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CN112852881A - 利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法 - Google Patents

利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种利用细胞穿膜肽（CPPs）增强腺相关病毒9型转导效率的方法，可用于增强载体将转基因递送至患者的中枢神经系统（CNS）的能力。通过施用CPPs和重组腺相关病毒9型（rAAV9），可以提高rAAV9穿过血脑屏障（BBB）的效率，并且极大的提高了转基因在中枢神经系统的表达，同时能够避免出现过度的免疫反应，大大拓展了药物制剂向脑和/或中枢神经系统的细胞递送核酸的临床前景。

Description

利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的 方法
技术领域
本发明涉及一种促进病毒载体转导效率方法，具体涉及一种利用细胞穿膜肽促进AAV9在中枢神经系统基因表达的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
重组腺相关病毒（recombination adeno-associated virus, rAAV）已在基因治疗领域广泛使用了数十年，并已广泛用于眼部疾病，癌症和血管疾病等，但是由于其通过血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）传递rAAV载体的效率非常低，其在中枢神经系统（CNS）疾病治疗中的应用受到严重限制。
血脑屏障是一种高度选择性的渗透屏障，可将循环血液与中枢神经系统的脑细胞外液分开，并阻止大多数药物从血液进入大脑。它由毛细血管内皮细胞形成。星形胶质细胞是哺乳动物脑中神经胶质细胞的主要类型，并且是形成血脑屏障所必需的。它们为中枢神经系统中的伙伴神经元提供多种支持功能，例如发育过程中的神经元指导以及终生的营养和代谢支持。
已经有许多研究致力于提高大脑中AAV载体的转导效率，但是目前为止这方面的进展仍旧非常有限。一些临床前研究表明，工程化的AAV载体显示出积极的结果，但进一步的研究发现，这些AAV载体可能无法增强大型动物和人类体内的转导效率。目前尚不清楚病毒衣壳上的突变是否会影响其生产能力，以及是否会导致任何安全隐患，并且AAV工程既费时又费钱。因此，有必要寻找一种有效且经济的策略来改善CNS中的AAV转导效率。
据报道，细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides, CPPs）可以在体内和体外增强AAV2和AAV8的转导，并且在体内没有检测到CPPs的细胞毒性。过去的研究已知THR肽能够增加AAV8在大脑中的BBB穿越能力和转导效率，但是与全身注射AAV8/多肽后的大脑相比，在肝脏中发现的AAV8病毒体数量要多得多（约175倍），即AAV8是具有高度肝向性的载体（Zhang X, He T, Chai Z, Samulski RJ, and Li C. Biomaterials. 2018; 176: 71-83），该结果表明AAV8不是将靶基因递送至大脑的理想AAV载体。尽管CPPs可以增强AAV定向转导，但是CPPs是否能够改变向量的向性是未知的。
LAH4是一种與磷脂膜强烈相互作用并能够吸附在膜上的抗菌肽，介导功能性β-半乳糖苷酶向细胞内部的转运，具有很高的核酸转染效率及细胞渗透活性，目前已经开发出相关的衍生物以增强病毒转导用于基因治疗。Leptin30是源自内源性激素leptin的30个氨基酸的肽，被用作脑靶向配体，特异性的配体-受体结合介导的内吞作用被认为是克服血脑屏障障碍的可能策略之一。ApoE是一种在外周和中枢神经系统（CNS）中分泌的脂质转运蛋白，目前也已经有将其作为血脑屏障受体靶向剂的研究。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒9型转导效率的方法，以克服现有技术中的不足。
为实现前述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种将转基因递送至中枢神经系统的方法，该方法包括施用：（i）细胞穿膜肽，前述细胞穿膜肽选自LAH4、LEPTIN30、APOE或其组合；（ii）重组腺相关病毒载体。
优选地，上述重组腺相关病毒载体是腺相关病毒9型或其任何突变体。
更优选地，上述腺相关病毒9型包含鸡β-肌动蛋白启动子。
优选地，上述LAH4包含SEQ ID NO：1的序列。
优选地，上述APOE包含SEQ ID NO：2的序列。
优选地，上述LEPTIN30包含SEQ ID NO：3的序列。
优选地，上述腺相关病毒9型和细胞穿膜肽形成复合物。
优选地，上述重组腺相关病毒载体能够穿过血脑屏障。
优选地，上述转基因能够在人脑内皮细胞和神经胶质细胞中表达。
在另一实施方案中，本发明还提供一种组合物，该组合物包含上述的细胞穿膜肽和重组腺相关病毒载体。
优选地，上述组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明还提供前述组合物于治疗患者中枢神经系统疾病中的应用。
本发明中发现了数种细胞穿膜肽（CPP）可以显着增强腺相关病毒9型（AAV血清型9，AAV9）的体外转导效率，这是一种用于治疗CNS疾病的有前途的AAV载体。在具体的实施方案中，使转导效率提升最多的是LAH4肽，并且LAH4肽对AAV9转导效率的增强是剂量依赖的，其依赖于AAV9衣壳与肽的结合。此外，还证明了全身给药后，LAH4肽增加了CNS内的AAV9转导。
本发明提供的CPP可以直接与AAV9相互作用，并增强该AAV载体穿越BBB的能力，从而进一步诱导脑中基因的更高表达，有助于改善AAV基因传递载体在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
如上所述，由CPPs介导的病毒转导效率增强是由AAV颗粒与CPPs之间的直接相互作用引起的，因此，纯化的AAV-CPP复合物将比未纯化的混合物具有更高的效率、更好的安全性和更低的免疫反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的利用细胞穿膜肽促进AAV介导的外源基因在中枢神经系统的表达能力的方法，利用细胞穿膜肽的特性，将其与AAV介导的基因治疗联合起来，携带AAV到达一些难以透过的区域，提高基因表达效率。本发明可以提高rAAV9穿过血脑屏障（BBB）的效率，并且极大的提高了转基因在中枢神经系统的表达，同时能够避免出现过度的免疫反应，对推动基因治疗、细胞治疗、细胞工程等领域发展有着至关重要的意义。
定义
重组AAV：
术语“重组AAV”是指已经从其天然环境（例如从宿主细胞、组织或受试者）分离的AAV或人工产生的AAV，使用重组方法产生重组的AAV。重组AAV（rAAV）优选具有组织特异性靶向能力，使得rAAV的转基因将被特异性递送至一个或多个预定组织。
转染：
术语“转染”指的是细胞吸收外来DNA，当外源DNA被引入细胞膜内时，细胞即被“转染”。许多转染技术是本领域公知的（参见如Graham等人 (1973) Virology, 52:456、Sambrook等人 (1989) Molecular Cloning, a laboratorymanual, Cold Spring HarborLaboratories, New York、Davis等人 (1986) Basic Methodsin Molecular Biology,Elsevier，和Chu等人 (1981) Gene 13:197），这些技术可用于将一种或多种外源核酸，如核苷酸整合载体和其它核酸分子引入合适的宿主细胞中。
载体：
术语“载体”包括任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等，其在与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列。因此，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。在一些实施方案中，有用的载体被认为是其中待转录的核酸片段位于启动子的转录控制下的那些载体。术语“启动子”是指引发基因的特异性转录需要的通过细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列。术语“表达载体”意指含有其中部分或全部核酸编码序列能够被转录的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如从转录基因产生生物活性多肽产物或抑制性RNA（例如shRNA、miRNA）。
重组AAV载体：
本文所述的“重组AAV(rAAV)载体”通常至少由转基因（例如编码GFP）及其调节序列，以及5’和3’AAV反向末端重复(ITR)组成。将这种重组AAV载体包装成衣壳蛋白并递送至选定的靶细胞。核酸编码序列以允许在靶组织的细胞中转基因转录、转译和/或表达的方式与调节组分可操作连接。术语“可操作连接”是指启动子相对于核酸处于正确位置以控制RNA聚合酶引发和表达基因。
附图说明
图1：本发明的示意图。
图2A-2B：本发明使用的CPPs对AAV9转导至HEK293T细胞的影响。图2A显示LAH4、LEPTIN30和APOE的肽增加了AAV9对HEK293T细胞的转导；图2B是图2A中GFP阳性的细胞数统计。
图3A-3B：本发明使用的CPPs对AAV9转导至EC和HA细胞的影响。图3A显示LAH4、LEPTIN30和APOE的肽增加了AAV9对EC细胞、HA细胞的转导；图3B是图3A中GFP阳性的细胞数统计。
图4A-4C：本发明使用的CPPs对靶基因在HEK293T、EC和HA细胞中表达的影响。图4A显示LAH4、LEPTIN30和APOE的肽增加了细胞中GFP mRNA的水平；图4B显示LAH4、LEPTIN30、APOE增加了细胞中GFP蛋白的水平；图4C是定量图4B中GFP蛋白的水平。
图5：LAH4肽和AAV9颗粒在细胞中的共定位结果。
图6A-6H：AAV9-CPP复合物与EC细胞在不同孵育时间下的转导效率。图6A显示孵育时间对复合物转导效率的影响；图6B是图6A中的细胞中分离总RNA，并通过定量聚合酶链反应评估GFP的mRNA水平；图6C显示图6A中的细胞的GFP蛋白水平；图6D是定量图6C中的GFP蛋白水平；图6E显示温育温度对复合物转导效率的影响；图6F是图6E中的细胞中分离总RNA，并通过定量聚合酶链反应评估GFP的mRNA水平；图6G显示图6E中的细胞的GFP蛋白水平；图6H是定量图6G中的GFP蛋白水平。
图7A-7B：LAH4促进AAV9通过BBB的体外测试结果。图7A显示AAV9和AAV9-LAH4（20μM）处理组的EC细胞中病毒滴度随时间的变化；图7B显示不同浓度的AAV9-LAH4处理后EC细胞中病毒滴度随时间的变化。
图8A-8D：AAV9载体和AAV9-LAH4复合物分别注入小鼠后，小鼠肝和脑组织中的GFP表达结果。图8A显示两种载体及对照在海马、小脑、皮质、肝脏中的表达；图8B是图8A的统计图；图8C显示在脑和肝脏中的基因组DNA中GFP的表达量；图8D显示在脑和肝脏中的mRNA中GFP的表达量。
图9A-9E：AAV9-LAH4复合物于小鼠体内免疫应答的情形。图9A显示肝脏和大脑中IL-1β和TNF-α的mRNA水平；图9B显示小鼠大脑中CD4和CD8的水平；图9C是定量图9B中CD4和CD8的表达水平；图9D显示小鼠肝脏中CD4和CD8的水平；图9E是定量图9D中CD4和CD8的表达水平。
图10A-10D：不同抑制剂对AAV9或AAV9-LAH4感染的细胞进行病毒转导作用的效果测试。图10A显示氯丙嗪（CPZ，15 nmol/L）和阿米洛利（Amiloride，1 mmol/L）预孵育后再感染的细胞内GFP蛋白水平；图10B是定量图10A中的GFP蛋白水平；图10C显示Erythrinacristagalli lectin（ECL，50 ug/mL）预孵育后再感染的细胞内GFP蛋白水平；图10D是定量图10C中的GFP蛋白水平。
具体实施方式
以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。本文中所用来表述“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这些名称包括其后代，还应当理解，由于故意或无意的突变，并非所有后代都具有精确相同的DNA含量，包括具有与原始转化细胞中筛选的相同功能或生物活性的突变体后代。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。
细胞系
HEK293T（人胚肾细胞HEK293的衍生株），在含有10％（v/v）的热灭活胎牛血清（FBS）（Sera Pro SA）的Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）（Hyclone，Northbrook，伊利诺伊州，美国）中培养。
人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3），购自Sigma-Aldrich（PN SCC066），在包含1％脂质浓缩物、1％ HEPES、0.055％皮质醇、0.002％ bFGF、0.00055％维生素c的内皮基础培养基（EBM-2）（Lonza，Basel，Switzerland）中培养。
人星形胶质细胞（HAs），购自科学细胞研究实验室（美国卡尔斯巴德），在星形胶质细胞培养基（科学细胞研究实验室，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）中培养。
将上述细胞系在37℃，5％ CO2的培养箱中培养。
多肽
所有使用的多肽在GenScript（中国南京）合成，纯度95％，并溶解在含10％二甲基亚砜的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中，制成10 mM的储备液。LAH4、ApoE和Leptin30肽的氨基酸序列分别是KKALLALHHLAHLALHLALALALKKAC（SEQ ID NO：1）、LRKLRKRLLLRKLRKRLL（SEQ ID NO：2）和YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL（SEQ ID NO：3）。
质粒
用于重组AAV9载体生产的AAV9 rep/cap质粒、pAAV/CBA-GFP和pAD辅助质粒获取自Addgene（美国马萨诸塞州剑桥）。
蛋白质印迹分析
使用RIPA缓冲液（上海比尤姆生物技术研究所，中国上海）分离细胞或动物组织中的总蛋白。蛋白质定量使用Wanleibio BCA蛋白质检测试剂盒（PN WLA004，中国沈阳），通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品，然后电泳转移到PVDF膜上。为了避免非特异性结合，在室温下用5％脱脂牛奶将膜封闭45分钟，随后，将膜与抗GFP抗体（1：100,000稀释度，PN66002-1-lg，Proteintech，中国武汉）在室温下孵育2小时。洗涤后，将膜与缀合有HRP的二抗在室温下以2小时孵育（1：5,000稀释，PN SA00001-1，武汉武汉蛋白技术有限公司）。用含Tween 20（TBST）的Tris缓冲盐水洗涤3次后，通过增强的化学发光（ECL）试剂盒（PN 180-5001，Tanon，中国上海）观察免疫印迹，并使用Tanon AllDoc_x进行扫描，通过Image J软件计算积分密度值。
实时PCR分析
使用TRIzol试剂（PN DP424，TIANGEN，中国北京）从细胞和组织中分离总RNA。然后使用NanoPhotometer N50 Touch（Implen）测定RNA的浓度和质量。使用TakaRaPrimeScript RT Master Mix（RR036A）将总RNA反转录为cDNA。使用对GFP转基因具有特异性的引物对5'-GCACAAGCTGGAGTACAACTA-3'（SEQ ID NO：4）和5'-TGTTGTGGCGGATCTTGAA-3'（SEQ ID NO：5），在LightCycler 96实时系统（Roche）上进行定量PCR。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为内源性对照，GAPDH基因的特异性引物对是5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'（SEQ ID NO：6）和5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（SEQ ID NO：7）。使用相对定量（2-△△Ct）计算相对表达值。
免疫组织化学分析
AAV9（3×1011粒/鼠）与0.001mM LAH4肽在37℃预孵育2小时。如图1所示，将AAV9或AAV9-CPP复合物经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内，注射21天后，小鼠的大脑和肝脏被切除、固定、冷冻、冷冻切片，然后装在玻璃载玻片（Thermo，Cryotome E）上。冷冻切片用冷PBS清洗，在抗原回收缓冲液（100X EDTA缓冲液，pH 8.0）中用4%多聚甲醛固定后，用3% BSA封闭载玻片，然后用PBS洗涤，然后用兔抗GFP（Proteintech 50430-2-AP）孵育，然后用二抗体孵育载玻片，再用4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染10分钟（KeyGen BioTECH KGA215）。荧光图像是由尼康（Nikon DS-U3）eclipsec1显微镜获得，在200倍的放大倍数下随机选择感兴趣的区域。
实施例1：重组AAV9病毒载体的生产
在HEK293T细胞中使用三重转染生产由鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子驱动GFP表达的重组AAV9完整颗粒。简而言之，将转基因质粒pAAV/CBA-GFP、含有Rep和Cap基因的AAV辅助质粒（AAV9 rep/cap）以及腺病毒辅助质粒pAD共转染到HEK293T细胞中。收集HEK293T细胞，并在转染后72小时裂解，然后将上清液进行氯化铯梯度超速离心。
实施例2：体外转导效率测定
为了测试CPPs对AAV9转导的影响，在AAV9转导前至少6小时，将细胞以每孔3×105个细胞的密度接种到24孔板中，然后将不同浓度（最终浓度为0.5μM或20μM）的CPPs（LAH4、LEPTIN30和APOE的肽）分别与MOI为1,000的编码绿色荧光蛋白的AAV9载体（AAV9/GFP）孵育，然后检测HEK293T细胞的感染情形。如图2A和2B所示，LAH4、LEPTIN30和APOE的肽诱导了HEK293T细胞中病毒转导的剂量依赖性增强。如预期的那样，在没有AAV9转导（NC）的细胞中没有发现荧光；在仅与AAV9载体一起孵育的细胞中，细胞中的荧光非常弱，但是将AAV9载体与5µM LAH4、LEPTIN30或APOE的肽孵育然后转导HEK293细胞时，荧光水平显著提高。当CPPs的浓度增加到20µM时，与仅用AAV转导的细胞相比，添加CPPs（LAH4、LEPTIN30和APOE肽）的组别荧光水平分别增加了550％、230％和189％，其中转导效率最好的是LAH4。这些结果表明CPPs可以有效地改善AAV9向HEK293T细胞的转导。
为了检查CPPs在AAV9转导至人脑内皮细胞（hCMEC/D3，简称EC）和神经胶质细胞（HA）中的作用，在AAV9转导前至少6小时，将细胞以每孔3×105个细胞的密度接种到24孔板中，然后将不同浓度（最终浓度为0.5μM或20μM）的CPPs（LAH4、LEPTIN30或APOE的肽）分别与MOI为1,000的AAV9/GFP一起孵育，然后检测EC细胞和HA细胞的感染情形。如图3A和3B所示，LAH4、LEPTIN30和APOE的肽诱导EC和HA细胞中病毒转导的剂量依赖性增强，这与HEK293T细胞中的情况类似。如预期的那样，在没有AAV9转导（NC）的细胞中没有发现荧光；在仅与AAV9载体一起孵育的细胞中，细胞中的荧光非常弱；但是将AAV9载体与5µM LAH4、LEPTIN30或APOE的肽孵育然后转导EC或HA细胞时，荧光水平显著提高。与仅用AAV转导的细胞相比，当CPPs浓度增加到20 µM时，添加CPPs（LAH4、LEPTIN30和APOE肽）的组别中EC细胞的荧光水平分别增加350％、230％和139％，HA细胞的荧光水平分别增加250％、130％和119％。与HEK293T相似，和LEPTIN30以及APOE相比，LAH4是增强EC和HA细胞中病毒转导最有效的多肽。根据这些数据，我们得出结论，CPPs可以有效地改善AAV9向EC细胞和HA细胞的转导。
实施例3：AAV9载体传递的靶基因表达
由于LAH4、LEPTIN30和APOE的CPP可以增强HEK293、EC和HA细胞中AAV9/GFP的转导，因此推测GFP基因的表达也应相应增加。为了验证这一假设，从图2A和图3A的细胞中纯化了总RNA，并进行了实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。如图4A所示，LAH4、LEPTIN30和APOE的肽诱导HEK293T、EC和HA细胞中GFP mRNA的剂量依赖性增加。仅用AAV9载体孵育的细胞中，细胞中的GFP mRNA水平非常低；但是，将AAV9载体与5µM LAH4、LEPTIN30或APOE的肽孵育，然后转导HEK293T、EC或HA细胞后，mRNA水平显著增加。与仅用AAV转导的细胞相比，当CPP的浓度增加到20 µM时，EC细胞中的mRNA水平分别增加350％、230％和139％，而HA细胞中的mRNA水平分别增加250％、130％和119％，三个多肽中效果最好的是LAH4。
此外，还使用兔抗GFP抗体通过免疫印迹检查了GFP蛋白水平。如图4B和4C所示，LAH4、LEPTIN30和APOE的肽诱导HEK293T、EC和HA细胞中GFP蛋白水平呈剂量依赖性增加。仅用AAV9载体孵育的细胞中，细胞中的GFP蛋白水平非常低，但是将AAV9载体与5µM LAH4、LEPTIN30或APOE的肽孵育，然后转导HEK293T、EC或HA细胞后，蛋白质水平显著增加。与仅用AAV载体转导的细胞相比，当CPPs浓度增加到20 µM时，EC细胞中的蛋白质水平分别增加350％、230％和139％，而HA细胞中的蛋白质水平分别增加250％、130％和119％，三个多肽中效果最好的仍然是LAH4。
实施例4：细胞中LAH4肽和AAV9载体颗粒的共定位
为了确定由CPPs介导增强的病毒转导效率是否是AAV9载体颗粒与CPPs直接相互作用的结果，将未转基因的空衣壳AAV9颗粒与5μM异硫氰酸荧光素（FITC）标记的LAH4肽在37℃下预孵育1小时，然后将混合物分别与EC和HA细胞孵育，3小时后，收集并固定细胞，然后通过荧光共聚焦显微镜拍照。用完整AAV颗粒特异性抗体对AAV9进行免疫染色，结果如图5所示，大多数AAV9与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的LAH4肽共定位，证明AAV9-LAH4复合物的形成，该结果证实了由CPPs介导的病毒转导增强是AAV9颗粒与CPPs直接相互作用导致的。
实施例5：AAV9-LAH4复合物形成的优化
5.1最佳作用时间测定：
为了优化生产具有最强转导效率的AAV9-CPP复合物的实验条件，我们首先研究了编码绿色荧光蛋白（GFP）的AAV9载体（1×104）与5μM LAH4肽分别孵育0、60分钟和120分钟。将AAV9-CPP复合物与EC细胞一起孵育24小时进行转导，然后通过荧光显微镜检查细胞。如图6A所示，LAH4肽诱导EC细胞中荧光水平的时间依赖性增加；如果不孵育AAV9载体和LAH4肽（时间0），则细胞中的荧光非常弱，然而将AAV9载体与LAH4肽孵育2小时后，荧光水平显着提高。
从图6A的细胞中提取了总RNA和蛋白质，并分别通过RT-qPCR和Western blot检测GFP mRNA水平和蛋白质水平。如图6B-6D所示，LAH4肽诱导EC细胞中GFP mRNA和蛋白水平的时间依赖性增加，其结果与荧光水平类似，孵育2小时后，GFP mRNA和蛋白质水平均比未孵育时（时间0）提高约250％。
5.2最佳作用温度测定：
过去研究指出，CPPs通过共价键与AAV颗粒相互作用，这是一个依赖能量的过程（Liu等人，2014）。为了确认AAV9-CPP复合物的形成是否依赖能量，分别测试了在4℃、25℃和37℃下形成的AAV9-LAH4复合物的转导效率。首先将AAV9-CPP复合物与EC细胞一起孵育24小时进行转导，然后通过荧光显微镜检查细胞。如图6E所示，LAH4肽诱导EC细胞中荧光水平的温度依赖性增加，在4℃下，细胞中的荧光非常弱，当AAV9载体与LAH4肽在25℃和37℃下孵育时，荧光水平显着增加。
从图6E的细胞中提取了总RNA和蛋白质，并分别通过RT-qPCR和Western blot检测了GFP mRNA水平和蛋白质水平。如图6F-6H所示，LAH4肽还诱导EC细胞中GFP mRNA和蛋白水平的温度依赖性增加，其结果与荧光水平类似，在37℃时，GFP mRNA和蛋白水平分别比在4℃时高120％和50％。
综上所述，在37℃的条件下反应120分钟可产生具有最大转导能力的AAV9-CPP复合。
实施例6：LAH4增加AAV9通过BBB
将EC细胞单层培养，并分别与AAV9或AAV9-LAH4复合物（最终浓度20μM）一起孵育，在不同时间点收集基底腔中的培养液，并通过qPCR分析病毒滴度，所有处理组均重复三次（* P <0.05，** P <0.01，与仅使用AAV9处理的细胞相比）。如图7A所示，与单独使用AAV9相比，AAV9-LAH4处理的细胞中的病毒滴度显著增加，并且呈现时间依赖性增加。
将EC细胞单层培养，并分别与不同浓度的AAV9-LAH4孵育，在不同时间点收集基底腔中的培养液，并通过qPCR分析病毒滴度，所有处理均重复三次（* P <0.05，** P <0.01，与以20μM LAH4处理的细胞相比）。如图7B所示，30μM、40μM、50μM处理的实验组与20μM处理的组别相比其病毒滴度皆有显著提升。
实施例7：AAV9-LAH4复合物体内传递靶基因的表达
血脑屏障（BBB）由大脑微血管内皮细胞（EC）组成，可控制物质流入和流出大脑的过程。由于CPPs可以增强AAV9载体向EC和HA细胞的转导，故推测CPPs也可以增强CNS跨BBB中AAV9载体的转导。本发明通过静脉内（IV）注射将磷酸盐缓冲液（PBS）、AAV9载体和AAV9-LAH4复合物分别注入不同组别的小鼠，两周后，通过免疫组织化学检查小鼠肝和脑组织中的GFP荧光。如图8A和8B所示，注射PBS组别的小鼠其大脑和肝脏的背景荧光都很弱，而注射AAV9载体的小鼠中，大脑和肝脏的荧光水平均轻度升高；与仅注射AAV9载体的小鼠相比，注射AAV9-LAH4复合物的小鼠的GFP荧光在大脑和肝脏中均增加了约100％。
为了证实该结果，还通过RT-qPCR检测了脑和肝中的mRNA水平和DNA水平。如图8C所示，与单独注射AAV9的小鼠相比，注射AAV9-LAH4复合物的小鼠中的GFP DNA拷贝数分别增加了约270％和400％；如图8D所示，与注射AAV9的小鼠相比，注射AAV9-LAH4复合物的小鼠中的GFP mRNA水平分别增加了约70％和340％。总之，LAH4肽通过体内全身给药增强了AAV9传递的大脑和肝脏中靶基因的表达。
实施例8：LAH4肽减少大脑中AAV9转导的免疫反应
AAV的全身给药通常会导致免疫反应，这导致基因治疗效率降低并增加对基因治疗的安全性疑虑，为了证明免疫应答是否随大脑中AAV9更高的转导而增加，检查注射有AAV9-CPP复合物的小鼠的免疫应答情形，通过RT-qPCR检查了两种炎症因子：白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA水平。如图9A所示，注射AAV9-LAH4的小鼠肝脏中IL-1β和TNF-α的mRNA水平分别约为仅注射AAV9的小鼠肝脏中的130％和140％，证明LAH4肽增加了肝脏的免疫反应；然而，注射AAV9-LAH4的小鼠大脑中IL-1β和TNF-α的mRNA水平分别约为注射AAV9的小鼠的55％和60％，证明LAH4肽可能会降低大脑中AAV9转导的免疫反应。如图9B和9C所示，与仅注射AAV9的小鼠相比，注射AAV9-LAH4的小鼠大脑中CD4和CD8的水平降低，图9D和图9E也显示注射AAV9-LAH4的小鼠肝脏中CD4和CD8的水平降低，进一步证实了这一结果。
实施例9：AAV9-CPP复合物进入细胞的机制
网格蛋白、小窝蛋白和大胞吞通路是病毒、蛋白质和纳米颗粒内吞的主要途径，为了评估这三条内吞通路在AAV9-CPP复合物进入胞内中扮演的作用，我们进行了药物抑制试验，测试不同抑制剂对AAV9或AAV9-LAH4感染细胞并进行病毒转导的效果。选用的抑制剂包括：氯丙嗪（CPZ）、阿米洛利（Amiloride）以及抑制大环胞苷酶凝集素（Erythrinacristagalli lectin, ECL），氯丙嗪可以阻断网格蛋白介导的内吞作用，阿米洛利通过防止膜皱褶的诱发，抑制大环胞苷酶凝集素阻断AAV9与其受体，抑制AAV9和AAV9-LAH4进入EC细胞。
首先，将EC细胞分别与不同抑制剂预处理，接着单独用AAV9或AAV9-LAH4复合物（最终浓度5μM）感染经抑制剂处理和未处理的细胞，提取总蛋白并通过Western印迹测定EC细胞的GFP表达水平，并以β-肌动蛋白作作为对照，所有处理均重复三次（* P <0.05，** P<0.01）。图10A和10B为EC细胞分别与氯丙嗪（15 nmol/L）或阿米洛利（1 mmol/L）在37℃下预孵育30分钟的结果，如图所示，阿米洛利不能抑制EC细胞中AAV9的转导，氯丙嗪可以，而阿米洛利和氯丙嗪均显著抑制AAV9-LAH4向EC细胞的转导效率，显示AAV9-LAH4的内吞作用在此过程中起重要作用；图10C和10D为EC细胞与ECL（50 ug/mL）在4℃下预孵育15分钟的结果，如图所示，ECL显著抑制AAV9和AAV9-LAH4进入EC细胞，显示AAV9受体在AAV9-CPP进入细胞的过程中也起重要作用。
本发明提及的所有文献都在本申请中全文引用作为参考。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式的修改同样落于本申请权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京贝思奥生物科技有限公司
<120> 利用细胞穿膜肽增强腺相关病毒在中枢神经系统转导效率的方法
<141> 2021-01-27
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu His His Leu Ala His Leu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Lys Lys Ala Cys
20 25
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu
20 25 30
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gcacaagctg gagtacaact a 21
<210> 5
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<212> DNA
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tgttgtggcg gatcttgaa 19
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<211> 19
<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gaagatggtg atgggatttc 20

Claims (9)

1.一种将转基因递送至中枢神经系统的方法，其特征在于，所述方法包括施用：
（i）细胞穿膜肽，所述细胞穿膜肽选自LAH4、LEPTIN30、APOE或其组合；
（ii）重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体是腺相关病毒9型或其任何突变体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LAH4包含SEQ ID NO：1的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述APOE包含SEQ ID NO：2的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LEPTIN30包含SEQ ID NO：3的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒9型包含鸡β-肌动蛋白启动子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腺相关病毒9型和细胞穿膜肽形成复合物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体能够穿过血脑屏障。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转基因能够在人脑内皮细胞和神经胶质细胞中表达。
9.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的细胞穿膜肽和重组腺相关病毒载体。
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