给定化学部分可含有其他官能团，但未必具有任何其他官能团。用于任选取代所阐述基团的合适取代基包括但不限于卤素、氧代基、-OH、-CN、-COOH、-CH2CN、-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、-O-(C2-C6)烯基、-O-(C2-C6)炔基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、-OH、-OP(O)(OH)2、-OC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)(C1-C6)烷基、-OC(O)O(C1-C6)烷基、-NH2、-NH((C1-C6)烷基)、-N((C1-C6)烷基)2、-NHC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)NH(C1-C6)烷基、-S(O)2(C1-C6)烷基、-S(O)NH(C1-C6)烷基和-S(O)N((C1-C6)烷基)2。取代基可自身任选地被取代。如本文所用的“任选地被取代”也是指被取代或未被取代，其含义阐述于下文中。
如本文所用，术语“被取代”意指，指定基团或部分带有一个或多个合适取代基，其中所述取代基可在一个或多个位置连接至指定基团或部分。例如，被环烷基取代的芳基可指示，环烷基利用键或通过与芳基稠合并共用两个或更多个公用原子而连接至芳基的一个原子。
如本文所用，术语“未被取代”意指指定基团不带有取代基。
除非另外具体定义，否则术语“芳基”是指具有1至3个芳族环的环状、芳族烃基团，包括单环或双环基团，例如苯基、联苯或萘基。在含有两个芳族环(双环等)的情形下，芳基的芳族环可接合于单一点(例如联苯)或发生稠合(例如萘基)。芳基可任选地在任何连接点被一个或多个取代基(例如1至5个取代基)取代。示例性取代基包括(但不限于)-H、-卤素、-O-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、-O-(C2-C6)烯基、-O-(C2-C6)炔基、(C2-C6)烯基、(C2-C6)炔基、-OH、-OP(O)(OH)2、-OC(O)(C1-C6)烷基、-C(O)(C1-C6)烷基、-OC(O)O(C1-C6)烷基、-NH2、-NH((C1-C6)烷基)、-N((C1-C6)烷基)2、-S(O)2-(C1-C6)烷基、-S(O)NH(C1-C6)烷基和-S(O)N((C1-C6)烷基)2。所述取代基可自身任选地被取代。此外，在含有两个稠合环时，本文所定义的芳基可具有与完全饱和环稠合的不饱和或部分饱和环。这些芳基的示例性环系统包括(但不限于)苯基、联苯、萘基、蒽基、非那烯基、菲基、二氢茚基、茚基、四氢萘基、四氢苯并轮烯基等。
除非另外具体定义，否则“杂芳基”意指具有5至24个环原子的单价单环芳族基团或者含有一个或多个选自N、O和S的环杂原子并且其余环原子是C的多环芳族基团。如本文所定义的杂芳基还意指双环杂芳族基团，其中杂原子选自N、O和S。芳族基团任选地独立地被一个或多个本文所阐述的取代基取代。实例包括(但不限于)呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡唑基、嘧啶基、咪唑基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吡嗪基、吲哚基、噻吩-2-基、喹啉基、苯并吡喃基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑、吲唑、苯并咪唑基、噻吩并[3,2-b]噻吩、三唑基、三嗪基、咪唑并[1,2-b]吡唑基、呋喃并[2,3-c]吡啶基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、吲唑基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯并[3,2-c]吡啶基、吡唑并[3,4-c]吡啶基、噻吩并[3,2-c]吡啶基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、噻吩并[2,3-b]吡啶基、苯并噻唑基、吲哚基、吲哚啉基、吲哚啉酮基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并呋喃基、苯并呋喃、色烷基、硫代色烷基、四氢喹啉基、二氢苯并噻嗪、二氢苯并噁烷基、喹啉基、异喹啉基、1,6-萘啶基、苯并[de]异喹啉基、吡啶并[4,3-b][1,6]萘啶基、噻吩并[2,3-b]吡嗪基、喹唑啉基、四唑并[1,5-a]吡啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶基、异吲哚基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[3,4-b]吡啶基、吡咯并[3,2-b]吡啶基、咪唑并[5,4-b]吡啶基、吡咯并[1,2-a]嘧啶基、四氢吡咯并[1,2-a]嘧啶基、二苯并[b,d]噻吩、吡啶-2-酮、呋喃并[3,2-c]吡啶基、呋喃并[2,3-c]吡啶基、1H-吡啶并[3,4-b][1,4]噻嗪基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、呋喃并[2,3-b]吡啶基、苯并噻吩基、1,5-萘啶基、呋喃并[3,2-b]吡啶、[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶基、苯并[1,2,3]三唑基、咪唑并[1,2-a]嘧啶基、[1,2,4]三唑并[4,3-b]哒嗪基、苯并[c][1,2,5]噻二唑基、苯并[c][1,2,5]噁二唑、1,3-二氢-2H-苯并[d]咪唑-2-酮、3,4-二氢-2H-吡唑并[1,5-b][1,2]噁嗪基、4,5,6,7-四氢吡唑并[1,5-a]吡啶基、噻唑并[5,4-d]噻唑基、咪唑并[2,1-b][1,3,4]噻二唑基、噻吩并[2,3-b]吡咯基、噻吩并[2,3-d]噻唑、1a,2,3,7b-四氢-1H-环丙并[c][1,8]萘啶、3H-吲哚基及其衍生物。此外，如本文所用的术语“杂芳基”和“杂芳-”还包括其中杂芳族环与一个或多个芳基、环脂族或杂环基环稠合的基团，其中连接基团或连接点位于杂芳族环上。非限制性实例包括吲哚啉基、吲哚啉酮基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并呋喃、色烷基、硫代色烷基、四氢喹啉基、二氢苯并噻嗪、3,4-二氢-1H-异喹啉基、2,3-二氢苯并呋喃、吲哚啉基、吲哚基、异吲哚基和二氢苯并噁烷基。
卤素或“卤基”是指氟、氯、溴或碘。
烷基是指含有1-12个碳原子的直链或支链饱和烃。(C1-C6)烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基和异己基。
“烷氧基”是指在链中含有1-12个碳原子并含有末端“O”的直链或支链饱和烃，例如-O(烷基)。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或戊氧基。
术语“亚烷基”或“烷基烯基”是指二价烷基。任何上文提及的单价烷基可通过从烷基夺取第二氢原子而成为亚烷基。如本文所定义，亚烷基还可为C0-C6亚烷基。亚烷基可另外为C0-C4亚烷基。典型的亚烷基包括(但不限于)-CH2-、-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-等。
“环烷基”或“碳环基”意指含有3-18个碳原子的单环或多环饱和碳环。环烷基的实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降莰烷基、降莰烯基、双环[2.2.2]辛烷基或双环[2.2.2]辛烯基及其衍生物。C3-C8环烷基是含有3至8个碳原子的环烷基。环烷基可为稠合的(例如十氢萘)或桥接的(例如降莰烷)。
“杂环基”或“杂环烷基”意指含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子(芳香性)的单环或多环。杂环烷基环结构可被一个或多个取代基取代。取代基可自身任选地被取代。杂环基环的实例包括(但不限于)氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基(azetadinyl)、四氢呋喃基、四氢吡喃基、吡咯烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、吡喃基、硫代吡喃基、四氢吡喃基、二氧戊环基(dioxalinyl)、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、硫代吗啉基S-氧化物、硫代吗啉基S-二氧化物、哌嗪基、氮杂卓基、氧杂卓基、二氮杂卓基、莨菪烷基(tropanyl)、噁唑烷酮基和高莨菪烷基(homotropanyl)。如本文所用，“杂环基”和“杂环烷基”还包括桥接和螺环环系统，其中至少一个原子是杂原子。作为取代基的杂环可经由环杂原子连接(例如“N连接”)或经由环碳连接(例如“C连接”)。
术语“羟基烷基”意指烷基被一个或多个OH基团取代的如上文所定义的烷基。羟基烷基的实例包括HO-CH2-、HO-CH2-CH2-和CH3-CH(OH)-。
如本文所用的术语“卤代烷基”是指被一个或多个卤素取代的如本文所定义的烷基。卤代烷基的实例包括(但不限于)三氟甲基、二氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
如本文所用的术语“卤代烷氧基”是指被一个或多个卤素取代的如本文所定义的烷氧基。卤代烷基的实例包括(但不限于)三氟甲氧基、二氟甲氧基、五氟乙氧基、三氯甲氧基等。
如本文所用的术语“氰基”意指具有通过三键接合至氮原子的碳原子的取代基，例如C≡N。
术语“溶剂化物”是指通过溶质和溶剂形成的具有可变化学计量的络合物。用于本公开目的的这些溶剂可能并不干扰溶质的生物活性。合适溶剂的实例包括(但不限于)水、MeOH、EtOH和AcOH。其中水是溶剂分子的溶剂化物通常被称为水合物。水合物包括含有化学计量量水的组合物以及含有可变量水的组合物。
术语“异构体”是指具有相同组成和分子量但具有不同物理和/或化学性质的化合物。结构差异可在于构造(几何异构体)或旋转偏振光平面的能力(立体异构体)。就立体异构体而言，式(I)化合物可具有一个或多个不对称碳原子并且可以外消旋物、外消旋混合物以及个别对映异构体或非对映异构体的形式存在。
本公开还包括包含有效量的所公开化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
关于受试者的术语“治疗”是指改善受试者的病症的至少一种症状。治疗包括治愈、改善或至少部分地缓解病症。
除非另外指示，否则术语“病症”在本公开中用于指术语疾病、疾患或病况，并且可互换使用。
如本公开所用的术语“施用”是指向受试者直接施用所公开化合物或所公开化合物的药学上可接受的盐或组合物，或者向受试者施用所述化合物或所述化合物的药学上可接受的盐或组合物的前药衍生物或类似物(其可在受试者身体内形成等效量的活性化合物)。
如本公开所用的术语“前药”意指可在体内通过代谢方式(例如通过水解)转化成所公开化合物的化合物。
术语“癌症”包括(但不限于)下列癌症：膀胱癌、乳腺癌(例如导管癌)、宫颈癌(例如鳞状细胞癌)、结直肠癌(例如腺癌)、食道癌(例如鳞状细胞癌)、胃癌(例如腺癌、髓母细胞瘤、结肠癌、绒毛膜癌、鳞状细胞癌)、头颈癌、血液学癌症(例如急性淋巴细胞性贫血、急性骨髓样白血病、急性淋巴母细胞性B细胞白血病、间变性大细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、慢性淋巴细胞性白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病/高嗜酸性粒细胞综合征、慢性骨髓样白血病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、套细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病)、肺癌(例如支气管肺泡腺癌、间皮瘤、粘液表皮样癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺癌、鳞状细胞癌)、肝癌(例如肝细胞癌)、淋巴瘤、神经学癌症(例如胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤)、卵巢癌(例如腺癌)、胰腺癌(例如导管癌)、前列腺癌(例如腺癌)、肾癌(例如肾细胞癌、透明细胞肾癌)、肉瘤(例如软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、纤维肉瘤、多能性肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤)、皮肤癌(例如黑色素瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌)、甲状腺癌(例如髓质癌)和子宫癌。
本公开涉及选自能够抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其可用于治疗与至少一种选自USP28和USP25的途径的调节相关的疾病和病症。本公开还涉及选自可用于抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。
在如本文所公开的任何实施方案中，癌症可为任何器官中的任何癌症，例如，癌症选自由以下组成的组：神经胶质瘤、甲状腺癌、乳腺癌、小细胞肺癌、非小细胞癌、胃癌、结肠癌、胃肠道基质癌、胰腺癌、胆管癌、CNS癌、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、间皮瘤和黑色素瘤及其组合。
本公开涉及选自能够抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其可用于治疗与至少一种选自USP28和/或USP25酶的途径的调节相关的疾病和病症。本公开还涉及选自可用于抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。
在一个实施方案中，化学实体选自式(II)化合物：
其中X、Y、R1、R2、R3、R4和n如上文所阐述；及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体。
在另一个实施方案中，化学实体选自式(III)化合物：
其中X、Y、R1、R2、R3、R4和n如上文所阐述；及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体。
在另一个实施方案中，化学实体选自式(IV)化合物：
其中X、Y、R1、R2、R3、R4和n如上文所阐述；及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体。
在另一个实施方案中，化学实体选自式(V)化合物：
其中X、Y、R1、R2、R3、R4和n如上文所阐述；及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体。
在一些实施方案中，化学实体选自式(VI)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
X选自C(R)(R”)和O；
Y1、Y2和Y3中的每一者独立地选自C(R3)和N；
R'选自H、氘和CH3；
R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基，
或者R和R”与其所连接的碳一起形成任选地被一个或多个Ri取代的螺环环丙基，其中任何作为或含有氢的R、R”或Ri基团可独立地具有一个或多个被氘置换的氢；
每个Ri独立地选自卤素、-OH和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-12元稠合和非稠合杂芳基，并且此外其中任何含氢的R1基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
R2选自N连接的4-12元杂环基、C连接的4-12元杂环基和连接至4-12元杂环基的O连接体，其中所述4-12元杂环基任选地被一个或多个R5(其可与R1的一个或多个R5相同或不同)取代，并且此外其中R2基团中的任何氢可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
R4选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6独立地选自-氨基烷基-芳基、-氨基烷基-杂芳基、-氨基烷基-环基和-氨基烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R7独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；
并且
n是0、1、2或3。
式(VI)化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
X选自C(R)(R”)和O；
Y1、Y2和Y3中的每一者独立地选自C(R3)和N；
R'选自H和CH3；
R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基，
或者R和R”与其所连接的碳一起形成任选地被一个或多个Ri取代的螺环环烷基(例如螺环环丙基)，其中任何R、R”；
每个Ri独立地选自卤素、-OH和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的稠合或非稠合杂芳基(例如6-12元稠合或非稠合杂芳基)(例如任选地被一个或多个R6取代的6元非稠合杂芳基)；
R2选自N连接的杂环基(例如4-12元杂环基)、C连接的杂环基(例如4-12元杂环基)和O连接的杂环基(例如4-12元杂环基，例如)，其中-N连接-、-C连接或-O连接(例如4-12元)的杂环基中的任一者任选地被一个或多个R5(其可与R1的一个或多个R5相同或不同)取代；
每个R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
R4选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、(C3-C8)环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R5取代；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；
每个R6独立地选自-氨基烷基-芳基、-氨基烷基-杂芳基、-氨基烷基-环基和-氨基烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代；
每个R7独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在一些实施方案中，上文中式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)和/或式(VI)的化合物包括呈CH2形式的X(如果存在)(例如，R和R”在式(VI)中都是氢)。在其他实施方案中，上文中式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)和/或式(VI)的化合物包括呈O形式的X(如果存在)。
在另一个实施方案中，化学实体选自如下的式(VI)化合物及其药学上可接受的盐，其中：
X选自C(R)(R”)和O；
Y1、Y2和Y3中的每一者独立地选自C(R3)和N；
R'选自H和CH3；
R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基；
每个Ri独立地选自卤素、-OH和CH3；
R1选自任选地被一个或多个R5取代的6-12元稠合和非稠合杂芳基，其中6元非稠合杂芳基被一个或多个R6取代；
R2选自N连接和C连接的4-12元杂环基，其中所述4-12元杂环基任选地被一个或多个R5(其可与R1的一个或多个R5相同或不同)取代；
每个R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH和-CN，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基和(C1-C6)卤代烷氧基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
R4选自H、(C1-C6)烷基、卤素、-OH和-CN，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中烷基任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；
每个R6独立地选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代；
每个R7独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中所述(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在另一个实施方案中，化学实体选自式(VII)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
Y选自C(R3)和N；
R'选自H、氘和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-11元杂芳基；
R2选自N连接的4-12元杂环基和C连接的4-12元杂环基，其中所述杂环基任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R2基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R3(如果存在)独立地选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
每个R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6(如果存在)选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R7(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在一些实施方案中，所述式(VII)化合物选自式(VII')化合物：
其中Y选自C(R3)和N；R3独立地选自氢和卤素；R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；B选自键、N或C(Rb')；Z选自N、S、C(Rz')；其中Rb'和Rz'各自独立地选自H和R5'；R5'各自独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素基团，R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且n选自0、1或2。
在一些实施方案中，所述式(VII)化合物选自式(VII”)化合物：
其中
Y选自C(R3)和N；R3独立地选自氢和卤素；R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；M选自N和C(Rm)；P选自N和C(Rp)；Q选自N(Rq')、S或C(Rq)；其中Rm、Rp和Rq'和Rq各自独立地选自氢和Rs；每个Rs(其当存在时可连接在稠合环系统的任何部分)独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素；s选自0、1、2、3、4、5或6；R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、-(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且n选自0、1或2。
本公开还提供式(VII”')化合物：
或其药学上可接受的形式，其中R1是并且R2选自
在一些实施方案中，本公开提供式(VIII)化合物：
或其药学上可接受的形式，其中：X选自C(R)(R”)和O；Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；其中当Y2是N时Y1是C(R3')，或者当Y1是N时Y2是C(R3”)；R、R'和R”中的每一者选自H和氘；R1优选地选自包含一个或多个N原子并任选地被一个或多个取代基取代的8-10元稠合杂芳基，所述取代基选自卤素(优选地F或Cl)、(C1-C4)烷基(优选地甲基或乙基)、(C3)环烷基(环丙基或稠合环丙基)或选自-NH2、-NHR10或NR10R10′的组的胺，其中R10和R10′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)；R2优选地选自5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基部分，任选地桥接，并任选地被一个或多个R5取代，并任选地被一个或多个选自NH2、NHR11或NR11R11′的组的胺取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)，并且其中R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基部分，优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代；R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基(优选地甲基)、卤素(优选地-F或-Cl)和-CN；R4选自H、(C1-C6)烷基(优选地甲基)、卤素，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、酰胺基-(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R6独立地选自-氨基烷基-芳基、-氨基烷基-杂芳基、-氨基烷基-环基和-氨基烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
其条件是所述式(VIII)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
在一些实施方案中，式(VIII)的取代基如式(VI)中所定义。
在一些实施方案中，式(VIII)的R1和R2基团分别选自表A和表B。
在式(VIII)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(I')化合物：
及其药学上可接受的形式，其中
X选自C(R)(R”)和O；R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基；每个Ri独立地选自卤素、-OH和-CH3；Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢，B选自键、N或C(Rb')；Z选自N、S、C(Rz')，其中Rb'和Rz'各自独立地选自H和R5'；
R5'各自独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素，R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且
其条件是所述式(VIII')化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(VIII')中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(VIII)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(VIII”)化合物：
及其药学上可接受的形式，其中X选自C(R)(R”)和O；
R和R”中的每一者独立地选自H、卤素、-OH、-CN、任选地被一个或多个Ri取代的C1-C6烷基；每个Ri独立地选自卤素、-OH和CH3；Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；
R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
R4选自H、氘、(C1-C6)烷基、卤素、-OH、-CN，并且此外其中任何含氢的R4基团可具有一个或多个被氘置换的氢，
M选自N和C(Rm)；P选自N和C(Rp)；Q选自N(Rq')、S或C(Rq)；
其中Rm、Rp和Rq'和Rq各自独立地选自氢和Rs；
每个Rs(其当存在时可连接在稠合环系统的任何部分)独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素；
i选自0、1、2、3、4、5或6；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代,并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
其条件是所述式(VIII”)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(VIIII”)中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在一些实施方案中，所述式(VIII)化合物可选自式(IX)化合物：
及其药学上可接受的形式，其中Y1、Y2、R'、R1、R2、R3、R3'、R3”、R4、R5、R6和R7都如关于式(VIII)所定义，并且其条件是所述式(II)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
在式(IX)的一些实施方案中，Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；R'选自H和氘；R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-11元杂芳基；R2选自N连接的4-12元杂环基和C连接的4-12元杂环基，其中所述杂环基任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R2基团可具有一个或多个被氘置换的氢；R3、R3'和R3”各自独立地选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；每个R4选自H和氘；每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；每个R6(如果存在)独立地选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且每个R7(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代。
在式(IX)的一些实施方案中，Y1选自C(R3')；Y2选自C(R3”)；R'选自H和氘；R1选自表A的基团；R2选自表B的基团；R3选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素和-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R3'选自H、氘和卤素；R3”选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素和-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R4是氢。
优选地，式(IX)中的R1是含有至少一个氮原子和一个或多个选自氮、硫和氧的其他杂原子并任选地被(C1-C4)烷基、卤素(优选地Cl或F)或胺(例如，被一个或多个烷基或卤代烷基部分取代的-NH2或仲胺或叔胺)取代的8元、9元或10元稠合双环杂芳基。优选地，R1选自由以下组成的组：
或者，式(IX)中的R1可为与3-6元杂环烷基或环烷基稠合的5-6元杂芳基，所述3-6元杂环烷基或环烷基可自身被稠合或螺环3-6元杂环烷基或环烷基取代(例如，优选地与任选地被螺环或稠合环丁基部分取代的6元杂环烷基部分稠合的6元杂芳基)。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
优选地，式(IX)中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(IX)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(IX')化合物：
及其药学上可接受的形式，其中Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；R3、R3'和R3”'各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；B选自键、N或C(Rb')；Z选自N、S、C(Rz')，其中Rb'和Rz'各自独立地选自H和R5'；R5'各自独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素基团；R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且其条件是所述式(IX')化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(IX')中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(II)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(IX”)化合物：
及其药学上可接受的形式，其中Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；M选自N和C(Rm)；P选自N和C(Rp)；Q选自N(Rq')、S或C(Rq)；其中Rm、Rp和Rq'和Rq各自独立地选自氢和Rs；每个Rs(其当存在时可连接在稠合环系统的任何部分)独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素；i选自0、1、2、3、4、5或6；R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且其条件是所述式(IX”)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(IX”)中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(IX)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(IX”')化合物：
或其药学上可接受的形式，其中R1是并且R2选自
在一些实施方案中，所述式(VIII)化合物可选自式(X)化合物：
或其药学上可接受的形式，其中Y1、Y2、R'、R1、R2、R3、R3'、R3”、R4、R5、R6和R7都如关于式(VIII)所定义，并且其条件是所述式(X)化合物不是来自图1的表C的化合物。
优选地，式(X)中的R1是含有至少一个氮原子和一个或多个选自氮、硫和氧的其他杂原子并任选地被(C1-C4)烷基、卤素(优选地Cl或F)或胺(例如，被一个或多个烷基或卤代烷基部分取代的-NH2或仲胺或叔胺)取代的8元、9元或10元稠合双环杂芳基。优选地，式(III)中的R1选自由以下组成的组：
或者，式(X)中的R1可为与3-6元杂环烷基或环烷基稠合的5-6元杂芳基，所述3-6元杂环烷基或环烷基可自身被稠合或螺环3-6元杂环烷基或环烷基取代(例如，优选地与任选地被螺环或稠合环丁基部分取代的6元杂环烷基部分稠合的6元杂芳基)。在一些实施方案中，R1选自由以下组成的组：
优选地，式(X)中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(X)的一些实施方案中，Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；R'选自H和氘；R1选自任选地被一个或多个选自R5和/或R6的取代基取代的6-11元杂芳基；R2选自N连接的4-12元杂环基和C连接的4-12元杂环基，其中所述杂环基任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R2基团可具有一个或多个被氘置换的氢；R3、R3'和R3”各自独立地选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R4选自H和氘；每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、-C(O)NHCH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；每个R6(如果存在)独立地选自-NH(C1-C6)烷基-芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂芳基、-NH(C1-C6)烷基-杂环基和-NH(C1-C6)烷基-杂环基，其中每个R6基团任选地被一个或多个选自-OH、-NH、卤素、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和(C1-C6)卤代烷基的取代基取代，并且此外其中任何含氢的R6基团可具有一个或多个被氘置换的氢；每个R7(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、-C(O)-环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和-OH的取代基取代；并且其条件是所述式(X)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
在式(X)的一些实施方案中，Y1选自C(R3')；Y2选自C(R3”)；R'选自H和氘；R1选自表A的基团；R2选自表B的基团；R3选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素和-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R3'选自H、氘和卤素；R3”选自H、氘、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素和-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；R4是氢；并且其条件是所述式(X)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
在式(X)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(X')化合物：
及其药学上可接受的形式，其中
Y1选自C(R3')和N；Y2选自C(R3”)和N；
R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
B选自键、N或C(Rb')；Z选自N、S、C(Rz')，其中Rb'和Rz'各自独立地选自H和R5'；
R5'各自独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素基团；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、-(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；并且
其条件是所述式(X')化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(X')中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在式(X)的一些实施方案中，所述化合物可选自式(X”)化合物：
及其药学上可接受的形式，其中
Y1选自C(R3')；Y2选自C(R3”)；
R3、R3'和R3”各自独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基、卤素、-OH、-CN，其中(C1-C6)烷基和(C1-C6)卤代烷基中的每一者任选地被一个或多个R7取代；
M选自N和C(Rm)；
P选自N和C(Rp)；
Q选自N(Rq')、S或C(Rq)；
其中Rm、Rp和Rq'和Rq各自独立地选自氢和Rs；
每个Rs(其当存在时可连接在稠合环系统的任何部分)独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷基和卤素；
i选自0、1、2、3、4、5或6；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元单环或双环杂环基；
每个R5独立地选自-OH、-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、-(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、-N(CO)CH3、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
其条件是所述式(X”)化合物不选自图1中可见的表C的化合物。
优选地，式(X”)中的R2是5-8元单环或双环的N连接的杂环烷基、杂芳基或稠合杂环烷基-杂芳基部分，其含有第二氮杂原子或者被选自-NH2、-NHR11或-NR11R11′的组的胺部分取代，其中R11和R11′各自独立地是(C1-C4)烷基(优选地甲基)。所述R2部分优选地包含至少2个氮杂原子或1个氮杂原子和至少一个胺取代。R2可为单环或双环的(例如，桥接、稠合或螺环的)环杂烷基结构。R2可为含有至少两个氮原子的N连接的5元、6元或7元单环N连接的杂环烷基部分。在任何情况下，R2可进一步任选地被如上文所指出的额外部分取代。
在上述各式的一些实施方案中，X是CH2。在另一个实施方案中，X是O。
在上述各式的一些实施方案中，R1选自任选地被一个或多个R5取代的6-12元杂芳基。在上述各式的一些实施方案中，R1选自被一个或多个R6取代的6元杂芳基。在上述各式的一些实施方案中，任何含氢的R1基团或任选取代基可具有一个或多个被氘置换的氢。
在上述各式的一些实施方案中，R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的4-10元杂环基，并且其中杂环基的硫成员可为S(O)或S(O)2。在上述各式的一些实施方案中，R2选自任选地被一个或多个R5取代的C连接的4-10元杂环基，并且其中杂环基的硫成员可为S(O)或S(O)2。在上述各式的一些实施方案中，R2选自任选地被一个或多个R5取代的O连接的杂环实体，并且其中杂环基的硫成员可为S(O)或S(O)2。在上述各式的一些实施方案中，任何含氢的R2基团或任选取代基可具有一个或多个被氘置换的氢。
在上述各式的一些实施方案中，R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素和-CN。
在上述各式的一些实施方案中，R4选自H和(C1-C6)烷基。在上述各式的一些实施方案中，R4可具有一个或多个被氘置换的氢。
在上述各式的一些实施方案中，n是0、1或2。在另一个实施方案中，n是0或1。在又一个实施方案中，n是1、2或3。在另一个实施方案中，n是1或2。在另一个实施方案中，n是2或3。在另一个实施方案中，n是0。在另一个实施方案中，n是1。在另一个实施方案中，n是2。在另一个实施方案中，n是3。
在上述各式的一些实施方案中，任选地被R5和/或R6取代的R1选自表A和/或表A-2的基团。优选地，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)和/或式(VII)的化合物包含选自下表A和/或表A-2中的基团的R1(单独或被一个或多个R5和/或R6取代)。
表A：
表A-2：
在上述各式的一些实施方案中，任选地被R5取代的R2选自下表B和/或表B-2的基团。优选地，式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)和/或式(VII)的化合物可包含选自下表B和/或表B-2的基团的R2(单独或被一个或多个可相同或不同的R5和/或R6取代)。
表B
表B-2
优选地，式(I)、式(I')、式(I”)、式(I”')、式(II)、式(III)、式(IV)、式(V)、式(VI)和/或式(VII)的化合物可包含选自上表A和/或表A-2中的基团的R1(单独或被一个或多个可相同或不同的R5和/或R6取代)和选自上表B和/或表B-2中的基团的R2(单独或被一个或多个可相同或不同的R5和/或R6取代)。
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIa)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n如式(I)中所定义；和/或式(IIaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3、R5、R6、R7和n如式(I)中所定义。
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIb)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R'、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(VI)所定义。
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中
R1选自被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8-9元杂芳基；
R2选自N连接的6-12元杂环基或C连接的6-12元杂环基，其中6-12元杂环基任选地被一个或多个R5取代；
R3独立地选自H、(C1-C6)烷基、卤素和-CN；并且
其中R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)中所定义。
在式(IIaa)的优选实施方案中，任选地被R5和/或R6取代的R1选自
并且
任选地被R5取代的R2选自
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIb')化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R'选自H和CH3；
R1选自被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8-9元杂芳基；
R2选自N连接的6-12元杂环基或C连接的6-12元杂环基，其中6-12元杂环基任选地被一个或多个R5取代；
R3独立地选自H和卤素；并且
R5、R6、R7和n各自独立地如式(VI)中所定义。
在式(IIb')的优选实施方案中，任选地被R5和/或R6取代的R1选自
并且
任选地被R5取代的R2选自
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIIa)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)所定义；和/或式(IIIb)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)所定义。
在一些实施方案中，化学实体选自式(IIIaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1选自任选地被一个或多个R5取代的8-11元杂芳基；
R2选自N连接的4-12元杂环基和C连接的4-12元杂环基，其任选地被一个或多个R5取代；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在式(IIIaa)的优选实施方案中，R1选自
其中B选自键或C；
Z选自N、S、C(Rii)；
Rii选自H、CH3和R5；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元杂环基；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在式(IIIaa)的其他优选实施方案中，任选地被R5取代的R1选自
并且
任选地被R5取代的R2选自
在一些实施方案中，化学实体选自式(IVa)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1、R2、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)所定义。
在一些实施方案中，化学实体选自式(Va)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)所定义。
在一些实施方案中，化学实体选自式(Vaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R1选自被一个或多个选自R5和R6的取代基取代的8元杂芳基；R2选自N连接的5元杂环基；并且R5、R6、R7和n各自独立地如式(I)所定义。
在式(Vaa)的其他优选实施方案中，被R5取代的R1选自
并且R2选自
在一些实施方案中，化学实体选自式(VIIa')化合物：
或其药学上可接受的盐，
其中R'、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和n各自独立地如式(VI)所定义。
在至少一个实施方案中，化学实体选自式(VIIaa)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中
R1选自任选地被一个或多个R5取代的8-9元杂芳基；
R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的4-12元杂环基；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1、2或3。
在式(VIIaa)的优选实施方案中，R1选自
其中B选自键或C；
Z选自N、S、C(Rii)；
Rii选自H、CH3和R5；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的5-8元杂环基；
每个R5(如果存在)独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、卤素、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基、环烷基、杂环烷基和-C(O)-杂环烷基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且n是0、1、2或3。
在式(VIIaa)的其他优选实施方案中，任选地被R5取代的R1选自
并且
任选地被R5取代的R2选自
优选地，化合物是如本文所定义的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化合物，其是USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂。
在本公开的另一个实施方案中，式(I)化合物是对映异构体。在一些实施方案中，化合物是(S)-对映异构体。在其他实施方案中，化合物是(R)-对映异构体。在其他实施方案中，式(I)化合物可为(+)或(-)对映异构体。
应理解，所有异构体形式都包括于本公开内(包括其混合物)。如果化合物含有双键，则取代基可呈E或Z构型。如果化合物含有被二取代的环烷基，则环烷基取代基可具有顺式或反式构型。还意在包括所有互变异构体形式。
本公开化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、立体异构体和前药可以其互变异构体形式(例如以酰胺或亚氨基醚形式)存在。所有这些互变异构体形式都作为本公开的部分涵盖于本文中。
本公开化合物可含有不对称或手性中心，并因此以不同立体异构体形式存在。本公开化合物的所有立体异构体形式以及其混合物(包括外消旋混合物)都旨在形成本公开的一部分。另外，本公开涵盖所有几何异构体和位置异构体。例如，如果本公开化合物并入双键或稠合环，则顺式形式和反式形式以及混合物涵盖于本公开范围内。本文所公开的每一化合物包括所有符合化合物的一般结构的对映异构体。所述化合物可呈外消旋或对映异构体纯形式，或者关于立体化学的任何其他形式。测定结果可反映外消旋形式、对映异构体纯形式或关于立体化学的任何其他形式所收集的数据。
非对映异构体混合物可基于其物理化学差异通过本领域技术人员众所周知的方法(例如通过色谱法和/或分步结晶)分离成其个别非对映异构体。对映异构体可通过以下方式进行分离：通过与适当的光学活性化合物(例如手性助剂，例如手性醇或Mosher酰氯)反应而将对映异构体混合物转化成非对映异构体混合物，分离所述非对映异构体并将个别非对映异构体转化(例如水解)成相应的纯对映异构体。此外，本公开的一些化合物可为阻转异构体(例如被取代的联芳基)并且视为本公开的一部分。还可通过使用手性HPLC柱来分离对映异构体。
本公开化合物还可以不同互变异构体形式存在，并且所有这些形式都涵盖于本公开范围内。此外，例如，本公开包括所述化合物的所有酮-烯醇和亚胺-烯胺形式。
本公开化合物的所有立体异构体(例如几何异构体、光学异构体等)(包括所述化合物的盐、溶剂化物、酯和前药以及前药的盐、溶剂化物和酯的那些立体异构体)，例如可由于各种取代基上的不对称碳而存在的立体异构体，包括对映异构体形式(其即使在不存在不对称碳下也可存在)、旋转异构体形式、阻转异构体和非对映异构体形式，以及位置异构体(例如4-吡啶基和3-吡啶基)，都涵盖于本公开范围内。(举例来说，如果式(I)化合物并入双键或稠合环，则顺式形式和反式形式以及混合物都涵盖于本公开范围内。此外，例如，本公开包括所述化合物的所有酮-烯醇和亚胺-烯胺形式。)本公开化合物的个别立体异构体可例如实质上不含其他异构体，或者可例如作为外消旋物混合，或与所有其他或其他被选择的立体异构体混合。本公开的手性中心可具有如通过IUPAC 1974 Recommendations所定义的S或R构型。使用术语“盐”、“溶剂化物”、“酯”、“前药”等旨在同样适用于本文所公开化合物的对映异构体、立体异构体、旋转异构体、互变异构体、位置异构体、外消旋物或前药的盐、溶剂化物、酯和前药。
本文所公开的化合物可形成也在本公开范围内的盐。
本公开涉及作为至少一种选自USP28和USP25的途径的调节剂的化合物。在一个实施方案中，本公开化合物是至少一种选自USP28和USP25的途径的抑制剂。
本公开涉及选自如本文所阐述的化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体；以及包含至少一种选自如本文所阐述的化合物及其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体的药物组合物。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除与USP28调节相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP28调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及治疗、预防、抑制或消除与USP28抑制相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP28调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及抑制USP28的方法。所述方法涉及向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除与USP25调节相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP25调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及治疗、预防、抑制或消除与USP25抑制相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP25调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及抑制USP25的方法。所述方法涉及向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除与USP28调节相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP28调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。在另一方面，本公开涉及治疗、预防、抑制或消除与USP28抑制相关的疾病或病症的方法。所述方法包括向需要治疗与USP28调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的组合物和式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。在另一方面，本公开涉及抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的方法。所述方法涉及向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除患者中与USP28抑制相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除患者中与USP25抑制相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
本公开的另一方面涉及治疗、预防、抑制或消除患者中与至少一种选自USP28和USP25的途径抑制相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的式(I)的化学实体。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
在另一方面，本公开涉及治疗、预防、抑制或消除癌症的方法。所述方法包括向需要治疗癌症的患者施用有效量的选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
本公开的另一方面涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其用于治疗、预防、抑制或消除与抑制USP28相关的疾病或病症的方法中。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。所述方法可包括向需要治疗与USP28和/或USP25的调节相关的疾病或病症的患者施用有效量的如本文所公开的包含USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的药物组合物。
在另一方面，本公开涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其用于治疗、预防、抑制或消除与抑制USP25相关的疾病或病症的方法中。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
本公开的另一方面涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其用于治疗、预防、抑制或消除与抑制至少一种选自USP28和USP25的途径相关的疾病或病症的方法中。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体，其用于治疗、预防、抑制或消除癌症的方法中。
本公开的另一方面涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体的用途，其用以制造用于治疗、预防、抑制或消除与抑制USP28相关的疾病或病症的药物。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
本公开的另一方面涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体的用途，其用以制造用于治疗、预防、抑制或消除与抑制至少一种选自USP28和USP25的途径相关的疾病或病症的药物。在一个实施方案中，疾病或病症是癌症。
在另一方面，本公开涉及选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体的用途，其用以制造用于治疗、预防、抑制或消除癌症的药物。
在其他实施方案中，本公开涉及USP28抑制剂的用途，其用以制备用于治疗、预防、抑制或消除与癌症相关的疾病或病症的药物。
本公开还涉及USP28抑制剂的用途，其用以制备用于治疗、预防、抑制或消除通过USP28介导的疾病或疾患的药物，其中所述药物包括选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。本公开还涉及USP28抑制剂的用途，其用以制备用于治疗、预防、抑制或消除通过USP28介导的疾病或疾患的药物，其中所述药物包括选自如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化合物的化学实体。
本公开还涉及USP25抑制剂的用途，其用以制备用于治疗、预防、抑制或消除通过USP25介导的疾病或疾患的药物，其中所述药物包括选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。本公开还涉及USP25抑制剂的用途，其用以制备用于治疗、预防、抑制或消除通过USP25介导的疾病或疾患的药物，其中所述药物包括选自如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化合物的化学实体。
在另一方面，本公开涉及制造用于治疗、预防、抑制或消除通过至少一种选自USP28和USP25的途径介导的疾病或疾患的药物的方法，其中所述药物包括选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体。这些机制已展示可用于治疗癌症(例如肺癌和脑癌)。
在一些实施方案中，基于基因扩增和/或升高的USP28、MYC、LSD1、NICD1肿瘤表达和/或降低的FBXW7表达(相对于组织匹配的表达)来选择患者进行治疗。
在一些实施方案中，基于基因扩增和/或升高的USP28、USP25、MYC、LSD1、NICD1肿瘤表达和/或降低的FBXW7表达(相对于组织匹配的表达)来选择患者进行治疗。
在一些实施方案中，施用式(I)化合物或包含本公开化合物和药学上可接受的载体的药物组合物可诱导细胞周期、细胞存活、细胞凋亡或分化的变化。
举例来说，细胞周期或细胞存活或分化的变化可通过降低的MYC、LSD1、NICD1、PIM1、CDK1、POLA2、HEY1和/或CCND1肿瘤水平和/或增加的CD86、p21、LGALS4和/或DLL1水平来指示。
本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体还可包括赋形剂、稀释剂或表面活性剂。本公开的另一方面涉及包含选自如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化合物的化学实体的药物组合物。
在一个实施方案中，提供治疗与USP28调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法，所述方法包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用式(I)的化学实体。治疗与USP28调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法可包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化学实体。
在另一个实施方案中，提供了治疗与USP25调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法，所述方法包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用式(I)的化学实体。治疗与USP25调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法可包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化学实体。
在另一个实施方案中，提供了治疗与至少一种选自USP28和USP25的途径的调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法，所述方法包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用式(I)的化学实体。治疗与至少一种选自USP28和USP25的途径的调节相关的疾病或病症(包括癌症)的方法还可包括向患有所述疾病或病症中的至少一者的患者施用如本文所定义的作为USP28抑制剂、USP25抑制剂和/或USP 28/25抑制剂的式(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(IIa)、(IIaa)、(IIb')、(IIIa)、(IIIb)、(IIIaa)、(IVa)、(Va)、(Vaa)、(VIIa')或式(VIIaa)的化学实体。
抑制USP28的本公开的化合物或组合物的一种治疗用途是向患有癌症的患者或受试者提供治疗。
抑制USP25的本公开的化合物或组合物的另一个治疗用途是向患有癌症的患者或受试者提供治疗。
抑制至少一种选自USP28和USP25的途径的本公开的化合物或组合物的另一个治疗用途是向患有癌症的患者或受试者提供治疗。
可施用有效量的本公开化合物以治疗或预防受试者的病症和/或预防病症的发展。
可经由施用治疗剂的任何模式来实现所公开化合物的施用。
本公开的另一方面涉及药物组合物，其包含选自式(I)化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、立体异构体和互变异构体的化学实体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体还可包括赋形剂、稀释剂或表面活性剂。
根据包括以下的各种因素来选择利用所公开化合物的给药方案：患者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况；待治疗疾患的严重程度；施用途径；患者的肾或肝功能；以及所采用的特定公开化合物。具有本领域一般技术的医师或兽医可易于确定预防、对抗或阻止疾患进展所需药物的有效量并开具处方。
根据本公开的式(I)-(VII)化合物的非限制性实例包括下表9-25的那些化合物。
合成化合物的方法
可以有机合成领域的技术人员已知的多种方式来制备本公开化合物。可通过各种方法(包括标准化学)来制备本公开化合物。合适的合成途径绘示于本文所提供的方案中。可通过有机合成领域中已知的方法来制备本文所公开的化合物，如部分地通过下列合成方案所陈述。在本文所阐述的方案中，应充分理解，根据一般原理或化学视需要采用敏感性或反应性基团的保护基。根据标准有机合成方法来操纵保护基(T.W.Greene和P.G.M.Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,第三版,Wiley,New York 1999)。在化合物合成的适宜阶段使用本领域技术人员显而易见的方法来去除这些基团。选择工艺以及反应条件及其执行顺序应与本文所公开化合物(包括例如式(I)化合物)的制备一致。
本文所阐述的化合物可从市售起始材料制得或使用已知有机、无机和/或酶促工艺来合成。本领域技术人员将认识到在本文所公开的化合物中是否存在立体中心。因此，本公开包括两种可能的立体异构体(除非指定于合成中)并且不仅包括外消旋化合物，而且还包括个别对映异构体和/或非对映异构体。在期望化合物作为单一对映异构体或非对映异构体时，可通过立体特异性合成或通过拆分最终产物或任何适宜中间体来获得。可通过本领域已知的任何合适方法来拆分最终产物、中间体或起始材料。例如参见“Stereochemistryof Organic Compounds”，E.L.Eliel,S.H.Wilen和L.N.Mander(Wiley-lnterscience,1994)。
举例来说，可使用下述方法以及合成有机化学领域已知的合成方法或本领域技术人员所了解的所述方法的变化形式来合成本公开化合物。优选方法包括(但不限于)下文所阐述的那些方法。制备本发明化合物的一般程序阐述于一般方案1中。可使被适当取代并被保护的双环中间体1与被适当取代的被保护的胺中间体2在钯催化的碳-氮偶联方案下使用适当钯络合物、配体和碱(例如但不限于：RuPhos第3代钯预催化剂和碳酸铯)在适当温度(例如100℃)下于合适溶剂(例如甲苯)中进行反应，得到中间体3。可在合适的脱保护条件(例如但不限于：氢(气体)，使用碳载钯，在适当溶剂(例如甲醇、乙醇或乙酸乙酯)中)下去除保护基1(PG1；通常是Cbz基团)，得到胺中间体4。可使被适当取代的胺中间体4与被适当取代的羧酸在酰胺偶联条件(例如但不限于：偶联试剂EDC和HOBt，使用适当碱(例如Et3N或DIEA)，在例如DMF或DMA的溶剂中)下进行反应，得到倒数第二个酰胺中间体5。可在适当条件下(例如TFA，在例如DCM或HCl的溶剂中，在例如MeOH或二噁烷的溶剂中)去除保护基2(PG2；通常是boc基团)，得到最终化合物6。可通常通过制备型HPLC来纯化最终化合物并分离为游离碱。倘若形成对映异构体和/或非对映异构体的混合物，则可在适当阶段(在许多情形下通过手性HPLC)纯化个别立体异构体。
一般方案1
制备所选中间体的一般方法
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案1中。可使含有被适当取代的离去基的起始材料1(LG1；通常是溴化物)与锂化手性助剂2(通过使2与强碱如nBuLi进行反应而形成)在低温(通常-78℃)下于适当溶剂(例如THF)中进行反应，得到中间体3。在例如HCl水溶液(于例如乙腈的溶剂中)的条件下水解以去除助剂，接着还原(通常使用于例如MeOH的溶剂中的NaBH4)可得到胺基醇4。可使用强碱(例如NaH)在低温(通常-70℃)于例如DMSO的溶剂中环化胺基醇4，得到中间体4。向相应中间体中添加适当保护基(PG1；通常是CBz基团)可产生被适当取代的双环中间体5。
中间体一般方案1.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案2中。可使被适当取代的酮1在还原胺化条件(通常使用乙酸铵作为胺源，使用NaBH3CN作为还原剂，并且使用例如MeOH的溶剂)下进行反应，得到胺中间体2。然后对胺2进行保护(PG1；通常是CBz基团)，得到被适当取代的中间体3。
中间体一般方案2.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案3中。可使酰氯1在路易斯酸(lewis acid)促进的乙烯加成(通常使用AlCl3和乙烯气体，在例如DCM的溶剂中)下进行反应，得到酮2。然后可将酮2转化成肟，然后还原(使用O-甲基羟基胺盐酸盐、吡啶和EtOH来形成肟；使用氢气、雷尼镍(Raney Ni)在EtOH溶剂中进行还原)或在还原胺化条件(通常使用乙酸铵作为胺源，使用NaBH3CN作为还原剂，并且使用例如MeOH的溶剂)下进行反应，得到胺3。然后可对胺3进行保护(PG1；通常是CBz基团)，得到被适当取代的中间体4。
中间体一般方案3.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案4中。可通过烯胺基酮(通常通过使用氨在甲醇中处理被单保护的环己烷-1,4-二酮(例如1)原位生成)与丙炔酸酯的迈克尔加成(Michael addition)来获得2-吡啶酮2。可转化吡啶酮2以并入离去基(LG；通常是三氟甲磺酸酯基，其可通过在例如三乙胺的碱存在下处理使用三氟甲磺酸酐进行处理来获得)。在去除酮保护基后，然后可使酮4在还原胺化条件(通常使用乙酸铵作为胺源，使用NaBH3CN作为还原剂，并且使用例如MeOH的溶剂)下进行反应，得到胺5。然后可对胺5进行保护(PG1；通常是Cbz基团)，得到被适当取代的中间体6。
中间体一般方案4.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案5中。可使酮1与二甲基-甲酰胺二甲基缩醛在溶剂(例如甲苯)中缩合，得到烯胺基酮2。可使用奎尼丁(quinidine)和碱(例如乙醇钠)处理酮2，得到嘧啶-2-胺3。可转化嘧啶-2-胺3以并入离去基(LG；通常是可通过使用CuCl2和亚硝酸叔丁酯进行处理所获得的氯化物基团)，得到被适当取代的中间体4。
中间体一般方案5.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案中6。可使被适当取代的中间体1与被适当取代的硼酸酯2(或硼酸)在钯催化的碳-碳键形成条件(使用适当钯催化剂(例如Pd(dppf)Cl2二氯甲烷复合物)，在例如1,4-二噁烷/水混合物的溶剂中，并且使用例如碳酸钾的碱，在例如100℃的温度下)下进行反应，得到偶联中间体3。然后可使用标准方法(例如但不限于：烯烃还原和环氧化，接着还原所得环氧化物)将存在于中间体3中的烯烃双键官能化，得到被适当取代的中间体4。
中间体一般方案6.
制备本发明中间体的一般程序阐述于中间体一般方案7中。可使被适当取代的中间体1在钯催化的硼酸酯形成条件(使用钯催化剂(例如Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2复合物)和硼酸酯来源(例如双(频哪醇合)二硼)，在例如二噁烷的溶剂中，在例如80℃的温度下)下进行反应，得到硼酸酯2。可使硼酸酯2在合适氧化剂(例如脲-过氧化氢复合物，在例如MeOH的溶剂中)存在下进行反应，得到酚中间体3。然后可使用合适亲电子试剂(例如通过使用光延(Mitsonobu)型条件：例如DIAD与PPh3)对酚中间体实施烷基化，得到被适当取代的中间体4。
中间体一般方案7.
实施例
通过下列实施例和合成方案来进一步阐释本公开，所述实施例和合成方案并不解释为将本公开的范围或精神限制于本文所阐述的具体程序。应理解，提供实施例以阐释某些实施方案并且由此并不打算限制本公开的范围。应当进一步理解的是，在不脱离本公开的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，可采取本领域技术人员可想到的各种其他实施方案、修改及其等同形式。
分析方法、材料和仪器
除非另外陈述，否则试剂和溶剂按从商业供应商收到时的状态使用。除非另有所述，否则在惰性氮气氛下实施反应。在Bruker或Varian光谱仪上在300或400MHz下获得质子核磁共振(NMR)光谱。光谱以ppm(δ)给出并且偶合常数J以赫兹报告。使用四甲基硅烷(TMS)作为内部标准物。使用两种下列方法中的一者来测量纯度和质谱数据。方法1：WatersAcquity i类超高效液相色谱(UPLC)系统，其具有Acquity光二极管阵列检测器、Acquity蒸发光散射检测器(ELSD)和Waters ZQ质谱仪。使用Waters MassLynx 4.1软件获取数据并通过220nm UV波长、蒸发光散射检测(ELSD)和电喷雾正离子(ESI)表征纯度。(柱：AcquityUPLC BEH C18 1.7μm 2.1×50mm；流速：0.6mL/min；溶剂A(95/5/0.1％：10mM甲酸铵/乙腈/甲酸)，溶剂B(95/5/0.09％：乙腈/水/甲酸)；梯度：从0至2min 5-100％B，保持100％B至2.2min并且在2.21min下5％B)。方法2：SHIMADZU LCMS，其由UFLC 20-AD和LCMS 2020 MS检测器组成。(柱：Shim-pack XR-ODS,2.2μm,3.0×50mm；溶剂：(乙腈/水，含有0.05％NH4HCO3))。除非另有所述，否则如下文所指定来实施制备型HPLC纯化，其中流速为20mL/min并通过220nm和254nm UV波长进行检测。偶尔测定本文所阐述实施例中的化合物的所分离对映异构体的绝对构型。在所有其他情形下，并不测定所分离对映异构体的绝对构型并且在那些情况下将所拆分材料的构型在每种情形下任意指定为R或S。
下列实施例和本文其他地方所用的缩写是：
中间体的制备
中间体1、2和3.(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯、(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯和(S)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
步骤1. 7-溴-3-硝基-2H-色烯
将4-溴-2-羟基苯甲醛(21.6g,108mmol)、1,3-二氢-2-苯并呋喃-1,3-二酮(32g,216mmol)和二丁胺(7.0g,54mmol)于甲苯(800mL)中的混合物在N2气氛下加热至回流。经2h以多份添加2-硝基乙-1-胺(50g,550mmol)。使用迪安-斯塔克装置(Dean-Starkapparatus)将混合物在回流下搅拌过夜。在冷却至室温后，过滤出固体。由此并行操作8个批次并且合并来自8个批次的滤液并在真空下浓缩。使用EtOAc(2L)稀释残余物并使用1NNaOH(2L)洗涤。经无水Na2SO4干燥有机层，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:6EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的7-溴-3-硝基-2H-色烯。MS:(ESI,m/z):256,258[M+H]+。
步骤2. 7-溴色烷-3-胺
向7-溴-3-硝基-2H-色烯(27g,106mmol)于THF(300mL)中的溶液中添加BH3(1M于THF中，600mL,600mmol)和NaBH4(201mg,5.3mmol)。将混合物在65℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，然后通过添加600mL MeOH来淬灭反应并在80℃下搅拌8h。在冷却至室温后，在真空下浓缩混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：0％至50％B，40min)纯化残余物，得到白色固体形式的7-溴色烷-3-胺。MS:(ESI,m/z):228,230[M+H]+。
步骤3.(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体1)
将K2CO3(19.3g,140mmol)于水(150mL)中的溶液添加至7-溴色烷-3-胺(16.0g,70.1mmol)于EtOAc(300mL)中的溶液中。在-10℃下添加氯甲酸苄酯(17.8g,104mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌30min。使用EtOAc(200mL)稀释混合物。收集有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。使用1:1 EtOAc/石油醚(200mL)洗涤残余物，得到白色固体形式的(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):362,364[M+H]+。
步骤4.(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体2)和(S)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体3)
通过SFC(柱：ChiralArt Amylose-SA,2×25cm,5μm；流动相A：CO2,80％，B：EtOH,20％；流速：40mL/min)分离外消旋(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(12.5g,34.6mmol)，得到如下标题化合物：白色固体形式的(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(第一洗脱异构体，RT＝7.98min)和白色固体形式的(S)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(第二洗脱异构体，RT＝9.21min)。
第一洗脱异构体：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.35-7.32(m,5H),7.03-7.01(m,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.22-5.10(m,3H),4.25(s,1H),4.17-4.09(m,2H),3.04(dd,J＝16.8Hz,4.8Hz,1H),2.73(d,J＝16.8Hz,1H)。MS:(ESI,m/z):362,364[M+H]+。
第二洗脱异构体：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.35-7.32(m,5H),7.03-7.01(m,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,1H),5.22-5.07(m,3H),4.25(s,1H),4.18-4.09(m,2H),3.04(dd,J＝16.8Hz,4.8Hz,1H),2.73(d,J＝16.80Hz,1H)。MS:(ESI,m/z):362,364[M+H]+。
中间体4-1. 4-(3-氨基-8-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1. 3,4-二氟-2-羟基苯甲醛
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的500mL圆底烧瓶中添加2,3-二氟苯酚(10.0g,75.33mmol)、ACN(200mL)、HCHO(23.06g,738mmol)、Et3N(21.0mL,146mmol)和MgCl2(14.6g,150.28mmol)。将所得溶液在60℃下搅拌16h。将反应混合物冷却至26℃，然后使用200mL水稀释。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得溶液。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到残余物，通过硅胶色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(1:4)纯化残余物，得到浅黄色油状物形式的3,4-二氟-2-羟基苯甲醛。
步骤2. 4-(2-氟-4-甲酰基-3-羟基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向250mL圆底烧瓶中添加3,4-二氟-2-羟基苯甲醛(5g,31.63mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(5.9g,31.68mmol)、DMSO(100mL)和DIEA(6.1g,47.20mmol)。将所得溶液在120℃下搅拌6h。在冷却至室温后，然后通过添加100mL水来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得溶液。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到残余物，通过硅胶色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(0-30％)纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-(2-氟-4-甲酰基-3-羟基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
步骤3. 4-(8-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向100mL圆底烧瓶中添加4-(2-氟-4-甲酰基-3-羟基苯基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(185mg,0.48mmol)、1,3-二氢-2-苯并呋喃-1,3-二酮(166mg,1.06mmol,95％)、2-硝基乙烷-1-醇(104mg,1.08mmol)、二丁胺(37mg,0.27mmol)和甲苯(10mL)。将所得溶液在100℃下于油浴中搅拌8h。将反应混合物冷却至室温，然后通过添加5mL水来淬灭，并使用DCM(3×10mL)萃取。合并有机层，使用盐水(3×10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到残余物，通过硅胶色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(1:3)纯化残余物，得到红色固体形式的4-(8-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
步骤4. 4-(3-氨基-8-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的100mL三颈圆底烧瓶中添加4-(8-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(150mg,0.39mmol)和THF(20mL)。在0℃和搅拌下逐滴添加硼烷-THF复合物(4mL,4mmol)。向此反应混合物中添加NaBH4(73mg,1.93mmol)。将所得溶液在65℃下搅拌12h，然后通过添加甲醇(20mL)来淬灭，并在真空下浓缩，得到残余物，通过硅胶色谱法使用乙酸乙酯/石油醚(0-100％)纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-(3-氨基-8-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体4-1的程序的程序来制备表1中的下列中间体。
表1：
1程序注意事项：无需步骤1。
中间体5-1.(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
方法1.
步骤1. 5-溴-2-(溴甲基)-1,3-二氟苯
将48％HBr(130mL,1149mmol)和(4-溴-2,6-二氟苯基)甲醇(40g,179mmol)的混合物加热至回流过夜。在冷却至室温后，将反应混合物倒入80mL水中并使用己烷(2×300mL)萃取。合并的有机层用碳酸氢钠溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并浓缩，得到5-溴-2-(溴甲基)-1,3-二氟苯。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):6.94-7.22(m,2H),4.46(s,2H)。
步骤2.(2R,5S)-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪
在-78℃下，将nBuLi(6.78mL,10.86mmol,1.6M)于己烷中的溶液逐滴添加至(S)-2-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪(2.0g,10.86mmol)于20mL THF中的溶液中。在-78℃下搅拌30min后，添加5-溴-2-(溴甲基)-1,3-二氟苯(3.10g,10.86mmol)于10mL THF中的溶液并且将反应混合物在-78℃下搅拌3h。然后添加20mL饱和NH4Cl溶液。在将反应混合物升温至室温后，添加150mL水并且使用EtOAc将混合物萃取三次。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(使用0至15％EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到(2R,5S)-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.03(d,J＝7.04Hz,2H),4.14-4.32(m,1H),3.71(s,3H),3.58(s,3H),3.13-3.33(m,1H),2.79-2.93(m,1H),2.13-2.33(m,1H),1.00(d,J＝7.04Hz,3H),0.64(d,J＝7.04Hz,3H)。MS:(ESI,m/z):389,391[M+H]+。
步骤3.(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯
使用HCl(53.5ml,16.04mmol,0.3N)处理(2R,5S)-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪(3.1g,8.02mmol)于乙腈(60mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌60min。使用NaHCO3饱和水溶液使反应物变为碱性并且使用CH2Cl2将混合物萃取三次。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(使用0至100％EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.07(d,J＝6.74Hz,2H),3.54-3.80(m,4H),3.01-3.24(m,1H),2.93(s,1H),1.62(br s,2H)。MS:(ESI,m/z):294,296[M+H]+。
步骤4.(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇
在室温下，向(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯(2.3g,7.85mmol)于MeOH(70mL)中的溶液中以多份添加NaBH4(1.043g,27.57mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。添加水并在减压下去除MeOH。使用氯仿将水性混合物萃取三次。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.08(d,J＝6.74Hz,2H),3.54-3.72(m,1H),3.36(dd,J＝10.55,7.62Hz,1H),3.09(br s,1H),2.51-2.86(m,2H),1.74(br s,3H)。MS:(ESI,m/z):266,268[M+H]+。
步骤5.(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺
在室温下，向(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇(500mg,1.88mmol)于DMSO(3mL)中的溶液中添加NaH(113mg,2.82mmol)。将混合物在室温下搅拌30min，然后在70℃下搅拌30min，并且在50℃下保持搅拌过夜。在冷却至室温后，添加30mL水，并使用EtOAc将混合物萃取三次。合并的有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到粗制(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):6.61-6.92(m,2H),4.01-4.32(m,1H),3.67-3.88(m,1H),3.35(ddt,J＝7.00,3.19,1.80,1.80Hz,1H),2.79-3.03(m,1H),2.46(br d,J＝6.74Hz,1H),1.40-1.89(m,2H)。MS:(ESI,m/z):246,248[M+H]+。
步骤6.(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
在0℃下，向(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺(467mg,1.90mmol)和碳酸氢钠饱和溶液(10mL)于MeOH(20mL)中的溶液中逐滴添加氯甲酸苄酯(0.405mL,2.85mmol)。将混合物搅拌过夜，从而使温度升温至室温。添加20mL水并使用EtOAc将混合物萃取三次。合并的有机层用水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(使用7％至60％EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.34(s,5H),6.65-6.97(m,2H),5.10(s,2H),4.90-5.08(m,1H),4.26(br s,1H),3.97-4.21(m,3H),2.89(m,1H),2.78(m,1H)。MS:(ESI,m/z):380,382[M+H]+。
中间体5-1.(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
方法2.
步骤1. 2-乙酰胺基-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)丙二酸二乙酯
在室温下，向2-乙酰胺基丙二酸二乙酯(59.2g,0.273mol)于DMF(500mL)中的搅拌溶液中以多份添加t-BuOK(33.1g,0.295mol)。将混合物在室温下搅拌1h并添加5-溴-2-(溴甲基)-1,3-二氟苯(65.0g,0.227mol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。缓慢添加水(2000mL)并将混合物搅拌1h。通过过滤收集所得沉淀物，使用水(3×250mL)洗涤并在真空下干燥，得到灰白色固体形式的2-乙酰胺基-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)丙二酸二乙酯。
步骤2. 2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸
向2-乙酰胺基-2-(4-溴-2,6-二氟苄基)丙二酸二乙酯(80g,0.189mol)于乙醇(500mL)中的搅拌溶液中添加NaOH(30g,0.758mol)于水(500mL)中的溶液。将反应混合物在回流下加热5h并且然后冷却至室温。使用2N HCl水溶液将混合物调节至pH＝5-6并在回流下加热过夜。将混合物冷却至室温并使用10％NaOH水溶液调节至pH＝8-9。使用MTBE(300mL)洗涤所得混合物并使用2N HCl水溶液将水相调节至pH 2-3并且然后使用EtOAc(500mL×2)萃取。合并的萃取物使用盐水(300mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥。使用EtOAc(100mL)和石油醚(150mL)的混合物将残余物在搅拌下处理1h。通过过滤收集所得沉淀物，使用石油醚洗涤并在真空下干燥，得到白色固体形式的2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):12.86(br s,1H),8.31(br s,1H),7.43(d,J＝6.8Hz,2H),4.43(m,1H),3.08-2.87(m,2H),1.77(s,3H)。MS:(ESI,m/z):322,324[M+H]+。
步骤3.(R)-2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸
向2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸(55g,0.171mol)于蒸馏水(1.1L)中的悬浮液中逐滴添加10％NaOH水溶液以将pH调节至8.5。将混合物加热至35-38℃并添加L-酰基酶(11.0g)。将反应混合物在此温度下搅拌48h，同时使用10％NaOH水溶液将pH保持在8.5。使用2N HCl水溶液将混合物调节至pH 4-5并添加活性碳(2g)。将混合物在60℃下加热2h并且然后冷却至室温。使用10％NaOH水溶液将混合物调节至pH 9.5-10并过滤。使用2NHCl水溶液将滤液调节至pH 2-3并且然后使用EtOAc(400mL×2)萃取。合并的萃取物用0.5NHCl水溶液(200mL×2)和盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩至干燥。使用EtOAc(60mL)和石油醚(80mL)的混合物将残余物在搅拌下处理1h。通过过滤收集所得沉淀物，使用石油醚洗涤并在真空下干燥，得到白色固体形式的(R)-2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸。
步骤4.(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸盐酸盐
将(R)-2-乙酰胺基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸(26g,80.7mmol)于6N HCl水溶液(260mL)中的混合物在回流下加热5h。浓缩混合物并且将残余物在真空和50℃下干燥，得到白色固体形式的粗制(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸盐酸盐。
步骤5.(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯
向(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸盐酸盐(25.4g,80.7mmol)于MeOH(125mL)中的溶液中添加MeOH/HCl(8M,125mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并浓缩至干燥。将残余物悬浮于5％Na2CO3水溶液(250mL)中并且然后使用EtOAc(250mL×2)萃取。合并的萃取物用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到油状物形式的(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.08(m,2H),3.73(s,3H),3.70(m,1H),3.09-2.87(m,2H),1.55(br s,2H)。MS:(ESI,m/z):294,296[M+H]+。
步骤6.(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇
向(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙酸甲酯(23.5g,79.9mmol)于MeOH(500mL)中的搅拌溶液中逐份添加NaBH4(6.08g,159.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h并添加NaBH4(1.52g,39.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。添加水(500mL)并通过在真空下蒸发来去除MeOH。使用CH2Cl2(250mL×3)萃取所得混合物并且合并的萃取物经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到白色固体形式的粗制(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇。MS:(ESI,m/z):266,268[M+H]+。
步骤7.(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺
在室温下，向(R)-2-氨基-3-(4-溴-2,6-二氟苯基)丙烷-1-醇(18.5g,69.5mmol)于DMSO(100mL)中的搅拌溶液中添加NaH(60％于矿物油中，4.17g)。将反应混合物在35℃下搅拌3h并小心添加冰-水(500mL)以淬灭反应。使用EtOAc(300mL×3)萃取所得混合物并且合并的萃取物用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到粗制(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺。MS:(ESI,m/z):246,248[M+H]+。
步骤8.(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
向粗制(R)-7-溴-5-氟色烷-3-胺(17g,69.5mmol)和NaHCO3饱和水溶液(200mL)于MeOH(400mL)中的搅拌混合物中逐滴添加氯甲酸苄酯(17.7g,104.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜并且然后使用水(500mL)稀释。使用EtOAc(300mL×2)萃取所得混合物并且合并的萃取物用水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法纯化残余物，得到(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):380,382[M+H]+。
可使用标准化学操作和类似于中间体5-1的方法2的程序来制备表2中的下列中间体。
表2：
1程序注意事项：并不实施步骤3和步骤8。在步骤1中，以两个步骤从4-溴-2,6-二氟苯甲酸甲酯来制备5-溴-2-(溴甲基-d2)-1,3-二氟苯：将甲醇(0.806ml,19.92mmol)小心逐滴添加至4-溴-2,6-二氟苯甲酸甲酯(5g,19.92mmol)、四氢硼酸钠-d4(0.834g,19.92mmol)于THF(15mL)中的搅拌溶液中。然后将反应物在70℃下搅拌2h。将反应物冷却至室温并添加10mL NH4Cl饱和水溶液。将反应物在室温下搅拌2h。分离有机层。使用2×15mLDCM萃取水层。合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到(4-溴-2,6-二氟苯基)甲烷-d2-醇。
将(4-溴-2,6-二氟苯基)甲烷-d2-醇(3.00g,13.33mmol)和PBr3(14.21mL,14.21mmol)于DCM(30mL)中的溶液在40℃下搅拌30min。在冷却至室温后，通过添加水(7.5mL)来淬灭反应。使用DCM(3×10mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到浅黄色油状物形式的粗制物。通过正相色谱法使用Biotage(KP-SIL 50g,2％EtOAc/己烷至最高25％EtOAc/己烷)纯化油状物。合并所需级分并浓缩，得到5-溴-2-(溴甲基-d2)-1,3-二氟苯。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):1.54(s,1H)4.46(br d,J＝3.8Hz,1H)7.05-7.21(m,2H)。
中间体6.(R)-4-(3-氨基-8-溴-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和
中间体7-1.(R)-4-(3-氨基-6-氰基-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1：(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-8-溴-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-6-溴-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向20mL小瓶中添加4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(570mg,1.17mmol)、THF(10mL)和NBS(314mg,1.76mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌2h，然后通过添加水(30mL)来淬灭。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XSelect CSH Prep C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(0.05％TFA),B：ACN；梯度：在15min内45％B增加至70％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(峰1)(中间体6)和灰白色固体形式的4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-6-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(峰2)。MS(ESI,m/z):564,566[M+H]+。使这两种化合物独立地进行至后续合成步骤中。
步骤2：4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-6-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的10mL密封管中添加4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-6-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(80mg,0.14mmol)、Zn(CN)2(13mg,0.11mmol)、Pd(PPh3)4(8mg,0.01mmol)、PPh3(7mg,0.03mmol)和NMP(5mL)。将所得溶液在120℃下搅拌1h。在冷却至25℃后，通过添加10mL水来淬灭反应。使用3×20mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到残余物，经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：于H2O中的0.1％TFA，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在30min内0％B增加至80％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-6-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):511[M+H]+。
步骤3：4-[(3R)-3-氨基-6-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向使用氮气吹扫并维持所述气氛的25mL圆底烧瓶中放置4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-6-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(40mg,0.08mmol)、乙酸乙酯(4mL)和10％碳载钯(40mg)。将所得混合物在25℃和氢气氛下搅拌2h。通过经由硅藻土过滤来去除固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的4-[(3R)-3-氨基-6-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体7-1)。MS(ESI,m/z):377[M+H]+。
可使用标准化学操作和类似于用于制备中间体7-1的程序的程序来制备表3中的下列中间体。
表3：
中间体8.(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯；
中间体9.(S)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯和
中间体10.(R)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯
步骤1. 6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-胺
将6-溴-3,4-二氢萘-2(1H)-酮(5g,22.21mmol)、NH4OAc(13.8g,179mmol)和NaBH3CN(1.68g,26.67mmol)于MeOH(250mL)中的溶液在室温下搅拌1h。使用2N HCl溶液将反应混合物酸化至pH 4-5并在真空下浓缩。使用CH2Cl2(200mL×2)洗涤残余溶液。使用1NNaOH溶液将水层碱化至pH 10，然后使用CH2Cl2(200mL×2)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到黄色油状物形式的6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-胺。MS:(ESI,m/z):226,228[M+H]+。
步骤2.(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体8)
将6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-胺(1.8g,7.96mmol)、氯甲酸苄酯(1.6g,9.55mmol)和Cs2CO3(3g,21.71mmol)于THF(20mL)和水(20mL)中的溶液在60℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，使用EtOAc(30mL×3)萃取反应混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:100至1:3EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到固体形式的(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体8)。MS:(ESI,m/z):360,362[M+H]+。
步骤3.(S)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体9)和(R)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体10)
通过SFC(柱：Chiralpak IA-SFC-03,5×25cm,5μm；流动相A：CO2，B：MeOH；流速：170mL/min)分离外消旋(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯，得到如下标题化合物：白色固体形式的(S)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(第一洗脱异构体，RT＝6.54min)和白色固体形式的(R)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(第二洗脱异构体，RT＝9.06min)。第一洗脱异构体：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.30-7.21(m,5H),7.17-7.13(m,2H),6.85-6.83(d,J＝8.00Hz,1H),5.02(s,2H),4.70(br,1H),3.95(m,1H),3.01-2.96(dd,J＝4.00Hz,16.00Hz,2H),2.79-2.75(m,2H),2.53-2.47(m,1H),2.00-1.97(m,1H),1.68-1.66(m,1H)。MS:(ESI,m/z):360,362[M+H]+。第二洗脱异构体：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.30-7.23(m,5H),7.17-7.13(m,2H),6.84-6.82(d,J＝8.00Hz,1H),5.02(s,2H),4.70(br,1H),4.06-3.95(m,1H),3.01-2.96(dd,J＝4.00Hz,16.0Hz,2H),2.79-2.75(m,2H),2.51-2.47(m,1H),2.00-1.96(m,1H),1.68-1.66(m,1H)。MS:(ESI,m/z):360,362[M+H]+。
中间体11-1.(6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯
步骤1. 2-(4-溴-2-氟苯基)乙酰氯
向250mL圆底烧瓶中装填2-(4-溴-2-氟苯基)乙酸(10g,42.05mmol)、DCM(50mL)和亚硫酰氯(6.3mL,85.11mmol)。将所得溶液在40℃下搅拌16h。在冷却至25℃后，在真空下浓缩反应混合物，得到褐色油状物形式的2-(4-溴-2-氟苯基)乙酰氯。
步骤2. 6-溴-8-氟-3,4-二氢萘-2(1H)-酮
向500mL圆底烧瓶中装填2-(4-溴-2-氟苯基)乙酰氯(5.0g,18.49mmol)和DCM(100mL)。然后在0℃下以多份添加AlCl3(7.15g,53.09mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌10min，然后在0℃下将温和乙烯气体流鼓泡至反应混合物中持续5h。将反应混合物倒入冰中并添加浓盐酸(5mL)。使用DCM(3×50mL)萃取所得溶液，合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩，得到粗制残余物，通过使用乙酸乙酯/石油醚(1:2)洗脱的柱色谱法纯化，得到褐色固体形式的6-溴-8-氟-3,4-二氢萘-2(1H)-酮。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.49(t,J＝8.0Hz,2H),3.08(t,J＝8.0Hz,2H),3.49(s,2H),7.40-7.42(m,2H)。
步骤3.(2E)-6-溴-8-氟-N-甲氧基-1,2,3,4-四氢萘-2-亚胺
向250mL圆底烧瓶中装填6-溴-8-氟-3,4-二氢萘-2(1H)-酮(4.2g,16.07mmol)、O-甲基羟基胺盐酸盐(2.16g,25.60mmol)、乙醇(50mL)和吡啶(5mL,61.50mmol)。将所得混合物在80℃下于油浴中搅拌16h，然后冷却至25℃。在冷却后，将所得混合物在真空下浓缩，得到残余物，通过使用乙酸乙酯/石油醚(1:2)洗脱的柱色谱法纯化残余物，得到褐色固体形式的(2E)-6-溴-8-氟-N-甲氧基-1,2,3,4-四氢萘-2-亚胺。MS:(ESI,m/z)272,274[M+H]+。
步骤4. 6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-胺
向使用氮气吹扫的250mL圆底烧瓶中装填(2E)-6-溴-8-氟-N-甲氧基-1,2,3,4-四氢萘-2-亚胺(3.5g,11.58mmol,90％)、乙醇(50mL)和雷尼镍(2.0g,23.11mmol)。向此烧瓶中引入氢气(g)。将所得混合物在25℃下搅拌48h。通过使用硅藻土过滤来去除固体。在真空下浓缩滤液，得到残余物，通过使用DCM/甲醇(10:1)洗脱的柱色谱法纯化残余物，得到褐色固体形式的6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-胺。MS:(ESI,m/z):244,246[M+H]+。
步骤5.(6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯
向100mL圆底烧瓶中装填6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-胺(930mg,3.43mmol)、乙酸乙酯(15mL)、水(15mL)、碳酸钾(1.58g,11.32mmol)和氯甲酸苄酯(780mg,4.53mmol)。将所得混合物在60℃下于油浴中搅拌16h。在冷却至25℃后，使用水(30mL)稀释反应物。使用乙酸乙酯(3×40mL)萃取所得溶液，合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到残余物，通过使用乙酸乙酯/石油醚(1:5)洗脱的柱色谱法纯化残余物，得到灰白色固体形式的(6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):378,380[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体11-1的程序的程序来制备表4中的下列中间体。
表4：
1程序注意事项：在步骤2中，生成区域异构体6-溴-7-甲基-3,4-二氢萘-2(1H)-酮和6-溴-5-甲基-3,4-二氢萘-2(1H)-酮(3:1，分别)的混合物。将混合物用于步骤5中。通过SFC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-3和流动相50％CO2/IPA(2mM NH3-MeOH)来分离区域异构体和对映异构体，得到中间体11-4(作为第一洗脱异构体)、中间体11-2(作为第二洗脱异构体)、中间体11-5(作为第三洗脱异构体)和中间体11-3(作为第四洗脱异构体)。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
中间体12. 4-(3-氨基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1. 7-溴-2H-色烯-3-甲腈
将4-溴-2-羟基苯甲醛(10g,47.26mmol)和三乙二胺(1.12g,9.49mmol)于丙烯腈(16mL)中的溶液在80℃下搅拌24h。在冷却至室温后，用1N NaOH(400mL)淬灭反应。使用EtOAc(300mL×3)萃取所得溶液。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用20:1-9:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的7-溴-2H-色烯-3-甲腈。MS:(ESI,m/z):236,238[M+H]+。
步骤2. 4-(3-氰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将7-溴-2H-色烯-3-甲腈(1g,3.81mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(950mg,4.85mmol)、Pd(dppf)Cl2(327mg,0.42mmol)、XPhos(191mg,0.38mmol)和Cs2CO3(3.9g,11.37mmol)于甲苯(20mL)中的混合物在100℃下搅拌18h。在冷却至室温后，通过添加30mL水来淬灭反应。使用EtOAc(30mL×3)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用9:1-4:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物，得到0.7g黄色固体形式的4-(3-氰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):342[M+H]+。
步骤3. 4-(3-氨甲酰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(3-氰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(500mg,1.32mmol)、30％过氧化氢(0.2mL,2.58mmol)和碳酸钾(304mg,2.09mmol)于DMSO(2mL)和乙醇(10mL)的混合物中的溶液在室温下搅拌3h。通过添加50mL水来淬灭反应。使用EtOAc(50mL×3)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用10:1-3:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的4-(3-氨甲酰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):360[M+H]+。
步骤4. 4-(3-氨甲酰基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(3-氨甲酰基-2H-色烯-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(700mg,1.95mmol)和Pd/C(100mg,10％)于THF(50mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌18h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用EtOAc洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的4-(3-氨甲酰基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):362[M+H]+。
步骤5. 4-(3-氨基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向(二乙酰氧基碘)苯(468mg,1.45mmol)于DMF(3.88mL)和水(3.88mL)的混合物中的搅拌溶液中添加4-(3-氨甲酰基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(350mg,0.97mmol)。将所得溶液在室温下搅拌18h。经24h分两份添加额外(二乙酰氧基碘)苯(936mg,2.90mmol)。使用20mL水稀释所得溶液并使用EtOAc(50mL)萃取。在真空下浓缩水层。通过制备型HPLC(柱：SunFire Prep C18,19×150mm；流动相A：水(0.05％NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在15min内15％B至70％B)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的4-(3-氨基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):334[M+H]+。
中间体13. 3-(3-氨基色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
步骤1. 7-氯色烷-3-胺
将7-氯色烷-3-酮(700mg,3.83mmol)和NH4OAc(2.37g,30.75mmol)于MeOH(35mL)中的溶液在室温下搅拌4h。向此溶液中添加NaBH3CN(364mg,5.79mmol)。将所得混合物在室温下搅拌14h并且然后在真空下浓缩。使用50mL水稀释残余物。使用1N HCl将混合物的pH值调节至5。使用CH2Cl2(20mL×2)萃取所得混合物。使用1M NaOH溶液将水层的pH值调节至10。使用CH2Cl2(30mL×3)萃取所得溶液。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的7-氯色烷-3-胺。MS:(ESI,m/z):184[M+H]+。
步骤2.(7-氯色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
将7-氯色烷-3-胺(350mg,1.91mmol)、碳酸钾(786.6mg,5.69mmol)和氯甲酸苄酯(390mg,2.29mmol)于EtOAc(15mL)和水(15mL)的混合物中的混合物在60℃下搅拌3h。在冷却至室温后，将反应混合物倒入10mL水中并使用EtOAc(10mL×3)萃取。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用7:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的(7-氯色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):318[M+H]+。
步骤3. 3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的20mL密封管中放置(7-氯色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(95mg,0.26mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(70mg,0.33mmol)、Cs2CO3(294mg,0.90mmol)、甲苯(5mL)和RuPhos Pd G3(25.1mg,0.03mmol)。使用微波辐射将反应混合物在120℃下处理5h。在冷却至室温后，然后将反应混合物倒入10mL水中。使用CH2Cl2(10mL×3)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用2:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化残余物，得到浅黄色油状物形式的3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):494[M+H]+。
步骤4. 3-(3-氨基色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(300mg,0.60mmol)和Pd/C(60mg,10％)于MeOH(25mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌2h。过滤掉固体并且浓缩滤液，得到黄色油状物形式的3-(3-氨基色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):360[M+H]+。
中间体14-1. 3-(3-氨基色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯
步骤1. 3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯
将(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯中间体1(400mg,1.07mmol)、3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯(300mg,1.31mmol)、Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(90mg,0.11mmol)、Xphos(52mg,0.11mmol)和Cs2CO3(722mg,2.22mmol)于甲苯(6mL)中的混合物在100℃下搅拌14h。在冷却至室温后，添加水并使用EtOAc(70mL×2)萃取反应混合物。合并的有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过制备型TLC(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):508[M+H]+。
步骤2. 3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯
将3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯(120mg,0.22mmol)和Pd/C(60mg,10％)于MeOH(5mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌1h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到无色油状物形式的3-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-3,9-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-9-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):374[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体14-1的程序的程序来制备表5中的下列中间体。
表5：
1程序注意事项：在步骤1中，使用RuPhos Pd G3/RuPhos作为催化剂/配体系统。
中间体15-1. 3-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
步骤1. 2,4-二氟-6-羟基苯甲醛
将3,5-二氟苯酚(10g,73mmol)、多聚甲醛(23g,728mmol)、Et3N(21mL)和MgCl2(14.6g,153.34mmol)于ACN(200mL)中的溶液在60℃下搅拌14h。在冷却至室温后，通过添加水(100mL)来淬灭反应。使用DCM(2×200mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:1EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的2,4-二氟-6-羟基苯甲醛。MS:(ESI,m/z):159[M+H]+。
步骤2. 3-(3-氟-4-甲酰基-5-羟基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将2,4-二氟-6-羟基苯甲醛(600mg,3.80mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(800mg,3.75mmol)和DIEA(700mg,5.42mmol)于DMSO(10mL)中的溶液在100℃下搅拌2h。在冷却至室温后，通过添加水(10mL)来淬灭反应。使用DCM(2×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:4EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-(3-氟-4-甲酰基-5-羟基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):351[M+H]+。
步骤3. 3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-甲酰基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(3-氟-4-甲酰基-5-羟基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.4g,3.60mmol)、碳酸钾(3g,21.71mmol)和烯丙基溴(500mg,4.13mmol)于DMF(20mL)中的溶液在100℃下搅拌2h。在冷却至室温后，通过添加水(20mL)来淬灭反应。使用DCM(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-甲酰基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):392[M+H]+。
步骤4. 3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-乙烯基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
在0℃下，向甲基三苯基溴化鏻(3.3g,8.86mmol)于THF(25mL)中的溶液中以多份添加氢化钠(178mg,4.45mmol，于油中的60％分散液)。将反应混合物在室温下搅拌4h。此后接着逐滴添加3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-甲酰基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.2g,2.77mmol)于THF(20mL)中的溶液并在30℃下继续搅拌3h。通过添加水(60mL)来淬灭反应。使用EtOAc(3×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:6至1:1的EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到无色油状物形式的3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-乙烯基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):389[M+H]+。
步骤5. 3-(5-氟-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(3-(烯丙基氧基)-5-氟-4-乙烯基苯基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(800mg,2.06mmol)和Grubbs催化剂TM第2代(48mg,0.05mmol)于DCM(10mL)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下浓缩混合物。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到无色油状物形式的3-(5-氟-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):361[M+H]+。
步骤6. 3-(5-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将KNO2(945mg,11.10mmol)和18-冠-6(2.2g,8.32mmol)于THF(20mL)中的溶液在室温下搅拌1h。然后添加I2(2.3g,9.06mmol)并且继续搅拌1h。最后，将3-(5-氟-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1g,2.77mmol)和吡啶(110mg,1.39mmol)于THF(10mL)中的溶液添加至溶液中并且继续搅拌14h。通过添加水(20mL)来淬灭反应。使用DCM(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:6EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-(5-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):406[M+H]+。
步骤7. 3-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(5-氟-3-硝基-2H-色烯-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(120mg,0.30mmol)、BH3-THF(1M,20mL,20.0mmol)和NaBH4(116mg,3.07mmol)于THF(20mL)中的溶液在65℃下搅拌14h。然后添加甲醇(20mL)并且在85℃下继续搅拌4h。在真空下浓缩混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：含有10mM NH4HCO3的水，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在40min内0％至50％B)纯化，得到无色油状物形式的3-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):378[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体15-1的程序的程序来制备表6中的下列中间体。
表6：
1程序注意事项：步骤6：通过在50℃下将4-[6-(三氟甲氧基)-2H-色烯-7-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(800mg,2.00mmol)、ACN(2.2g,4.00mmol)、NaNO2(1.4g,20.29mmol)和乙酸(1.44g,23.98mmol)于氯仿(40mL)中的溶液声波处理6h来实施硝化。使用NaHCO3饱和水溶液(40mL)淬灭反应并且使用EtOAc实施萃取后处理。
中间体16. 3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 2-氯-5-氟-6-甲基烟腈
将2,6-二氯-5-氟吡啶-3-甲腈(5g,26.18mmol)、甲基硼酸(1.58g,26.36mmol)、Na2CO3(8.33g,78.54mmol)和Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(958mg,1.31mmol)于DMF(40mL)和水(20mL)中的混合物在80℃下搅拌3h。在冷却至室温后，使用50mL水稀释反应混合物。使用EtOAc(3×100mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到粉红色固体形式的2-氯-5-氟-6-甲基烟腈。MS:(ESI,m/z):171[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯
将2-氯-5-氟-6-甲基烟腈(1.40g,8.21mmol)、KOH(1.38g,24.63mmol)和2-巯基乙酸甲酯(1.74g,16.42mmol)于DMF(20mL)和水(20mL)中的溶液在室温下搅拌3h。使用1N HCl溶液将溶液的pH值调节至5。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):241[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(200mg,0.83mmol)和NaOH(66mg,1.66mmol)于MeOH(2mL)和水(1mL)中的溶液在60℃下搅拌1h。在冷却至室温后，在真空下浓缩所得混合物。使用20mL水稀释残余物。使用1N HCl溶液将混合物的pH值调节至5。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):227[M+H]+。
中间体17. 3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯
将钠(230mg,10.00mmol)在0℃下添加至MeOH(20mL)中并且将所得混合物在0℃下搅拌30min直至钠耗尽为止。向反应混合物中添加2-氯-5-氟烟腈(900mg,5.75mmol)和2-巯基乙酸甲酯(1.8mL,14.98mmol)。将所得溶液在室温下搅拌16h。通过添加50mL水来淬灭反应并使用DCM(3×50mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):227[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(1g,3.76mmol)和LiOH(100mg,3.97mmol)于水(10mL)和二噁烷(10mL)中的溶液在室温下搅拌1h。使用20mL水稀释反应物并使用EtOAc(3×30mL)萃取。使用6N HCl溶液将水层的pH值调节至6。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):213[M+H]+。
中间体18. 3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 2,6-二氟烟腈
将2,6-二氯烟腈(6.92g,40.00mmol)和KF(6.98g,120.14mmol)于DMF(30mL)中的混合物在90℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，通过添加100mL水来淬灭反应。使用EtOAc(3×100mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的2,6-二氟烟腈。MS:(ESI,m/z):141[M+H]+。
步骤2. 2-((3-氰基-6-氟吡啶-2-基)硫基)乙酸苄酯
在-70℃下，向2,6-二氟烟腈(1g,6.42mmol)和NaOAc(878mg,10.70mmol)于THF(20mL)中的混合物中添加2-巯基乙酸苄酯(1.17g,6.42mmol)。将所得溶液缓慢升温至室温并且然后搅拌30min。通过添加20mL水来淬灭反应。使用DCM(3×30mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用2:25EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的2-((3-氰基-6-氟吡啶-2-基)硫基)乙酸苄酯。MS:(ESI,m/z):303[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸苄酯
在-50℃下，将2-((3-氰基-6-氟吡啶-2-基)硫基)乙酸苄酯(120mg,0.40mmol)于THF(2mL)中的溶液逐滴添加至DBU(120mg,0.79mmol)于THF(3mL)中的溶液中。然后将混合物升温至室温并搅拌过夜。在真空下浓缩所得溶液。通过硅胶色谱法(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到灰白色固体形式的3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):303[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸苄酯(89mg,0.29mmol)和Pd/C(20mg,10％)于EtOAc(15mL)中的混合物在室温下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到浅黄色固体形式的3-氨基-6-氟噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):213[M+H]+。
中间体19. 3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 2-氯-6-甲氧基烟腈
将钠(1.5g,65.22mmol)在0℃下添加至MeOH(25mL)中并且将所得混合物在室温下搅拌30min直至钠耗尽为止。经5min向反应混合物中添加2,6-二氯烟腈(5g,28.90mmol)，维持反应温度低于10℃。将所得溶液在室温下搅拌过夜。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到白色固体形式的2-氯-6-甲氧基烟腈。MS:(ESI,m/z):169[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯
在0℃下经5min向2-氯-6-甲氧基烟腈(3.9g,23.13mmol)于DMF(10mL)中的溶液中添加KOH(5.2g)，接着添加2-巯基乙酸甲酯(2.46g,23.18mmol)。将所得溶液在0℃下搅拌1h。通过添加20mL水来淬灭反应。使用EtOAc(3×30mL)萃取所得混合物。使用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:1 EtOAc/己烷洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.40(d,J＝8.7Hz,1H),7.24(br,2H),6.89(d,J＝9.0Hz,1H),3.93(s,3H),3.77(s,3H)。MS:(ESI,m/z):239[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(110mg,0.46mmol)和LiOH(100mg,4.18mmol)于THF(4mL)和水(1.5mL)中的溶液在60℃下搅拌2h。在冷却至室温后，在真空下浓缩所得混合物。使用2mL水稀释残余物。使用1N HCl将溶液的pH值调节至7。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):225[M+H]+。
中间体20. 3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 2-氯-5-氟-6-甲氧基烟腈
将2,6-二氯-5-氟吡啶-3-甲腈(3.0g,15.71mmol)和MeONa(1.28g,23.70mmol)于MeOH(30mL)中的混合物在室温下搅拌5h。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的2-氯-5-氟-6-甲氧基烟腈。MS:(ESI,m/z):187,189[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯
将2-氯-5-氟-6-甲氧基烟腈(1.90g,10.22mmol)、2-巯基乙酸甲酯(1.3g,12.26mmol)和DBU(7.2g,47.29mmol)于THF(30mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。通过添加50mL水来淬灭反应并使用EtOAc(3×50mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):257[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(500mg,1.95mmol)和LiOH(236mg,9.85mmol)于THF(8mL)和水(8mL)中的混合物在60℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，在真空下去除溶剂。使用3N HCl将残余物的pH值调节至7。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-5-氟-6-甲氧基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):243[M+H]+。
中间体21. 3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯
在搅拌和-50℃下，向2-氯-4,6-二甲基烟腈(2.000g,12.00mmol)和DBU(5.00g,32.84mmol)于DMF(20mL)中的溶液中逐滴添加2-硫烷基乙酸甲酯(1.019g,9.60mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。将混合物倒入水(50mL)中并通过过滤收集固体，得到浅黄色固体形式的3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):237[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
向3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸甲酯(300mg,1.27mmol)于MeOH(5mL)中的溶液中添加NaOH(254mg,6.35mmol)于水(5mL)中的溶液。将所得溶液在70℃下搅拌3h。在冷却至室温后，在真空下去除溶剂。使用3N HCl将残余物的pH值调节至6。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):223[M+H]+。
中间体22. 3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 6-甲基-2-硫代-4-(三氟甲基)-1,2-二氢吡啶-3-甲腈
将2-氰基乙硫酰胺(2g,19.97mmo)、1,1,1-三氟戊烷-2,4-二酮(3g,19.47mmol)和三乙胺(0.1mL)于乙醇(20mL)中的溶液在90℃下搅拌1h。在冷却至室温后，通过过滤收集固体并在减压下于烘箱中干燥，得到黄色固体形式的6-甲基-2-硫代-4-(三氟甲基)-1,2-二氢吡啶-3-甲腈。MS:(ESI,m/z):219[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯
将6-甲基-2-硫代-4-(三氟甲基)-1,2-二氢吡啶-3-甲腈(800mg,3.67mmol)、2-溴乙酸乙酯(609mg,3.65mmol)和NaOEt(297mg,4.37mmol)于乙醇(20mL)中的溶液在80℃下搅拌过夜。在真空下去除溶剂。使用30mL水稀释残余物并使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:1EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯。MS:(ESI,m/z):305[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
将3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯(1.0g,3.29mmol)和氢氧化钠(470mg,11.75mmol)于水(2mL)和甲醇(10mL)中的溶液在60℃下搅拌2h。在真空下浓缩所得混合物。使用10mL水稀释残余物。使用3N HCl将溶液的pH值调节至3。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的3-氨基-6-甲基-4-(三氟甲基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):277[M+H]+。
中间体23. 6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸甲酯和
中间体24. 6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸
步骤1. 4-氯-2-甲基噻唑-5-甲腈
将2,4-二氯噻唑-5-甲腈(1.00g,5.59mmol)、二甲基锌(1M于Et2O中)(8.8mL,8.80mmol)和Pd(dppf)Cl2 -CH2Cl2(911mg,1.12mmol)于甲苯(30mL)中的混合物在40℃下搅拌4h。通过添加20mL水来淬灭反应。使用EtOAc(3×20mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的4-氯-2-甲基噻唑-5-甲腈。MS:(ESI,m/z):159[M+H]+。
步骤2. 6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸甲酯
在搅拌和-40℃下，向4-氯-2-甲基噻唑-5-甲腈(550mg,3.47mmol)和DBU(1.06g,6.94mmol)于THF(20mL)中的溶液中逐滴添加2-巯基乙酸甲酯(443mg,4.17mmol)于THF(2mL)中的溶液。使所得溶液升温至室温，同时搅拌过夜。使用20mL水淬灭反应。使用EtOAc(3×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:7EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):229[M+H]+。
步骤3. 6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸
向6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸甲酯(174mg,0.76mmol)于ACN(11mL)中的溶液中添加LiOH(100mg,4.18mmol)于水(5mL)中的溶液。将所得溶液在30℃下搅拌过夜，然后在真空下浓缩。使用1mL水稀释残余物。使用1N HCl溶液将残余物的pH值调节至7。通过过滤收集固体，得到灰白色固体形式的6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d]噻唑-5-甲酸。MS:(ESI,m/z):214[M+H]+。
中间体25. 1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸
在0℃下，向1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸甲酯(3g,17.03mmol)于DMF(80mL)中的溶液中以多份添加氢化钠(2.04g,51.09mmol，于油中的60％分散液)。将反应混合物在0℃下搅拌1h。然后在0℃下添加碘乙烷(5.32g,34.06mmol)。将所得溶液在室温下搅拌10h。使用10mL水淬灭反应。在搅拌30min后，使用3N HCl将溶液的pH值调节至7～8。使用EtOAc(6×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(粗制物，90％纯度)。MS:(ESI,m/z):191[M+H]+。
中间体26. 7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸
步骤1. 3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪
在0℃下，向3-氯-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪(700mg,4.56mmol)于DMF(17mL)中的溶液中以多份添加NaH(365mg,9.12mmol，于油中的60％分散液)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。然后在0℃下添加碘乙烷(856mg,5.49mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌2h。通过添加40mL水来淬灭反应。使用EtOAc(3×20mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过制备型TLC(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色油状物形式的3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪。MS:(ESI,m/z):182,183[M+H]+。
步骤2. 7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯
在30mL压力罐反应器中，将3-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪(300mg,1.65mmol)、Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(121mg,0.15mmol)和Et3N(0.69mL,4.96mmol)于MeOH(15mL)中的溶液在120℃和50atm CO(g)下搅拌48h。在冷却至室温后，在真空下浓缩所得混合物。使用20mL水稀释残余物。使用EtOAc(3×20mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过制备型TLC(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):206[M+H]+。
步骤3. 7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸
将7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯(238mg,1.04mmol)和氢氧化钠(206mg,5.20mmol)于THF(10mL)和水(10mL)中的混合物在室温下搅拌18h。在真空下浓缩所得混合物。使用10mL水稀释残余物。使用2N HCl将混合物的pH值调节至5。使用EtOAc(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到浅黄色固体形式的7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸(粗制物)。MS:(ESI,m/z):192[M+H]+。
中间体27. 3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
步骤1. 3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯
将2-氯-6-甲基烟腈(5g,32.77mmol)、2-羟基乙酸乙酯(3.36g,32.28mmol)和Cs2CO3(32.2g,98.83mmol)于NMP(80mL)中的溶液在75℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，将混合物倒入100mL水中。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化，得到粉红色固体形式的3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯。MS:(ESI,m/z):221[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸
在搅拌下，向3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸乙酯(110mg,0.53mmol)于甲醇(1mL)和THF(1mL)中的溶液中逐滴添加LiOH(24mg,1.00mmol)于水(0.5mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌过夜。使用1N HCl将溶液的pH值调节至8。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在30min内0％B至100％B)纯化，得到浅黄色固体形式的3-氨基-6-甲基呋喃并[2,3-b]吡啶-2-甲酸。MS:(ESI,m/z):193[M+H]+。
中间体28. 8-(叔丁氧基羰基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸
步骤1. 5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸甲酯
在30mL压力罐反应器中，将6-溴-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(300mg,0.86mmol)、Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(90mg,0.11mmol)和Et3N(1mL)于MeOH(5mL)中的混合物在120℃和5atm CO(g)下搅拌48h。在冷却至室温后，在真空下去除溶剂。使用水(10mL)稀释残余物并使用EtOAc(3×10mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5EtOAc/石油醚洗脱)纯化残余物，得到0.15g白色固体形式的5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸甲酯。MS:(ESI,m/z):193[M+H]+。
步骤2. 3,4-二氢-1,8-萘啶-1,6(2H)-二甲酸1-(叔丁基)酯6-甲基酯
将5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸甲酯(110mg,0.52mmol)、DMAP(126mg,1.03mmol)和(Boc)2O(227mg,1.04mmol)于DMF(5mL)中的溶液在室温下搅拌1h。通过添加5mL水来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×10mL)萃取所得混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:8EtOAc/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3,4-二氢-1,8-萘啶-1,6(2H)-二甲酸1-(叔丁基)酯6-甲基酯。MS:(ESI,m/z):293[M+H]+。
步骤3. 8-(叔丁氧基羰基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸
将3,4-二氢-1,8-萘啶-1,6(2H)-二甲酸1-(叔丁基)酯6-甲基酯(280mg,0.86mmol)和LiOH(81mg,3.38mmol)于THF(5mL)和水(5mL)中的溶液在室温下搅拌3h。在真空下浓缩所得混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.05％甲酸)，B：ACN；梯度：在40min内0％B至60％B)纯化残余物，得到白色固体形式的8-(叔丁氧基羰基)-5,6,7,8-四氢-1,8-萘啶-3-甲酸。MS:(ESI,m/z):279[M+H]+。
中间体29. 2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-6'-甲酸
步骤1. 6-溴-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶
在0℃下，向6-溴-3,4-二氢-1,8-萘啶-2(1H)-酮(5.0g,21.80mmol)和NaBH4(4.18g,110.49mmol)于THF(140mL)中的溶液中逐滴添加BF3-Et2O(20mL,157.83mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。添加1N HCl溶液(100mL)并且将反应混合物在室温下再搅拌16h。然后使用NaHCO3饱和水溶液将混合物的pH值调节至8。使用乙酸乙酯(3×150mL)萃取所得混合物并且合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到白色固体形式的6-溴-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶。MS:(ESI,m/z):213,215[M+H]+。
步骤2. 6-溴-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
在0℃下，向氢化钠(1.41g,58.76mmol，于油中的60％分散液)于THF(100mL)中的混合物中添加6-溴-1,2,3,4-四氢-1,8-萘啶(5.0g,22.53mmol)于THF(100mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌30min。然后向混合物中添加(Boc)2O(10.15g,46.51mmol)于THF(50mL)中的溶液。将所得混合物在回流下加热16h。在冷却至室温后，通过添加水(150mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×150mL)萃取所得混合物并且合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的6-溴-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):313,315[M+H]+。
步骤3. 6-溴-4-氧代-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
在50℃下，向6-溴-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(2.0g,6.13mmol)和NaH2PO4(1.92g,16.00mmol)于叔丁醇(20mL)和水(15mL)中的溶液中逐滴添加NaMnO4-H2O(6.13g,38.31mmol)于水(5mL)中的溶液。将反应混合物在50℃下搅拌3h。在冷却至室温后，添加Na2SO3并且将混合物在室温下搅拌30min。过滤掉固体并使用50mL水稀释滤液。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物并且合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的6-溴-4-氧代-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):327,329[M+H]+。
步骤4. 6-溴-4-亚甲基-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
将甲基三苯基溴化鏻(3.29g,9.21mmol)和t-BuOK(1M于THF中)(9.2mL,9.02mmol)于甲苯(30mL)中的溶液在100℃下搅拌1h。向反应混合物中添加6-溴-4-氧代-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(1.5g,4.40mmol)于甲苯(5mL)中的溶液。将所得溶液在100℃下保持1h。在冷却至室温后，通过添加水(50mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物并且合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:100至1:3的EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到白色固体形式的6-溴-4-亚甲基-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):325,327[M+H]+。
步骤5. 6'-溴-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-1'-甲酸叔丁酯
向氢氧化钾(4.8g,85.55mmol)于水(7.2mL)中的溶液中添加2-亚硝基丙酰胺(3.76g,36.83mmol)于Et2O(30mL)中的溶液。将所得溶液在0℃下搅拌1h。分离有机相以获得重氮甲烷于Et2O中的溶液。在0℃下，向6-溴-4-亚甲基-3,4-二氢-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(400mg,1.18mmol)于THF(30mL)中的溶液中添加重氮甲烷溶液，接着添加Pd(OAc)2(28mg,0.12mmol)于THF(3mL)中的混合物。将反应混合物在室温下再搅拌3h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的6'-溴-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-1'-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):339,341[M+H]+。
步骤6. 2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-6'-甲酸
向配备有磁力搅拌棒的30mL压力罐反应器中放置6'-溴-2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-1'-甲酸叔丁酯(140mg,0.40mmol)、三水合乙酸钠(167mg,1.23mmol)和Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(65mg,0.08mmol)于DMF(6mL)和水(2mL)中的混合物。将反应混合物在120℃、一氧化碳气氛和50atm下搅拌16h。在冷却至室温后，通过添加20mL水来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得溶液。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水，B：ACN；梯度：在10min内0％B至10％B)纯化，得到灰白色固体形式的2',3'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,4'-[1,8]萘啶]-6'-甲酸。MS:(ESI,m/z):205[M+H]+。
中间体30. 3-(叔丁氧基羰基)-1a,2,3,7b-四氢-1H-环丙并[c][1,8]萘啶-6-甲酸
步骤1. 2-(烯丙基氨基)-5-溴烟醛
向两个并行30ml密封管中各自放置5-溴-2-氟烟醛(1.83g,9.0mmol)、烯丙基胺(1.03g,18.0mmol)和乙醇(15mL)。将所得溶液在80℃下搅拌3h。在冷却至室温后，将所得溶液倒入30mL盐酸(1N)中并将所得混合物搅拌10min并且然后使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的2-(烯丙基氨基)-5-溴烟醛。MS:(ESI,m/z):241,243[M+H]+。
步骤2.N-烯丙基-5-溴-3-乙烯基吡啶-2-胺
将甲基三苯基溴化鏻(6.22g,17.42mmol)和叔丁醇钾(1.96g,17.42mmol)于THF(30mL)中的溶液在室温下搅拌1h。然后在室温下逐滴添加2-(烯丙基氨基)-5-溴烟醛(2.10g,87.1mmol)于THF(5mL)中的溶液并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过添加20mL水来淬灭反应并使用DCM(3×40)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:20EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色液体形式的N-烯丙基-5-溴-3-乙烯基吡啶-2-胺。MS:(ESI,m/z):239,241[M+H]+。
步骤3.烯丙基(5-溴-3-乙烯基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
将N-烯丙基-5-溴-3-乙烯基吡啶-2-胺(590mg,2.47mmol)、二碳酸二叔丁酯(1.62g,7.40mmol)、三乙胺(749mg,7.40mmol)和4-二甲基氨基吡啶(90mg,0.74mmol)于THF(15mL)中的溶液在70℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，通过添加50mL水来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×40mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:30EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到灰白色固体形式的烯丙基(5-溴-3-乙烯基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):339,341[M+H]+。
步骤4. 6-溴-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯
将烯丙基(5-溴-3-乙烯基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(600mg,1.77mmol)和二氯[1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷亚基](亚苄基)(三环己基膦)钌(II)(Grubbs催化剂TM第2代)(75mg,0.09mmol)于DCM(10mL)中的溶液在50℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1:20EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到灰白色固体形式的6-溴-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):311,313[M+H]+。
步骤5. 6-溴-1,1a,2,7b-四氢-3H-环丙并[c][1,8]萘啶-3-甲酸叔丁酯
在0℃下，向氢氧化钾(5.68g,101.24mmol)于水(8mL)中的溶液中逐滴添加1-甲基-1-亚硝基脲(2.98g,28.92mmol)于Et2O(40mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1h。然后分离有机相以获得重氮甲烷于Et2O中的溶液。向6-溴-1,8-萘啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(450mg,1.45mmol)于THF(15mL)中的溶液中添加重氮甲烷于Et2O(40mL)中的溶液，然后添加Pd(OAc)2(32mg,0.14mmol)于THF(7mL)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌过夜。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:50至1:20EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到灰白色固体形式的6-溴-1,1a,2,7b-四氢-3H-环丙并[c][1,8]萘啶-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):325,327[M+H]+。
步骤6. 3-(叔丁氧基羰基)-1a,2,3,7b-四氢-1H-环丙并[c][1,8]萘啶-6-甲酸
向30mL压力罐反应器中放置6-溴-1,1a,2,7b-四氢-3H-环丙并[c][1,8]萘啶-3-甲酸叔丁酯(200mg,0.62mmol)、Pd(dppf)Cl2(90mg,0.12mmol)、NaOAc(151mg,1.85mmol)、DMF(4.5mL)和水(1.5mL)。将反应混合物在120℃和50atm CO(g)下搅拌18h。在冷却至室温后，使用10mL水稀释反应混合物。使用乙酸乙酯(3×10mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在30min内0％B至100％B)纯化，得到浅黄色固体形式的3-(叔丁氧基羰基)-1a,2,3,7b-四氢-1H-环丙并[c][1,8]萘啶-6-甲酸。MS:(ESI,m/z):291[M+H]+。
中间体31. 6-(苄基氨基)烟酸
步骤1. 6-(苄基氨基)烟酸甲酯
将6-氟吡啶-3-甲酸甲酯(1g,6.12mmol)、苯基甲烷胺(1.38g,12.88mmol)和碳酸钾(2.67g,19.32mmol)于DMF(10mL)中的混合物在80℃下搅拌2h。在冷却至室温后，通过添加20mL水来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用3:10EtOAc:石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的6-(苄基氨基)烟酸甲酯。MS:(ESI,m/z):243[M+H]+。
步骤2. 6-(苄基氨基)烟酸
将6-(苄基氨基)烟酸甲酯(500mg,1.86mmol)、甲醇(20mL)、水(2mL)和NaOH(165mg,4.13mmol)的混合物在80℃下搅拌3h。在冷却至室温后，在真空下浓缩所得混合物。将残余物溶于10mL水中。使用盐酸(6N)将溶液的pH值调节至6。通过过滤收集固体，得到白色固体形式的6-(苄基氨基)烟酸。MS:(ESI,m/z):229[M+H]+。
中间体32. 9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
步骤1：7-苄基-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
将7-苄基-9-氧代-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯(5g,14.94mmol)和DAST(12.2g,75.69mmol)于CH2Cl2(80mL)中的溶液在室温下搅拌16h。然后通过添加50mLNaHCO3饱和水溶液来淬灭反应。使用CH2Cl2(100mL×3)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用5:1石油醚/EtOAc洗脱)纯化，得到700mg黄色固体形式的7-苄基-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):353[M+H]+。
步骤2：9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
将7-苄基-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯(460mg,1.24mmol)和Pd/C(50mg,10％)于EtOAc(20mL)中的混合物在50℃和氢气氛下搅拌2h。在冷却至室温后，过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18OBD,19×250mm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在7min内20％B至45％B)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):263[M+H]+。
中间体33. 5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷
步骤1. 2-(3-(硝基甲基)氧杂环丁烷-3-基氨基)乙酸甲酯
在-80℃下，向氧杂环丁烷-3-酮(5g,69.38mmol)、硝基甲烷(5.93g,97.15mmol)和Et3N(2.1g,13.28mmol)于DCM(70mL)中的溶液中添加MsCl(10g,87.30mmol)于DCM(70mL)中的溶液。在-80℃下再继续搅拌90min。单独地，使甘氨酸乙酯盐酸盐(19.4g,139mmol)和Et3N(21g,139mmol)于DCM(300mL)中的溶液在搅拌和室温下反应10min。将所得溶液在-80℃下以多份添加至第一反应混合物中。在添加后，将反应混合物在室温下搅拌16h。通过添加100mL水来淬灭反应并使用2×300mL DCM萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在30min内10％B至50％B)纯化，得到黄色油状物形式的2-(3-(硝基甲基)氧杂环丁烷-3-基氨基)乙酸甲酯。MS:(ESI,m/z):205[M+H]+。
步骤2. 2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮
将2-(3-(硝基甲基)氧杂环丁烷-3-基氨基)乙酸甲酯(8.5g,41.63mmol)和雷尼镍(2g)在MeOH(50mL)中的悬浮液在室温和氢气氛下搅拌16h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mMNH4HCO3)，B：ACN；梯度：在30min内10％B至80％B)纯化，得到红色固体形式的2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮。MS:(ESI,m/z):143[M+H]+。
步骤3. 5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮
将2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮(4g,28.14mmol)、(溴甲基)苯(12g,70.16mmol)、Na2CO3(20.9g,197.18mmol)和NaI(10.5g,70.05mmol)于乙腈(200mL)中的混合物在80℃下搅拌3h。在冷却至室温后，在真空下去除溶剂。使用水(200mL)稀释残余物。使用DCM(2×300mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10MeOH/CH2Cl2洗脱)纯化，得到黄色固体形式的5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮。MS:(ESI,m/z):233[M+H]+。
步骤4. 5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-硫酮
将5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-酮(2.9g,11.86mmol)和2,4-双(4-甲氧基苯基)-2,4-二硫代-1,3,2,4-二硫杂二磷杂环丁烷(劳森试剂(Lawesson reagent))(2.44g,6.03mmol)于THF(150mL)中的溶液在室温下搅拌16h并且然后在65℃下再搅拌3h。然后将反应混合物倒入水(100mL)中并使用DCM(2×150mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-硫酮。MS:(ESI,m/z):249[M+H]+。
步骤5. 5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷
将5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-7-硫酮(300mg,1.15mmol)和硼氢化钠(412mg,11.19mmol)于THF(15mL)和MeOH(30mL)中的溶液在室温下搅拌2h。使用水(15mL)淬灭反应并在室温下再搅拌14h。使用DCM(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在30min内10％B至75％B)纯化，得到白色固体形式的5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷。MS:(ESI,m/z):219[M+H]+。
中间体34. 2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯
步骤1. 5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯
将5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷中间体31(200mg,0.82mmol)、(Boc)2O(200mg,0.92mmol)、Et3N(185mg,1.83mmol)和4-二甲基氨基吡啶(11mg,0.09mmol)于DCM(4mL)中的溶液在室温下搅拌2.5h。通过添加水(20mL)来淬灭反应并使用EtOAc(3×20mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:4EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色油状物形式的5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):319[M+H]+。
步骤2. 2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯
将5-苄基-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯(190mg,0.60mmol)和Pd/C(20mg,10％)于EtOAc(10mL)中的混合物在室温下搅拌1h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):229[M+H]+。
中间体35.N-(4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(5g,22.81mmol)、NaN3(3g,46.15mmol)、NH4Cl(1.23g,22.99mmol)于MeOH(60mL)和水(10mL)中的溶液在65℃下搅拌16h。在冷却至室温后，使用0.5N NaOH水溶液将pH值调节至7-8。使用DCM(2×150mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到浅黄色固体形式的3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):263[M+H]+。
步骤2. 3-叠氮基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
在<10℃下，向3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(4g,15.25mmol)于DMF(40mL)中的溶液中添加NaH(1.2g，于油中的60％分散液)。将所得溶液在室温下搅拌1h。添加碘甲烷(2.8mL,44.98mmol)并且再继续搅拌1h。通过添加水(50mL)来淬灭反应。使用Et2O(2×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到无色油状物形式的3-叠氮基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):277[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将3-叠氮基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯(2g,7.24mmol)和PPh3(2.1g,8.01mmol)于THF(50mL)和水(5mL)中的溶液在室温下搅拌1h，然后在50℃下再搅拌5h。在冷却至室温后，在真空下浓缩反应物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×50mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在30min内10％B至80％B)纯化，得到无色油状物形式的3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):251[M+H]+。
步骤4. 3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯(600mg,2.40mmol)、Et3N(457mg,4.52mmol)和(Boc)2O(786mg,3.60mmol)于THF(12mL)和水(12mL)中的溶液在室温下搅拌30min。使用DCM(2×30mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):351[M+H]+。
步骤5.N-(4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯(200mg,0.57mmol)和Pd/C(200mg,10％)于EtOAc(10mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌3h。过滤出固体并使用EtOAc(3×10mL)洗涤。在真空下浓缩滤液，得到白色固体形式的N-(4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):217[M+H]+。
中间体36.((3S,4S)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
步骤1.(3S,4S)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
在30℃下，向6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(10g,44.70mmol)和(1R,2R)-(-)-[1,2-环己烷二氨基-N,N'-双(3,5-二叔丁基亚水杨基)]氯化铬(III)(雅克布森铬催化剂(Jacobsen's Chromium catalyst))(682mg,1.08mmol)的混合物中添加叠氮基三甲基硅烷(6.52g,56.59mmol)。将反应混合物在30℃下搅拌16h。添加甲醇(30mL)和三氟乙酸(0.5mL)。将所得溶液在30℃下搅拌3h，然后在真空下浓缩。使用100mL水稀释残余物并使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:2EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到浅黄色油状物形式的(3S,4S)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):263[M+H]+。
步骤2.(3S,4S)-3-叠氮基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
根据中间体35步骤2的程序从(3S,4S)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯起始来制备标题化合物。MS:(ESI,m/z):277[M+H]+。
步骤3.(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
根据中间体35步骤3的程序从(3S,4S)-3-叠氮基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯起始来制备标题化合物。MS:(ESI,m/z):251[M+H]+。
步骤4.(3S,4S)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯
根据中间体35步骤4的程序从(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯起始来制备标题化合物。MS:(ESI,m/z):351[M+H]+。
步骤5.((3S,4S)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
根据中间体35步骤5的程序从(3S,4S)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯起始来制备标题化合物。MS:(ESI,m/z):217[M+H]+。
中间体37. 3-(三氟甲基)哌啶-3-基氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 3-(三氟甲基)哌啶-1,3-二甲酸1-苄基酯3-甲基酯
在-78℃下，向哌啶-1,3-二甲酸1-苄基酯3-甲基酯(2.0g,7.14mmol)于THF(60mL)中的溶液中逐滴添加LDA(2.0M于THF中)(10.8mL,21.66mmol)。在将溶液在-78℃下搅拌30min后，添加S-(三氟甲基)二苯并噻吩鎓三氟甲磺酸盐(4.35g,10.81mmol)。在添加后，使所得溶液在搅拌和-40℃下再反应2h。然后通过添加30mL NH4Cl饱和水溶液来淬灭反应。使用EtOAc(3×70mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:4EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色油状物形式的3-(三氟甲基)哌啶-1,3-二甲酸1-苄基酯3-甲基酯。MS:(ESI,m/z):346[M+H]+。
步骤2. 1-((苄基氧基)羰基)-3-(三氟甲基)哌啶-3-甲酸
将3-(三氟甲基)哌啶-1,3-二甲酸1-苄基酯3-甲基酯(310mg,0.83mmol)于MeOH(10mL)和1N NaOH水溶液(2.7mL,2.70mmol)中的溶液在50℃下搅拌2h并且然后在真空下浓缩。使用5mL水稀释残余物。使用6N HCl将溶液的pH值调节至3-4。通过过滤收集固体，得到黄色固体形式的1-((苄基氧基)羰基)-3-(三氟甲基)哌啶-3-甲酸。MS:(ESI,m/z):332[M+H]+。
步骤3. 3-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄酯
将1-((苄基氧基)羰基)-3-(三氟甲基)哌啶-3-甲酸(250mg,0.76mmol)、Et3N(229mg,2.26mmol)和DPPA(415mg,1.51mmol)于甲苯(8mL)中的溶液在90℃下搅拌2h。添加叔丁醇(279mg,3.76mmol)并且将反应混合物在90℃下再搅拌16h。在冷却至室温后，通过添加水(20mL)来淬灭反应并使用EtOAc(20mL×3)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):403[M+H]+。
步骤4.(3-(三氟甲基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(三氟甲基)哌啶-1-甲酸苄酯(90mg,0.21mmol)和Pd/C(10mg,10％)于EtOAc(5mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌1h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的(3-(三氟甲基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):269[M+H]+。
中间体38.(4-(三氟甲氧基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(5g,22.81mmol)、NaN3(3g,46.15mmol)、NH4Cl(1.23g,22.99mmol)于MeOH(60mL)和水(10mL)中的溶液在65℃下搅拌16h。在冷却至室温后，使用0.5N NaOH水溶液将pH值调节至7-8。使用DCM(2×150mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到浅黄色固体形式的3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):263[M+H]+。
步骤2. 3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(6g,22.88mmol)、1N NaOH水溶液(46mL,46mmol)、PMe3(1M于THF中)(70mL,70mmol)和(Boc)2O(15.0g,68.73mmol)于THF(228mL)中的溶液在室温下搅拌3h。使用50mL水稀释反应混合物并使用CH2Cl2(3×200mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在40min内0％B至70％B)纯化，得到白色固体形式的3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):337[M+H]+。
步骤3. 3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(三氟甲氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(1g,2.97mmol)、(5.26g,14.85mmol)、AgOTf(7.6g,29.7mmol)、KF(1.72g,29.61mmol)、2-氟吡啶(2.88g,29.66mmol)和TMS-CF3(4.22g,29.68mmol)于EtOAc(14mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。过滤出固体并使用CH2Cl2(3×50mL)洗涤。在真空下浓缩合并的滤液并通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在40min内0％B至80％B)纯化，得到黄色油状物形式的3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(三氟甲氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):405[M+H]+。
步骤4.(4-(三氟甲氧基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(三氟甲氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(190mg,0.47mmol)和Pd/C(20mg,10％)于EtOAc(10mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌2h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的(4-(三氟甲氧基)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):271[M+H]+。
中间体39. 4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶
步骤1. 1-苄基-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶
将1-苄基哌啶-4-醇(1g,5.23mmol)、咪唑(712mg,10.46mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(867mg,5.75mmol)于DCM(20mL)中的溶液在室温下搅拌3h并且然后使用20mL水稀释。使用DCM(3×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到无色油状物形式的1-苄基-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶。MS:(ESI,m/z):306[M+H]+。
步骤2. 4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶
将1-苄基-4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶(500mg,1.64mmol)和Pd/C(50mg,10％)于EtOAc(20mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌2h。过滤出固体并在真空下浓缩滤液，得到无水油状物形式的4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶。MS:(ESI,m/z):216[M+H]+。
中间体40：3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3-甲基哌啶
将3-甲基哌啶-3-醇(500mg,3.91mmol)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(497mg,3.30mmol)和Et3N(837mg,8.27mmol)于DCM(20mL)中的溶液在室温下搅拌24h。通过添加50mL水来淬灭反应。使用DCM(3×40mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:20至1:5EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到无色油状物形式的3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3-甲基哌啶。MS:(ESI,m/z):230[M+H]+。
中间体41. 7-羟基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯
步骤1：3-(2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(26.2g,116.86mmol)于THF(60mL)中的溶液中以多份添加NaH(4.68g,117.01mmol，于油中的60％分散液)。将所得溶液在室温下搅拌30min。在搅拌和0℃下，向反应混合物中添加3-氧代氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(10g,58.41mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌30min。然后通过添加30mL水/冰混合物来淬灭反应。使用DCM(3×40mL)萃取所得溶液。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色油状物形式的3-(2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):242[M+H]+。
步骤2：7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2,8-二甲酸2-(叔丁基)酯8-乙基酯
在0℃下，向NaH(1.2g,30.00mmol，于油中的60％分散液)于Et2O(20mL)中的溶液中添加2-羟基乙酸甲酯(2.69g,29.86mmol)。将所得溶液在室温下搅拌30min并且然后在真空下浓缩。使用20mL DMSO稀释残余物并添加3-(2-乙氧基-2-氧代亚乙基)氮杂环丁烷-1-甲酸叔丁酯(6g,24.87mmol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。使用盐酸(1N)将溶液的pH值调节至4-5。使用Et2O(4×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:5EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到浅黄色固体形式的7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2,8-二甲酸2-(叔丁基)酯8-乙基酯。MS:(ESI,m/z):300[M+H]+。
步骤3. 7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯
将7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2,8-二甲酸2-(叔丁基)酯8-乙基酯(4g,13.4mmol)和NaCl(1.33g,22.76mmol)于DMSO/水(10:1,20mL)中的溶液在120℃下搅拌2h。在冷却至室温后，使用20mL水淬灭反应。使用Et2O(4×20mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):228[M+H]+。
步骤4. 7-羟基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯
在0℃下，向7-氧代-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯(1.1g,4.84mmol)于THF(8mL)中的溶液中以多份添加NaH(276mg,7.49mmol)。将所得混合物在室温下搅拌30min。使用50mL水/冰混合物淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.5％TFA)，B：ACN；梯度：在35min内0％至50％B)纯化，得到黄色油状物形式的7-羟基-5-氧杂-2-氮杂螺[3.4]辛烷-2-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):230[M+H]+。
中间体42.(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯
步骤1.(4,6-二氯吡啶-3-基)甲醇
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的500mL三颈圆底烧瓶中放置4,6-二氯烟醛(8g,43.18mmol)和乙醇(200mL)。在0℃下以多份添加NaBH4(5.2g,141.21mmol)。然后，将所得溶液在25℃下搅拌2h。然后通过添加水(200mL)来淬灭反应。使用DCM(3×300mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的((4,6-二氯吡啶-3-基)甲醇。MS:(ESI,m/z):178,180[M+H]+。
步骤2. 5-(溴甲基)-2,4-二氯吡啶
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的250mL三颈圆底烧瓶中放置(4,6-二氯吡啶-3-基)甲醇(5g,26.68mmol)、DCM(100mL)和PBr3(7.7g,28.45mmol)。将所得溶液在40℃下于油浴中搅拌30min。在冷却至25℃后，然后通过添加水(120mL)来淬灭反应。使用DCM(2×150mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:30乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的5-(溴甲基)-2,4-二氯吡啶。MS:(ESI,m/z):240,242,244[M+H]+。
步骤3.(2R,5S)-2-((4,6-二氯吡啶-3-基)甲基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的500mL三颈圆底烧瓶中放置(2S)-3,6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪(3g,15.47mmol)和THF(200mL)。将n-BuLi于正己烷(2.5M)(9.8mL,24.5mmol)中的溶液在-80℃下添加至液氮浴中。将所得溶液于-80℃下在液氮浴中搅拌30min。然后，添加5-(溴甲基)-2,4-二氯吡啶(4.7g,18.53mmol)于THF(10mL)中的溶液。使所得溶液在搅拌下再反应1h，同时将液氮浴中的温度维持于-80℃。然后通过添加120mL氯化铵(饱和水溶液)来淬灭反应。使用DCM(2×150mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的(2R,5S)-2-[(4,6-二氯吡啶-3-基)甲基]-3,6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪。MS:(ESI,m/z):344,346[M+H]+。
步骤4.(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯
向250mL圆底烧瓶中放置(2R,5S)-2-[(4,6-二氯吡啶-3-基)甲基]-3,6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪(3.5g,9.66mmol)、盐酸(0.3M)(70mL)和ACN(80mL)。将所得溶液在25℃下搅拌2h。然后通过添加100mL碳酸氢钠(饱和水溶液)来淬灭反应。使用2×150mL DCM萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到无色油状物形式的(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯。MS:(ESI,m/z):249,251[M+H]+。
步骤5.(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇
向250mL圆底烧瓶中放置(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯(1.5g,5.72mmol)和甲醇(50mL)。在0℃下以多份添加NaBH4(690mg,18.24mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌3h。然后通过添加水(20mL)来淬灭反应。使用DCM(2×50mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10甲醇/DCM洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇。MS:(ESI,m/z):221,223[M+H]+。
步骤6.(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-胺
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的50mL圆底烧瓶中放置(2R)-2-氨基-3-(4,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇(1g,4.30mmo)、氢化钠(271mg,6.78mmol,60％)和DMSO(10mL)。将所得溶液在50℃下于油浴中搅拌16h。在冷却至25℃后，然后通过添加水(20mL)来淬灭反应。使用DCM(2×30mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在30min内0％B至30％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到白色固体形式的(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-胺。MS:(ESI,m/z):185,187[M+H]+。
步骤7.(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯
向50mL圆底烧瓶中放置(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-胺(500mg,2.57mmol)、乙酸乙酯(15mL,153.23mmol)、水(15mL)、氯甲酸苄酯(558mg,3.27mmol)和碳酸钾(751mg,5.43mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌30min。使用3×20mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[3,2-c]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):319,321[M+H]+。
中间体43.(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯
步骤1. 3-(溴甲基)-2,6-二氯吡啶
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的500mL三颈圆底烧瓶中放置(2,6-二氯吡啶-3-基)甲醇(10g,56.17mmol)、DCM(200mL)和PBr3(15.3g,56.52mmol)。将所得溶液在40℃下于油浴中搅拌30min。使用NH4HCO3(饱和水溶液)将溶液的pH值调节至7。使用3×200mL DCM萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的3-(溴甲基)-2,6-二氯吡啶。MS:(ESI,m/z):240,242,244[M+H]+。
步骤2.(2R,5S)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)甲基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的两个250mL三颈圆底烧瓶中放置(2S)-3,6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪(2g,10.86mmol)和THF(15mL)。此后接着在-78℃下添加丁基锂(2.5M)(6.5mL,16.25mmol)。将所得溶液搅拌30min。向此溶液中添加3-(溴甲基)-2,6-二氯吡啶(2.62g,10.88mmol)。将所得溶液在-78℃下再搅拌1h。然后通过添加5mL NH4HCO3(饱和)来淬灭反应并且使用10mL H2O稀释混合物。合并两个批次的所得混合物并使用3×50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1/5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的(2R,5S)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)甲基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪。MS:(ESI,m/z):344,346[M+H]+。
步骤3.(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯
向500mL圆底烧瓶中放置(2R,5S)-2-((2,6-二氯吡啶-3-基)甲基)-5-异丙基-3,6-二甲氧基-2,5-二氢吡嗪(5.4g,16.35mmol)、乙腈(100mL)和盐酸(0.3N)(157mL)。将所得溶液在24℃下搅拌1小时。在真空下去除溶剂并且使用3×100mL DCM萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5至1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯。MS:(ESI,m/z):249,251[M+H]+。
步骤4.(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇
向250mL圆底烧瓶中放置(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙酸甲酯(3.2g,12.85mmol)、甲醇(15mL)、THF(60mL)和NaBH4(1.46g,39.65mmol)。将所得溶液在24℃下搅拌2h。然后通过添加5mL水来淬灭反应。在真空下去除溶剂。使用50mL水稀释残余物。使用3×50mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:20甲醇/DCM洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇。MS:(ESI,m/z):221,223[M+H]+。
步骤5.(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-胺
向配备有氢气囊的250mL圆底烧瓶中放置(R)-2-氨基-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙烷-1-醇(2.6g,11.76mmol)和DMSO(30mL)。此后接着在0℃下添加氢化钠(706mg,29.42mmol,60％)。将所得溶液在24℃搅拌30min并且然后在50℃下搅拌过夜。在冷却至25℃后，然后通过添加60mL水来淬灭反应。使用3×60mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在30min内0％B至30％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-胺。MS:(ESI,m/z):185,187[M+H]+。
步骤6.(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯
向100mL圆底烧瓶中放置(R)-7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-胺(1.3g,6.34mmol)、乙酸乙酯(15mL)、水(10mL)、碳酸钾(1.95g,14.11mmol)和氯甲酸苄酯(1.44g,8.44mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌2h。然后通过添加30mL水来淬灭反应。使用3×30mL乙酸乙酯萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过从石油醚中重结晶来纯化残余物。通过过滤收集固体，得到白色固体形式的(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):319,321[M+H]+。
中间体44. 4-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-氟哌啶-1-甲酸叔丁酯
步骤1. 7-溴-4-甲基-3-硝基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃
在-78℃下，向7-溴-3-硝基-2H-色烯(2.2g,8.59mmol)于THF(30mL)中的溶液中添加CH3MgBr(1M于THF中)(13mL,13.00mmol)。将所得溶液在-78℃下搅拌20min。然后通过添加20mL NH4Cl饱和水溶液来淬灭反应。使用3×50mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的7-溴-4-甲基-3-硝基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃。GCMS:(ESI,m/z):271,273[M+H]+。
步骤2. 7-溴-4-甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺
向BH3-THF(1M)(40mL,40.00mmol)和NaBH4(1.26g,33.30mmol)于THF(40mL)中的溶液中添加7-溴-4-甲基-3-硝基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃(900mg,3.31mmol)。将所得混合物在75℃下于密封管中搅拌16h。然后添加甲醇(40mL)并且将反应混合物在80℃下搅拌6h。在冷却至25℃后，在真空下去除溶剂。使用50mL冰/水稀释残余物。使用3×50mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.05％TFA)，B：ACN；梯度：在45min内0％B至40％)纯化残余物，得到白色固体形式的7-溴-4-甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺。MS:(ESI,m/z):242,244[M+H]+。
步骤3.N-(7-溴-4-甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基)氨基甲酸苄酯
将7-溴-4-甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺(500mg,2.07mmol)和CbzCl(423mg,2.48mmol)于乙酸乙酯(8mL)中的溶液和碳酸钾(567mg,4.10mmol)于水(8mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。使用20mL水稀释所得溶液。使用3×20mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-(7-溴-4-甲基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):376,378[M+H]+。
中间体45. 6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯
步骤1. 1,4-二苄基-1,4-二氮杂环庚烷-6-醇
将1,3-二溴丙烷-2-醇(12.37g,56.77mmol)、苄基(2-(苄基氨基)乙基)胺(13.56g,56.42mmol)和Et3N(17.17g,169.68mmol)于甲苯(50mL)中的溶液在120℃下搅拌48h。在冷却至25℃后，然后通过添加100mL水来淬灭反应。使用2×100mL乙酸乙酯萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的1,4-二苄基-1,4-二氮杂环庚烷-6-醇。MS:(ESI,m/z):297[M+H]+。
步骤2. 1,4-二苄基-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷
将1,4-二苄基-1,4-二氮杂环庚烷-6-醇(2.0g,6.61mmol)、咪唑(900mg,13.22mmol)和TBS-Cl(1.2g,7.96mmol)于DMF(10mL)中的溶液在25℃下搅拌16h。然后通过添加50mL水来淬灭反应。使用2×50mL乙酸乙酯萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的1,4-二苄基-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷。MS:(ESI,m/z):411[M+H]+。
步骤3. 6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷
将1,4-二苄基-6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷(1.5g,3.47mmol)和碳载Pd(OH)2(20mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在氢气氛和20℃下搅拌28h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到无色油状物形式的6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷。MS:(ESI,m/z):231[M+H]+。
步骤4. 6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯
将6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷(1.2g,4.95mmol)、Boc2O(700mg,3.21mmol)和三乙胺(500mg,4.94mmol)于DCM(20mL)中的溶液在-40℃下于干冰/乙醇浴中搅拌2h并在20℃下再搅拌1h。然后通过添加40mL水来淬灭反应。使用2×40mL乙酸乙酯萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10甲醇/DCM洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):331[M+H]+。
中间体46. 6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯
向2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1g,4.39mmol)和三乙胺(1.53mL,10,98mmol)于DCM(20mL)中的溶液中添加叔丁基(氯)二甲基硅烷(693mg,4.60mmol)。将所得溶液在20℃下搅拌过夜。然后通过添加20mL水来淬灭反应。使用3×20mL DCM萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用20:1乙基DCM/甲醇洗脱)纯化残余物，得到浅色至无色油状物形式的6-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1,4-二氮杂环庚烷-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):331[M+H]+。
中间体47-1.N-[2-[(三氟甲烷)磺酰基氧基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
中间体47-2.N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
中间体47-3.N-[(6R)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
方法1.手性分离
步骤1. 7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-醇
将1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-酮(50.0g,320mmol)、丙-2-炔酸乙酯(68mL,672mmol)和NH3于MeOH中的溶液(230mL,7M)于异丙醇(1.3L)中的溶液在130℃下搅拌14h。将反应混合物冷却至20℃。在真空下去除溶剂。通过过滤收集固体。使用2×30mL石油醚洗涤滤饼并在真空下干燥，得到灰白色固体形式的7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-醇。MS(ESI,m/z):208[M+H]+。
步骤2.三氟甲磺酸7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-基酯
在10℃下，向7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-醇(24.0g,116mmol)和三乙胺(64.4mL,464mmol)于DCM(500mL)中的溶液中添加三氟甲磺酸酐(58.4mL,347mmol)于DCM(100mL)中的溶液。将所得溶液在20℃下搅拌1h。在真空下浓缩混合物。通过硅胶色谱法(使用3:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的三氟甲磺酸7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-基酯。MS(ESI,m/z):340[M+H]+。
步骤3.三氟甲磺酸6-氧代-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯
将三氟甲磺酸7',8'-二氢-5'H-螺[1,3-二氧杂环戊烷-2,6'-喹啉]-2'-基酯(35.0g,103mmol)和盐酸(206mL,1N)于丙酮(300mL)中的溶液在75℃下搅拌1h。将混合物冷却至20℃。在真空下浓缩丙酮。使用NaHCO3(饱和水溶液)将残余物的pH值调节至7-8。使用3×100mL DCM萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过使用乙酸乙酯和石油醚(10:1)的100mL混合溶剂进行重结晶来纯化残余物，得到灰白色固体形式的三氟甲磺酸6-氧代-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯。MS(ESI,m/z):296[M+H]+。
步骤4.三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯
将三氟甲磺酸6-氧代-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯(16.0g,54.2mmol)和NH4OAc(50.1g,650mmol)于甲醇(250mL)中的混合物在20℃下搅拌1h。在10℃下以多份添加NaBH3CN(4.10g,65.2mmol)。使所得混合物在20℃下反应13h。然后通过添加50mL水/冰来淬灭反应。在真空下浓缩溶剂。使用100mL盐酸(1N)稀释残余物。使用2×100mL DCM萃取所得混合物。使用Na2CO3(饱和水溶液)将水相的pH值调节至10。使用4×100mL DCM萃取水相。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，以得到黄色油状物形式的三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯。MS(ESI,m/z):297[M+H]+。
步骤5.N-[2-[(三氟甲烷)磺酰基氧基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯(12.0g,40.5mmol)、碳酸钾(14.0g,101mmol)和CbzCl(7.4mL,52.8mmol)于乙酸乙酯(100mL)中的混合物在20℃下搅拌2h。然后通过添加100mL水/冰来淬灭反应。使用3×100mL乙酸乙酯萃取混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过使用乙酸乙酯和石油醚(10:1)的80mL混合溶剂进行重结晶来纯化残余物，得到灰白色固体形式的N-[2-[(三氟甲烷)磺酰基氧基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):431[M+H]+。
步骤6.N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯和N-[(6R)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
通过SFC(柱：Chiralpak AD-H SFC,5×25cm,5μm；流动相A：CO2:55％和B：MeOH:45％；流速：150mL/min)分离外消旋N-[2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-1)(7.00g,16.3mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝4.23min)并在真空下浓缩，得到灰白色固体形式的N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)。并且收集第二洗脱异构体(RT＝5.16min)并在真空下浓缩，得到灰白色固体形式的N-[(6R)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-3)。两种异构体的MS(ESI,m/z)：431[M+H]+。
中间体47-2.N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
方法2.手性拆分
步骤1.(S)-三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯
将三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯(183g,525.65mmol)和L-(-)-苦杏仁酸(39.99g,262.83mmol)于EtOH(1830mL)中的溶液在70℃下搅拌2h。使混合物缓慢冷却至25℃并搅拌过夜。通过过滤收集所形成沉淀物并在真空下干燥，得到白色固体形式的手性盐。将盐溶于H2O(350mL)中并且使用NaOH(1N水溶液)将水相的pH值调节至12-14。使用EtOAc(500mL)萃取水相。有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩，得到黄色油状物形式的手性胺(S)-三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯的游离碱。MS(ESI,m/z):297[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400mHz)δ(ppm):7.79(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(d,J＝8.4Hz,1H),3.14-3.11(m,1H),2.97-2.81(m,3H),2.54-2.52(m,1H),2.61-2.58(m,2H),1.64-1.59(m,1H)。
步骤2.N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
在0℃下，向(S)-三氟甲磺酸6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基酯(48.0g,162.02mmol)和K2CO3(55.98g,405.04mmol)于EtOAc(480mL)中的溶液中逐滴添加CbzCl(35.93g,210.62mmol,29.94mL)。将混合物在20℃下搅拌30min。然后通过水/冰(150mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(350mL)萃取混合物。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。使用石油醚(200mL)在20℃下湿磨粗制物。通过过滤收集所得沉淀物并在真空下干燥，得到浅粉红色固体形式的N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):431[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400mHz)δ(ppm):7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(m,1H),7.37-7.28(m,6H),5.04(s,2H),3.82(m,1H),3.08(dd,J＝16.8Hz,4.8Hz,1H),2.91-2.88(m,2H),2.76-2.72(m,1H),2.02-2.00(m,1H),1.83-1.75(m,1H)。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体47-1的程序的程序来制备表7中的下列中间体。
表7：
1程序注意事项：在步骤1中，所用酮是6,9-二氧杂二螺[2.1.45.33]十二烷-12-酮，其通过下列方法制备：将(2-氯乙基)二甲基碘化锍(88.0g,347mmol)经4h缓慢添加至1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-酮(60.0g,384mmol)和t-BuOK(88.0g,784mmol)于t-BuOH(1.50L)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。过滤固体。在真空下浓缩滤液。使用水(400mL)稀释残余物。使用DCM(3×400mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。经由反相色谱法纯化残余物，得到浅黄色油状物形式的6,9-二氧杂二螺[2.1.45.33]十二烷-12-酮。MS(ESI,m/z):183[M+H]+。
中间体48-1.顺式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯；
中间体48-2.N-[(3R,4R)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和
中间体48-3.(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
步骤1.顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将顺式-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(2.00g,7.99mmol)、Et3N(2.13mL,23.7mmol)和(Boc)2O(2.20g,10.1mmol)于THF(40mL)和水(20mL)中的溶液在20℃下搅拌2h。在真空下去除溶剂。使用水(20mL)稀释残余物。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):351[M+H]+。
步骤2.顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将四氟硼酸三甲基氧鎓(1.50g,10.4mmol)于DCM(20mL)中的溶液添加至1,8-双(二甲基氨基)萘(2.20g,10.3mmol)和顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(2.20g,6.09mmol)于DCM(100mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在40℃下搅拌3h。使用HCl(3N，水溶液)将混合物的pH调节至4-6。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):365[M+H]+。
步骤3.顺式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.00g,2.74mmol)和碳载钯(1.00g,10％)于乙酸乙酯(50mL)中的混合物在20℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的顺式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体48-1)(粗制物)。MS(ESI,m/z):231[M+H ]+。
步骤4.N-[(3R,4R)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过SFC(柱：Chiralpak IA-SFC,5×25cm,5μm；流动相A：CO2:70％和B：MeOH(含有于MeOH中的2mM NH3):30％；流速：150mL/min)将外消旋顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯分离成其对映异构体。收集第一洗脱异构体(RT＝3.91min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。收集第二洗脱异构体(RT＝5.04min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(中间体48-3)。MS(ESI,m/z):365[M+H]+。
将(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(中间体48-3)(0.800g,2.20mmol)和碳载钯(0.800g,10％)于乙酸乙酯(30mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的N-[(3R,4R)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体48-2)(粗制物)。MS(ESI,m/z):231[M+H]+。
中间体48-3.(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
方法2.
步骤1.N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄酯
向2,2-二甲氧基乙-1-胺(1600g,15.22mol)于甲苯(8L)中的溶液中添加NaOH(858g,21.45mol)于水(4.42L)中的溶液。然后在搅拌和<20℃下逐滴添加CbzCl(2598g,15.23mol)。将所得溶液在室温下搅拌4h。分离有机层并使用3×5L盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩，得到白色固体形式的N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄酯。
步骤2.N-(2,2-二甲氧基乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯
在搅拌和室温下，向N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸苄酯(1700g,7.10mol)、KOH(1755g,31.28mol)和苄基三乙基氯化铵(32.37g,142.1mmol)于甲苯(7.82L)中的溶液中逐滴添加3-溴丙-1-烯(1117.4g,9.24mol)。将所得溶液在室温下搅拌24h。由此并行操作两个批次。然后通过添加10L水来淬灭反应。使用2×7L甲苯萃取所得溶液并合并有机层。使用2×10L盐水洗涤有机相。混合物经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的N-(2,2-二甲氧基乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯。
步骤3.N-(2-氧代乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯
将N-(2,2-二甲氧基乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯(3900g,13.96mol)于88％甲酸(5460mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。在真空下浓缩所得混合物。使用20L乙酸乙酯稀释残余物，使用4×10L盐水洗涤。经无水硫酸钠干燥有机相并在真空下浓缩，得到褐色油状物形式的N-(2-氧代乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯。
步骤4.N-[2-(羟基亚氨基)乙基]-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯
向N-(2-氧代乙基)-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯(1700g,7.29mol)和NH2OH-HCl(638g,9.18mol)于ACN(9.52L)中的溶液中添加NaOAc(669g,8.16mol)于H2O(4.96L)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌20h。由此并行操作两个批次。所得混合物在真空下浓缩并使用3×10L乙酸乙酯萃取，并且合并有机层。使用3×5L盐水洗涤有机相，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:9EtOAc/石油醚洗脱)纯化粗产物，得到无色油状物形式的N-[2-(羟基亚氨基)乙基]-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯。
步骤5.顺式-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将N-[2-(羟基亚氨基)乙基]-N-(丙-2-烯-1-基)氨基甲酸苄酯(1200g,4.83mol)和二甲苯(6L)的溶液在130℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温。将HOAc(6L)添加至混合物中。然后在15℃下将Zn(1200g,18.35mol)添加至混合物中。将所得溶液在室温下于水浴中搅拌过夜。由此并行操作两个批次。合并各批次并过滤。使用二甲苯洗涤滤饼。使用20L水稀释合并的滤液。使用二甲苯(4×5L)萃取混合物。在真空下浓缩水相。使用饱和碳酸钠将残余物的pH值调节至9-10。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。使用5L THF萃取残余物并在真空下浓缩，得到褐色油状物形式的顺式-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。
步骤6.顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在搅拌和室温下，向顺式-3-氨基-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(900g,3.60mol)和三乙胺(728g,7.19mol)于甲醇(9L)中的溶液中逐滴添加二碳酸二叔丁酯(863g,3.95mol)。将所得溶液在室温下搅拌过夜。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用2:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化粗产物，得到白色固体形式的顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。
步骤7.顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
向顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(羟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(600g,1.71mol)和2,6-二叔丁基-4-甲基吡啶(1406g,6.85mol)于DCM(12L)中的混合物中添加四氟硼酸三甲基氧鎓(506.5g,3.42mol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在真空下浓缩所得溶液。通过硅胶色谱法(使用3:7EtOAc/石油醚洗脱)纯化粗产物，得到白色固体形式的顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。
步骤8.(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
通过SFC(柱：Lux 5μm Amylose-1,5×25cm,5μm；流动相A：CO2:50％，和B：MeOH:50％；流速：160mL/min)将外消旋顺式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯分离成其对映异构体。收集第一洗脱异构体(RT＝4.2min)并在真空下浓缩，得到白色固体形式的(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):387[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.31-7.44(m,5H),5.14-5.36(m,3H),4.28(s,1H),3.46-3.70(m,4H),3.32-3.46(m,5H),2.54(s,1H),1.47(s,9H)。
收集第二洗脱异构体(RT＝5.7min)并在真空下浓缩，得到白色固体形式的(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(中间体48-3)。MS(ESI,m/z):387[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.33-7.40(m,5H),5.09-5.40(m,3H),4.28(s,1H),3.46-3.73(m,4H),3.32-3.46(m,5H),2.53-5.55(m,1H),1.46(s,9H)。
中间体49.((3S,4S)-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
步骤1.(3S,4S)-3-叠氮基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯
向(3S,4S)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(202.7mg,0.773mmol)于无水DMF(5mL)中的溶液中添加NaH(于矿物油中的60％分散液，37.1mg,0.927mmol)。将反应物在室温下搅拌1h。然后，添加碘甲烷-d3(0.058ml,0.927mmol)并且将反应物在22℃下搅拌6h。使用5mL EtOAc稀释反应物并使用2×3mL H2O洗涤。分离有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩，得到黄色油状物形式的粗制(3S,4S)-3-叠氮基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):280[M+H]+。
步骤2.(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将(3S,4S)-3-叠氮基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯(215.8mg,0.773mmol)和三苯基膦(223mg,0.850mmol)于THF(1.405mL)和水(0.14mL)中的溶液在室温下搅拌1h。然后将反应物在50℃下加热5h。在冷却至室温后，在真空下浓缩反应物。通过制备型HPLC(柱：Waters XBridge Prep C18 OBD 5μm,19×50mm；流动相梯度：在8min内0％至35％ACN(0.1％甲酸)；流速：23mL/min)纯化残余物，得到无色油状物形式的(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):254[M+H]+。
步骤3.(3S,4S)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯(217mg,0.858mmol)、Et3N(225μl,1.61mmol)和Boc2O(0.299mL,1.29mmol)于THF(1.43mL)和水(1.43mL)中的溶液在室温下搅拌30min。使用2×30mL DCM萃取所得混合物。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，得到无色油状物形式的(3S,4S)-3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):354[M+H]+。
步骤4.((3S,4S)-4-(甲氧基-d3)吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-甲酸苄酯(200mg,0.57mmol)和Pd/C(200mg,10％)于EtOAc(10mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌3h。过滤出固体并使用3×10mL EtOAc洗涤。在真空下浓缩滤液，得到无色油状物形式的N-(4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):220[M+H]+。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):8.04-8.26(m,1H),4.41-4.86(m,1H),3.93-4.22(m,1H),3.09-3.92(m,3H),1.46(s,9H)。
中间体50.N-(7-氯-6,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基)氨基甲酸苄酯
步骤1. 4-氯-3,5-二氟-2-羟基苯甲醛
将3-氯-2,4-二氟苯酚(4.00g,23.6mmol)和HMTA(6.60g,47.2mmol)于TFA(60mL)中的溶液在100℃下搅拌3h。在冷却至0℃后，将浓H2SO4(10mL)和H2O(50mL)在0℃下添加至混合物中。将混合物在20℃下搅拌2h并且然后使用H2O(40mL)稀释。使用二丁胺将混合物的pH值调节至7-8。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的4-氯-3,5-二氟-2-羟基苯甲醛。GCMS(ESI,m/z):192,194[M+H]+。
步骤2. 7-氯-6,8-二氟-3-硝基-2H-色烯
在125℃下，经由注射泵使用0.5mL/h的流速将2-硝基乙烷-1-醇(3.72mL,51.9mmol)添加至4-氯-3,5-二氟-2-羟基苯甲醛(1.50g,7.77mmol)、二丁胺(0.659mL,3.89mmol)和邻苯二甲酸酐(2.20g,14.8mmol)于甲苯(80mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在125℃下回流16h。在冷却至20℃后，在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的7-氯-6,8-二氟-3-硝基-2H-色烯。MS(ESI,m/z):248,250[M+H]+。
步骤3. 7-氯-8-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺
将7-氯-6,8-二氟-3-硝基-2H-色烯(1.30g,5.25mmol)、BH3(40mL,1M于THF中)和NaBH4(399mg,10.5mmol)的混合物在65℃下搅拌16h。将MeOH(80mL)在<10℃下缓慢添加至混合物中。将所得溶液在80℃下搅拌8h。在冷却至20℃后，在真空下浓缩所得混合物。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在20min内5％至75％))纯化残余物，得到灰白色固体形式的7-氯-8-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺。MS(ESI,m/z):220,222[M+H]+。
步骤4.N-(7-氯-6,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基)氨基甲酸苄酯
在<10℃下，将CbzCl(0.500mL,3.55mmol)添加至7-氯-6,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-胺(650mg,2.96mmol)和碳酸钾(822mg,5.92mmol)于乙酸乙酯(20mL)和水(20mL)中的混合物中。然后将所得溶液在25℃下搅拌1h并使用水(30mL)稀释。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的N-(7-氯-6,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基)氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):354,356[M+H]+。
中间体51-1.N-[(3R,4S)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
中间体51-2.N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 4,4-二氟-3-羟基丁酸乙酯
在0℃下，将NaBH4(34.2g,902mmol)添加至4,4-二氟-3-氧代丁酸乙酯(100g,602mmol)于甲苯(1L)中的搅拌溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌2h，并且然后升温至最高25℃并搅拌16h。使用水(400mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(2×1L)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的4,4-二氟-3-羟基丁酸乙酯。GCMS(ESI,m/z):168[M+H]+。
步骤2.(2E)-4,4-二氟丁-2-烯酸乙酯
在0℃下，向4,4-二氟-3-羟基丁酸乙酯(40.0g,238mmol)和Et3N(99.0mL,712mmol)于DCM(300mL)中的溶液中逐滴添加MsCl(28.0mL,244mmol)。将所得混合物升温至25℃并搅拌16h。使用水(500mL)淬灭反应。使用DCM(2×500mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(500mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄绿色油状物形式的(2E)-4,4-二氟丁-2-烯酸乙酯。GCMS(ESI,m/z):150[M+H]+。
步骤3.反式-1-苄基-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯
在0℃下经2min，向(2E)-4,4-二氟丁-2-烯酸乙酯(12.0g,79.9mmol)和苄基(甲氧基甲基)[(三甲基甲硅烷基)甲基]胺(30.7mL,120mmol)于DCM(250mL)中的搅拌溶液中逐滴添加TFA(0.59mL,5.21mmol)于DCM(20mL)中的溶液。将所得混合物升温至25℃并搅拌14h。通过添加水(500mL)来淬灭反应。使用DCM(2×300mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用碳酸氢钠溶液(饱和，300mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10至1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色油状物形式的反式-1-苄基-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯。MS(ESI,m/z):284[M+H]+。
步骤4.反式-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯
将反式-1-苄基-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯(5.50g,19.4mmol)和Pd(OH)2/C(2.00g,10％)于MeOH(30mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体并且使用MeOH(3×10mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到白色固体形式的反式-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯。MS(ESI,m/z):194[M+H]+。
步骤5.反式-3-(二氟甲基)-4-[乙氧基(羟基)甲基]吡咯烷-1-甲酸苄酯
在0℃下，将CbzCl(4.05g,23.741mmol)添加至反式-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯(3.90g,19.8mmol)和K2CO3(8.20g,59.3mmol)于H2O(20mL)和乙酸乙酯(40mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌1h。通过添加水(100mL)来淬灭反应。使用DCM(2×200mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的反式-3-(二氟甲基)-4-[乙氧基(羟基)甲基]吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):328[M+H]+。
步骤6.反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸
向反式-3-(二氟甲基)-4-[乙氧基(羟基)甲基]吡咯烷-1-甲酸苄酯(6.00g,18.0mmol)于THF(80mL)和MeOH(20mL)中的搅拌溶液中添加LiOH(4.30g,180mmol)于水(10mL)中的溶液。将所得混合物在25℃下搅拌1h。在真空下去除溶剂。使用NH4Cl(饱和水溶液)将残余物的pH值调节至5-6。使用DCM(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用碳酸氢钠溶液(饱和，50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化残余物，得到无色油状物形式的反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸。MS(ESI,m/z):300[M+H]+。
步骤7.反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在0℃下，向反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-甲酸(4.00g,13.1mmol)于t-BuOH(100mL)中的搅拌溶液中逐滴添加Et3N(2.73mL,19.6mmol)和DPPA(4.33g,15.7mmol)。在添加后，将所得混合物在80℃下搅拌2h。将混合物冷却至25℃并且然后在真空下浓缩。通过反相急速色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在40min内0％至100％))纯化残余物，得到所需产物。通过硅胶色谱法(使用2:5THF/石油醚洗脱)进一步纯化，得到无色油状物形式的反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):371[M+H]+。
步骤8.N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(3R,4S)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过SFC(柱：Chiralpak AD-H SFC,5×25cm,5μm；流动相A：CO2:70％和B：MeOH(含有2mM NH3-MeOH):30％；流速：180mL/min)分离反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.70g,4.58mmol)，得到白色固体形式的第一洗脱异构体(RT＝4.23min)，其立体化学任意指定为N-[(3R,4S)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯；和白色固体形式的第二洗脱异构体(RT＝6.14min)，其立体化学任意指定为N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):371[M+H]+。
步骤9.N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(3R,4S)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将(3S,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(650mg,1.76mmol)和Pd/C(450mg,10％)于乙酸乙酯(14mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到无色油状物形式的N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):237[M+H]+。
类似地，从(3R,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯获得N-[(3R,4S)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):237[M+H]+。
中间体52-1. 4-[(6S)-6-氨基-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1.N-苄基-N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
在0℃下，将NaH(260mg,6.50mmol,60％)以多份添加至N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(1.00g,2.23mmol)于DMF(5mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下经30min向上述混合物中逐滴添加苄基溴(795mg,4.56mmol)。将所得混合物在26℃下搅拌1h。通过在0℃下添加水(30mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物。浓缩所收集级分，得到褐色固体形式的N-苄基-N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):521[M+H]+。
步骤2.N-苄基-N-[(6S)-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-苄基-N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(925mg,1.69mmol)和HCl溶液(1mL,4M于二噁烷中)于二噁烷(3mL)中的溶液在100℃下搅拌15min。将混合物冷却至25℃并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物。浓缩所收集级分，得到褐色油状物形式的N-苄基-N-[(6S)-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):407,409[M+H]+。
步骤3.(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐
将N-苄基-N-[(6S)-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(632mg,1.49mmol)和m-CPBA(1.31g,7.46mmol)于DCM(20mL)中的溶液在25℃下搅拌16h。通过添加Na2SO3(饱和水溶液，30mL)和NaHCO3(饱和水溶液，30mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐。MS(ESI,m/z):423,425[M+H]+。
步骤4.(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐
将(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-氯-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐(470mg,1.06mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.04g,5.58mmol)和DIEA(0.990mL,5.57mmol)于t-BuOH(5mL)中的溶液在90℃下搅拌10h。在真空下浓缩所得混合物。通过反相色谱法(C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物。浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐。MS(ESI,m/z):573[M+H]+。
步骤5.(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-N,N,N-三甲基-5,6,7,8-四氢喹啉-4-铵的TFA盐
在0℃下，使用三甲基胺溶液(3.63mL,1M于THF中)处理(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-1-鎓-1-醇盐(460mg,0.760mmol)于DCM(9mL)中的溶液，接着在0℃下逐滴添加Tf2O(0.365mL,2.13mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌1h并且然后在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物。浓缩所收集级分，得到浅褐色固体形式的(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-N,N,N-三甲基-5,6,7,8-四氢喹啉-4-铵的TFA盐。MS(ESI,m/z):615[M+H]+。
步骤6. 4-[(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-2-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-N,N,N-三甲基-5,6,7,8-四氢喹啉-4-铵的TFA盐(230mg,0.300mmol)和TBAF溶液(3.30mL,1M于THF中)于DMF(5mL)中的溶液在90℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化混合物。浓缩所收集级分，得到白色固体形式的4-[(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):575[M+H]+。
步骤7. 4-[(6S)-6-氨基-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-[(6S)-6-[苄基[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(100mg,0.170mmol)和碳载钯(100mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛下搅拌3h。过滤出固体并且使用乙酸乙酯(3×10mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到浅褐色固体形式的4-[(6S)-6-氨基-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):351[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备中间体52-1的程序的程序来制备表8中的下列中间体。
表8
中间体53.反式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
步骤1.(2E)-4-甲氧基丁-2-烯酸乙酯
将(2E)-4-溴丁-2-烯酸乙酯(33.0g,171mmol)、Ag2O(39.6g,171mmol)和MeOH(100mL)的混合物在25℃和无光下搅拌12h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内5％至75％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色油状物形式的(2E)-4-甲氧基丁-2-烯酸乙酯。MS(ESI,m/z):145[M+H]+。
步骤2.反式-1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯
在<10℃下，将TFA(0.480mL,4.20mmol)于DCM(2mL)中的溶液添加至(2E)-4-甲氧基丁-2-烯酸乙酯(9.30g,64.5mmol)和苄基(甲氧基甲基)[(三甲基甲硅烷基)甲基]胺(22.9g,96.7mmol)于DCM(400mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌2h。通过添加NH4HCO3(饱和水溶液，150mL)来淬灭反应。使用DCM(3×100mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的反式-1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯。MS(ESI,m/z):278[M+H]+。
步骤3.反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯
将反式-1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯(14.0g,50.4mmol)、Pd(OH)2/C(8.43g,10％)和MeOH(200mL)的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯。MS(ESI,m/z):188[M+H]+。
步骤4.反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-苄基酯3-乙基酯
在0℃下，将CbzCl(9.01mL,64.0mmol)添加至反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸乙酯(8.00g,42.7mmol)和K2CO3(14.7g,106mmol)于乙酸乙酯(100mL)和H2O(100mL)中的混合物中。将混合物在25℃下搅拌1h。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-苄基酯3-乙基酯。MS(ESI,m/z):322[M+H]+。
步骤5.反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸
将反式-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1,3-二甲酸1-苄基酯3-乙基酯(5.00g,15.6mmol)和NaOH(3.11g,77.7mmol)于H2O(40mL)、THF(40mL)和MeOH(40mL)中的溶液在25℃下搅拌2h。在真空下去除溶剂。使用盐酸(3N)将残余物的pH值调节至pH 6。使用乙酸乙酯(3×25mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到黄色油状物形式的反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸。MS(ESI,m/z):294[M+H]+。
步骤6.反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将反式-1-[(苄基氧基)羰基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-甲酸(3.00g,10.2mmol)、DPPA(3.38g,12.3mmol)和Et3N(4.25mL,30.6mmol)于t-BuOH(60mL)中的溶液在80℃下搅拌3h。将混合物冷却至25℃并在真空下浓缩。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内5％至75％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到粗产物。通过硅胶色谱法(使用1:3THF/石油醚洗脱)纯化粗产物，得到无色油状物形式的反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):365[M+H]+。
步骤7.反式-N-[1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
在0℃下，将NaH(59.0mg,1.48mmol,60％)添加至反式-N-[1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(350mg,0.983mmol)于DMF(4mL)中的溶液中。将所得溶液在0℃下搅拌30min。然后在0℃下添加CH3I(0.018mL,0.281mmol)。将所得混合物在25℃下再搅拌2h。使用水(50mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的反式-N-[1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲叔丁基酸酯。MS(ESI,m/z):379[M+H]+。
步骤8.反式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
将反式-N-[1-苄基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(330mg,0.828mmol)和碳载钯(300mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤所得混合物。在减压下浓缩滤液，得到无色油状物形式的反式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):245[M+H]+。
中间体54.顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 1-苄基-4-(羟甲基)吡咯烷-2-酮
在0℃下，将NaBH4(24.0g,634mmol)添加至1-苄基-5-氧代吡咯烷-3-甲酸甲酯(50.0g,214mmol)于乙醇(800mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌4h。使用水(50mL)淬灭反应。在真空下浓缩混合物。使用水(200mL)稀释残余物。使用DCM(3×500mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用10:1二氯甲烷/甲醇洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的1-苄基-4-(羟甲基)吡咯烷-2-酮。MS(ESI,m/z):206[M+H]+。
步骤2. 1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮
在-78℃下，将DAST(32.2mL,244mmol)添加至1-苄基-4-(羟甲基)吡咯烷-2-酮(20.0g,97.5mmol)于DCM(300mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌16h。将反应物倒入冰-水(200mL)中。使用DCM(3×200mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。经由反相色谱法(柱：C18柱；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在45min内0％至50％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮。MS(ESI,m/z):208[M+H]+。
步骤3.反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮
在-78℃下，将LDA溶液(24.0mL,2M于THF中)添加至1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(5.00g,23.6mmol)于THF(100mL)中的溶液中。将所得溶液在-78℃下搅拌1h。然后引入O2。将所得溶液在-78℃下搅拌3h。通过添加水(50mL)来淬灭反应。在真空下去除溶剂。使用DCM(3×100mL)萃取残余物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化残余物，得到褐色油状物形式的反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮。MS(ESI,m/z):224[M+H]+。
步骤4.反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯
在0℃下，将MsCl(2.75mL,35.5mmol)添加至反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮(5.40g,23.7mmol)和Et3N(6.59mL,47.4mmol)于DCM(70mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌2h。通过在0℃下添加水(50mL)来淬灭反应。使用DCM(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，在减压下浓缩，得到褐色油状物形式的反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯。MS(ESI,m/z):302[M+H]+。
步骤5.顺式-3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮
将反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯(6.00g,19.5mmol)和NaN3(3.81g,58.6mmol)于DMF(150mL)中的混合物在100℃下搅拌1h。将混合物冷却至25℃。通过在25℃下添加水(500mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×200mL)萃取所得混合物。使用盐水(300mL)洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的顺式-3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮。MS(ESI,m/z):249[M+H]+。
步骤6.顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(4.00g,15.8mmol)、碳载钯(4.00g,10％)和二碳酸二叔丁酯(6.89g,31.6mmol)于EtOH(100mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):323[M+H]+。
步骤7.顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
在0℃下，将BH3溶液(30mL,1M于THF中)添加至顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(2.40g,7.30mmol)于THF(60mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌16h。在真空下浓缩所得混合物。然后添加EtOH(60mL)、H2O(15mL)和Et3N(15mL)。将所得混合物在80℃下搅拌2h。将所得混合物冷却至25℃并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18柱；流动相A：水(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在30min)内0％至100％)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):309[M+H]+。
步骤8.顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(450mg,1.43mmol)和Pd(OH)2/C(450mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤所得混合物。在减压下浓缩滤液，得到褐色油状物形式的顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):219[M+H]+。
中间体55.反式-N-[4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
步骤1.反式-3-叠氮基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在<10℃下，将NaH(1.91g,47.7mmol,60％)添至反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(5.00g,19.1mmol)于DMF(70mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在<10℃下搅拌30min。然后将1-溴-2-甲氧基乙烷(7.95g,57.2mmol)在<10℃下添加至混合物中。将所得混合物在26℃下搅拌3h。然后通过添加水/冰(70mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩滤液。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在25min内10％至75％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色油状物形式的反式-3-叠氮基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):321[M+H]+。
步骤2.反式-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将反式-3-叠氮基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(5.60g,17.4mmol)和PtO2(2.00g,8.80mmol)于乙酸乙酯(100mL)中的混合物搅在26℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黑色油状物形式的反式-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):295[M+H]+。
步骤3.反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将(Boc)2O(5.45g,25.0mmol)添加至反式-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(5.00g,17.0mmol)和Et3N(7.08mL,70.0mmol)于THF(70mL)和H2O(70mL)中的溶液中。将所得溶液在26℃下搅拌3h。在真空下去除THF。使用乙酸乙酯(3×100mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):395[M+H]+。
步骤4.反式-N-[4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.60g,4.06mmol)和碳载钯(1.60g,10％)于乙酸乙酯(30mL)中的混合物在26℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到浅黄色油状物形式的反式-N-[4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):261[M+H]+。
中间体56.N-[(3S,4S)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
步骤1.(3S,4S)-3-叠氮基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在0℃下，将氢化钠(688mg,17.2mmol,60％)添加至(3S,4S)-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(3.00g,11.44mmol)、2-溴丙烷(10.7mL,113mmol)和KI(3.80g,2.89mmol)于DMF(100mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在50℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，通过添加H2O/冰(100mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×200mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并且然后在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱，C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％甲酸)和B：ACN(在40min内0％至80％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到无色油状物形式的(3S,4S)-3-叠氮基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):305[M+H]+。
步骤2.(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将(3S,4S)-3-叠氮基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(220mg,0.72mmol)和PtO2(33.0mg,0.150mmol)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到褐色油状物形式的(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):279[M+H]+。
步骤3.(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
将(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(200mg,0.720mmol)、Et3N(0.190mL,1.35mmol)和(Boc)2O(236mg,1.08mmol)于THF(5mL)和水(5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下去除溶剂。使用水(10mL)稀释残余物。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得混合物，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):379[M+H]+。
步骤4.N-[(3S,4S)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(250mg,0.660mmol)和碳载钯(250mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到褐色固体形式的N-[(3S,4S)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):245[M+H]+。
中间体57.N-(2-氯-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯
步骤1.N-[(3Z)-3-[(二甲基氨基)亚甲基]-4-氧代环己基]氨基甲酸苄酯
将N-(4-氧代环己基)氨基甲酸苄酯(10.0g,40.4mmol)和(二甲氧基甲基)二甲基胺(4.80g,40.4mmol)于甲苯(20mL)中的溶液在100℃下搅拌16h。在真空下浓缩所得混合物，得到黄色油状物形式的N-[(3Z)-3-[(二甲基氨基)亚甲基]-4-氧代环己基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):303[M+H]+。
步骤2.N-(2-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯
将胍盐酸盐(3.45g,36.1mmol)和乙醇钠(2.47g,36.3mmol)于乙醇(150mL)中的溶液在23℃下搅拌30min。然后添加N-[(3Z)-3-[(二甲基氨基)亚甲基]-4-氧代环己基]氨基甲酸苄酯(11g,21.8mmol，纯度：60％)。将所得溶液在80℃下搅拌过夜。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1:10MeOH/DCM洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-(2-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯。S(ESI,m/z):299[M+H]+。
步骤3.N-(2-氯-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯
将N-(2-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯(1.85g,6.20mmol)、t-BuNO2(3.72mL,31.0mmol)和CuCl2(4.14g,30.8mmol)于ACN(40mL)中的混合物在60℃下搅拌20min。将反应混合物冷却至25℃并添加二乙醚(20mL)。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物，得到白色固体形式的N-(2-氯-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):318,320[M+H]+。
中间体58. 4-(7-氨基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1.RuCl-(S,S)-Ts-DPEN(六甲基苯)
将N-[(1S,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙基]-4-甲基苯-1-磺酰胺(S,S-Ts-DPEN)(1.09g,3.00mmol)、Et3N(0.90mL,6.47mmol)和[RuCl2(六甲基苯)]2(1.00g,1.50mmol)于DCM(40mL)中的溶液在25℃下搅拌5h。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1:10MeOH/DCM洗脱)纯化残余物，得到红色固体形式的RuCl-(S,S)-Ts-DPEN(六甲基苯)。
步骤2.RuCl-(S,S)-Ts-DPEN-OTf(六甲基苯)
将RuCl-(S,S)-Ts-DPEN(六甲基苯)(1.95g,2.99mmol)和三氟甲磺酸银(0.800g,3.17mmol)于DCM(50mL)中的溶液在25℃下搅拌6h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到褐色固体形式的RuCl-(S,S)-Ts-DPEN-OTf(六甲基苯)。
步骤3. 6-氯-4-甲基吡啶-3-甲酸乙酯
将硫酸(15.6mL,306mmol)添加至6-氯-4-甲基吡啶-3-甲酸(10.0g,58.3mmol)于EtOH(250mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌48h。向反应物中添加NaHCO3于水(500mL)中的饱和溶液。然后蒸发出EtOH。使用DCM(2×500mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:15乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的6-氯-4-甲基吡啶-3-甲酸乙酯。MS(ESI,m/z):200,202[M+H]+。
步骤4. 3-氯-8-羟基-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯
在-78℃下，将LDA溶液(12.5mL,2M于THF中)添加至6-氯-4-甲基吡啶-3-甲酸乙酯(2.00g,10.0mmol)于THF(100mL)中的溶液中。将所得溶液在-78℃下搅拌1h。然后添加丙-2-烯酸甲酯(2.25mL,24.9mmol)并且将反应物在-78℃下搅拌1h。然后使用水(50mL)淬灭反应。在真空中去除THF。使用DCM(3×50mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-氯-8-羟基-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯。MS(ESI,m/z):240,242[M+H]+。
步骤5. 3-氯-8-羟基-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸甲酯
在0℃下，将Et3N(7.62mL,54.8mmol)添加至甲酸(1.89mL,50.1mmol)于MeOH(90mL)中的溶液中。然后添加3-氯-8-羟基-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯(3.00g,12.5mmol)和RuCl-(S,S)-Ts-DPEN-OTf(六甲基苯)(82mg,0.099mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌16h。然后将反应物倒入水(200mL)中。在真空中去除溶剂。使用DCM(3×150mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-氯-8-羟基-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸甲酯。MS(ESI,m/z):242,244[M+H]+。
步骤6. 3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯
将3-氯-8-羟基-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸甲酯(0.500g,2.07mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(0.750g,4.03mmol)、RuPhos Pd G3(100mg,0.120mmol)、RuPhos(62.0mg,0.140mmol)和Cs2CO3(2.00g,6.16mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在95℃下搅拌16h。4个批次的这个反应并行实施。在冷却至室温后，将4批反应混合物倒入水(100mL)中。使用乙酸酰基酯(3×100mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:4乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯)。MS(ESI,m/z):374[M+H]+。
步骤7. 3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯
将3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6-二氢异喹啉-7-甲酸甲酯(550mg,1.47mmol)和碳载钯(500mg,10％)于乙酸乙酯(20mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到白色固体形式的3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸甲酯。MS(ESI,m/z):376[M+H]+。
步骤8. 3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸
将LiOH(200mg,8.35mmol)于水(20mL)中的溶液添加至3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸甲酯(500mg,1.33mmol)于THF(20mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌2h。在真空下浓缩所得溶液。经由反相色谱法(柱：X Bridge C18,19×150mm,5um；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在25min内0％至30％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到白色固体形式的3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸。MS(ESI,m/z):362[M+H]+。
步骤9. 4-(7-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将3-[4-[(叔丁氧基)羰基]哌嗪-1-基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-甲酸(400mg,1.11mmol)、DPPA(476mL,2.20mmol)和Et3N(0.460mL,3.72mmol)于甲苯(6mL)中的溶液在25℃下搅拌2h并且然后在70℃下搅拌2h。然后添加苄基醇(1.14mL,11.0mmol)。将所得溶液在70℃下搅拌2h。在冷却至室温后，然后将反应物倒入水(30mL)中。使用乙酸酰基酯(3×20mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到无色油状物形式的4-(7-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):467[M+H]+。
步骤10. 4-(7-氨基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(7-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(200mg,0.430mmol)和K3PO4(228mg,1.07mmol)于DMA(5mL)中的混合物在90℃下搅拌1h。在冷却至室温后，经由反相色谱法(柱：X Bridge C18,19×150mm,5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内10％至50％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到白色固体形式的4-(7-氨基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):333[M+H]+。
中间体59.N-[1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
步骤1. 1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-(2-羟乙基)酯
使用迪安-斯塔克管(Dean-Stark tube)，将4-氧代吡咯烷-1,3-二甲酸1-苄基酯3-乙基酯(5.00g,17.2mmol)、乙烷-1,2-二醇(3.20g,51.5mmol)和PTSA(296mg,1.72mmol)于甲苯(100mL)中的混合物在110℃下搅拌3h。将混合物冷却至27℃并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内5％至55％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-(2-羟乙基)酯。MS(ESI,m/z):352[M+H]+。
步骤2. 7-[(苄基氧基)羰基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸
将1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-(2-羟乙基)酯(2.80g,7.96mmol)和氢氧化钠(199mg,4.98mmol)于MeOH(40mL)、THF(40mL)和H2O(40mL)中的混合物在28℃下搅拌2h。在真空下去除THF和MeOH。使用HCl(1M)将所得混合物酸化至pH7-8，并且然后在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内5％至30％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的7-[(苄基氧基)羰基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸。MS(ESI,m/z):308[M+H]+。
步骤3. 9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯
在0℃下，将DPPA(632mg,2.30mmol)添加至7-[(苄基氧基)羰基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸(600mg,1.91mmol)和Et3N(0.398mL,2.87mmol)于t-BuOH(10mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在90℃下搅拌2h。冷却混合物。在真空下浓缩所得混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：H2O(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化混合物，得到黄色油状物形式的9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):379[M+H]+。
步骤4.N-[1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯(200mg,0.518mmol)和Pd/C(200mg,10％)于EtOAc(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛下搅拌2h。过滤所得混合物，并且使用乙酸乙酯(3×5mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到褐色N-[1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):245[M+H]+。
式(I)化合物的合成实施例：
实施例1-1.(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例1-2.(S)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(3-氨基色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯中间体12(130mg,0.27mmol)、EDCI(81mg,0.42mmol)、HOBt(57mg,0.42mmol)、DIEA(108mg,0.84mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(58mg,0.28mmol)于DMF(5mL)中的溶液在室温下搅拌18h。使用20mL水淬灭反应并使用EtOAc(50mL×3)萃取。合并的有机层用盐水(30mL×2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×50mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在13min内40％B至60％B)纯化，得到4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
步骤2.(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯和(S)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Lux cellulose-4,0.46×5cm,3μm；流动相：己烷(0.1％Et2NH):EtOH＝60:40，6min)分离4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，得到如下标题化合物：黄色固体形式的(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(第一洗脱异构体，RT＝3.87min，假定立体化学)和黄色固体形式的(S)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(第二洗脱异构体，RT＝4.74min，假定立体化学)。
步骤3.(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸酯(6mg,0.01mmol)和TFA(0.5mL)于CH2Cl2(2mL)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×50mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在13min内5％B至30％B)纯化残余物，得到黄色固体形式的(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,1H),6.95(d,J＝8.4Hz,1H),6.54-6.56(m,1H),6.41(d,J＝2.4Hz,1H),4.40-4.47(m,1H),4.21-4.24(m,1H),3.88-3.93(m,1H),3.07-3.12(m,4H),2.95-3.02(m,5H),2.82-2.88(m,1H),2.62(s,3H)。MS:(ESI,m/z):424[M+H]+。
步骤4.(S)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将类似于步骤3的程序应用于(S)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸酯(8mg,0.02mmol)，得到白色固体形式的(S)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,300MHz)δ(ppm):8.18(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝8.7Hz,1H),6.96(d,J＝8.7Hz,1H),6.54-6.58(m,1H),6.41(d,J＝2.1Hz,1H),4.39-4.86(m,1H),4.22-4.25(m,1H),3.88-3.96(m,1H),3.04-3.10(m,5H),2.89-3.02(m,4H),2.81-2.87(m,1H),2.63(s,3H)。MS:(ESI,m/z):424[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例1-1和1-2的程序的程序来制备表9中的下列实施例。
表9：
15程序注意事项：在步骤1中，使用胺中间体15-3和羧酸中间体24。通过手性HPLC使用手性柱Chiral Art Cellulose-SB和流动相10％IPA/MTBE来分离对映异构体，提供实施例1-37前体作为第一洗脱异构体并提供实施例1-38前体作为第二洗脱异构体。
16程序注意事项：在步骤1中，使用羧酸中间体24。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak ID-2和流动相40％EtOH/己烷来分离对映异构体，提供实施例1-39前体作为第一洗脱异构体并提供实施例1-40前体作为第二洗脱异构体。
17程序注意事项：在步骤1中，使用胺中间体15-3。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IG和流动相50％EtOH/己烷来分离对映异构体，提供实施例1-41前体作为第一洗脱异构体并提供实施例1-42前体作为第二洗脱异构体。
实施例2-1. 3-氨基-N-((3R)-7-(9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 7-((R)-3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
将(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯中间体2(400mg,1.08mmol)、9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯中间体32(288mg,1.06mmol)、Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(90mg,0.11mmol)、Xphos(105mg,0.22mmol)和Cs2CO3(1.076g,3.30mmol)于甲苯(40mL)中的混合物在100℃下搅拌16h。在冷却至室温后，使用水(40mL)淬灭反应并使用EtOAc(40mL×3)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:4EtOAc/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的7-((R)-3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):544[M+H]+。
步骤2. 7-((R)-3-氨基色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
将7-((R)-3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯(110mg,0.19mmol)和Pd/C(20mg,10％)于EtOAc(10mL)中的混合物在30℃和氢气氛下搅拌2h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色固体形式的7-((R)-3-氨基色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):410[M+H]+。
步骤3. 7-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯
将7-((R)-3-氨基色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯(70mg,0.16mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(43mg,0.20mmol)、HOBt(45mg,0.33mmol)、EDCI(65mg,0.34mmol)和DIEA(66mg,0.51mmol)于DMF(15mL)中的溶液在室温下搅拌16h。通过添加25mL水来淬灭反应。使用EtOAc(30mL×3)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的7-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):600[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-((3R)-7-(9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将7-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-甲酸叔丁酯(50mg,0.08mmol)和TFA(1mL)于CH2Cl2(3mL)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。将残余物溶于NH3(7M于MeOH中)(5mL)中并搅拌1h。浓缩混合物并通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×250mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在7min内30％B至50％B)纯化粗产物，得到黄色固体形式的3-氨基-N-((3R)-7-(9,9-二氟-3,7-二氮杂双环[3.3.1]壬烷-3-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,300MHz)δ(ppm):8.19(d,J＝8.1Hz,1H),7.29(d,J＝8.4Hz,1H),6.99(d,J＝8.4Hz,1H),6.64(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),6.48(s,1H),4.41-4.48(m,1H),4.21-4.25(m,1H),3.82-3.96(m,3H),3.35-3.37(m,2H),3.13-3.19(m,4H),2.80-2.98(m,2H),2.63(s,3H),2.15-2.18(m,2H)。MS:(ESI,m/z):500[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例2-1的程序的程序来制备表10中的下列实施例。
表10：
27程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体11-2至11-5。使用Pd2(dba)3/Xphos作为催化剂/配体系统。
28程序注意事项：在步骤1中，使用胺中间体49。在偶联反应中，使用Xphos Pd G3作为催化剂系统，使用Cs2CO3作为碱，并且使用1,4-二噁烷作为溶剂。在步骤3中，使用于DMA中的HATU和Et3N在50℃下实现酰胺偶联。在步骤4中，使用于二噁烷/EtOAc中的HCl实现boc脱保护。
实施例3-1. 3-氨基-N-((R)-7-((3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例3-2. 3-氨基-N-((R)-7-((3R,4R)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法1.
步骤1.((3R)-7-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
将(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯中间体2(170mg,0.47mmol)、N-(4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯中间体35(100mg,0.46mmol)、RuPhos Pd G3(38mg,0.05mmol)、RuPhos(23mg,0.05mmol)和Cs2CO3(300mg,0.92mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在95℃下搅拌2h。在冷却至室温后，将反应物倒入水(20mL)中。使用DCM(2×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶柱(使用1:1EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到白色固体形式的((3R)-7-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):498[M+H]+。
步骤2.(1-((R)-3-氨基色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将((3R)-7-(3-((叔丁氧基羰基)氨基)-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(80mg,0.16mmol)和Pd/C(80mg,10％)于EtOAc(5mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌3h。过滤掉固体并使用EtOAc(10mL×3)洗涤。在真空下浓缩滤液，得到无色油状物形式的(1-((R)-3-氨基色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):364[M+H]+。
步骤3.(1-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯
将(1-((R)-3-氨基色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(40mg,0.11mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(23mg,0.11mmol)、Et3N(39mg,0.39mmol)和HBTU(50mg,0.13mmol)于DMA(2mL)中的溶液在室温下搅拌30min。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在10min内10％至80％B)纯化，得到白色固体形式的(1-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):554[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-((3R)-7-(3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(1-((R)-3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(45mg,0.08mmol)和TFA(1mL)于CH2Cl2(3mL)中的溶液在室温下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在10min内10％至80％B)纯化粗产物，得到无色油状物形式的3-氨基-N-((3R)-7-(3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS:(ESI,m/z):454[M+H]+。
步骤5.氨基-N-((R)-7-((3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和3-氨基-N-((R)-7-((3R,4R)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IE,2×25cm,5μm；流动相：50％EtOH/MTBE(0.1％Et2NH)，28min；流速：16mL/min)分离3-氨基-N-((3R)-7-(3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(35mg,0.077mmol)的外消旋混合物，得到如下标题化合物：
黄色固体形式的氨基-N-((R)-7-((3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(第一洗脱异构体，RT＝13.5min)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.4Hz,1H).7.49(br s,1H),7.31(d,J＝8.1Hz,1H),7.21(br s,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.12-6.08(br s,1H),5.91(s,1H),4.31-4.21(m,1H),4.16-4.11(m,1H),3.79(t,J＝9.9Hz,1H),3.63-3.62(m,1H),3.51-3.46(m,1H),3.42-3.32(m,2H),2.93(s,3H),3.13-3.09(m,1H),2.91-2.82(m,3H),2.58(s,3H),2.12-1.96(m,2H)。MS:(ESI,m/z):454[M+H]+；
和黄色固体形式的氨基-N-((R)-7-((3R,4R)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(第二洗脱异构体，RT＝20.2min)。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.1Hz,1H).7.49(br s,1H),7.31(d,J＝8.1Hz,1H),7.21(br s,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),6.11-6.08(br s,1H),5.91(s,1H),4.31-4.21(m,1H),4.16-4.11(m,1H),3.79(t,J＝9.9Hz,1H),3.63-3.62(m,1H),3.51-3.46(m,1H),3.42-3.32(m,2H),2.93(s,3H),3.13-3.09(m,1H),2.91-2.81(m,3H),2.58(s,3H),2.12-1.96(m,2H).MS:(ESI,m/z):454[M+H]+。
实施例3-1. 3-氨基-N-((R)-7-((3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法2.
还可使用类似于方法1的程序从((3S,4S)-4-甲氧基吡咯烷-3-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体36)来制备氨基-N-((R)-7-((3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺，其中无需步骤5的手性分离。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例3-1和3-2的方法1的程序来制备表11中的下列实施例。
表11：
8程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体50。使用预催化剂tBuXphos Pd G3并且使用于DMSO中的膦氮烯碱P2-Et在25℃下实现偶联反应。在步骤5中，使用手性柱Chiralpak IC和流动相50％EtOH/己烷(0.1％Et2NH)实施手性分离。
实施例6-1.(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸
步骤1.(R)-1-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯
将(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯中间体2(200mg,0.52mmol)、哌啶-4-甲酸乙酯(130mg,0.79mmol)、RuPhos Pd G3(44mg,0.05mmol)、RuPhos(24mg,0.05mmol)和Cs2CO3(513mg,1.57mmol)于甲苯(30mL)中的混合物在90℃下搅拌2h。在冷却至室温后，过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶柱(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的(R)-1-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯。MS:(ESI,m/z):439[M+H]+。
步骤2.(R)-1-(3-氨基色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯
将(R)-1-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯(180mg,0.32mmol)和Pd/C(50mg,10％)于EtOAc(5mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌2h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的(R)-1-(3-氨基色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯。MS:(ESI,m/z):305[M+H]+。
步骤3.(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯
将(R)-1-(3-氨基色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯(110mg,0.33mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(107mg,0.49mmol)、Et3N(99mg,0.98mmol)和HBTU(185mg,0.49mmol)于DMA(5mL)中的溶液在室温下搅拌2h。然后通过添加5mL水来淬灭反应。使用EtOAc(3×10mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(2×30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶柱(使用1:1EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯。MS:(ESI,m/z):495[M+H]+。
步骤4.(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸
将(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸乙酯(40mg,0.07mmol)和LiOH(1.6mg,0.07mmol)于THF(2mL)和水(0.5mL)中的混合物在室温下搅拌16h。在真空下浓缩所得混合物。使用水(5mL)稀释残余物并使用3N HCl水溶液将pH调节至4。使用DCM(3×10mL)洗涤所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridgeShield RP18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在7min内5％B至65％B)纯化，得到黄色固体形式的(R)-1-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)色烷-7-基)哌啶-4-甲酸。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H).7.53(br s,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.22(br s,2H),6.91(d,J＝8.7Hz,1H),6.52(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),6.32(s,1H),4.32-4.24(m,1H),4.16-4.12(m,1H),3.80(t,J＝9.9Hz,1H),3.57-3.52(m,2H),2.86-2.82(m,2H),2.73-2.65(m,2H),2.58(s,3H),2.50-2.28(m,1H),1.91-1.84(m,2H),1.69-1.57(m,2H)。MS:(ESI,m/z):467[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例6-1的程序的程序来制备表13中的下列实施例。
表13：
2程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体9。
实施例7-1.(R)-3-氨基-N-(7-(4-羟基哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.(R)-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯
将(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯中间体2(200mg,0.55mmol)、4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶中间体39(142mg,0.66mmol)、RuPhos Pd G3(46mg,0.05mmol)、RuPhos(26mg,0.06mmol)和Cs2CO3(539mg,1.65mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在100℃下搅拌3h。在冷却至室温后，过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶柱(使用1:3 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的(R)-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):497[M+H]+。
步骤2.(R)-7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-胺
将(R)-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(170mg,0.34mmol)和Pd/C(170mg,10％)于EtOAc(6mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌2h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色固体形式的(R)-7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-胺。MS:(ESI,m/z):363[M+H]+。
步骤3.(R)-3-氨基-N-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-胺(100mg,0.28mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(63mg,0.30mmol)、Et3N(84mg,0.83mmol)和HBTU(157mg,0.41mmol)于DMA(5mL)中的溶液在室温下搅拌30min。然后通过添加10mL水来淬灭反应。使用CH2Cl2(3×15mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(3×15mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过硅胶柱(使用1:1 EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到黄色固体形式的(R)-3-氨基-N-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS:(ESI,m/z):553[M+H]+。
步骤4.(R)-3-氨基-N-(7-(4-羟基哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-3-氨基-N-(7-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(30mg,0.05mmol)和HCl(4N于二噁烷中)(1mL)于CH2Cl2(3mL)中的溶液在室温下搅拌10min。使用NaHCO3饱和水溶液将pH调节至8。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,30×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在7min内15％B至50％B)纯化，得到白色固体形式的(R)-3-氨基-N-(7-(4-羟基哌啶-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.52(br s,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.22(brs,2H),6.91(d,J＝8.4Hz,1H),6.51(dd,J＝2.4,8.4Hz,1H),6.31(s,1H),4.65(br s,1H),4.29-4.26(m,1H),4.17-4.13(m,1H),3.80(t,J＝9.9Hz,1H),3.64-3.58(m,1H),3.48-3.44(m,2H),2.87-2.73(m,4H),2.59(s,3H),1.80-1.76(m,2H),1.48-1.43(m,2H)。MS:(ESI,m/z):439[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例7-1的程序的程序来制备表14中的下列实施例。
表14：
2程序注意事项：在步骤1中，使用外消旋溴化物中间体8、胺中间体45并使用Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2/Xphos作为催化剂/配体系统。使用于DMF中的EDCI、HOBt和DIEA实施酰胺化。在步骤4后，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IA和流动相90％MeOH/DCM(0.1％Et2NH)分离外消旋物，得到第一洗脱样品(其为2种异构体的混合物)；实施例7-5，作为第二洗脱样品(假定立体化学)；和实施例7-7，作为第三洗脱样品(假定立体化学)。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IC和流动相30％EtOH/MTBE(0.1％Et2NH)进一步分离2种异构体的混合物，提供实施例7-4作为第一洗脱异构体并提供实施例7-6作为第二洗脱异构体(假定立体化学)。
3程序注意事项：在步骤1中，使用外消旋溴化物中间体8、胺中间体46并使用Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2/Xphos作为催化剂/配体系统。使用于DMF中的EDCI、HOBt和DIEA实施酰胺化。在步骤4后，通过手性HPLC使用手性柱EnantioCel-C1and流动相25％EtOH/己烷(0.1％Et2NH)分离外消旋物，得到第一洗脱样品1(其为两种异构体的混合物)和第二洗脱样品2(其为两种异构体的混合物)。通过SFC使用手性柱EnantioPak A1-5和流动相50％CO2/MeOH(0.1％iPrNH2)进一步分离两种样品中的每一者以从样品1提供实施例7-8作为第一洗脱异构体并提供实施例7-9作为第二洗脱异构体；并且从样品2提供实施例7-10作为第一洗脱异构体并提供实施例7-11作为第二洗脱异构体(假定立体化学)。
实施例10-1.(R)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体5-1，500mg,1.32mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(294mg,1.58mmol)、Pd(dppf)Cl2-CH2Cl2(106mg,0.13mmol)、Xphos(63mg,0.13mmol)和Cs2CO3(1.3g,3.99mmol)于甲苯(15mL)中的混合物在95℃下于密封管中搅拌过夜。在冷却至室温后，过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):486[M+H]+。
步骤2.(R)-4-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(4.9g,10.10mmol)和Pd/C(0.5g,10％)于EtOAc(100mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌1h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的(R)-4-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):352[M+H]+。
步骤3.(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-氨基-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(3.5g,9.96mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(2.5g,12.01mmol)、Et3N(3.0g,29.65mmol)和HBTU(4.5g,11.87mmol)于DMA(30mL)中的溶液在室温下搅拌30min。通过添加60mL水来淬灭反应。使用CH2Cl2(50mL×3)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在30min内0％至100％B；流速：90mL/min)纯化，得到灰白色固体形式的(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):542[M+H]+。
步骤4.(R)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30mg,0.05mmol)和TFA(1mL)于CH2Cl2(2mL)中的溶液在室温下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×50mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在7min内25％B至75％B)纯化粗产物，得到黄色固体形式的(R)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝9MHz,1H),7.58(d,J＝9MHz,1H),7.31(d,J＝6MHz,1H),7.22(s,2H),6.43-6.40(m,1H),6.17(s,1H),4.40-4.20(m,1H),4.19-4.12(m,1H),3.89-3.82(m,1H),3.32(s,1H),3.01-2.97(m,4H),2.80-2.74(m,6H),2.58(s,3H)。MS:(ESI,m/z):442[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例10-1的程序的程序来制备表15中的下列实施例。
表15：
2程序注意事项：在步骤1中，使用RuPhos Pd G3/RuPhos作为催化剂/配体系统。
3程序注意事项：在步骤1中，使用(S)-(7-溴-5-氟色烷-3-基)氨基甲酸苄酯。
4程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体21。
5程序注意事项：在步骤4中，使用于MeOH中的NH3处理粗产物，得到游离碱，然后通过制备型HPLC纯化。
6程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体19。
7程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体22。
8程序注意事项：在Cbz脱保护(步骤2)之前，通过使用NaH(2当量)和MeI(1.5当量)在25℃下于DMF中处理来对氨基甲酸酯实施甲基化。使用水淬灭反应并使用EtOAc实施萃取后处理，接着通过硅胶色谱法纯化，得到相应4-(3-[[(苄基氧基)羰基](甲基)氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):500[M+H]+。
实施例11-1.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例11-2.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法1.
步骤1. 3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯中间体8(2g,5.55mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.171g,5.52mmol)、Pd(dppf)Cl2(404.96mg,0.55mmol)、Xphos(527mg,1.11mmol)、Cs2CO3(5.3g,16.28mmol)于甲苯(40mL)中的混合物在100℃下搅拌过夜。在冷却至室温后，在真空下浓缩反应混合物。通过硅胶色谱法(使用1:100至2:5EtOAc/石油醚的梯度洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):492[M+H]+。
步骤2. 3-(6-氨基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.4g,2.85mmol)和Pd/C(1.4g,13.16mmol)于乙醇(30mL)中的混合物在室温和氢气氛下搅拌1h。过滤掉固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:10MeOH/CH2Cl2洗脱)纯化，得到黄色固体形式的3-(6-氨基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):358[M+H]+。
步骤3. 3-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(175mg,0.84mmol)、3-(6-氨基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(300mg,0.84mmol)、EDCI(193mg,1.01mmol)、HOBt(136mg,1.01mmol)、DIEA(325mg,2.52mmol)于DMF(20mL)中的混合物在20℃下搅拌18h。使用水(50mL)稀释反应混合物并使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3EtOAc/石油醚洗脱)纯化，得到3-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):548[M+H]+。
步骤4. 3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：(R,R)-WHELK-O1-Kromasil,0.5×25cm,5μm；流动相：MeOH；检测器：UV 190nm至500nm)分离3-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的外消旋混合物，得到如下标题化合物：白色固体形式的3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(第一洗脱异构体，RT＝15.5min)和白色固体形式的3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(第二洗脱异构体，RT＝20.4min)。
步骤5.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(70mg,0.13mmol)和TFA(7mL)于DCM(28mL)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下浓缩反应混合物。使用5mL DCM稀释所得溶液。使用NH3(于MeOH中的溶液)将溶液的pH值调节至8。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在8min内5％B至52％B)纯化，得到灰白色固体形式的N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),6.65(d,J＝8.4Hz,1H),6.58(s,1H),4.24-4.23(m,1H),3.63-3.60(m,2H),3.45-3.41(m,2H),3.02-2.68(m,6H),2.64(s,3H),2.14-2.08(m,1H),1.92-1.75(m,5H)。MS:(ESI,m/z):449[M+H]+。
步骤6.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(70mg,0.13mmol)和TFA(7mL)于DCM(28mL)中的溶液在室温下搅拌1h。在真空下浓缩反应混合物。使用5mL DCM稀释所得溶液。使用NH3(7M于MeOH中)将溶液的pH值调节至8。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在8min内5％B至52％B)纯化，得到灰白色固体形式的N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),6.93(d,J＝8.4Hz,1H),6.66(d,J＝8.4Hz,1H),6.59(s,1H),4.26-4.17(m,1H),3.65-3.61(m,2H),3.45-3.39(m,3H),3.00-2.71(m,6H),2.64(s,3H),2.12-2.09(m,1H),1.91-1.75(m,5H)。MS:(ESI,m/z):449[M+H]+。
实施例11-1.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法2.
还可根据方法1从(S)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体9)起始并跳过步骤4手性分离来制备N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。
实施例11-2.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法2.
还可根据方法1从(R)-(6-溴-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(中间体10)起始并跳过步骤4手性分离来制备N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。
使用标准化学操作和类似于制备实施例11-1和11-2的方法1(或根据指示的方法2)的程序来制备表16中的下列实施例。
表16：
7程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体44并使用Ruphos Pd G3作为催化剂。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Cellulose SB和0％至5％EtOH/MTBE(0.1％Et2NH)的洗脱剂梯度分离4种对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
8程序注意事项：在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak ID和流动相MeOH来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
9程序注意事项：在Boc脱保护后而非在步骤4中通过手性HPLC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-4和流动相50％EtOH/己烷来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
10程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体26。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-4和流动相50％EtOH/己烷来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
11程序注意事项：在步骤1中，使用N-甲基-N-[(3S)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IA和流动相35％EtOH/己烷来分离对映异构体。任意指定四氢萘酰胺处的立体化学。
12程序注意事项：在步骤1中，使用N-甲基-N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱(R,R)-Whelk-O1-Kromasil和流动相30％DCM/EtOH来分离对映异构体。任意指定四氢萘酰胺处的立体化学。
13程序注意事项：在步骤1中，使用(1S,4S)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯并使用Ruphos Pd G3作为催化剂。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱ChiralpakID和60％至65％MeOH/DCM的洗脱剂梯度来分离对映异构体。任意指定四氢萘酰胺处的立体化学。
14程序注意事项：在步骤1中，使用(1R,4R)-2,5-二氮杂双环[2.2.1]庚烷-2-甲酸叔丁酯并使用Ruphos Pd G3作为催化剂。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱ChiralpakAD-H-SL001和流动相40％IPA/己烷(0.1％Et2NH)来分离对映异构体。任意指定四氢萘酰胺处的立体化学。
15程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体24。在步骤4中，通过SFC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-4和流动相60％EtOH/己烷来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
16程序注意事项：使用实施例11的方法2。在步骤1中，使用Ruphos Pd G3作为催化剂。
17程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体11-1。在步骤4中，通过SFC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-4和流动相50％CO2/EtOH:ACN(1:1)来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
18程序注意事项：在步骤1中，使用溴化物中间体11-1并使用Ruphos Pd G3作为催化剂。在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Phenomenex Lux 5μm Cellulose-4和流动相50％EtOH/己烷来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
实施例14-1.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
实施例14-2.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
实施例14-3.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-7-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例14-4.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-7-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.外消旋3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-1-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和外消旋3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
向250mL圆底烧瓶中添加3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.2g,2.44mmol)和DCM(96mL)。此后接着在搅拌和0℃下逐滴添加NBS(478mg,2.69mmol)于DCM(24mL)中的溶液。将所得溶液在20℃下搅拌2h，然后通过添加水(20mL)淬灭。使用DCM(3×30mL)萃取所得溶液。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到残余物，通过使用乙酸乙酯/石油醚(PE/EA＝100:1至5:1)洗脱的硅胶色谱法纯化残余物，得到黄色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物。MS:(ESI,m/z):572[M+H]+。
步骤2.外消旋3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
向使用惰性氮气氛吹扫并维持所述气氛的20mL密封管中添加3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-溴-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(460mg,0.81mmol)、Zn(CN)2(93mg,0.80mmol)、Pd(PPh3)4(93mg,0.08mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(9mL)的混合物。使用微波将所得混合物在120℃下辐照1h。将反应物冷却至室温并通过添加20mL水淬灭。使用乙酸乙酯(3×15mL)萃取所得溶液。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到残余物，通过硅胶色谱法纯化残余物并使用100:1至2:1乙酸乙酯/石油醚洗脱，得到黄色油状物形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物。MS:(ESI,m/z):517[M+H]+。
步骤3.外消旋3-(6-氨基-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和外消旋3-(6-氨基-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
向使用氮气吹扫并维持所述气氛的50mL圆底烧瓶中添加3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(300mg,0.58mmol)、乙醇(20mL)和钯碳(300mg)的混合物。将所得悬浮液在20℃和氢气氛下搅拌1h。通过硅藻土过滤去除固体并在真空下浓缩滤液，得到粗制残余物，通过硅胶色谱法纯化并使用DCM/甲醇(DCM/MeOH＝10:1)洗脱，得到黄色油状物形式的3-(6-氨基-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-氨基-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物。MS:(ESI,m/z):383[M+H]+。
步骤4. 3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰A，对映异构体1)；
3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰A，对映异构体2)；
3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰B，对映异构体1)；
3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰B，对映异构体2)。
向100mL圆底烧瓶中放置3-(6-氨基-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-氨基-3-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(150mg,0.39mmol)、EDCI(90mg,0.47mmol)、HOBt(63mg,0.47mmol)、DIEA(152mg,1.18mmol)、N,N-二甲基甲酰胺(10mL)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(98mg,0.47mmol)的混合物。将所得溶液在20℃下搅拌2h，然后通过添加20mL水淬灭。通过过滤收集固体，并通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相：水(10mM NH4HCO3),ACN(在7min内55％ACN至最高70％))纯化固体。
然后通过手性HPLC(柱：Chiralpak OD-H,5μm,20×250mm；流动相A：己烷，B：EtOH,50％B)进一步纯化此混合物。这产生单一区域异构体峰A：(RT＝8.45min)和单一区域异构体峰B：(RT＝12.91min)。
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IC,5μm,20×250mm；流动相A：己烷，B：EtOH,50％B)进一步纯化峰A。这产生黄色固体形式的峰A/对映异构体1:(RT＝15.55min)和黄色固体形式的峰A/对映异构体2：(RT＝21.10min)。任意指定所分离峰A对映异构体的立体化学。MS(对于两种对映异构体)：(ESI,m/z):573[M+H]+。
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IB,5μm,20×250mm；流动相A：己烷，B：EtOH,50％B)进一步纯化峰B。这产生黄色固体形式的峰B/对映异构体1：(RT＝7.65min)和黄色固体形式的峰B/对映异构体2：(RT＝9.22min)。任意指定所分离峰B对映异构体的立体化学。MS(对于两种对映异构体)：(ESI,m/z):573[M+H]+。
步骤5.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-7-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-7-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
第一异构体的代表性程序和光谱：
向50mL圆底烧瓶中添加3-[(6R)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1-氰基-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(30mg,0.05mmol)、DCM(5mL)和TFA(1mL)。将所得溶液在20℃下搅拌1h，然后在真空下浓缩，得到粗制残余物，使用5mL DCM稀释所述残余物。使用于MeOH中的NH3(7M)将溶液的pH调节至8，然后在真空下将所得混合物浓缩成残余物，通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD Prep柱,5μm,19×150mm；流动相：水(10mmol NH4HCO3),ACN(在7min内35％ACN至最高56％))纯化，得到浅黄色固体形式的N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(400MHz,MeOH-d4)δ(ppm):8.20(d,J＝8.3Hz,1H),7.29-7.30(m,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),4.21-4.24(m,1H),3.55(s,2H),3.20-3.27(m,2H),2.91-3.19(m,5H),2.79-2.80(m,1H),2.64(s,3H),2.18-2.20(m,3H),1.79-1.94(m,3H)。MS:(ESI,m/z):473[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例14-1的程序的程序来制备表18中的下列实施例。
表18
1程序注意事项：在步骤1中，仅观察到一种溴化区域异构体，即4-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-1-溴-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
2程序注意事项：在步骤5之后而非在步骤4中使用手性柱Chiralpak IA和流动相50％EtOH/己烷(0.1％Et2NH)来手性分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
3程序注意事项：在步骤4中，使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。在步骤5之后而非在步骤4中使用手性柱Chiralpak IE和流动相20％IPA/MTBE(0.1％Et2NH)来手性分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
4程序注意事项：在步骤4中，使用羧酸中间体24。使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。在步骤5之后而非在步骤4中使用手性柱Chiralpak IA和流动相40％EtOH/己烷-DCM(5:1)(0.1％Et2NH)来手性分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
5程序注意事项：在步骤4中，使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。在步骤5之后而非在步骤4中使用手性柱Chiralpak IG和流动相30％EtOH/MTBE(含有于MeOH中的8mM NH3)来手性分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
6程序注意事项：在步骤4中，使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IC和流动相15％EtOH/MTBE来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
7程序注意事项：在步骤4中，使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IG和流动相30％EtOH/MTBE来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
8程序注意事项：在步骤4中，使用羧酸中间体24。使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IG和流动相30％EtOH/MTBE来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
9程序注意事项：在步骤2中，在Zn(2当量)、Zn(CN)2(10当量)、Pd(P(t-Bu)3)2(0.5当量)和4,4'-二叔丁基-2,2'-联吡啶(1当量)存在下于DMA中实现氰化，其中在97℃下加热2h。
10程序注意事项：在步骤4中，使用HBTU和Et3N在DMA中实施酰胺偶联反应。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak ID-2和流动相15％EtOH/MTBE(0.1％Et2NH)来分离对映异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
实施例21-1.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
将3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(800mg,1.63mmol)和Selectfluor(634mg,1.79mmol)于ACN(16mL)中的溶液在20℃下搅拌18h。通过添加30mL水来淬灭反应。使用3×10mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1％-50％EtOAC/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的区域异构体3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物。MS:(ESI,m/z):510[M+H]+。
步骤2. 3-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-氨基-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
将3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(508mg,1.00mmol)和碳载钯(100mg,10％)于乙酸乙酯(100mL)中的浆液在20℃和氢气氛下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用1％-50％MeOH/DCM洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的区域异构体3-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-氨基-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物。MS:(ESI,m/z):376[M+H]+。
步骤3. 3-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
将3-(6-氨基-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(150mg,0.40mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(99mg,479.45mmol)、EDCI(92mg,0.48mmol)、HOBt(65mg,0.48mmol)和DIEA(155mg,1.20mmol)于DMF(5mL)中的溶液在20℃下搅拌2h。通过添加20mL水来淬灭反应。通过过滤收集固体并通过制备型HPLC(柱：XBridge BEH C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(10mMNH4HCO3)，B：ACN(在7min内60％ACN至80％))纯化粗产物，得到标题化合物的混合物。
手性分离.通过手性HPLC(柱：Chiralpak IA,250×20mm,5um；流速：15mL/min；流动相10％MeOH/MTBE；波长：190nm至500nm)来部分地分离区域异构体和对映异构体的混合物，得到3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(峰1：RT＝7.37min；任意指定立体化学)；白色固体形式的3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰2：RT＝7.69min；任意指定立体化学)；和白色固体形式的3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(峰3：RT＝13.70min；任意指定立体化学)。
通过手性HPLC(柱：Phenomenex Lux 5u Cellulose-4,AXIA Packed,250×21.5mm,5um；流速：18mL/min，流动相：MeOH；波长：190nm至500nm)进一步纯化峰1，得到白色固体形式的3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(RT＝13.56min；任意指定立体化学)和白色固体形式的3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(RT＝17.31min；任意指定立体化学)。所有4种异构体的MS：(ESI,m/z):566[M+H]+。
步骤4.N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(25mg,0.04mmol)和TFA(1mL)于DCM(5mL)中的溶液在20℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。使用5mL DCM稀释残余物。使用于MeOH中的NH3(7M)将溶液的pH调节至8。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相：水(10mM NH4HCO3)、ACN(在7min内25％ACN至最高55％))纯化残余物，得到灰白色固体形式的N-((2R)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(甲醇-d4，400MHz)δ(ppm):8.20(d,J＝8.0Hz,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),6.80-6.76(m,2H),4.25-4.17(m,1H),3.53-3.51(m,2H),3.16-3.14(m,2H),3.10-2.99(m,2H),2.92-2.90(m,2H),2.82-2.74(m,2H),2.64(s,3H),2.18-2.12(m,1H),2.04-2.02(m,2H),1.87-1.82(m,3H)。MS:(ESI,m/z):466[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于那些用于制备实施例21-1的程序的程序从步骤3中所分离的剩余三种异构体来制备表19中的前三个实施例。使用标准化学操作和类似于那些用于制备实施例21-1至21-4的程序的程序来制备表19中的其余实施例。
表19：
1程序注意事项：通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak-AD-H-SL002和流动相50％EtOH/己烷来部分地分离区域异构体和对映异构体的混合物，得到实施例21-7前体(作为第一洗脱样品)、实施例21-8前体(作为第二洗脱样品)和两个峰的混合物(作为第三洗脱样品)。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak-IC和流动相30％IPA/MTBE来进一步分离混合物，提供实施例21-5前体作为第一洗脱样品并提供实施例21-6前体作为第二洗脱样品。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
2程序注意事项：通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak-IA和流动相EtOH来部分地分离区域异构体和对映异构体的混合物，得到实施例21-9前体(作为第一洗脱样品)、两个峰的混合物(作为第二洗脱样品)和实施例21-12前体(作为第三洗脱样品)。通过手性HPLC使用手性柱(R,R)-Whelk-O1-Kromasil和流动相10％EtOH/MTBE来进一步分离混合物，提供实施例21-10前体作为第一洗脱样品并提供实施例21-11前体作为第二洗脱样品。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
实施例22-1.(S)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例22-2.(R)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 4-(6-(苄基氧基羰基氨基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向4-(6-(苄基氧基羰基氨基)-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(3.00g,6.20mmol)于1:1DCM/MeOH(100mL)中的溶液中添加Selectfluor(2.20g,6.20mmol)。将所得溶液在20℃下搅拌过夜。在0℃下添加两个额外部分的Selectfluor(1.1g,3.1mmol)并在20℃下搅拌4h。然后将反应混合物倒入80mL水中。使用3×100mL DCM萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的4-(6-(苄基氧基羰基氨基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):502[M+H]+。
步骤2. 4-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(6-(苄基氧基羰基氨基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(530mg,1.06mmol)和碳载钯(100mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的溶液在20℃和氢气氛下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色固体形式的4-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):368[M+H]+。
步骤3. 4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(360mg,0.74mmol，75％纯度)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(188mg,0.90mmol)、HBTU(343mg,0.90mmol)和Et3N(0.31mL,2.26mmol)于DMA(5mL)中的溶液在20℃下搅拌30min。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.05％甲酸)，B：ACN(在30min内0％ACN至最高80％))纯化粗产物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):558[M+H]+。
步骤4.手性分离.
通过手性HPLC(柱：ChiralArt Cellulose-SB,2×25cm,5μm；流动相：30％EtOH/己烷，13min)分离外消旋4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(250mg)。在真空下浓缩第一洗脱异构体(RT＝9.05min)，得到黄色固体形式的(S)-4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(任意指定立体化学)。在真空下浓缩第二洗脱异构体(RT＝10.15min)，得到黄色固体形式的(R)-4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(任意指定立体化学)。两种异构体的MS：(ESI,m/z):558[M+H]+。
步骤5.(S)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(S)-4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(60mg,0.11mmol)和三氟乙酸(1mL)于DCM(3mL)中的溶液在20℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBDC18,30×150mm,5μm；流动相A：水(0.05％NH4OH)，B：ACN(在7min内15％ACN至最高50％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到灰白色固体形式的(S)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(CD3OD,300MHz)δ(ppm):8.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),6.67-6.65(m,1H),4.25-4.17(m,1H),3.14-2.97(m,10H),2.82-2.70(m,1H),2.64-2.54(m,4H),1.89-1.74(m,1H)。MS:(ESI,m/z):458[M+H]+。
步骤6.(R)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-4-(6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(90mg,0.16mmol)和三氟乙酸(1.5mL)于DCM(4mL)中的溶液在20℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱，XBridge PrepOBD C18,30×150mm,5μm；流动相A：水(0.05％NH4OH)，B：ACN(在7min内15％ACN至最高50％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到灰白色固体形式的(R)-3-氨基-N-(5,8-二氟-6-(哌嗪-1-基)-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(d,J＝7.5Hz,1H),7.31(d,J＝8.1Hz,1H),7.17(s,2H),6.70-6.68(m,1H),4.13-4.04(m,1H),2.92-2.81(m,10H),2.73-2.55(m,5H),2.06-1.97(m,1H),1.78-1.68(m,1H)。MS:(ESI,m/z):458[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例22-1和22-2的程序的程序来制备表20中的下列实施例。
表20：
1程序注意事项：在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IG和流动相15％EtOH/MTBE来分离立体异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
2程序注意事项：在步骤4中，通过手性HPLC使用手性柱Chiral Art Cellulose-SB和流动相10％EtOH/MTBE来分离立体异构体。任意指定所分离对映异构体的立体化学。
实施例23-1. 7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺方法1.
步骤1.N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(500mg,1.16mmol)、N-[(3S,4S)-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg,1.39mmol)、RuPhos Pd G3(195mg,0.230mmol)、RuPhos(108mg,0.230mmol)和Cs2CO3(1.14g,3.49mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在95℃下搅拌3h。在冷却至20℃后，过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用5:2石油醚/乙酸乙酯洗脱)纯化残余物，得到褐色固体形式的N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):497[M+H]+。
步骤2.N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(450mg,0.910mmol)和碳载钯(450mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在20℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到白色固体形式的N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):362[M+H]+。
步骤3.N-[(3S,4S)-1-(6-[7-氨基-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将三乙胺(0.400mL,2.92mmol)和HBTU(377mg,0.990mmol)添加至N-[(3S,4S)-1-(6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg,0.830mmol)和7-氨基-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酸(174mg,0.830mmol)于DMA(5mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在20℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至70％B))纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到绿色固体形式的N-[(3S,4S)-1-(6-[7-氨基-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):554[M+H]+。
步骤4. 7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[7-氨基-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-甲氧基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg,0.470mmol)和TFA(3mL)于DCM(10mL)中的溶液在20℃下搅拌30min并且然后在真空下浓缩。使用NH3于MeOH中的溶液(15mL,7M)将残余物在20℃下处理1h。在真空下浓缩所得溶液。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm5μm；流动相A：水(含有10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至42％B))纯化残余物，得到黄色固体形式的7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺。MS(ESI,m/z):454[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.65(s,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,1H),6.92(br s,2H),6.23(d,J＝8.4Hz,1H),4.28-4.12(m,1H),3.62-3.59(m,2H),3.48-3.41(m,2H),3.36-3.33(m,4H),3.14-3.12(m,1H),2.84-2.73(m,4H),2.66(s,3H),2.05-2.00(m,1H),1.90-1.83(m,1H),1.79(br s,2H)。
实施例23-1. 7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺和
实施例23-2. 7-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
方法2.
也从外消旋N-[2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-1)起始并遵循类似于方法1的程序来获得7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IE和洗脱剂系统50％EtOH/MTBE(含有于MeOH中的2mM NH3)分离外消旋7-氨基-N-[2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺的对映异构体，提供黄色固体形式的7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺作为第一洗脱异构体并提供黄色固体形式的7-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺作为第二洗脱异构体。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.65(s,1H),7.83(d,J＝7.6Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),6.93(br,2H),6.24(d,J＝8.8Hz,1H),4.20-4.11(m,1H),3.63-3.56(m,2H),3.47-3.44(m,2H),3.33(s,3H),3.15-3.13(m,1H),2.84-2.73(m,4H),2.65(s,3H),2.05-1.98(m,1H),1.91-1.83(m,2H)。MS(ESI,m/z):454[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于制备实施例23-1的方法1(或根据指示的方法2)的程序来制备表21中的下列实施例。
表21：
1程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体21。
2程序注意事项：遵循方法2，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IE和洗脱剂梯度30％至35％EtOH/MTBE(含有于MeOH中的2mM NH3)来分离立体异构体。
3程序注意事项：遵循方法2，通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak ID-3和流动相30％EtOH/(己烷:DCM＝3:1，含有0.1％DIEA)来分离立体异构体。
4程序注意事项：在步骤3中，使用羧酸中间体24。
5程序注意事项：在步骤1中，使用(2S)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
6程序注意事项：在步骤1中，使用(2R)-2-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯。
7程序注意事项：跳过步骤1和步骤2，在步骤3中使用胺中间体52-1。
8程序注意事项：跳过步骤1和步骤2，在步骤3中使用胺中间体52-2。
实施例24-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法1.
步骤1.N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(800mg,1.85mmol)、N-[(3R,4R)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体48-2)(513mg,2.23mmol)、RuPhos Pd G3(155mg,0.186mmol)、RuPhos(86.7mg,0.186mmol)和Cs2CO3(1.21g,3.71mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在90℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):511[M+H]+。
步骤2.N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(550mg,1.07mmol)和碳载钯(80mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到白色固体形式的N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(粗制物)。MS(ESI,m/z):377[M+H]+。
步骤3.N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将Et3N(0.50mL,3.58mmol)和HBTU(453mg,1.19mmol)添加至N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(450mg,1.19mmol)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(248mg,1.19mmol)于DMA(4mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在25min内15％至90％))纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):567[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(450mg,0.794mmol)和TFA(3mL)于DCM(12mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。在真空下浓缩混合物。使用NH3于MeOH中的溶液(2mL,7M)处理残余物。将所得混合物搅拌10min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,30×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内27％至37％)；流速：60mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):467[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.19-7.17(m,3H),6.20(d,J＝8.4Hz,1H),4.15-4.08(m,1H),3.61-3.51(m,2H),3.52-3.35(m,3H),3.29(s,3H),3.25-3.15(m,2H),2.81-2.64(m,4H),2.60(s,3H),2.49-2.38(m,1H),2.09-1.98(m,1H),1.91-1.80(m,1H),1.61(br s,2H)。
实施例24-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例24-2. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
方法2.
也从顺式外消旋物N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体48-1)并遵循类似于方法1的程序来获得3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IA和流动相50％A：己烷:DCM＝3:1和50％B:EtOH(含有0.1％Et2NH)来分离顺式外消旋物N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(步骤3产物)的对映异构体，提供白色固体形式的N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯作为第一洗脱异构体(RT＝9.3min)并提供白色固体形式的N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯作为第二洗脱异构体(RT＝11.3min)。
通过遵循类似于方法1步骤4的程序转化N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯来获得3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.30(d,J＝8.0Hz,1H),7.56(br s,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.18-7.16(m,3H),6.20(d,J＝8.4Hz,1H),4.18-4.09(m,1H),3.61-3.51(m,2H),3.50-3.39(m,3H),3.28(s,3H),3.21-3.17(m,2H),2.81-2.64(m,4H),2.67(s,3H),2.46-2.40(m,1H),2.09-1.91(m,1H),1.91-1.80(m,1H),1.55(br s,2H)。MS(ESI,m/z):467[M+H]+。
实施例25. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(480mg,1.09mmol)、N-[(3S,4R)-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体51-2)(284mg,1.20mmol)、RuPhos(51.0mg,0.109mmol)、RuPhos Pd G3(91.0mg,0.109mmol)和Cs2CO3(890mg,2.73mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在95℃下搅拌4h。在冷却至25℃后，过滤出固体。在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):517[M+H]+。
步骤2.N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(350mg,0.664mmol)和Pd/C(350mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛下搅拌2h。过滤出固体并且使用乙酸乙酯(3×10mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到褐色固体形式的N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):383[M+H]+。
步骤3.N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(240mg,0.615mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(141mg,0.677mmol)、Et3N(0.260mL,1.85mmol)和HBTU(280mg,0.738mmol)于DMA(5mL)中的溶液在25℃下搅拌6h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化混合物，得到黄色固体形式的N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):573[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
在0℃下，向N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(二氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg,0.513mmol)于DCM(15mL)中的搅拌溶液中逐滴添加TFA(5mL)。将所得混合物在25℃下搅拌40min。在真空下浓缩所得混合物。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3(15mL，于MeOH中的7M)处理残余物。将溶液在25℃下搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridgePrep Phenyl OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在8min内20％至37％)；流速：60mL/min)纯化残余物。冻干产物级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):473[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.17(br s,2H),6.34-6.05(m,2H),3.68-3.57(m,2H),3.51-3.48(m,1H),3.39-3.77(m,1H),3.04-3.00(m,1H),2.81-2.75(m,4H),2.72(s,3H),2.48-2.42(m,1H),2.08-1.91(m,1H),1.90-1.78(m,3H)。
实施例26-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例26-2. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(200mg,0.446mmol)、反式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(中间体53)(121mg,0.446mmol)、RuPhos(42.0mg,0.090mmol)、RuPhos Pd G3(38.0mg,0.045mmol)和Cs2CO3(291mg,0.893mmol)于甲苯(4mL)中的混合物在90℃下搅拌3h。过滤出固体。在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):525[M+H]+。
步骤2.反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
将反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(180mg,0.326mmol)和碳载钯(180mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在减压下浓缩滤液，得到白色固体形式的反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):391[M+H]+。
步骤3.反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(122mg,0.322mmol)添加至反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,0.179mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(39.0mg,0.189mmol)和Et3N(0.075mL,0.537mmol)于DMA(2mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化所得混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):581[M+H]+。
步骤4.N-[(3R,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯和N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IA,2×25cm,5μm；流动相A：己烷:DCM＝3:1(含有0.1％Et2NH)和B：EtOH(在30min内保持30％)；流速：12mL/min)分离反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(40.0mg,0.0690mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝11.8min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT＝21.4min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3R,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):581[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(11.0mg,0.0190mmol)和TFA(0.500mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)处理残余物。将所得溶液在25℃下搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内0％至55％)；流速：25mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):481[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(brs,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.20-7.17(m,3H),6.24(d,J＝8.0Hz,1H),4.14-4.10(m,1H),3.64-3.59(m,1H),3.54-3.50(m,1H),3.46-3.27(m,8H),3.17-3.10(m,5H),2.55(s,3H),2.35-2.30(m,4H),2.02-1.97(m,1H),1.88-1.82(m,1H)。
步骤6. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3R,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(13.0mg,0.022mmol)和TFA(0.500mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)处理残余物。将所得溶液在25℃下搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至45％)；流速：25mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):481[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.59(brs,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.20-7.17(m,3H),6.24(d,J＝8.4Hz,1H),4.14-4.10(m,1H),3.65-3.60(m,1H),3.55-3.51(m,1H),3.46-3.27(m,5H),3.16-3.10(m,2H),3.02-3.00(m,1H),2.76-2.72(m,4H),2.59(s,3H),2.34-2.32(m,4H),2.02-1.97(m,1H),1.88-1.82(m,1H)。
实施例27-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例27-2. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体54)(150mg,0.687mmol)、N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(150mg,0.342mmol)、RuPhos(16.0mg,0.034mmol)、RuPhos Pd G3(29.0mg,0.035mmol)和Cs2CO3(278mg,0.853mmol)于甲苯(5mL)中的混合物在95℃下搅拌2h。在冷却至25℃后，过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):499[M+H]+。
步骤2.顺式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(130mg,0.256mmol)和碳载钯(130mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤所得混合物。在减压下浓缩滤液，得到褐色固体形式的顺式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):365[M+H]+。
步骤3.顺式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(92.0mg,0.243mmol)添加至顺式-N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(75.0mg,0.202mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(45.0mg,0.216mmol)和Et3N(0.084mL,0.603mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至100％))纯化混合物，得到黄色固体形式的顺式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):555[M+H]+。
步骤4.N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IG,20×250mm,5μm；流动相A：己烷:DCM＝3:1(含有0.1％Et2NH)和B：IPA(在16min内保持30％))分离顺式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,0.124mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝10.09min)并在真空下浓缩，得到白色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT＝13.22min)并在真空下浓缩，得到白色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):555[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,0.027mmol)和TFA(0.5mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌25min。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3溶液(1.0mL，7M于MeOH中)处理残余物。将所得溶液搅拌30min并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18柱，30×150mm，5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至45％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):455[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝8.4Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.16(br s,2H),6.23(d,J＝8.4Hz,1H),4.81-4.47(m,2H),4.11-4.09(m,1H),3.61-3.60(m,1H),3.54-3.46(m,2H),3.33-3.28(m,1H),3.20-3.18(m,1H),2.81-2.68(m,4H),2.59(s,3H),2.02-1.96(m,1H),1.90-1.66(m,2H)。
步骤6. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,0.027mmol)和TFA(0.5mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌25min。在真空下浓缩所得混合物。向残余物中添加NH3(1.0mL，7M于MeOH中)。将所得溶液搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18柱，30×150mm，5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至45％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):455[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.20(d,J＝8.8Hz,1H),7.16(br s,2H),6.23(d,J＝8.4Hz,1H),4.81-4.47(m,2H),4.12-4.09(m,1H),3.61-3.60(m,1H),3.53-3.47(m,2H),3.33-3.27(m,1H),3.21-3.18(m,1H),2.81-2.68(m,4H),2.59(s,3H),2.02-1.96(m,1H),1.90-1.66(m,2H)。
实施例28-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例28-2. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(200mg,0.465mmol)、反式-N-[4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体55)(157mg,0.603mmol)、RuPhos Pd G3(38.9mg,0.046mmol)、RuPhos(22.0mg,0.047mmol)和Cs2CO3(454mg,1.39mmol)于甲苯(4mL)中的混合物在100℃下搅拌3h。在冷却至26℃后，过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):541[M+H]+。
步骤2.反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将反式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(140mg,0.259mmol)和碳载钯(70.0mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在26℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黑色固体形式的反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):407[M+H]+。
步骤3.反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(112mg,0.295mmol)添加至反式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.246mmol)、Et3N(0.103mL,0.741mmol)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(61.0mg,0.293mmol)于DMA(2mL)中的溶液中。将所得溶液在26℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在25min内20％至85％))纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):597[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,S-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IG,2×25cm,5μm；流动相A：己烷：DCM＝3:1(0.1％Et2NH)和B：EtOH(在20min内保持40％))分离反式-N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(120mg,0.201mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝12.26min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。收集第二洗脱异构体(RT＝17.55min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):597[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(27.0mg,0.047mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在26℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)处理残余物。将所得溶液搅拌30min，并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18,19×150mm,5μm,13nm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在8min内18％至40％)，流速：60mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):497[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.19(d,J＝8.8Hz,1H),7.17(br s,2H),6.22(d,J＝8.4Hz,1H),4.14-4.10(m,1H),3.75-3.74(m 1H),3.64-3.55(m,3H),3.49-3.31(m,5H),3.24(s,3H),3.14-3.12(m,1H),2.82-2.72(m,4H),2.59(s,3H),2.03-1.82(m,4H)。
步骤6. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(26.0mg,0.045mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。向残余物中添加NH3(2.00mL，7M于MeOH中)。将所得溶液搅拌30min，并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：X Bridge Prep OBD C18,30×150mm,5μm；流动相A：水(10mMNH4HCO3)和B：ACN(在8min内18％至40％)，流速：60mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):497[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.19(d,J＝8.8Hz,1H),7.17(br s,2H),6.22(d,J＝8.4Hz,1H),4.15-4.11(m,1H),3.75-3.74(m1H),3.63-3.59(m,3H),3.48-3.33(m,5H),3.24(s,3H),3.14-3.11(m,1H),2.80-2.72(m,4H),2.59(s,3H),2.01-1.82(m,4H)。
实施例29-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(9S)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例29-2. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(9R)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.N-[(6S)-2-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(180mg,0.410mmol)、N-[1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体59)(150mg,0.614mmol)、RuPhos(19.0mg,0.041mmol)、RuPhos Pd G3(34.0mg,0.041mmol)和Cs2CO3(334mg,1.025mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在95℃下搅拌3h。将混合物冷却至25℃，过滤，并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-[(6S)-2-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):525[M+H]+。
步骤2.N-[7-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(6S)-2-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(180mg,0.336mmol)和Pd/C(180mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃下搅拌2h。过滤所得混合物，并且使用乙酸乙酯(3×5mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到褐色固体形式的N-[7-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):391[M+H]+。
步骤3.N-[7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(114mg,0.301mmol)添加至N-[7-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.251mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(57.0mg,0.274mmol)和Et3N(0.104mL,0.751mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将反应物在25℃下搅拌3h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％))纯化残余物，得到黄色固体形式的N-[7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):581[M+H]+。
步骤4.N-[(9S)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(9R)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IF,2×25cm,5μm；流动相A：MTBE(0.1％Et2NH)和B：EtOH(在24min内保持30％)；流速：12mL/min)分离N-[7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.169mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝15.97min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(9S)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):581[M+H]+。
收集第二洗脱异构体(RT＝20.62min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(9R)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):581[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(9S)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(9S)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(40mg,0.068mmol)和TFA(0.50mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液。向残余物中添加NH3(2.0mL，7M于MeOH中)。将所得溶液在25℃下搅拌30min，并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：X Bridge Prep C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至35％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(9S)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):481[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.82(d,J＝8.0Hz,1H),7.22-7.20(m,1H),6.20(d,J＝8.0Hz,1H),6.06-6.02(m,2H),5.52(d,J＝7.2Hz,1H),4.48-4.42(m,1H),4.14-4.09(m,4H),3.82-3.69(m,2H),3.53-3.50(m,2H),3.24-3.20(m,1H),3.09-3.08(m,1H),2.94-2.86(m,2H),2.70-2.64(m,4H),2.26-2.23(m,1H),1.98-1.91(m,1H)。
步骤6. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(9R)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(9R)-7-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(40.0mg,0.068mmol)和TFA(0.50mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液。向残余物中添加NH3(2.0mL，7M于MeOH中)。将所得溶液在25℃下搅拌30min，并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm,5μm；流动相A：水(0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至35％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(9R)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):481[M+H]+。1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.82(d,J＝8.4Hz,1H),7.22-7.20(m,1H),6.20(d,J＝8.4Hz,1H),6.06-6.00(m,2H),5.53(d,J＝6.8Hz,1H),4.48-4.42(m,1H),4.14-4.09(m,4H),3.82-3.67(m,2H),3.53-3.501(m,2H),3.27-3.22(m,1H),3.10-3.08(m,1H),2.95-2.90(m,2H),2.70-2.65(m,4H),2.24-2.20(m,1H),1.93-1.87(m,1H)。
实施例30-1. 3-氨基-N-[(6S)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例30-2. 3-氨基-N-[(6R)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将N-[2-[(三氟甲烷)磺酰基氧基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-1)(400mg,0.930mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(208mg,1.12mol)、RuPhos(87.0mg,0.190mmol)、RuPhos Pd G3(76.0mg,0.090mmol)和Cs2CO3(758mg,2.33mmol)于甲苯(15mL)中的混合物在95℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):467[M+H]+。
步骤2. 4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将SelectFluor(683mg,1.93mmol)于ACN(10mL)中的溶液添加至4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(600mg,1.29mmol)于DCM(30mL)和MeOH(30mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在-20℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(0.05％TFA)和B：ACN(在7min内55％至85％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):485[M+H]+。
步骤3. 4-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将4-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(70.0mg,0.140mmol)和碳载钯(70.0mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到灰白色固体形式的4-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):351[M+H]+。
步骤4. 4-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将HBTU(58.0mg,0.150mmol)添加至4-(6-氨基-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸酯(45.0mg,0.130mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(32.0mg,0.150mmol)和Et3N(54.0μL,0.390mmol)于DMA(2mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌30min。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmoL/L NH4HCO3)和B：ACN(在25min内0％至85％))纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的4-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):541[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和3-氨基-N-[(6R)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将4-[3-氨基-6-(3-氨基-6-甲基-1-苯并噻吩-2-酰胺基)-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(40.0mg,0.070mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物，得到黄色固体形式的3-氨基-N-[3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺的TFA盐。通过手性HPLC(柱：Chiralpak IC,2×25cm,5μm；流动相A：Hex(0.2％Et2NH)和B：EtOH(在20min内保持50％)；流速：15mL/min)分离对映异构体。在真空下浓缩第一洗脱异构体(RT＝11.3min)并且然后冻干，得到灰白色固体，立体化学任意指定为3-氨基-N-[(6S)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):441[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.60(d,J＝7.5Hz,1H),7.32-7.22(m,2H),7.16(br s,2H),4.14(br s,1H),3.25-3.21(m,4H),2.83-2.72(m,8H),2.58(s,3H),1.98-1.86(m,2H)。
在真空下浓缩第二洗脱异构体(RT＝16.9min)并且然后使用ACN和水冻干，得到灰白色固体，立体化学任意指定为3-氨基-N-[(6R)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):441[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.30(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(d,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.21(m,2H),7.16(br s,2H),4.15(br s,1H),3.22-3.20(m,4H),2.83-2.72(m,8H),2.58(s,3H),2.07-1.83(m,2H)。
实施例31-1. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例31-2. 3-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.N-[2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-(2-氯-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基)氨基甲酸苄酯(中间体57)(300mg,0.944mmol)、N-[(3S,4S)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体56)(276mg,1.133mmol)和DIEA(0.312mL,1.89mmol)于DMA(10mL)中的溶液在150℃下微波处理1h。在冷却至25℃后，通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在20min内0％至70％))纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到褐色固体形式的N-[2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):526[M+H]+。
步骤2.N-[(3S,4S)-1-(6-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[2-[(3S,4S)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]氨基甲酸苄酯(300mg,0.542mmol)和碳载钯(300mg,10％)于乙酸乙酯(20mL)中的混合物在20℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤所得混合物并使用乙酸乙酯(3×10mL)洗涤滤饼。在真空下浓缩滤液，得到褐色固体形式的N-[(3S,4S)-1-(6-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):392[M+H]+。
步骤3.N-[(3S,4S)-1-[6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(140mg,0.370mmol)添加至N-[(3S,4S)-1-(6-氨基-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基)-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.230mmol)、Et3N(0.096mL,0.690mmol)和3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(中间体21)(70.0mg,0.300mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌3h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内10％至60％))纯化残余物。浓缩所收集级分，得到白色固体形式的N-[(3S,4S)-1-[6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):596[M+H]+。
步骤4.N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(3S,4S)-1-[(6R)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IA,2×25cm,5μm；流动相A：己烷:DCM＝3:1和B：EtOH(在19min内保持50％)；流速：16mL/min)分离N-[(3S,4S)-1-[6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(65.0mg,0.109mmol)。收集第一洗脱异构体(RT＝11.42min)并浓缩，得到白色固体，针对酰胺的立体化学任意指定为N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT＝15.96min)并在真空下浓缩，得到白色固体，针对酰胺的立体化学任意指定为N-[(3S,4S)-1-[(6R)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):596[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(28.0mg,0.05mmol)和TFA(0.5mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。使用NH3溶液(1.0mL，7M于MeOH中)处理残余物。将所得溶液搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,30×150mm,5μm；流动相A：水(10mMNH4HCO3)和B：ACN(在7min内25％至45％)；流速：60mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):496[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.06(s,1H),7.64(br s,1H),7.04(s,1H),6.82(br s,2H),4.14-4.11(m,1H),3.78-3.73(m,1H),3.71-3.70(m,2H),3.57-3.53(m,1H),3.37-3.32(m,5H),3.25-3.22(m,1H),2.82-2.62(m,7H),2.01-1.98(m,1H),1.91-1.83(m,1H),1.74(br s,2H),1.12-1.08(m,6H)。
步骤6. 3-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6R)-6-[3-氨基-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-2-基]-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(27.0mg,0.05mmol)和TFA(0.5mL)于DCM(1.5mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。向残余物中添加NH3(1.0mL，7M于MeOH中)。将所得溶液搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,30×150mm,5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内25％至50％)；流速：60mL/min)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):496[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.07(s,1H),7.65(br s,1H),7.05(s,1H),6.83(brs,2H),4.16-4.13(m,1H),3.79-3.74(m,1H),3.72-3.71(m,2H),3.57-3.53(m,1H),3.38-3.33(m,5H),3.26-3.23(m,1H),2.83-2.62(m,7H),2.01-1.99(m,1H),1.92-1.83(m,1H),1.74(br s,2H),1.12-1.08(m,6H)。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例31-1和31-2的程序的程序来制备表22中的下列实施例。
表22：
1程序注意事项：在步骤1中，使用三氟甲磺酸盐中间体47-4。在步骤4中，通过手性HPLC使用柱Chiralpak IC和流动相10％EtOH/MTBE(含有于MeOH中的10mmol/L NH3)分离对映异构体，提供实施例31-3前体作为第一洗脱异构体(任意指定立体化学)；并提供实施例31-4前体作为第二洗脱异构体(任意指定立体化学)。
实施例32-1. 3-氨基-6-甲基-N-[(7S)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和
实施例32-2. 3-氨基-6-甲基-N-[(7R)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 4-(7-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将HBTU(70.0mg,0.180mmol)添加至4-(7-氨基-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(中间体58)(30mg,0.090mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(20.0mg,0.100mmol)和Et3N(0.038mL,0.270mmol)于DMA(2mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌30min。经由反相色谱法(柱：X Bridge C18,19×150mm,5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内10％至80％))纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到白色固体形式的4-(7-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):523[M+H]+。
步骤2. 3-氨基-6-甲基-N-[3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将4-(7-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢异喹啉-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(35.0mg,0.070mmol)和TFA(0.50mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩反应混合物。然后添加NH3溶液(2mL，7M于甲醇中)。将所得溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液，得到白色固体形式的3-氨基-6-甲基-N-[3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):423[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-6-甲基-N-[(7S)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺和3-氨基-6-甲基-N-[(7R)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IG,2×25cm,5um；流动相A：MTBE(含有0.1％Et2NH)和B:乙醇(在20min内保持50％))将外消旋3-氨基-6-甲基-N-[3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(25.0mg,0.059mmol)分离成其对映异构体。在真空下浓缩第一洗脱异构体(RT＝12.37min)并且然后冻干，得到白色固体，立体化学任意指定为3-氨基-6-甲基-N-[(7S)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):423[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),6.63(s,1H),4.25-4.23(m,1H),3.49-3.43(m,4H),3.06-2.98(m,1H),2.97-2.92(m,6H),2.82-2.69(m,1H),2.66(s,3H),2.15-2.13(m,1H),1.89-1.81(m,1H)。在真空下浓缩第二洗脱异构体(RT＝17.03min)并且然后冻干，得到白色固体，立体化学任意指定为3-氨基-6-甲基-N-[(7R)-3-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢异喹啉-7-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):423[M+H]+。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):8.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(s,1H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),6.63(s,1H),4.25-4.23(m,1H),3.49-3.43(m,4H),3.15-2.98(m,1H),2.97-2.93(m,6H),2.82-2.72(m,1H),2.76(s,3H),2.15-2.13(m,1H),1.89-1.81(m,1H)。
实施例33-1.(R)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
实施例33-2.(S)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 3-氨基-N-(7-溴-5-氟色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将7-溴-5-氟色烷-4,4-d2-3-胺(中间体5-2)(340mg,1.370mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(342mg,1.645mmol)、Et3N(0.287ml,2.056mmol)和HBTU(624mg,1.645mmol)于DMA(5mL)中的溶液在室温下搅拌4h。将反应物的体积在减压下减半。添加EtOAc(5mL)和H2O(3mL)。分离有机层，经Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(使用2％至100％EtOAc/己烷洗脱)纯化残余物。合并所需级分并浓缩，得到黄色固体形式的3-氨基-N-(7-溴-5-氟色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS:(ESI,m/z):438[M+H]+。1H NMR(CDCl3,300MHz)δ(ppm):7.61-7.83(m,1H),7.03-7.13(m,1H),6.69-6.90(m,2H),6.00(br s,2H),5.59(br d,J＝6.7Hz,1H),4.47-4.82(m,1H),3.95-4.29(m,3H),2.85-2.86(m,1H),2.67-2.79(m,3H),2.59(d,J＝3.2Hz,3H)。
步骤2. 4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基-4,4-d2)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将3-氨基-N-(7-溴-5-氟色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(150mg,0.342mmol)的溶液与哌嗪-1-甲酸叔丁酯(127mg,0.684mmol)组合于无水DMA(3.42mL)中。添加LiHMDS的1M THF溶液(3.42mL,3.42mmol)并且使用N2将反应物吹扫20min。添加Pd-PEPPSI-IPent(34.2mg,0.034mmol)并且将反应物在60℃下搅拌16h。使用10mL EtOAc稀释反应物并使用3mL H2O洗涤。分离有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并浓缩。通过硅胶色谱法(使用5％至80％EtOAc/己烷洗脱)纯化残余物。合并所需级分并浓缩，得到灰白色固体形式的4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基-4,4-d2)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):544[M+H]+。
步骤3. 3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将HCl(4M于1,4-二噁烷中，0.276mL,1.104mmol)添加至4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-5-氟色烷-7-基-4,4-d2)哌嗪-1-甲酸叔丁酯于EtOAc(1mL)中的悬浮液中。将反应物在22℃下搅拌16h。将反应物在真空下浓缩至干燥。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IA(流动相A：己烷(0.1％Et2NH)，和B：EtOH(0.1％Et2NH)；50％B)来纯化残余物，得到峰1(其立体化学任意指定为(R)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺)和峰2(其立体化学任意指定为(S)-3-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基-4,4-d2)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺)。MS:(ESI,m/z):444[M+H]+。
使用标准化学操作和类似于用于制备实施例33-1和33-2的程序的程序来制备表23中的下列实施例。
表23：
1程序注意事项：在步骤1中，使用7-溴色烷-3-胺作为胺偶联搭配物，得到外消旋3-氨基-N-(7-溴色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。通过SFC使用手性柱ChiralArt Amylose-SA和流动相A：65％CO2和B：EtOH:DCM＝1:1来分离对映异构体，提供(R)-3-氨基-N-(7-溴色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺作为第一洗脱异构体并提供(S)-3-氨基-N-(7-溴色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺作为第二洗脱异构体。在步骤2中，使用顺式-3,8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸叔丁酯作为胺偶联搭配物，得到顺式-8-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[4.2.0]辛烷-3-甲酸叔丁酯。通过手性HPLC使用手性柱Chiralpak IE和流动相10％EtOH/MTBE(0.1％Et2NH)来分离顺式异构体，提供实施例33-3前体作为第一洗脱异构体(任意指定立体化学)并提供实施例33-4前体作为第二洗脱异构体(任意指定立体化学)。在步骤3中，通过使用TFA在DCM中处理来实现boc脱保护。
实施例34. 3-氨基-N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.N-[(3R)-7-(4-羟基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
在-78℃下，将n-BuLi(4.40mL，2.5M于正己烷中)添加至(R)-(7-溴色烷-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体2)(800mg,2.16mmol)于THF(20mL)中的溶液中。将所得溶液在-78℃下搅拌30min。然后在-78℃下添加噻烷-4-酮(1.28g,11.0mmol)于THF(3mL)中的溶液。将所得溶液在-78℃下搅拌1h。然后使用水(30mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的N-[(3R)-7-(4-羟基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):400[M+H]+。
步骤2.N-[(3R)-7-(4-氰基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将TMSCN(120mg,1.21mmol)于DCM(1mL)中的溶液添加至InBr3(11.0mg,0.030mmol)和DCM(1mL)的混合物中。然后经30min添加N-[(3R)-7-(4-羟基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(120mg,0.300mmol)于DCM(1mL)中的溶液。将所得混合物在29℃下搅拌30min。由此并行操作三个批次并合并以用于使用水(10mL)淬灭。使用DCM(3×15mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的N-[(3R)-7-(4-氰基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):409[M+H]+。
步骤3.N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(3R)-7-(4-氰基噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(160mg,0.390mmol)和oxone(650mg,3.87mmol)于2-丁酮(10mL)中的混合物在40℃下搅拌12h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。经由硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):441[M+H]+。
步骤4. 4-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-甲腈
将N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(80.0mg,0.180mmol)和碳载钯(80.0mg,10％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在29℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到灰白色固体形式的4-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-甲腈。MS:(ESI,m/z):307[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将HBTU(68.0mg,0.180mmol)添加至4-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-甲腈(50.0mg,0.160mmol)、Et3N(0.067mL,0.480mmol)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(34.0mg,0.160mmol)于DMA(2mL)中的溶液中。将所得溶液在29℃下搅拌30min。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在7min内30％至60％))纯化混合物。冻干所收集级分，得到浅黄色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-(4-氰基-1,1-二氧代-1λ6-噻烷-4-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):497[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),7.24-7.22(m,3H),7.10-7.08(m,1H),6.99(d,J＝2.0Hz,1H),4.37-4.32(m,1H),4.26-4.22(m,1H),3.93-3.88(m,1H),3.42-3.27(m,4H),3.01-2.99(m,2H),2.59-2.50(m,7H)。
实施例35. 3-氨基-6-甲基-N-[(3R)-5,6,8-三氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 4-(2,3,5,6-四氟-4-甲酰基苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯
将2,3,4,5,6-五氟苯甲醛(10.0g,51.0mmol)、哌嗪-1-甲酸苄酯(11.2g,50.8mmol)和DIEA(15.9mL,95.9mmol)于DMF(50mL)中的溶液在60℃下搅拌12h。通过添加水(50mL)来淬灭反应，并使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。合并有机层，使用水(6×100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:5乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的4-(2,3,5,6-四氟-4-甲酰基苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):397[M+H]+。
步骤2. 4-[2,3,5,6-四氟-4-(羟甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯
在<10℃下，向4-(2,3,5,6-四氟-4-甲酰基苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯(4.00g,10.1mmol)于甲醇(40mL)中的溶液中添加NaBH4(950mg,25.1mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌2h。在真空下去除溶剂。使用水(100mL)稀释残余物。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到白色固体形式的4-[2,3,5,6-四氟-4-(羟甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS:(ESI,m/z):399[M+H]+。
步骤3. 4-[4-(溴甲基)-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯
将4-[2,3,5,6-四氟-4-(羟甲基)苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯(5.70g,14.3mmol)和PBr3(3.85g,14.2mmol)于DCM(40mL)中的溶液在25℃下搅拌2h。然后通过添加水(40mL)来淬灭反应。使用DCM(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到白色固体形式的4-[4-(溴甲基)-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):461,463[M+H]+。
步骤4. 4-(4-[[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪-2-基]甲基]-2,3,5,6-四氟苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯
在-78℃下，向(2S)-3,6-二甲氧基-2-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪(1.84g,9.99mmol)于THF(50mL)中的溶液中添加n-BuLi(6.0mL，2.5M于正己烷中)。将所得溶液在-78℃下搅拌30min。在-78℃下，向此溶液中添加4-[4-(溴甲基)-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯(4.60g,9.97mmol)。将所得溶液在-78℃下搅拌2h。然后通过添加NH4Cl(饱和水溶液)(40mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(3×30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至75％)纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-(4-[[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪-2-基]甲基]-2,3,5,6-四氟苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):565[M+H]+。
步骤5. 4-[4-[(2R)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯
在<10℃下，将盐酸(100mL,0.3N)添加至4-(4-[[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-5-(丙烷-2-基)-2,5-二氢吡嗪-2-基]甲基]-2,3,5,6-四氟苯基)哌嗪-1-甲酸苄酯(5.86g,10.3mmol)于ACN(100mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。在真空下去除溶剂。使用NaHCO3(饱和水溶液)将残余物的pH值调节至9-10。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的4-[4-[(2R)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):470[M+H]+。
步骤6. 4-[4-[(2R)-2-氨基-3-羟丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯
在<10℃下，向4-[4-[(2R)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯(3.83g,8.16mmol)于甲醇(10mL)和THF(40mL)中的溶液中添加NaBH4(900mg,23.7mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌3h。在真空下浓缩溶剂。使用水(50mL)稀释残余物。使用乙酸乙酯(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(3×30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-[4-[(2R)-2-氨基-3-羟丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):442[M+H]+。
步骤7. 4-[(3R)-3-氨基-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯
将氢化钠(34.0mg,1.42mmol,60％)添加至4-[4-[(2R)-2-氨基-3-羟丙基]-2,3,5,6-四氟苯基]哌嗪-1-甲酸苄酯(400mg,0.910mmol)于DMSO(10mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌30min并且然后在70℃下搅拌2h。在冷却至25℃后，通过添加水(40mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×20mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(20mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内20％至70％))纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-[(3R)-3-氨基-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):422[M+H]+。
步骤8. 4-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯
向4-[(3R)-3-氨基-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯(70.0mg,0.170mmol)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(41.5mg,0.200mmol)于DMA(2mL)中的溶液中添加Et3N(0.068mL,0.49mmol)和HBTU(75.0mg,0.200mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至80％))纯化混合物，得到黄色油状物形式的4-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):612[M+H]+。
步骤9. 3-氨基-6-甲基-N-[(3R)-5,6,8-三氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
向4-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,8-三氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]哌嗪-1-甲酸苄酯(50.0mg,0.080mmol)于CH3COOH(1.5mL)中的溶液中添加氢溴酸(1.5mL,48％)。将所得溶液在50℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD柱；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内25％至65％B))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-6-甲基-N-[(3R)-5,6,8-三氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。MS(ESI,m/z):478[M+H]+。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.70(d,J＝6.8Hz,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.25(br s,2H),4.36-4.30(m,1H),4.26-4.23(m,1H),3.99-3.95(m,1H),3.04-2.94(m,5H),2.90-2.84(m,1H),2.79-2.77(m,4H),2.58(s,3H)。
实施例288. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(3R)-3-氨基吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.N-[(3R)-7-[(3R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(3R)-7-溴-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(150mg,0.400mmol)、N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(94.0mg,0.500mmol)、Cs2CO3(274mg,0.840mmol)、RuPhos(40.0mg,0.090mmol)和3代RuPhos预催化剂(35.0mg,0.040mmol)于甲苯(4mL)中的混合物在90℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，过滤出固体。在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的N-[(3R)-7-[(3R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(145mg,75％)。LCMS(ES,m/z):468[M+H]+。
步骤2.N-[(3R)-1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(3R)-7-[(3R)-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(145mg,0.300mmol)和Pd/C(100mg,10％)于EA(6mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在减压下浓缩滤液，得到浅褐色固体形式的N-[(3R)-1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(95.0mg,粗制物)。LCMS(ES,m/z):334[M+H]+。
步骤3.N-[(3R)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(154mg,0.400mmol)添加至N-[(3R)-1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(90.0mg,0.260mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(84.0mg,0.400mmol)和TEA(0.150mL,1.07mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌3h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV 254/220nm)纯化混合物。浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的N-[(3R)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(85.0mg,61％)。LCMS(ES,m/z):524[M+H]+。
步骤4. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(3R)-3-氨基吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3R)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(42.0mg,0.080mmol)和TFA(0.500mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌25min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(1.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物中。将所得溶液搅拌0.5h并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD,30×150mm,5um；流动相A：水(含有10mmol/LNH4HCO3)和B：ACN(在7min内25％至55％)；检测器：UV 254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到黄色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(3R)-3-氨基吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(20.0mg,60％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.48(br s,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(brs,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),6.10(d,J＝8.0Hz,1H),5.90(s,1H),4.30-4.26(m,1H),4.16-4.12(m,1H),3.82-3.77(m,1H),3.55-3.53(m,1H),3.30-3.25(m,2H),3.19-3.13(m,1H),2.89-2.80(m,3H),2.59(s,3H),2.10-1.90(m,2H),1.72-1.64(m,2H)。LCMS(ES,m/z):424[M+H]+。
实施例400.N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺和
实施例401.N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
步骤1.顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(6S)-2-(三氟甲烷磺酰基氧基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(中间体47-2)(300mg,0.690mmol)、顺式-N-[4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(192mg,0.825mmol)(中间体48-1)、Cs2CO3(454mg,1.38mmol)、RuPhos(65.0mg,0.138mmol)和RuPhos Pd G3(58.0mg,0.069mmol)于甲苯(10mL)中的溶液在90℃下搅拌3h。在冷却至环境温度(～23℃)后，过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过反相色谱法(柱：XBridge Prep C18 OBD,19×150mm 5μm；流动相A：水(含有10mM NH4HCO3)和B：ACN(在30min内50％至70％B))纯化残余物，得到无色油状物形式的顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯。MS(ESI,m/z):511[M+H]+。
步骤2.顺式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-N-[(6S)-2-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(240mg,0.465mmol)和碳载钯(240mg,10％)于乙酸乙酯(15mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体并用MeOH(3×10mL)洗涤滤饼。在真空下浓缩滤液，得到红色固体形式的顺式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):377[M+H]+。
步骤3.顺式-N-[1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(176mg,0.459mmol)添加至顺式-N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(160mg,0.421mmol)、1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酸(中间体25)(80.0mg,0.417mmol)和Et3N(0.180mL,1.76mmol)于DMA(4mL)中的搅拌溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h。通过反相色谱法(柱：XBridgePrep C18 OBD,19×150mm 5μm；流动相A：水(含有10mM NH4HCO3)和B：ACN(在20min内50％至70％B))纯化所得混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到顺式-N-[1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。
步骤4.N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性HPLC(柱：Chiralpak IF,2×25cm,5μm；流动相A：己烷:DCM＝3:1(含有0.1％Et2NH)和B：EtOH(在13min内保持30％)；流速：30mL/min)分离外消旋顺式-N-[1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第一洗脱异构体(RT＝8.4min)并在真空下浓缩，得到白色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT＝10.2min)并在真空下浓缩，得到白色固体，针对吡咯烷的立体化学任意指定为N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。MS(ESI,m/z):549[M+H]+。
步骤5.N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将N-[(3R,4R)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(60.0mg,0.108mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。在25℃下使用NH3溶液(3.00mL，7M于MeOH中)逐滴处理残余物。将所得混合物在25℃下再搅拌10min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在10min内30％至50％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺。MS(ESI,m/z):449[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.77(s,1H),8.47-8.45(m,2H),7.69(d,J＝3.6Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,1H),6.59(d,J＝3.6Hz,1H),6.21(d,J＝8.4Hz,1H),4.36-4.30(m,2H),4.22-4.17(m,1H),3.60-3.33(m,5H),3.28(s,3H),3.23-3.18(m,2H),2.88-2.81(m,1H),2.80-2.77(m,2H),2.71-2.67(m,1H),2.41-2.38(m,1H),2.10-2.05(m,1H),1.88-1.82(m,1H),1.59(br s,2H),1.41-1.38(m,4H)。
步骤6.N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(6S)-6-[1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(60.0mg,0.108mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(10mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。在25℃下使用NH3溶液(3.00mL，7M于MeOH中)逐滴处理残余物。所得混合物在25℃下再搅拌10min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD,5μm,19×150mm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)和B：ACN(在10min内30％至50％))纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-1-乙基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-甲酰胺。MS(ESI,m/z):449[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.77(d,J＝2.0Hz,1H),8.47-8.45(m,2H),7.68(d,J＝3.6Hz,1H),7.19(d,J＝8.4Hz,1H),6.59(d,J＝3.2Hz,1H),6.21(d,J＝8.4Hz,1H),4.36-4.30(m,2H),4.18-4.13(m,1H),3.60-3.35(m,5H),3.28(s,3H),3.22-3.17(m,2H),2.88-2.86(m,1H),2.78-2.77(m,2H),2.71-2.67(m,1H),2.41-2.37(m,1H),2.11-2.04(m,1H),1.90-1.80(m,1H),1.55(br s,2H),1.41-1.38(m,3H)。
实施例424. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 1-苄基-4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮
在0℃下，将NaBH4(24.0g,634mmol)添加至1-苄基-5-氧代吡咯烷-3-甲酸甲酯(50.0g,214mmol)于乙醇(800mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌4h。使用水(50mL)淬灭反应。在真空下浓缩混合物。使用水(200mL)稀释残余物。使用二氯甲烷(3×500mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用10/1二氯甲烷/甲醇洗脱)纯化残余物，得到白色油状物形式的1-苄基-4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮(35.0g,76％)。LCMS(ES,m/z):206[M+H]+。
步骤2. 1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮
在-78℃下，将DAST(32.2mL,244mmol)添加至1-苄基-4-(羟基甲基)吡咯烷-2-酮(20.0g,97.5mmol)于DCM(300mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌16h。将反应物倒入冰-水(200mL)中。使用DCM(3×200mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。经由反相色谱法(柱：C18柱；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：CH3CN(在45min内0％至50％)；检测器：254/220nm)纯化残余物，得到黄色油状物形式的1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(12.0g,53％)。LCMS(ES,m/z):208[M+H]+。
步骤3.反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮
在-78℃下，将LDA溶液(24.0mL，2M于THF中)添加至1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(5.00g,23.6mmol)于四氢呋喃(100mL)中的溶液中。将所得溶液在-78℃下搅拌1h。然后引入O2。将所得溶液在-78℃下搅拌3h。通过添加水(50mL)来淬灭反应。在真空下去除溶剂。使用CH2Cl2(3×100mL)萃取残余物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.1％TFA)和B：ACN(在30min内0％至60％)；检测器：UV 220nm和254nm)纯化残余物，得到褐色油状物形式的反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮(3.00g,56％)。LCMS(ES,m/z):224[M+H]+。
步骤4.反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯
在0℃下，将MsCl(2.75mL,35.5mmol)添加至反式-1-苄基-4-(氟甲基)-3-羟基吡咯烷-2-酮(5.40g,23.7mmol)和TEA(6.59mL,47.4mmol)于DCM(70mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌2h。在0℃下通过添加水(50mL)来淬灭反应。使用CH2Cl2(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，得到褐色油状物形式的反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯(6.00g，粗制物)。LCMS(ES,m/z):302[M+H]+。
步骤5.顺式-3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮
将反式-甲磺酸1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基酯(6.00g,19.5mmol)和NaN3(3.81g,58.6mmol)于DMF(150mL)中的混合物在100℃下搅拌1h。使混合物冷却至25℃。通过在25℃下添加水(500mL)来淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×200mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色油状物形式的顺式-3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(4.20g,85％)。LCMS(ES,m/z):249[M+H]+。
步骤6.顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将3-叠氮基-1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-2-酮(4.00g,15.8mmol)、碳载钯(4.00g,10％)和二碳酸二叔丁酯(6.89g,31.6mmol)于EtOH(100mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:1乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(2.40g,46％)。LCMS(ES,m/z):323[M+H]+。
步骤7.顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
在0℃下，将BH3溶液(30mL,1M于THF中)添加至顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)-2-氧代吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(2.40g,7.30mmol)于THF(60mL)中的搅拌溶液中。将所得混合物在25℃下搅拌16h。在真空下浓缩所得混合物。然后添加EtOH(60mL)、H2O(15mL)和TEA(15mL)。将所得混合物在80℃下搅拌2h。将所得混合物冷却至25℃并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18柱；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至100％)；检测器：UV220nm和200nm)纯化残余物，得到白色固体形式的顺式-N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(1.00g,44％)。LCMS(ES,m/z):309[M+H]+。
步骤8.顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[1-苄基-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(450mg,1.43mmol)和碳载Pd(OH)2(450mg,20％)于乙酸乙酯(10mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在减压下浓缩滤液，得到褐色油状物形式的顺式-N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):219[M+H]+。
步骤9.顺式-N-[(3R)-7-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(133mg,0.349mmol)、顺式-N-[(3R)-7-溴-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(76.1mg,0.331mmol)、Cs2CO3(227mg,0.698mmol)、RuPhos(32.6mg,0.070mmol)和第3代RuPhos预催化剂(29.2mg,0.035mmol)于甲苯(3mL)中的混合物在100℃下搅拌6h。在冷却至25℃后，过滤出固体并在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的顺式-N-[(3R)-7-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(120mg,65％)。LCMS(ES,m/z):500[M+H]+。
步骤10.顺式-N-[1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-N-[(3R)-7-(3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(155mg,0.295mmol)和碳载钯(160mg,10％)于乙酸乙酯(15mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到灰白色固体形式的顺式-N-[1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):366[M+H]+。
步骤11.顺式-N-[1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(156mg,0.410mmol)添加至顺式-N-[1-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.274mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(51.3mg,0.246mmol)和TEA(0.114ml,0.821mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至60％)；检测器：UV 220nm)纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的顺式-N-[1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(95.0mg,59％)。LCMS(ES,m/z):556[M+H]+。
步骤12.N-[(3S,4S)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性制备型HPLC(柱：CHIRALPAK IG,2×250mm,5um；流动相A：MTBE(含有0.1％IPA)和B：IPA(在16min内保持30％)；流速：20mL/min；检测器：UV 220/254nm)分离顺式-N-[1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(95.0mg,0.171mmol)。收集第一洗脱异构体(RT1＝11.150min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(3R,4R)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT2＝14.269min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(3S,4S)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯。LCMS(ES,m/z):556[M+H]+。
步骤13. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(3S,4S)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-(氟甲基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(30.0mg,0.051mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3.00mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物中。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD柱19×150mm,5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在7min内30％至50％)；流速：60mL/min；检测器：254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到灰白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(12.5mg,51％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(br s,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.22(br s,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.09(d,J＝6.8Hz,1H),5.90(s,1H),4.81-4.46(m,2H),4.29-4.23(m,1H),4.15-4.12(m,1H),3.81-3.76(m,1H),3.61-3.60(m,1H),3.42-3.34(m,1H),3.28-3.26(m,1H),3.16-3.12(m,1H),2.97-2.95(m,1H),2.89-2.83(m,2H),2.59-2.57(m,4H),1.86(br s,2H)。LCMS(ES,m/z):456[M+H]+。
实施例439. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(5R,9R)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 2-[(3Z)-氧杂环戊烷-3-亚基]乙酸乙酯
在0℃下，向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(26.0g,110mmol)于THF(300mL)中的搅拌溶液中以多份添加NaH(2.60g,60％)。将反应在0℃下搅拌1.5h。然后添加氧杂环戊烷-3-酮(5.00g,55.2mmol)于THF中的溶液。将反应在25℃下搅拌12h。使用水(300mL)淬灭反应。使用EtOAc(3×300mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(1×200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。在过滤后，在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色油状物形式的2-[(3Z)-氧杂环戊烷-3-亚基]乙酸乙酯(6.00g,66％)。LCMS(ES,m/z):157[M+H]+。
步骤2. 7-苄基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯
将TFA(104mg,0.912mmol)添加至2-[(3Z)-氧杂环戊烷-3-亚基]乙酸乙酯(5.00g,30.4mmol)和苄基(甲氧基甲基)[(三甲基甲硅烷基)甲基]胺(11.1g,45.6mmol)于甲苯(10mL)中的溶液中。将反应在60℃下搅拌1.5h。将所得混合物冷却至25℃，然后倒入NaHCO3(1×20mL)中。使用EtOAc(3×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(1×50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。在过滤后，在减压下浓缩滤液。通过硅胶色谱柱(使用1:3THF/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色油状物形式的7-苄基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯(3.00g,30％)。LCMS(ES,m/z):290[M+H]+。
步骤3. 2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯
将7-苄基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯(3.00g,9.85mmol)和Pd(OH)2/C(2.38g,20％)于MeOH(30mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌3.5h。过滤所得混合物，使用MeOH(1×30mL)洗涤滤饼。在减压下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯(1.90g,92％)。LCMS(ES,m/z):200[M+H]+。
步骤4. 2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-乙基酯
在0℃下，将CbzCl(4.00ml,28.0mmol)添加至2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸乙酯(3.91g,18.6mmol)和K2CO3(5.21g,37.3mmol)于EA(20.0mL)和H2O(15.0mL)中的搅拌溶液中。将反应在25℃下搅拌3h。使用EtOAc(3×40mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(1×40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。在过滤后，在减压下浓缩滤液。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至60％)；检测器：UV220nm和254nm)纯化残余物。浓缩所收集级分，得到棕黄色油状物形式的2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-乙基酯(3.60g,55％)。LCMS(ES,m/z):334[M+H]+。
步骤5. 7-[(苄基氧基)羰基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸
将LiOH(1.28g,0.053mmol)添加至2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7,9-二甲酸7-苄基酯9-乙基酯(3.70g,10.5mmol)于THF(10mL)和H2O(10mL)中的溶液中。将反应在25℃下搅拌2h。在真空下蒸发出THF。使用HCl(1mol/L)将所得混合物酸化至pH 4。使用DCM(3×50mL)萃取所得混合物。合并的有机层用盐水(1×40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。在过滤后，在减压下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的7-[(苄基氧基)羰基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸(2.80g,83％)。LCMS(ES,m/z):306[M+H]+。
步骤6. 9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯
向7-[(苄基氧基)羰基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-甲酸(3.00g,9.33mmol)于t-BuOH(10mL)中的搅拌溶液中添加TEA(2.60ml,18.7mmol)和DPPA(3.08g,11.2mmol)。将反应在90℃下搅拌2h。将混合物冷却，并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至60％)；检测器：UV 220nm)纯化残余物。浓缩所收集级分，得到灰白色固体形式的9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯(1.40g,38％)。LCMS(ES,m/z):377[M+H]+。
步骤7.N-[2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯(1.40g,3.53mmol)和碳载钯(1.40g,10％)于乙酸乙酯(50mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到灰白色油状物形式的N-[2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(755mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):243[M+H]+。
步骤8.N-[(3R)-7-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(3R)-7-溴-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(400mg,1.10mmol)、N-[2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(300mg,1.24mmol)、第3代RuPhos预催化剂(92.4mg,0.110mmol)、RuPhos(51.5mg,0.110mmol)和Cs2CO3(1.08g,3.31mmol)于甲苯(8mL)中的混合物在95℃下搅拌3h。将混合物冷却。过滤出固体，并在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的N-[(3R)-7-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(350mg,61％)。LCMS(ES,m/z):524[M+H]+。
步骤9.N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)-4-甲基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(6S)-2-(4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-(氟甲基)-3-甲基吡咯烷-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]氨基甲酸苄酯(350mg,0.683mmol)和碳载钯(190mg,10％)于EA(8mL)中的混合物在28℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)-4-甲基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(250mg,93％)。LCMS(ES,m/z):390[M+H]+。
步骤10.N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)-4-甲基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(300mg,0.791mmol)添加至N-[1-[(6S)-6-氨基-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)-4-甲基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(250mg,0.661mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(151mg,0.725mmol)和TEA(0.280mL,2.72mmol)于DMA(5mL)中的溶液中。将所得溶液在28℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在25min内10％至70％)；检测器：UV 220/254nm)纯化混合物，得到黄色固体形式的N-[1-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5,6,7,8-四氢喹啉-2-基]-4-(氟甲基)-4-甲基吡咯烷-3-基]氨基甲酸叔丁酯(260mg,69％)。LCMS(ES,m/z):580[M+H]+。
步骤11.N-[(5R,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性制备型HPLC(柱：CHIRALPAK IF,2×25cm,5um；流动相A：己烷:DCM(3:1)(含有10mM NH3-MEOH)--HPLC和B：EtOH--HPLC(在20min内保持50％)；流速：15mL/min；检测器：UV 254/220nm)分离N-[7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(260mg,0.431mmol)。收集第三洗脱异构体(RT3＝11.68min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(5S,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第四洗脱异构体(RT4＝13.805min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。并且通过手性制备型HPLC(柱：CHIRALPAK IC,2×25cm,5um；流动相A：己烷:DCM(3:1)(含有0.2％IPA)--HPLC和B：MeOH:DCM(1:1)--HPLC(在20min内保持60％)；流速：20mL/min；检测器：UV 254/220nm)分离混合物A(第一异构体和第二洗脱异构体的混合物)。收集第一洗脱异构体(RT1＝8.3min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(5R,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT2＝15min)并在真空下浓缩，得到黄色固体，其立体化学任意指定为N-[(5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯。LCMS(ES,m/z):580[M+H]+。
步骤12. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(5R,9R)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(5R,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(34.0mg,0.059mmol)和TFA(1mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌0.5h。在真空下浓缩所得混合物。将NH3(7M于MeOH中，2mL)添加至残余物中。将所得溶液搅拌0.5h，并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：X Select CSH Prep C18 OBD柱19×150mm 5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内20％至45％)，流速：25mL/min；检测器UV 254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(5R,9R)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(14.0mg,50％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.48(br s,1H),7.31(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(br s,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),6.08(d,J＝6.8Hz,1H),5.88(s,1H),4.27-4.24(m,1H),4.15-4.12(m,1H),3.81-3.77(m,3H),3.55(d,J＝8.4Hz,1H),3.48(d,J＝8.4Hz,1H),3.39-3.36(m,1H),3.32-3.23(m,2H),3.14-3.11(m,1H),2.92-2.90(m,1H),2.89-2.81(m,2H),2.58(s,3H),2.10-2.06(m,1H),1.72(br s,2H),1.61-1.57(m,1H)。LCMS(ES,m/z):480[M+H]+。
实施例525.(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-(7-氯-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)氨基甲酸苄酯(中间体43)(200mg,0.56mmol)、哌嗪-1-甲酸叔丁酯(140mg,0.75mmol)、RuPhos Pd G3(52mg,0.06mmol)、RuPhos(59mg,0.13mmol)和Cs2CO3(618mg,1.90mmol)于甲苯(5mL)中的溶液在100℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，然后通过添加10mL水来淬灭反应。使用3×10mL乙酸乙酯萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):469[M+H]+。
步骤2.(R)-4-(3-氨基-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(270mg,0.52mmol)和碳载钯(30mg,10％)于乙酸乙酯(20mL)中的悬浮液在25℃下搅拌4h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到褐色油状物形式的(R)-4-(3-氨基-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):335[M+H]+。
步骤3.(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-氨基-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(50mg,0.13mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(34mg,0.16mmol)、HBTU(62mg,0.16mmol)和Et3N(45mg,0.44mmol)于DMA(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。然后通过添加10mL水来淬灭反应。使用3×10mL乙酸乙酯萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在40min内0％增加至100％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):525[M+H]+。
步骤4.(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(30mg,0.05mmol)和TFA(1mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge ShieldRP18 OBD,19×250mm,10μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；梯度：在8min内20％B至38％B)纯化残余物。冻干所收集级分，得到灰白色固体形式的(R)-3-氨基-6-甲基-N-(7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1HNMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.55(br s,1H),7.32-7.27(m,2H),7.22(br s,2H),6.37(d,J＝8.4Hz,1H),4.33-4.20(m,2H),3.99-3.94(m,1H),3.49-3.31(m,5H),2.89-2.74(m,6H),2.59(s,3H)。MS:(ESI,m/z):425[M+H]+。
实施例526.(R)-3-氨基-N-(6-氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在-20℃下，向(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(580mg,1.24mmol)于DCM(25mL)和MeOH(25mL)中的溶液中添加Selectfluor(441mg,1.24mmol)。将所得混合物在25℃下搅拌2h。在真空下去除溶剂。使用水(30mL)稀释残余物。使用DCM(3×30mL)萃取所得混合物。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10-1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):487[M+H]+。
步骤2.(R)-4-(3-氨基-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-(((苄基氧基)羰基)氨基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(150mg,0.31mmol)和碳载钯(20mg,10％)于乙酸乙酯(5mL)中的悬浮液在25℃和氢气氛下搅拌2h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的(R)-4-(3-氨基-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):353[M+H]+。
步骤3.(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(R)-4-(3-氨基-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(90mg,190mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(56.0mg,270mmol)、HBTU(107mg,0.28mmol)和Et3N(77mg,0.76mmol)于DMA(4mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。使用水(10mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×10mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(0.1％TFA)，B：ACN；流速：50mL/min；梯度：在40min内0％B至70％B)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯。MS:(ESI,m/z):543[M+H]+。
步骤4.(R)-3-氨基-N-(6-氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(R)-4-(3-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-6-氟-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-7-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(100mg,0.18mmol)和TFA(1mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。添加NH3于甲醇中的溶液(7M)(5mL)。将所得混合物在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep OBD C18,30×150mm5μm；流动相A：水(10mM NH4HCO3)，B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在7min内20％B至45％B)纯化残余物，得到灰白色固体形式的(R)-3-氨基-N-(6-氟-7-(哌嗪-1-基)-3,4-二氢-2H-吡喃并[2,3-b]吡啶-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.32(d,J＝8.1Hz,1H),7.59(br s,1H),7.36-7.30(m,2H),7.21(br s,2H),4.33-4.19(m,2H),4.01-3.95(m,1H),3.23-3.20(m,4H),2.89-2.73(m,6H),2.58(s,3H)。MS:(ESI,m/z):443[M+H]+。
实施例601. 6-氨基-N-[(3R)-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-甲酰胺
步骤1：3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将N-[(3R)-7-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(500mg,1.32mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(364mg,1.71mmol)、Cs2CO3(1.30g,3.99mmol)、RuPhos(123mg,0.260mmol)、第3代RuPhos预催化剂(110mg,0.130mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在100℃下搅拌3h(反应设置平行3个批次)。将反应混合物冷却。合并所有混合物。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。经由硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.20g,60％)。LCMS(ES,m/z):512[M+H]+。
步骤2. 3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
在-20℃下，将Selectfluor(727mg,2.05mmol)添加至3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(700mg,1.37mmol)于ACN(35mL)、甲醇(35mL)和二氯甲烷(35mL)的混合溶液中的溶液中。将所得溶液在-20℃下搅拌1h，然后缓慢升温至28℃并在28℃下搅拌10h。然后用水(20mL)淬灭反应。蒸发出有机层。水层用二氯甲烷(3×30mL)萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(270mg,37％)。LCMS(ES,m/z):530[M+H]+。
步骤3. 3-[(3R)-3-氨基-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-氨基-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
将碳载钯(220mg,10％)、3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(260mg,0.490mmol)于乙酸乙酯(20mL)中的混合物在28℃下搅拌1.5h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色固体形式的3-[(3R)-3-氨基-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-氨基-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(160mg,82％)。LCMS(ES,m/z):396[M+H]+。
步骤4. 3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物
将HBTU(84mg,0.222mmol)添加至6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-甲酸(43.0mg,0.202mmol)、TEA(0.084mL,0.606mmol)以及3-[(3R)-3-氨基-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-氨基-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(80.0mg,0.202mmol)于DMA(2.50mL)中的溶液中。将所得混合物在29℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱，C18硅胶；流动相A：水(含有0.5％TFA)和B：ACN(在40min内0至100％)；检测器，UV 220nm)纯化残余物。在真空下浓缩收集级分，得到黄色固体形式的3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(70.0mg,55％)。LCMS(ES,m/z):592[M+H]+。
步骤5. 6-氨基-N-[(3R)-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-甲酰胺
将TFA(1.00mL)以及3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(3R)-3-[6-氨基-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-酰胺基]-5,6-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯的混合物(60.0mg,0.101mmol)于DCM(3mL)中的溶液在27℃下搅拌0.5h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD柱,5um,19×150mm；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在12min内20％至55％)；流速：20mL/min；检测器：220nm；检测器，UV 220nm)纯化残余物。收集第一洗脱异构体(Rt1＝9.92min)并冻干，得到白色固体形式的6-氨基-N-[(3R)-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-2-甲基噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-甲酰胺(6.20mg,13％)。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):7.57(d,J＝6.9Hz,1H),7.17(br s,2H),6.36-6.30(m,1H),4.29-4.22(m,2H),3.95-3.88(m,1H),3.38-3.34(m,2H),3.07-3.04(m,2H),2.95--2.87(m,1H),2.80-2.72(m,6H),1.79-1.64(m,4H)。LCMS(ES,m/z):492[M+H]+。
实施例602.N-((2S)-6-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-5-氰基-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1. 3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将N-(6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(500mg,1.32mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(337mg,1.59mmol)、RuPhos(124mg,0.270mmol)、第3代RuPhos预催化剂(110mg,0.130mmol)和Cs2CO3(1.30g,3.99mmol)于甲苯(10mL)中的混合物在100℃下搅拌3h(并行3个批次)。在冷却至室温(20℃)后，将3个批次的混合物溶液合并。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶柱色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.35g,67％)。LCMS(ES,m/z):510[M+H]+。
步骤2. 3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-溴-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
在-10℃下，向3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.10g,2.16mmol)于四氢呋喃(50mL)中的溶液中添加NBS(460mg,2.58mmol)。将所得溶液在-10℃和无光条件下搅拌2h。然后将反应物倒入水(50mL)中。在真空下去除溶剂。使用二氯甲烷(3×50mL)萃取水层。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶柱色谱法(使用1/2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-溴-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.10g,82％)。LCMS(ES,m/z):588,590[M+H]+。
步骤3. 3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
在120℃下，将3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-溴-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.00g,1.70mmol)、Zn(CN)2(1.00g,8.51mmol)和Pd(PPh3)4(393mg,0.340mmol)于NMP(20mL)中的混合物用微波辐照2.5h。在冷却至室温(20℃)后，然后将反应物倒入水(60mL)中。使用二氯甲烷(3×50mL)萃取所得混合物。合并有机层，用水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶柱色谱法(使用1/4乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(600mg,63％)。LCMS(ES,m/z):535[M+H]+。
步骤4. 3-(6-氨基-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(400mg,0.750mmol)和碳载钯(400mg,10％)于乙酸乙酯(20mL)中的混合物在20℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到浅黄色油状物形式的3-(6-氨基-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(200mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):401[M+H]+。
步骤5. 3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
向3-(6-氨基-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(75.0mg,0.190mmol)和3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(47.0mg,0.220mmol)于DMA(2.5mL)中的溶液中添加TEA(0.092mL,0.660mmol)和HBTU(107mg,0.280mmol)。将所得溶液在20℃下搅拌3h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内0％至70％)；流速：60mL/min；检测器：UV254/220nm)纯化残余物，得到黄色固体形式的3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(80.0mg,72％)。LCMS(ES,m/z):591[M+H]+。
步骤6. 3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
经由手性HPLC(柱：CHIRALPAK IC,2×25cm,5um；流动相A：MTBE和B：EtOH(在13min内保持15％)；流速：20mL/min；检测器：220nm)分离3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(80.0mg,0.135mmol)。收集第一洗脱异构体(RT1＝6.944min)并在真空下浓缩，得到白色固体，其立体化学任意指定为3-((S)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。收集第二洗脱异构体(RT2＝8.717min)并在真空下浓缩，得到白色固体，其立体化学任意指定为3-((R)-6-(3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺基)-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS(ES,m/z):591[M+H]+。
步骤7. 3-氨基-N-[(2S)-5-氰基-6-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将3-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1-氰基-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(35.0mg,0.060mmol)和TFA(1mL)于二氯甲烷(3mL)中的溶液在20℃下搅拌20min。在真空下浓缩所得溶液。使用2mL的NH3(7M)于MeOH中的溶液处理残余物。将所得溶液在26℃下搅拌30min，并且然后在真空下浓缩。经由制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD柱,5um,19×150mm；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在7min内30％至60％)；流速：20mL/min；检测器：220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(2S)-5-氰基-6-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(10.0mg,34％)。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ(ppm):8.30(d,J＝8.1Hz,1H),7.66(d,J＝7.5Hz,1H),7.31(d,J＝8.1Hz,1H),7.18(br s,2H),6.78(d,J＝12.0Hz,1H),4.15-4.14(m,1H),3.44-3.42(m,2H),3.33-3.25(m,2H),3.05-2.82(m,5H),2.61-2.55(m,4H),2.07-2.03(m,1H),1.94-1.75(m,3H),1.66-1.63(m,2H)。LCMS(ES,m/z):491[M+H]+。
实施例603. 3-氨基-N-[(2S)-6-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤5. 3-(6-(((苄基氧基)羰基)氨基)-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将N-(6-溴-8-氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基)氨基甲酸苄酯(1.50g,3.97mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.01g,4.78mmol)、甲苯(30mL)、Cs2CO3(3.90g,12.0mmol)、RuPhos(342mg,0.81mmol)、第3代RuPhos预催化剂(330mg,0.39mmol)的混合物在油浴中在100℃下搅拌3h。在冷却至25℃后，然后通过添加水(50mL)淬灭反应。使用二氯甲烷(2×50mL)萃取所得混合物并且合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(1.35g,67％)。LCMS:(ES,m/z):510[M+H]+。
步骤6. 3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
在-20℃下，将Selectfluor(521mg,1.47mmol)逐滴添加至3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-4-氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(500mg,0.980mmol)于甲醇(25mL)和二氯甲烷(25mL)的混合物中的搅拌溶液中。然后将所得溶液在25℃下搅拌10h。在真空下浓缩所得混合物。通过硅胶色谱法(使用3:17乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到白色固体形式的3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(180mg,35％)。LCMS(ES,m/z):528[M+H]+。
步骤7. 3-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(6-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(150mg,0.28mmol)、碳载钯(110mg,10％)和乙酸乙酯(8mL)的混合物在25℃温度和氢气氛下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的3-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(100mg,89％)。LCMS(ES,m/z):394[M+H]+。
步骤8. 3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-(6-氨基-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(100mg,0.250mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(56.0mg,0.270mmol)、TEA(0.1mL,0.76mmol)、HBTU(106mg,0.28mmol)于DMA(3mL)中的溶液在25℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱，C18硅胶；流动相A：H2O(含有0.5％TFA)和B：ACN(在40min内0至100％)；检测器，UV 220nm)纯化混合物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(100mg,67％)。LCMS(ES,m/z):584[M+H]+。
步骤9. 3-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯和3-[(6R)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
通过手性制备型HPLC(柱：手性ART Cellulose-SB,2×25cm,5um；流动相A：MTBE，流动相B：EtOH(在10min内保持10％B)；流速：20mL/min；检测器：254/220nm；RT1:7.015min；RT2:8.508min)分离3-(6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(80.0mg,0.137mmol)。在真空下浓缩第一洗脱异构体(RT1＝7.015min)，得到黄色油状物，其立体化学任意指定为3-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。并且在真空下浓缩第二洗脱异构体(RT2＝8.508min)，得到黄色油状物，其立体化学任意指定为3-[(6R)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯。LCMS(ES,m/z):584[M+H]+。
步骤10. 3-氨基-N-[(2S)-6-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
3-[(6S)-6-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-1,4-二氟-5,6,7,8-四氢萘-2-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(35.0mg,0.060mmol)、三氟乙酸(1mL)于二氯甲烷(3mL)中的溶液。将所得溶液在25℃下搅拌1h。在真空下浓缩所得混合物。通过制备型HPLC(柱,XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm 5um；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在12min内25％至50％)；检测器，UV 220nm)纯化残余物。将产物级分浓缩并冻干，得到灰白色固体形式的3-氨基-N-[(2S)-6-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5,8-二氟-1,2,3,4-四氢萘-2-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(19.1mg,66％)。LCMS(ES,m/z):484[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.17(br s,2H),6.61-6.57(m,1H),4.09-4.07(m,1H),3.40-3.98(m,2H),3.08-3.03(m,2H),2.95-2.62(m,5H),2.59-2.57(m,4H),2.37-2.30(m,1H),2.02-1.99(m,1H),1.80-1.61(m,5H)。
步骤1.顺式-1-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯
将N-[(3R)-7-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(1.00g,2.53mmol)、八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(614mg,2.78mmol)、BTMG(1.73g,10.100mmol)、第3代t-BuXPhos预催化剂(602mg,0.757mmol)和顺式-六氢吡咯并[3,4-b]吡咯-5(1H)-甲酸叔丁酯(644mg,3.04mmol)于DMSO(30mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。然后通过添加水(30mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用盐水(2×100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的顺式-1-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(1.00g,74％)。LCMS(ES,m/z):512[M+H]+。
步骤2.顺式-1-[(3R)-3-氨基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯
将顺式-1-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(1.00g,1.88mmol)和碳载钯(1.10g,10％)于乙酸乙酯(30mL)中的混合物在25℃和氢气氛下搅拌2h。过滤出固体并在真空下浓缩滤液，得到浅黄色固体形式的顺式-1-[(3R)-3-氨基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(750mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):378[M+H]+。
步骤3.顺式-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯
将顺式-1-[(3R)-3-氨基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(720mg,1.72mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(357mg,1.72mmol)、HBTU(1.02g,2.58mmol)和TEA(0.953mL,6.87mmol)于DMA(5mL)中的溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV254/220nm)纯化混合物。浓缩所收集级分，得到浅黄色固体形式的顺式-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(700mg,69％)。LCMS(ES,m/z):568[M+H]+。
步骤4.(3aR,6aR)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯和(3aS,6aS)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯
经由手性Prep-HPLC(柱：Chiralpak IC,2×25cm,5um；流动相A：MTBE(含有10mMNH3-MeOH)和B：EtOH(在12min内保持30％)；流速：20mL/min；检测器：254/220nm；RT1:6.456min；RT2:9.216min)分离顺式-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(700mg,1.18mmol)。收集第一洗脱异构体(RT1:6.456min)并浓缩，得到浅黄色固体，其立体化学任意指定为(3aS,6aS)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯并且收集第二洗脱异构体(RT2:9.216min)并浓缩，得到浅黄色固体，其立体化学任意指定为(3aR,6aR)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯。LCMS(ES,m/z):568[M+H]+。
步骤5. 3-氨基-N-((R)-5-氟-7-((3aS,6aS)-六氢吡咯并[3,4-b]吡咯-1(2H)-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将(3aS,6aS)-1-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-5-甲酸叔丁酯(250mg,0.418mmol)和三氟乙酸(5mL)于二氯甲烷(6mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液。将残余物溶解在NH3溶液(10mL，7M于甲醇中)。将所得溶液在25℃下搅拌30min并在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱，XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm 5μm；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在7min内20％至最高50％)；检测器，UV 254/220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到浅黄色固体形式的N-[(3R)-7-[(3aS,6aS)-八氢吡咯并[2,3-c]吡咯-1-基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(95.0mg,48％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.57(br s,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(br s,2H),5.99(d,J＝11.2Hz,1H),5.81(s,1H),4.31-4.24(m,1H),4.18-4.15(m,1H),3.89-3.81(m,2H),3.43-3.41(m,1H),3.11-3.05(m,1H),2.88-2.63(m,7H),2.59(s,3H),2.05-2.01(m,1H),1.76-1.71(m,1H)。LCMS(ES,m/z):468[M+H]+。
实施例606. 5-氯-N-[(3R)-8-氰基-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺
步骤1. 5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸酯
将7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯(1.20g,5.84mmol)和NCS(3.12g,23.3mmol)于DCM(30mL)中的溶液在25℃下搅拌18h。将所得溶液用水(50ml)稀释，使用DCM(3×30mL)萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:10MeOH/DCM洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯(1.30g,88％)。LCMS(ES,m/z):240,242[M+H]+。
步骤2. 5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸
在<10℃下，将NaOH(1.08g,27.1mmol)添加至5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸甲酯(1.30g,5.42mmol)于THF(20mL)和H2O(20mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌16h。在真空下浓缩THF。使用水(20mL)稀释残余物。使用HCl(1M)将溶液的pH值调节至6并在真空下浓缩混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％B至80％B)；检测器：UV 254/220nm)纯化残余物，得到黄色固体形式的5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸(440mg,34％)。LCMS(ES,m/z):256,258[M+H]+。
步骤3. 3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将BTMG(362mg,2.10mmol)于DMSO(2mL)中的溶液添加至N-[(3R)-7-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(500mg,1.05mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(336mg,1.57mmol)和第3代t-BuXPhos预催化剂(84.0mg,0.105mmol)于DMSO(8mL)中的溶液中。将所得溶液在20℃下搅拌2h。使用水(20mL)淬灭反应。使用乙酸乙酯(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，使用水(3×45mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(460mg,81％)。LCMS(ES,m/z):512[M+H]+。
步骤4. 3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
在0℃下在黑暗中，将NBS(160mg,0.899mmol)添加至3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(460mg,0.899mmol)于THF(20mL)中的溶液中。将所得溶液在0℃下搅拌2h。然后通过添加水(20mL)淬灭反应。使用EA(3×30mL)萃取所得混合物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。经由硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到灰白色固体形式的3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(230mg,41％)。LCMS(ES,m/z):590,592[M+H]+。
步骤5. 3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将叔丁基3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-溴-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基](230mg,0.390mmol)、4-叔丁基-2-(4-叔丁基吡啶-2-基)吡啶(104mg,0.390mmol)、Pd(t-Bu3P)2(99.5mg,0.195mmol)、Zn(50.9mg,0.779mmol)和Zn(CN)2(457mg,3.89mmol)于DMA(6mL)中的混合物在100℃下搅拌1h。使混合物冷却至25℃。过滤出固体并在真空下浓缩滤液。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV 254/220nm)纯化残余物，得到白色固体形式的3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(155mg,70％)。LCMS(ES,m/z):537[M+H]+。
步骤6. 3-[(3R)-3-氨基-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将3-[(3R)-3-[[(苄基氧基)羰基]氨基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(155mg,0.289mmol)和Pd/C(150mg,10％)于EA(15mL)中的混合物在24℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到无色固体形式的3-[(3R)-3-氨基-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(110mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):403[M+H]+。
步骤7. 3-[(3R)-3-[5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-酰胺基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯
将HBTU(118mg,0.313mmol)添加至3-[(3R)-3-氨基-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(105mg,0.261mmol)、5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酸(70.6mg,0.313mmol)和TEA(0.110mL,0.780mmol)于DMA(4mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV 254/220nm)纯化混合物，得到黄色固体形式的3-[(3R)-3-[5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-酰胺基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(120mg,72％)。LCMS(ES,m/z):610,612[M+H]+。
步骤8. 5-氯-N-[(3R)-8-氰基-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺
将3-[(3R)-3-[5-氯-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-酰胺基]-8-氰基-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(60.0mg,0.098mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液搅拌0.5h并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm5μm；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内23％至38％):检测器，UV 220/254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的5-氯-N-[(3R)-8-氰基-7-[3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基]-5-氟-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-7-乙基-7H-吡咯并[2,3-c]哒嗪-3-甲酰胺(19.8mg,39％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):9.19(br s,1H),8.40(s,1H),8.36(s,1H),6.50(d,J＝9.6Hz,1H),4.55-4.50(m,3H),4.41-4.38(m,1H),4.31-4.27(m,1H),3.46-3.44(m,2H),3.32-3.28(m,2H),2.98-2.89(m,4H),1.90-1.89(m,2H),1.65-1.63(m,2H),1.51-1.47(m,3H)。LCMS(ES,m/z):510,512[M+H]+。
实施例611-1. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
实施例611-2. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将NaN3(17.4g,267mmol)于水(58mL)中的溶液添加至6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(29.0g,133mmol)和NH4Cl(7.15g,134mmol)于甲醇(348mL)中的溶液中。将所得溶液在60℃下搅拌16h。在冷却至25℃后，使用NaOH(1M)将pH值调节至7-8。然后通过添加水(100mL)淬灭所得溶液。在真空下去除溶剂并且使用二氯甲烷(2×150mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g，粗制物)。LCMS(ES,m/z):263[M+H]+。
步骤2.反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g,133mmol)和PtO2(10.0g,44.1mmol)于乙酸乙酯(2.00L)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体，并在真空下浓缩滤液，得到浅黄色油状物形式的反式-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g，粗制物)。将反式-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g,127mmol)溶解在THF(500mL)和H2O(500mL)中。然后在5℃下添加TEA(53.0mL,381mmol)和(Boc)2O(33.3g,152mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌16h。在真空下去除溶剂。使用乙酸乙酯(3×300mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。使用乙酸乙酯/石油醚(1:10)洗涤残余物，得到白色固体形式的反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g,82％)。LCMS(ES,m/z):337[M+H]+。
步骤3. 3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯
在-78℃下，将DMSO(15.0mL,339mmol)添加至草酰二氯化物(7.55mL,89.2mmol)于无水THF(120mL)中的溶液中。在-78℃下搅拌15分钟后，在-78℃下添加反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g,89.2mmol)于无水THF(600mL)中的溶液，接着在-78℃下添加TEA(37.2mL,268mmol)。将反应在-60℃下搅拌30分钟。使用H2O(50mL)淬灭反应混合物。收集有机层，并且使用乙酸乙酯(2×30mL)萃取水相。合并有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(使用1/10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯(21.0g,67％)。LCMS(ES,m/z):335[M+H]+。
步骤4. 4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基-3-(丙-2-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在-78℃下，将溴(丙-2-烯-1-基)镁(59.8mL,1M于THF中)添加至3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯(10.0g,29.9mmol)于THF(100mL)中的溶液中。将所得溶液在-78℃至10℃下搅拌2h。所得溶液用水(100mL)淬灭，使用EA(3×100mL)萃取。合并的有机层用盐水(2×200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基-3-(丙-2-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(11.0g,87％)。LCMS(ES,m/z):377[M+H]+。
步骤5. 3-[(2E)-4-溴丁-2-烯-1-基]-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将第2Grubbs(1.24g,1.46mmol)添加至4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基-3-(丙-2-烯-1-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(11.0g,29.2mmol)和3-溴丙-1-烯(14.1g,116mmol)于DCM(200mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h，并且然后在真空下浓缩。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：CH3CN(在30min内0％至70％)；检测器：220/254nm)纯化残余物，得到灰白色固体形式的3-[(2E)-4-溴丁-2-烯-1-基]-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(6.80g,47％)。LCMS(ES,m/z):469,471[M+H]+。
步骤6.顺式-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-8-烯-2-甲酸苄酯
在25℃下，将t-BuOK(20.8mL,1M于THF中)添加至3-[(2Z)-4-溴丁-2-烯-1-基]-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(4.90g,10.4mmol)于DMSO(40.0mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌1h。使用冰/水(10mL)淬灭反应。使用EA(3×50mL)萃取所得溶液。将有机层浓缩并且然后经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.5％TFA)和B：CH3CN(在45min内0％至70％)；检测器：200/210nm)纯化，得到黄色油状物形式的顺式-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-8-烯-2-甲酸苄酯(550mg,12％)。(构型假定为顺式)。LCMS(ES,m/z):389[M+H]+。
步骤7.顺式-N-[6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸-8-烯-2-甲酸苄酯(550mg,1.41mmol)和Pd(OH)2/C(300mg,20％)于MeOH(20mL)中的混合物在35℃和氢气氛(气囊)下搅拌2h。过滤出固体，并在真空下浓缩滤液，得到灰白色油状物形式的顺式-N-[6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(350mg,88％)。LCMS(ES,m/z):389[M+H]+。
步骤8.顺式-N-[(3R)-7-[4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(3R)-7-溴-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(200mg,0.552mmol)、顺式-N-[6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(155mg,0.607mmol)、第3代RuPhos预催化剂(46.2mg,0.055mmol)、RuPhos(51.5mg,0.110mmol)和Cs2CO3(539mg,1.65mmol)于甲苯(10.0mL)中的混合物在95℃下搅拌3h。将混合物冷却。过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:2乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的顺式-N-[(3R)-7-[4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(110mg,35％)。LCMS(ES,m/z):538[M+H]+。
步骤9.顺式-N-[2-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯
将顺式-N-[(3R)-7-[4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(110mg,0.205mmol)和Pd/C(100mg,10％)于EA(10.0mL)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到白色固体形式的顺式-N-[2-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,80％)。LCMS(ES,m/z):404[M+H]+。
步骤10.顺式-N-[2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(78.9mg,0.208mmol)添加至顺式-N-[2-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,0.173mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(43.3mg,0.208mmol)和TEA(0.070mL,0.504mmol)于DMA(3mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV 254/220nm)纯化混合物，得到黄色固体形式的顺式-N-[2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,64％)。LCMS(ES,m/z):594[M+H]+。
步骤11.N-[(4S,5R)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(4R,5S)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯
经由手性制备型HPLC在下列条件(柱：CHIRALPAK IA,2×25cm,5um；流动相A：HEX:DCM＝3:1(含有0.2％IPA)和B：EtOH(在16min内保持50％)；流速：16mL/min；检测器，UV254/220nm)下分离N-[2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(70.0mg,0.118mmol)。收集第一洗脱异构体(RT1＝8.989nm)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4S,5R)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(25.0mg,33％)；收集第二洗脱异构体(RT2＝14.735min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4R,5S)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(20.0mg,27％)。LCMS(ES,m/z):594[M+H]+。
步骤12. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4S,5R)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(25.0mg,0.042mmol)和TFA(0.500mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液。将NH3(2.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h，并且然后在真空下浓缩。经由制备型HPLC(柱，XBridge Shield RP18 OBD柱,30×150mm5um；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在7min内30％至55％)；检测器，UV 220/254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(9.3mg,43％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
步骤13. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4R,5S)-2-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-4-基]氨基甲酸叔丁酯(20.0mg,0.034mmol)和TFA(0.500mL)于DCM(1.50mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得溶液。将NH3(2.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h，并且然后在真空下浓缩。经由制备型HPLC(柱,XBridge Shield RP18 OBD柱,30×150mm 5um；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在7min内30％至55％)；检测器，UV 220/254nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S)-4-氨基-6-氧杂-2-氮杂螺[4.5]癸烷-2-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(10.2mg,60％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝7.6Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(s,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.11(d,J＝8.4Hz,1H),5.91(s,1H),4.29-4.26(m,1H),4.16-4.12(m,1H),3.82-3.80(m,1H),3.77-3.64(m,2H),3.60-3.58(m,1H),3.37-3.35(m,1H),3.11-3.03(m,2H),2.85-2.81(m,3H),2.59(s,3H),1.76-1.70(m,2H),1.58-1.43(m,6H)。LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
实施例612-1. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
实施例612-2. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
实施例612-3. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
实施例612-4. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
步骤1.反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将NaN3(17.4g,267mmol)于水(58mL)中的溶液添加至6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-甲酸苄酯(29.0g,133mmol)和NH4Cl(7.15g,134mmol)于甲醇(348mL)中的溶液中。将所得溶液在60℃下搅拌16h。在冷却至25℃后，使用NaOH(1M)将pH值调节至7-8。然后使用水(100mL)稀释所得溶液。在真空下去除溶剂并且使用二氯甲烷(2×150mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩，得到浅黄色油状物形式的反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g，粗制物)。LCMS(ES,m/z):263[M+H]+。
步骤2.反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
将反式-3-叠氮基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g,133mmol)和PtO2(10.0g,44.1mmol)于乙酸乙酯(2.00L)中的混合物在25℃和氢气氛(气囊)下搅拌16h。过滤出固体，并在真空下浓缩滤液，得到浅黄色油状物形式的反式-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g，粗制物)。将反式-3-氨基-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g,127mmol)溶解在THF(500mL)和H2O(500mL)中。然后在5℃下添加TEA(53.0mL,381mmol)和(Boc)2O(33.3g,152mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌16h。在真空下去除溶剂。使用乙酸乙酯(3×300mL)萃取残余物。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。使用乙酸乙酯/石油醚(1:10)洗涤残余物，得到白色固体形式的反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(35.0g,82％)。LCMS(ES,m/z):337[M+H]+。
步骤3. 3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯
在-78℃下，将DMSO(15.0mL,339mmol)添加至草酰二氯化物(7.55mL,89.2mmol)于无水THF(120mL)中的溶液中。在-78℃下搅拌15分钟后，在-78℃下添加反式-3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(30.0g,89.2mmol)于无水THF(600mL)中的溶液，接着在-78℃下添加TEA(37.2mL,268mmol)。将反应在-60℃下搅拌30分钟。使用H2O(50mL)淬灭反应。收集有机层，并且使用乙酸乙酯(2×30mL)萃取水相。合并有机物，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(使用1/10乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到浅黄色固体形式的3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯(21.0g,67％)。LCMS(ES,m/z):335[M+H]+。
步骤4. 3-(丁-3-烯-2-基)-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯
在-78℃下，将(丁-3-烯-2-基)(氯)镁溶液(46.6mL,0.25M于THF中)添加至3-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-氧代吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.50g,4.48mmol)于THF(40mL)中的搅拌溶液中。温度自然升高至-10℃。然后通过NH4Cl(40mL，饱和)淬灭反应。所得混合物用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩滤液。经由反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内5％至30％)；检测器：UV254/220nm)纯化残余物，得到3-(丁-3-烯-2-基)-4-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(1.10g,60％)。LCMS(ES,m/z):391[M+H]+。
步骤5. 4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-羟基-3-(4-羟基丁烷-2-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯
在0℃下，将9-硼杂双环[3.3.1]壬烷溶液(30.7mL,0.5M于THF中)添加至3-(丁-3-烯-2-基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-羟基吡咯烷-1-甲酸苄酯(600mg,1.53mmol)于THF(40mL)中的溶液中。将混合物在21℃下搅拌15小时后，在0℃下向溶液中添加H2O2(20mL,30％)和NaOAc(20mL，饱和)。将所得混合物在20℃下搅拌1h。在0℃下使用MeOH淬灭反应并且将溶液在21℃下搅拌2小时。在减压下浓缩所得混合物。将残余物溶解于乙酸乙酯(10mL)中，使用水(2×5mL)洗涤。合并有机层，经无水硫酸钠干燥，过滤并在真空下浓缩。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％TFA)和B：ACN(在20min内20％至85％)；检测器：220/254nm)纯化残余物，得到黄色油状物形式的4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-羟基-3-(4-羟基丁烷-2-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(500mg,76％)。LCMS(ES,m/z):409[M+H]+。
步骤6. 9-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯
将4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-羟基-3-(4-羟基丁烷-2-基)吡咯烷-1-甲酸苄酯(440mg,1.08mmol)、Et3N(0.450mL,3.23mmol)和MsCl(172mg,1.51mmol)于DCM(4mL)中的溶液在20℃下搅拌1h并在60℃下搅拌1h。在真空下浓缩混合物。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有0.05％NH4HCO3)和B：ACN(在20min内15％至80％ACN)；检测器：UV 254/220nm)纯化残余物。在真空下浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的9-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯(400mg,54％)。LCMS(ES,m/z):391[M+H]+。
步骤7.N-[4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-甲酸苄酯(550mg,1.41mmol)、Pd/C(400mg,10％)和EA(15mL)的混合物在28℃和氢气氛(气囊)下搅拌3h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色固体形式的N-[4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(200mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):257[M+H]+。
步骤8.N-[(3R)-7-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯
将N-[(3R)-7-溴-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(200mg,0.621mmol)、N-[4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(142mg,0.621mmol)、第3代RuPhos预催化剂(46.2mg,0.062mmol)、RuPhos(51.2mg,0.110mmol)、Cs2CO3(539mg,1.66mmol)和甲苯(7mL)的混合物在95℃下搅拌3h。在冷却至28℃后，过滤出固体。在真空下浓缩滤液。通过硅胶色谱法(使用1:3乙酸乙酯/石油醚洗脱)纯化残余物，得到黄色固体形式的N-[(3R)-7-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(110mg,33％)。LCMS(ES,m/z):538[M+H]+。
步骤9.N-[7-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将N-[(3R)-7-(9-[[(叔丁氧基)羰基]氨基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基)-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]氨基甲酸苄酯(110mg,0.205mmol)和Pd/C(110mg,10％)于EA(5mL)中的混合物在28℃和氢气氛(气囊)下搅拌1h。过滤出固体。在真空下浓缩滤液，得到黄色油状物形式的N-[7-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg，粗制物)。LCMS(ES,m/z):404[M+H]+。
步骤10.N-[7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
将HBTU(112mg,0.297mmol)添加至N-[7-[(3R)-3-氨基-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.248mmol)、3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酸(51.6mg,0.248mmol)和TEA(0.100mL,0.987mmol)于DMA(2mL)中的溶液中。将所得溶液在25℃下搅拌2h。通过反相色谱法(柱：C18硅胶；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在30min内5％至80％)；检测器：UV 254/220nm)纯化所得混合物。浓缩所收集级分，得到黄色固体形式的N-[7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,65％)。LCMS(ES,m/z):594[M+H]+。
步骤11.N-[(4S,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯、N-[(4S,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯、N-[(4R,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯和N-[(4R,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯
通过手性制备型HPLC(柱：Chiralpak IA,2×25cm,5um；流动相A：HEX:DCM＝3:1(含有0.2％IPA)和B：IPA:DCM＝1:1(在16min内保持60％)；流速：20mL/min；220/254nm)分离N-[7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.168mmol)。收集第一洗脱异构体(RT1:5.379min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4S,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,14％)。收集第二洗脱异构体(RT2:7.043min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4S,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,14％)。收集第三洗脱异构体(RT3:9.337min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4R,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,14％)。收集第四洗脱异构体(RT4:14.107min)并在真空下浓缩，得到黄色固体形式的N-[(4R,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,14％)。LCMS(ES,m/z):594[M+H]+。
步骤12. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4S,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(11.0mg,0.019mmol)和TFA(1mL)于DCM(2mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(2.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Shield RP18 OBD柱,5um,19×150mm；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内30％至50％)；流速：25mL/min；检测器：220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(7.20mg,76％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(br s,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(brs,2H),6.87(d,J＝8.0Hz,1H),6.08(d,J＝6.8Hz,1H),5.89(s,1H),4.30-4.20(m,1H),4.16-4.13(m,1H),3.86-3.72(m,3H),3.41-3.32(m,1H),3.26-3.21(m,2H),3.07-3.04(m,1H),2.86-2.82(m,3H),2.59(s,3H),2.30-2.24(m,1H),2.17-2.13(m,1H),1.93(br s,2H),1.64-1.59(m,1H),1.03(d,J＝6.8Hz,3H)。LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
步骤13. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4R,5R,9S)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(12.0mg,0.020mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(3mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(2mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内30％至50％)；流速：25mL/min；检测器：220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5R,9S)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(8.10mg,78％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(br s,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.21(brs,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.05-6.03(m,1H),5.84(s,1H),4.31-4.21(m,1H),4.15-4.12(m,1H),3.98-3.95(m,1H),3.81-3.76(m,1H),3.70-3.67(m,1H),3.39-3.32(m,1H),3.29-3.25(m,2H),3.10-3.07(m,1H),2.85-2.80(m,3H),2.59(s,3H),2.20-2.12(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.88-1.79(m,1H),1.50(br s,2H),1.14(d,J＝6.8Hz,3H)。LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
步骤14. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4S,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(10.0mg,0.017mmol)和TFA(1mL)于DCM(2mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(1.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm,5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内30％至50％)；流速：60mL/min；检测器：220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4S,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(7.30mg,84％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(br s,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(brs,2H),6.86(d,J＝8.4Hz,1H),6.08-6.06(m,1H),5.88(s,1H),4.31-4.20(m,1H),4.15-4.12(m,1H),3.83-3.72(m,3H),3.40-3.32(m,1H),3.25-3.18(m,2H),3.06-3.04(m,1H),2.85-2.82(m,3H),2.59(s,3H),2.28-2.22(m,1H),2.20-2.11(m,1H),1.63-1.58(m,3H),1.03(d,J＝6.8Hz,3H)。LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
步骤15. 3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
将N-[(4R,5S,9R)-7-[(3R)-3-[3-氨基-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-酰胺基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-7-基]-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-9-基]氨基甲酸叔丁酯(12.0mg,0.020mmol)和TFA(1.00mL)于DCM(2mL)中的溶液在25℃下搅拌30min。在真空下浓缩所得混合物。将NH3溶液(1.00mL，7M于MeOH中)添加至残余物。将所得溶液在25℃下搅拌0.5h并且然后在真空下浓缩。通过制备型HPLC(柱：XBridge Prep C18 OBD柱,19×150mm5um；流动相A：水(含有10mmol/L NH4HCO3)和B：ACN(在8min内30％至50％)；流速：25mL/min；检测器：220nm)纯化残余物。冻干所收集级分，得到白色固体形式的3-氨基-N-[(3R)-7-[(4R,5S,9R)-9-氨基-4-甲基-1-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-3,4-二氢-2H-1-苯并吡喃-3-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺(7.60mg,73％)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(br s 7.6Hz,1H),7.32(d,J＝8.4Hz,1H),7.21(br s,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,1H),6.05-6.03(m,1H),5.84(s,1H),4.31-4.21(m,1H),4.15-4.12(m,1H),3.98-3.95(m,1H),3.82-3.77(m,1H),3.70-3.67(m,1H),3.40-3.32(m,1H),3.29-3.25(m,2H),3.10-3.08(m,1H),2.85-2.80(m,3H),2.59(s,3H),2.19-2.12(m,1H),2.07-1.99(m,1H),1.88-1.79(m,1H),1.51(br s,2H),1.14(d,J＝6.8Hz,3H)。LCMS(ES,m/z):494[M+H]+。
实施例A-1(a)：生物化学测定：USP28活性的泛素-罗丹明110测定。
在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0,(1M Tris-HCl,pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma 63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma,G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma,T9284-10L)的测定缓冲液中，以9μL最终体积进行测定。将毫微升量的于DMSO中的10个点的3倍连续稀释液预先分配至1536测定板(Corning,#3724BC)中，最终测试浓度为25μM至1.3nM(分别为最高至最低剂量)。酶USP28、构建体加His标签的USP28-FL-哺乳动物(蛋白质表达和纯化程序阐述于下文中)。将浓度和温育时间优化以实现最大信号/背景，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中的最终酶浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，UbiQ-126)浓度为25nM并且[Ub-Rh110]<<Km。向与USP25一起预温育30分钟的测定板(使用化合物预压印)中添加3μL2x酶并且然后向测定板中添加3μL的2×Ub-Rh110。将板在室温下温育45分钟，然后添加3μL终止溶液(最终浓度为10mM柠檬酸(Sigma,251275-500G))。在Envision(在485nm下激发并在535nm下发射；Perkin Elmer)上或在PheraSTAR(在485nm下激发并在535nm下发射；BMG Labtech)上读取荧光。
构建体加His标签的USP28-FL-哺乳动物的蛋白质表达和纯化的程序
在Expi293f细胞(序列源自uniprot ID:Q96RU2-1)中进行USP28(1-1077)-TEV-6*His(pTT5载体)的表达。将细胞重悬于裂解缓冲液B(50mM pH 8.0二羟乙甘氨酸(Bicine)、20mM NaCl、5％甘油、0.1％CHAPS、5mMβ-ME、1mM PMSF、1ug/ml亮肽素(Leupeptin)、1ug/ml胃蛋白酶抑制素(Pepstatin))中并通过声波处理来裂解。通过离心去除不溶性材料并且将上清液加载于用Ni缓冲液A(50mM pH 8.0二羟乙甘氨酸、20mM NaCl、5％甘油、0.1％CHAPS、5mMβ-ME.)平衡的Ni-NTA柱(GE Healthcare)上，并使用Ni缓冲液A+20mM咪唑洗涤直至A280达到基线为止。使用Ni缓冲液B(50mM pH 8.0二羟乙甘氨酸、20mM NaCl、5％甘油、0.1％CHAPS、5mMβ-ME、300mM咪唑)洗脱蛋白质。使用用50mM pH 8.0二羟乙甘氨酸、20mM NaCl、5％甘油、0.1％CHAPS、5mMβ-ME平衡的SuperdexTM 200 10/300GL柱(GE Healthcare)进一步纯化蛋白质。将蛋白质浓缩至2.5mg ml-1，急速冷冻于液体N2中并储存于-80℃下。
实施例A-1(b)：生物化学测定：USP28活性的泛素-罗丹明110测定。
以20μL最终体积在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0,(1M Tris-HCl,pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、2mM CaCl2(1M氯化钙溶液；Sigma#21114)、2mM BME(2-巯基乙醇；Sigma 63689-25ML-F)、0.01％Prionex(0.22μM过滤，Sigma#G-0411)和0.01％Triton X-100的测定缓冲液中实施每个测定。将储备化合物于DMSO中的10mM溶液储存于-20℃下。在测定之前至多1个月，将2mM测试化合物预分配至测定板(黑色，低体积；Corning#3820)中并在-20℃下冷冻。使预压印测定板在测定当天达到室温。对于筛选而言，预分配100nL 2mM溶液直至最终筛选浓度为10μM(DMSO(fc)＝0.5％)。将酶(USP28，构建体USP28(USP28-5(1-1077)-TEV-6*His；LifeSensors)浓度和温育时间优化以实现最大信号/背景，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中的最终酶浓度为400pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110,R&D Systems#U-555)浓度为25nM并且[Ub-Rh110]<<Km。向测定板(使用化合物预压印)中添加10μL 2x酶(与2×Ub-Rh110同时或与USP28一起预温育40分钟)，然后向化合物板中添加10μL 2×Ub-Rh110。将板在室温下堆叠温育90分钟，然后在Envision(在485nm下激发并在535nm下发射；Perkin Elmer)上或在PheraSTAR(在485nm下激发并在535nm下发射；BMG Labtech)上读取荧光。
对于随访研究，以15μL最终体积在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0,(1M Tris-HCl,pH8.0溶液；Corning 46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma 63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma,G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma,T9284-10L)的测定缓冲液中实施每个测定。将毫微升量的于DMSO中的8点或10点的3倍连续稀释液预分配至测定板(Perkin Elmer,ProxiPlate-384 F Plus,#)中，最终测试浓度分别为25μM至11nM或25μM至1.3nM。将酶USP28(即构建体USP28(USP28-5(1-1077)-TEV-6*His；LifeSensors))浓度和温育时间优化以实现最大信号/背景，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中的最终酶浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110,R&D Systems#U-555)浓度为25nM并且[Ub-Rh110]<<Km。向与USP28一起预温育30分钟的测定板(使用化合物预压印)中添加5μL 2x酶并且然后向测定板中添加5μL 2×Ub-Rh110。将板在室温下堆叠温育20分钟，然后添加5μL终止溶液(最终浓度为10mM柠檬酸(Sigma,251275-500G))。在Envision(在485nm下激发并在535nm下发射；Perkin Elmer)上或在PheraSTAR(在485nm下激发并在535nm下发射；BMG Labtech)上读取荧光。
实施例A-2：体内异种移植研究。
向小鼠侧腹皮下注射人嗜酸性粒细胞EOL-1(DSMZ编号ACC386)细胞(NCI)。监测细胞注射(圆圈，图2A)和仅媒介物注射(三角形，图2B)，并且当肿瘤达到临界大小(例如，约1000mm3)时，将小鼠随机分到包括媒介物对照和参考标准组的处理组中。如图2B所示，各组如下：第1组，每隔一天经口施用媒介物；第2组，每隔一天经口施用120mg/kg的第一测试化合物((S)-氨基-N-(5-氟-7-(哌嗪-1-基)色烷-3-基)-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺)；第3组，每隔一天经口施用80mg/kg的第一测试化合物；第4组，每天两次皮下施用80mg/kg的第一测试化合物，此后每隔一天；第5组，每天两次皮下施用60mg/kg的第一测试化合物，连续四天，然后三天不给药。在图2C中，第6组代表每隔一天经口施用媒介物；第7组，每天两次皮下施用50mg/kg的第一测试化合物，连续五天，然后两天不给药；第8组，每天两次经口施用40mg/kg的第二测试化合物(7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺)；以及第9组，每天两次经口施用60mg/kg的第二测试化合物。在指定天数对小鼠称重并使用游标卡尺测量肿瘤。根据式(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。施用测试化合物显示出随着时间的流逝肿瘤生长减慢。
实施例A-3：生物化学测定：USP25活性的泛素-罗丹明110测定。
以9μL最终体积在含有20mM Tris-HCl(pH 8.0,(1M Tris-HCl,pH 8.0溶液；Corning 46-031-CM))、3mM BME(2-巯基乙醇；Sigma63689-25ML-F)、0.03％BGG(0.22μM过滤，Sigma,G7516-25G)和0.01％Triton X-100(Sigma,T9284-10L)的测定缓冲液中实施测定。将毫微升量的于DMSO中的10点的3倍连续稀释液预分配至1536测定板(Corning,#3724BC)中，最终测试浓度为25μM至1.3nM(分别为最高至最低剂量)。酶USP25，构建体USP25-His6(Boston Biochem E-546)。将浓度和温育时间优化以实现最大信号/背景，同时在固定底物浓度下维持初始速度条件。测定中的最终酶浓度为75pM。最终底物(Ub-Rh110；泛素-罗丹明110，R&D Systems#U-555)浓度为25nM并且[Ub-Rh110]<<Km。向与USP25一起预温育30分钟的测定板(使用化合物预压印)中添加3μL 2x酶并且然后向测定板中添加3μL 2×Ub-Rh110。将板在室温下温育45分钟，然后添加3μL终止溶液(最终浓度为10mM柠檬酸(Sigma,251275-500G))。在Envision(在485nm下激发并在535nm下发射；Perkin Elmer)上或在PheraSTAR(在485nm下激发并在535nm下发射；BMG Labtech)上读取荧光。
对于测定形式实施例A-1(a)、A-1(b)和A-2，基于下列方程式将数据报告为与对照孔相比的抑制百分比：抑制％＝1-((FLU-Ave低)/(Ave高-Ave低))，其中FLU＝所测量荧光，Ave低＝无酶对照的平均荧光(n＝16)，并且Ave高＝DMSO对照的平均荧光(n＝16)。通过Activity Base软件包：IDBS XE Designer模型205中所包括标准4参数逻辑拟合算法的曲线拟合来测定IC50值。使用Levenburg Marquardt算法来拟合数据。
根据本公开的生物化学IC50测定中的化合物活性(IC50范围)根据下列报告于下表24中：
“+”:>2μM；“++”:0.2-2μM；“+++”:0.05-0.2μM；“++++”:0.001-0.05μM。
表24：
表25：
表26：
表27：
表28：
本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定，表24、表25、表26、表27和表28的化合物可使用如本文所公开的合成方案或其组合制备。
等同物
本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所具体阐述的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在涵盖于所附权利要求的范围内。

Claims (16)

1.一种式(I)化合物：
或其药学上可接受的形式，其中
Y选自C(R3)和N；
R'选自H和CH3；
R1选自任选地被一个或多个选自R5的取代基取代的含有一个或多个选自N、O和S的环杂原子并且其余环原子是C的6-11元杂芳基；每个R5，如果存在，独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和卤素；
R2选自N连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环4-12元杂环基和C连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环4-12元杂环基，其中所述杂环基任选地被一个或多个R5取代，并且此外其中任何含氢的R2基团可具有一个或多个被氘置换的氢；每个R5，如果存在，独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基和卤素，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基和(C1-C6)卤代烷氧基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代，并且其中任何含氢的R5基团可具有一个或多个被氘置换的氢；
每个R3独立地选自H、氘和卤素；
R4选自H、氘、(C1-C6)烷基和卤素；
n是0、1或2。
2.如权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(II)：
或其药学上可接受的形式，其中R1、R2、R3、R4、R5和n都如关于式(I)所定义。
3.如权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(III)：
或其药学上可接受的形式，其中
R1选自任选地被一个或多个R5取代的含有一个或多个选自N、O和S的环杂原子并且其余环原子是C的8-11元杂芳基；每个R5，如果存在，独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和卤素；
R2选自N连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环4-12元杂环基和C连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环4-12元杂环基，所述杂环基任选地被一个或多个R5取代；每个R5，如果存在，独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基和卤素，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基和(C1-C6)卤代烷氧基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1或2。
4.如权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(IV)：
及其药学上可接受的形式，其中R'、R1、R2、R3、R4、R5和n都如关于式(I)所定义。
5.如权利要求1所述的化合物，所述化合物具有式(V)：
或其药学上可接受的形式，其中
R1选自任选地被一个或多个R5取代的含有一个或多个选自N、O和S的环杂原子并且其余环原子是C的8-9元杂芳基；每个R5，如果存在，独立地选自-NH2、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基和卤素；
R2选自任选地被一个或多个R5取代的N连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环4-12元杂环基；每个R5，如果存在，独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基和卤素，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基和(C1-C6)卤代烷氧基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1或2或3。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中任选地被R5取代的R1选自以下的基团：
7.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中任选地被R5取代的R2选自以下基团：
8.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中任选地被R5取代的R1选自
并且任选地被R5取代的R2选自
9.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中R1选自
其中B选自键或C；
Z选自N、S和C(Rii)；
Rii选自H、CH3和R5；
R2选自被一至三个R5取代的N连接的含有碳和取自氧、氮或硫的杂原子并且其中全部的环碳或杂原子并不共用离域π电子的单环或多环5-8元杂环基；
每个R5，如果存在，独立地选自-OH、-NH2、NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基、(C1-C6)卤代烷氧基和卤素，其中-NH2、-NHC(O)CH3、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)卤代烷基和(C1-C6)卤代烷氧基中的每一者任选地被一个或多个独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH2和-OH的取代基取代；并且
n是0、1或2。
10.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中
任选地被R5取代的R1选自
并且
任选地被R5取代的R2选自
11.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中所述化合物是
a.USP28抑制剂化合物，其在USP28的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-2微摩尔浓度的IC50；和/或
b.USP25抑制剂化合物，其在USP25的泛素-罗丹明110测定中具有0.001-2微摩尔浓度的IC50。
12.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自以下，或其药学上可接受的形式：
13.如权利要求1所述的化合物，所述化合物选自下列化合物：
23-1：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
23-2：7-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
23-3：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-4：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-5：3-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-6：7-氨基-3-甲基-N-[(6S)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
23-7：3-氨基-6-甲基-N-[(6S)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-8：3-氨基-6-甲基-N-[(6R)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-9：6-氨基-2-甲基-N-[(6S)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-d][1,3]噻唑-5-甲酰胺
23-12：3-氨基-N-[(6S)-2-{3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基}-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-13：7-氨基-N-[(6S)-2-{3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基}-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
23-14：3-氨基-4,6-二甲基-N-[(6S)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-17：3-氨基-N-[(6S)-4-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
23-18：3-氨基-N-[(6S)-2-{3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基}-4-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
24-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
24-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
25：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
26-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺26-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺27-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
27-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
28-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
28-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
29-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(9S)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
29-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(9R)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
30-1：3-氨基-N-[(6S)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
30-2：3-氨基-N-[(6R)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
31-3：3-氨基-6-甲基-N-[(6'S)-2'-(哌嗪-1-基)-6',7'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,8'-喹啉]-6'-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
31-4：3-氨基-6-甲基-N-[(6'R)-2'-(哌嗪-1-基)-6',7'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,8'-喹啉]-6'-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
142：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-乙氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
203：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-5-氟-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
204：3-氨基-5-氟-6-甲基-N-[(6S)-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
205：3-氨基-6-甲基-N-[(6S,8S)-8-甲基-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
206：3-氨基-6-甲基-N-[(6R,8S)-8-甲基-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
207：3-氨基-6-甲基-N-[(6S,8R)-8-甲基-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
208：3-氨基-6-甲基-N-[(6R,8R)-8-甲基-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
210：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
211：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
239：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
240：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
254：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-乙氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
255：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-乙氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
269：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
270：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
279：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
280：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
285：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-环丁氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
296：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
297：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
298：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
299：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺
300：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
301：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
302：3-氨基-N-[(6R)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
303：3-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-3-氟-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
311：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-甲氧基-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
312：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-甲氧基-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
320：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
321：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
322：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
327：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
328：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
331：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-羟基-3-甲基-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
332：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-羟基-3-甲基-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
341：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-4-氨基-3-(甲氧基甲基)-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺342：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-4-氨基-3-(甲氧基甲基)-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺343：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-4-氨基-3-(甲氧基甲基)-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺344：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-4-氨基-3-(甲氧基甲基)-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺345：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
346：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
347：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
354：3-氨基-N-[(6S)-2-{3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基}-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
363：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-(三氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
364：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(三氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
376：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(二氟甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
377：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(二氟甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
384：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
385：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
427：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
428：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-4-氨基-3-甲氧基-3-甲基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
430：3-氨基-N-[(6S)-2-[(5S,9R)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
431：3-氨基-N-[(6S)-2-[(5R,9S)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
437：3-氨基-N-[(6S)-2-[(5R,9R)-9-氨基-2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
441：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-(氟甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
442：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-(氟甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。
14.一种组合物，所述组合物包含至少一种如权利要求1-13中任一项所述的化合物和生物学上可接受的载体。
15.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐，所述化合物选自由以下组成的组：
23-1：7-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺；
23-2：7-氨基-N-[(6R)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-甲氧基吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-3-甲基噻吩并[2,3-b]吡嗪-6-甲酰胺；
24-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
24-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
25：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-氨基-4-(二氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
26-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4R)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
26-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4S)-3-(甲氧基甲基)-4-(甲基氨基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
27-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
27-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(氟甲基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
28-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
28-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3R,4R)-3-氨基-4-(2-甲氧基乙氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
29-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(9S)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
29-2：3-氨基-N-[(6S)-2-[(9R)-9-氨基-1,4-二氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬烷-7-基]-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
30-1：3-氨基-N-[(6S)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺
30-2：3-氨基-N-[(6R)-3-氟-2-(哌嗪-1-基)-5,6,7,8-四氢喹啉-6-基]-6-甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺；
31-1：3-氨基-N-[(6S)-2-[(3S,4S)-3-氨基-4-(丙烷-2-基氧基)吡咯烷-1-基]-5,6,7,8-四氢喹唑啉-6-基]-4,6-二甲基噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺。
16.化合物，其为：
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