CN112840024A - 单细胞中的核条形码化和捕获 - Google Patents

Abstract

本文公开了适用于在单一步骤中进行单个核捕获和条形码化的方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，该方法包括使用核分离组合物分离核。核分离组合物可以包含能够与核的一种或更多种组分特异性结合的核结合试剂。该方法可以包括使用条形码将核中的靶条形码化，以产生用于测序分析的条形码化靶。

Description

单细胞中的核条形码化和捕获

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2018年8月3日提交的美国临时专利申请序号62/714,222的权益，为了所有目的将该相关申请的内容通过引用以其整体并入本文。

背景

领域

本公开内容总体涉及对靶进行分子条形码化的领域，并且更特别地涉及核条形码化的领域。

现有技术的描述

诸如使用与核酸条形码偶联的珠进行条形码化的方法和技术可用于单细胞分析，诸如使用例如逆转录、聚合酶链式反应(PCR)扩增和下一代测序(NGS)来解密基因表达谱以确定单细胞的状态。然而，制备用于单细胞分析的单细胞悬液可能具有挑战性。

概述

本文公开的包括用于确定多于一个细胞中的靶的数目的方法的实施方案。在一些实施方案中，该方法包括：使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核，其中核分离组合物包含核结合试剂，并且其中核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；使用多于一个条形码将多于一个核中的多于一个靶条形码化，以产生多于一个条形码化靶，其中多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且其中多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列；获得多于一个条形码化靶的测序数据；以及使用测序数据中的多于一个条形码的分子标记序列来估计多于一个细胞中的多于一种靶的每一种的数目。

在一些实施方案中，分离多于一个核包括：使多于一个细胞的多于一个核与核分离组合物接触，以产生与核结合试剂结合的核。分离多于一个核可以包括：使用能够与核结合试剂特异性结合的试剂分离与核结合试剂结合的核。

在一些实施方案中，核结合试剂与第一表位缔合，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包括第一表位结合试剂。第一表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)或其组合。在一些实施方案中，核结合试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分(click-chemistry moiety)、地高辛、一个或更多个伯胺(primary amine(s))、一个或更多个羧基(carboxyl(s))、一个或更多个羟基(hydroxyl(s))、一个或更多个醛(aldehyde(s))、一个或更多个酮(ketone(s))或其组合。在一些实施方案中，能够与核结合试剂特异性结合的试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮或其组合。

在一些实施方案中，核结合试剂包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂。糖结合试剂可以包括糖结合蛋白。糖结合蛋白可以包括凝集素。凝集素可以包括甘露糖结合凝集素、半乳糖结合凝集素、N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡萄糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素、岩藻糖结合凝集素或其组合。凝集素可以包括伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁豆凝集素(LCH)、雪花莲(Snowdrop)凝集素(GNA)、蓖麻(Ricinus communis)凝集蛋白(RCA)、花生凝集蛋白(PNA)、波罗蜜凝集素(Jacalin，AIL)、毛叶苕子(Hairy vetch)凝集素(VVL)、麦胚凝集蛋白(WGA)、接骨木(Elderberry)凝集素(SNA)、朝鲜槐(Maackia amurensis)白细胞凝集素(MAL)、朝鲜槐血凝素(MAH)、荆豆(Ulex europaeus)凝集蛋白(UEA)、橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)凝集素(AAL)或其组合。凝集素(lectin)可以是或包括凝集蛋白(agglutinin)。凝集蛋白可以是或包括麦胚凝集蛋白(WGA)。糖结合蛋白可以来自或来源于动物、细菌、病毒、真菌或其组合。糖结合蛋白可以来自或来源于植物。植物可以是直生刀豆(Canavalia ensiformis)、兵豆(Lens culinaris)、雪花莲(Galanthus nivalis)、蓖麻、落花生(Arachis hypogaea)、波罗蜜(Artocarpus integrifolia)、毛叶苕子(Viciavillosa)、普通小麦(Triticum vulgaris)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、朝鲜槐、荆豆、橙黄网孢盘菌或其组合。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分包括糖、寡糖、多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括单糖、二糖、多元醇、麦芽寡糖、非麦芽寡糖、淀粉、非淀粉多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖糊精、棉子糖、水苏糖、果寡糖、直链淀粉、支链淀粉、改性淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶、水胶体、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括α-D-甘露糖基残基、α-D-葡糖基残基、高α-甘露糖型支链α-甘露糖苷结构、混合型和二分支复合型N-聚糖的支链α-甘露糖苷结构、二分支和三分支复合型N-聚糖的岩藻糖基化核心区、α1-3和α1-6连接的高甘露糖结构、Galβ1-4GalNAcβ1-R、Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、(Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、GalNAcα-Ser/Thr、GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Ac(唾液酸)、Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,4Glc(NAc)、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)GalNac、Fucα1-2Gal-R、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ1-4GlcNAc、R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括糖蛋白、糖脂或其组合。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分包括核纤层蛋白、Emerin、Nesprin、Nurim、UNC-83、Klar、ZYG-12、Kms1p、UNC-84、Klaroid、SUN-1、Sad1p、LBR、MAN1、LAP1、LAP2、LINK、核孔复合体、其一部分或其组合。

在一些实施方案中，核结合试剂与核分离颗粒缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以与核分离颗粒缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以被固定在核分离颗粒上或被部分固定在核分离颗粒上。例如，能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以与核分离颗粒可逆地、非可逆地、共价地、非共价地或这些方式组合地缔合。作为另一种实例，能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包埋(embedded)、部分包埋(partiallyembedded)、非包埋(non-embedded)、封闭(enclosed)、部分封闭(partially enclosed)、非封闭(non-enclosed)或这些方式组合地在核分离颗粒中。在一些实施方案中，能够与核结合试剂特异性结合的试剂通过可裂解接头与核分离颗粒缔合。可裂解接头可以包括例如可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。

在一些实施方案中，核分离颗粒包括核分离珠。核分离颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。核分离颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。核分离颗粒可以是可破坏的。核分离颗粒可以包括核分离可破坏的水凝胶颗粒。在一些实施方案中，分离与核结合试剂结合的核包括使与核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触。在一些实施方案中，该方法包括，使与核结合试剂结合的核与多于一个空(null)颗粒接触，然后使与核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触。在一些实施方案中，空颗粒与核分离颗粒的比是至少10:1。在一些实施方案中，空颗粒不包含磁特性(magnetic property)。在一些实施方案中，空颗粒不包含能够与核结合试剂特异性结合的试剂。在一些实施方案中，空颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。在一些实施方案中，多于一个空颗粒降低核分离颗粒聚集(clumping)，或者防止核分离颗粒聚集，或者实现两者。在一些实施方案中，使与核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触，产生多于一个通过能够与核结合试剂特异性结合的试剂与核分离颗粒结合的核。在一些实施方案中，在使与核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核分离颗粒结合的核的百分比是至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，在使与核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比是至少90％、至少95％或至少99％。

在一些实施方案中，分离与核结合试剂结合的核可以包括：通过磁性移除、离心或其任何组合来分离核分离颗粒。在一些实施方案中，该方法包括，在分离多于一个核分离颗粒之前，使多于一个与核分离颗粒结合的核与游离的第一表位接触，其中游离的第一表位包括第一表位的全部或一部分。在一些实施方案中，多于一个条形码与核分离颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以不被封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被包埋在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分包埋在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以不被包埋在核分离颗粒中。

在一些实施方案中，核结合试剂包含核被膜表面组分结合试剂，并且核结合试剂可以能够与一种或更多种核被膜表面组分特异性结合。

在一些实施方案中，该方法包括：将多于一个核裂解，然后使用多于一个条形码将多于一个核中的多于一个靶条形码化以，产生多于一个条形码化靶。在一些实施方案中，该方法包括：将多于一个细胞裂解而不裂解多于一个细胞的核，然后使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核。在一些实施方案中，该方法包括在将多于一个核裂解之前，将多于一个核分区。在一些实施方案中，将多于一个核分区包括将多于一个核分区到多于一个分区，其中多于一个分区中的分区包含来自多于一个核的单个核。在一些实施方案中，多于一个分区包括微孔阵列的微孔。在一些实施方案中，多于一个分区包括多于一个液滴。在一些实施方案中，多于一个分区中的两个或更多个分区包含单个核。在一些实施方案中，多于一个分区中的分区包含单个核和单个核分离颗粒。在一些实施方案中，多于一个分区中的分区包含单个核和单个条形码化颗粒。在一些实施方案中，多于一个分区中的分区包含单个核、单个核分离颗粒和单个条形码化颗粒。

在一些实施方案中，该方法包括：在使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核之前，使多于一个细胞透化(例如，将多于一个细胞的质膜裂解)；并且使用包含细胞器结合试剂的细胞器捕获组合物来耗尽多于一个细胞的一种或更多种细胞器，其中细胞器结合试剂能够与多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。耗尽一种或更多种细胞器可以包括：使多于一个细胞的一种或更多种细胞器与细胞器捕获组合物接触，以产生与细胞器组分结合试剂结合的一种或更多种细胞器。耗尽一种或更多种细胞器可以包括：使用能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂，耗尽与细胞器结合试剂结合的一种或更多种细胞器。细胞器结合试剂可以与第二表位缔合，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括第二表位结合试剂。

在一些实施方案中，第二表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。细胞器结合试剂可以包括能够与多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，细胞器结合试剂与细胞器捕获颗粒缔合。细胞器结合试剂可以被固定在细胞器捕获颗粒上或被部分固定在细胞器捕获颗粒上。例如，细胞器结合试剂可以可逆地、非可逆地、共价地、非共价地或这些方式组合地与细胞器捕获颗粒缔合。作为另一种实例，细胞器结合试剂可以包埋、部分包埋、非包埋、封闭、部分封闭、非封闭或这些方式组合地在细胞器捕获颗粒中。

在一些实施方案中，细胞器捕获颗粒包括细胞器捕获珠。细胞器捕获颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。细胞器捕获颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

在一些实施方案中，使用细胞器捕获组合物来耗尽多于一个细胞的细胞器可以包括：通过磁性移除、离心或其任何组合来耗尽一个或更多个细胞器捕获颗粒。细胞器可以包括多于一个细胞的线粒体。多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括：ABCD3、ESR2、NOS3、ALB、HIF1A、NR3C1、ATP5A1、HK1、PGR、CASQ1、HSPA1A、PHB、CLTC、HSPD1、PLN、COX4I1、IFM1、SOD1、CPS1、LGALS3、TP53、细胞色素C氧化酶、MAPT、TP5B、ERN1、MT-CO1、VDAC1或其组合。

在一些实施方案中，细胞器结合试剂可以包含细胞器表面组分结合试剂，一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括一种或更多种细胞器表面组分，并且细胞器结合试剂可以能够与一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。核结合试剂可以包含核索引寡核苷酸，并且其中核索引寡核苷酸包含核索引序列。

在一些实施方案中，该方法包括：使用多于一个条形码将核索引寡核苷酸条形码化，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸；并且获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据。将核索引寡核苷酸条形码化可以包括：使用多于一个条形码进行随机条形码化，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。使用多于一个条形码将核索引寡核苷酸条形码化可以包括：使多于一个条形码与核索引寡核苷酸接触，以产生与核索引寡核苷酸杂交的条形码；并且将与核索引寡核苷酸杂交的条形码延伸，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。将条形码延伸可以包括：使用DNA聚合酶将条形码延伸以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。将条形码延伸可以包括：使用逆转录酶将条形码延伸以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

在一些实施方案中，该方法可以包括：扩增多于一个条形码化核索引寡核苷酸，以产生多于一个条形码化核索引扩增子。扩增多于一个条形码化核索引寡核苷酸可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增分子标记序列的至少一部分和核索引寡核苷酸的至少一部分。获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据可以包括：获得多于一个条形码化核索引扩增子的测序数据。获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据可以包括：对分子标记序列的至少一部分和核索引寡核苷酸的至少一部分进行测序。

在一些实施方案中，多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在条形码化颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以包括条形码化珠。条形码化颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。条形码化颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。

在一些实施方案中，使用多于一个条形码将多于一个靶条形码化以产生多于一个条形码化靶包括：使靶的拷贝与条形码的靶结合区接触；并且使用多于一个条形码逆转录多于一个靶以产生多于一个条形码化靶。该方法可以包括：扩增多于一个条形码化靶以产生多于一个扩增的条形码化靶，然后获得多于一个条形码化靶的测序数据。扩增条形码化靶以产生多于一个扩增的条形码化靶可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增条形码化靶，以产生多于一个扩增的条形码化靶。该方法可以包括：扩增多于一个扩增的条形码化靶，以产生多于一个条形码化靶扩增子。扩增多于一个扩增的条形码化靶可以包括：扩增分子标记序列和多于一个靶的靶序列或其一部分，以产生多于一个条形码化靶扩增子。扩增多于一个扩增的条形码化靶可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增多于一个扩增的条形码化靶，以产生多于一个条形码化靶扩增子。使用多于一个条形码将细胞的多于一个靶条形码化以产生多于一个条形码化靶可以包括：使用多于一个随机条形码将细胞的多于一个靶随机条形码化，以产生多于一个随机条形码化靶。

在一些实施方案中，多于一个条形码中的每一个包含细胞标记序列、通用引物的结合位点或其任何组合，并且多于一个条形码中的至少两个条形码的细胞标记序列包含相同的序列。靶结合区可以包含聚(dT)区多于一个条形码的至少100个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少1000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少10000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的分子标记序列可以包含随机序列。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。多于一个细胞包括组织样品。多于一个细胞可以包括例如上皮组织样品、冷冻的细胞、固定的细胞、福尔马林固定石蜡包埋的细胞、肿瘤细胞、固定的肿瘤细胞、冷冻的肿瘤细胞、福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤细胞或其组合。在一些实施方案中，多于一个细胞包括一种或更多种核外细胞组分。核外细胞组分的非限制性实例包括线粒体、过氧化物酶体、胞质溶胶、囊泡、溶酶体、质膜、叶绿体、内部线粒体基质、线粒体内膜、膜间隙、线粒体外膜、分泌囊泡、光面内质网、粗面内质网、高尔基体、吞噬体、内体、外泌体、质膜、微管、微丝、中间丝、丝状伪足、褶边、片状伪足、肌节、黏着斑、足体、核糖体、微粒体、脂筏、细胞壁或其任何组合。在一些实施方案中，一种或更多种核外细胞组分包含一种或更多种不期望的核酸物质。在一些实施方案中，一种或更多种核外细胞组分中的至少一种的丰度通过分离多于一个核而降低，通过耗尽一种或更多种细胞器而降低，或通过这两者降低。在一些实施方案中，多于一个细胞包含多于一个靶和一种或更多种不期望的核酸物质。在一些实施方案中，不期望的核酸物质来源于非核细胞器。在一些实施方案中，不期望的核酸物质包括核糖体RNA、线粒体RNA、线粒体DNA。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸物质中的至少一种的丰度通过分离多于一个核而降低、通过耗尽一种或更多种细胞器而降低，或通过这两者降低。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸物质总计达到多于一个细胞的核酸含量的约50％、约60％、约70％、约80％或更多。

在一些实施方案中，不期望的核酸物质占多于一个条形码化靶扩增子的少于40％、少于20％、少于10％、少于5％。在一些实施方案中，获得多于一个条形码化靶的测序数据包括产生多于一个测序读段。不期望的核酸物质的测序读段可以是，例如，总测序读段的少于40％，少于20％，少于10％，少于5％。

本文公开的包括条形码化组合物的实施方案。在一些实施方案中，条形码化组合物包含：包含核结合试剂的核分离组合物，其中核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；和多于一个条形码，其中多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且其中多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列。

在一些实施方案中，组合物包含：能够与核结合试剂特异性结合的试剂。核结合试剂可以与第一表位缔合，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括第一表位结合试剂。第一表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。

在一些实施方案中，核结合试剂包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂。糖结合试剂可以包括糖结合蛋白。糖结合蛋白可以包括凝集素。凝集素可以包括甘露糖结合凝集素、半乳糖结合凝集素、N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡萄糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素、岩藻糖结合凝集素或其组合。凝集素可以包括伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁豆凝集素(LCH)、雪花莲凝集素(GNA)、蓖麻凝集蛋白(RCA)、花生凝集蛋白(PNA)、波罗蜜凝集素(AIL)、毛叶苕子凝集素(VVL)、麦胚凝集蛋白(WGA)、接骨木凝集素(SNA)、朝鲜槐白细胞凝集素(MAL)、朝鲜槐血凝素(MAH)、荆豆凝集蛋白(UEA)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)或其组合。凝集素可以是或包括凝集蛋白。凝集蛋白可以是或包括麦胚凝集蛋白(WGA)。糖结合蛋白可以来自或来源于动物、细菌、病毒或真菌。糖结合蛋白可以来自或来源于植物。植物可以是直生刀豆、兵豆、雪花莲、蓖麻、落花生、波罗蜜、毛叶苕子、普通小麦、西洋接骨木、朝鲜槐、荆豆、橙黄网孢盘菌或其组合。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分包括糖、寡糖、多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括单糖、二糖、多元醇、麦芽寡糖、非麦芽寡糖、淀粉、非淀粉多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖糊精、棉子糖、水苏糖、果寡糖、直链淀粉、支链淀粉、改性淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶、水胶体、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括α-D-甘露糖基残基、α-D-葡糖基残基、高α-甘露糖型支链α-甘露糖苷结构、混合型和二分支复合型N-聚糖的支链α-甘露糖苷结构、二分支和三分支复合型N-聚糖的岩藻糖基化核心区、α1-3和α1-6连接的高甘露糖结构、Galβ1-4GalNAcβ1-R、Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、(Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、GalNAcα-Ser/Thr、GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Ac(唾液酸)、Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,4Glc(NAc)、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)GalNac、Fucα1-2Gal-R、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ1-4GlcNAc、R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括糖蛋白、糖脂或其组合。

在一些实施方案中，核结合试剂与核分离颗粒缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以与核分离颗粒缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以被固定在核分离颗粒上或被部分固定在核分离颗粒上。核分离颗粒可以包括核分离珠。核分离颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。核分离颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。核分离颗粒可以是可破坏的。核分离颗粒可以包括核分离可破坏的水凝胶颗粒。

在一些实施方案中，多于一个条形码与核分离颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在核分离颗粒中。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分可以包括核纤层蛋白、Emerin、Nesprin、Nurim、UNC-83、Klar、ZYG-12、Kms1p、UNC-84、Klaroid、SUN-1、Sad1p、LBR、MAN1、LAP1、LAP2、LINK、核孔复合体、其一部分或其组合。在一些实施方案中，核结合试剂包含核被膜表面组分结合试剂，并且核结合试剂可以能够与一种或更多种核被膜表面组分特异性结合。

在一些实施方案中，组合物包含细胞器捕获组合物，该细胞器捕获组合物包含细胞器结合试剂，其中细胞器结合试剂能够与一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。组合物可以包含能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂。细胞器结合试剂可以与第二表位缔合，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括第二表位结合试剂。第二表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。细胞器结合试剂可以包括能够与多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，细胞器结合试剂与细胞器捕获颗粒缔合。细胞器结合试剂可以被固定在细胞器捕获颗粒上或被部分固定在细胞器捕获颗粒上。细胞器捕获颗粒可以包括细胞器捕获珠。细胞器捕获颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。细胞器捕获颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

在一些实施方案中，细胞器包括多于一个细胞的线粒体。多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括ABCD3、ESR2、NOS3、ALB、HIF1A、NR3C1、ATP5A1、HK1、PGR、CASQ1、HSPA1A、PHB、CLTC、HSPD1、PLN、COX4I1、IFM1、SOD1、CPS1、LGALS3、TP53、细胞色素C氧化酶、MAPT、TP5B、ERN1、MT-CO1、VDAC1或其组合。

在一些实施方案中，细胞器结合试剂包含细胞器表面组分结合试剂，一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括一种或更多种细胞器表面组分，并且细胞器结合试剂可以能够与一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。

在一些实施方案中，核结合试剂可以包含核索引寡核苷酸，并且其中核索引寡核苷酸包含核索引序列。多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在条形码化颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以包括条形码化珠。条形码化颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。条形码化颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。

在一些实施方案中，多于一个条形码中的每一个包含细胞标记序列、通用引物的结合位点或其任何组合，并且多于一个条形码中的至少两个条形码的细胞标记序列包含相同的序列。

靶结合区可以包含聚(dT)区多于一个条形码的至少100个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少1000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少10000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的分子标记序列可以包含随机序列。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。

附图简述

图1示出了非限制性示例性条形码(例如，随机条形码)。

图2示出了条形码化和数字计数(例如，随机条形码化和数字计数)的非限制性示例性工作流程。

图3是示出了用于从多于一个靶产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。

图4A-图4B示出了核条形码化工作流程(例如，随机条形码化)的非限制性示例性示意图。

图5A-图5B示出了带有细胞器(例如，线粒体)去除的条形码化工作流程(例如，随机条形码化)的非限制性示例性示意图。

图6A-图6F示出了核捕获和条形码化工作流程的非限制性示例性示意图。

图7A-图7C示出了核捕获和条形码化工作流程的非限制性示例性示意图。

详述

在以下详述中参考了形成本文的一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指示，否则相似的符号通常标识相似的组成部分。在详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意味着是限制性的。在不脱离本文提供的主题的精神或范围的情况下，可以利用其他实施方案，并且可以做出其他改变。容易理解的是，如本文一般描述的以及图中说明的本公开内容的方面可以以各种各样不同的配置来布置、替换、组合、分开和设计，所有这些都在本文中明确设想并且构成本文公开内容的一部分。

本文引用的涉及的相关技术的所有专利、公开的专利申请、其他出版物、和来自GenBank以及其他数据库的序列通过引用以其整体并入。

确定核酸或靶(例如信使核糖核酸(mRNA)分子)的数目对于鉴定例如在不同发育阶段或在不同环境条件下在细胞中表达的基因是临床上重要的。然而，确定核酸分子(例如，mRNA分子)的绝对数目可以是非常具有挑战性的，特别是当分子数目非常小时。确定样品中分子的绝对数目的一种方法是数字聚合酶链式反应(PCR)。理想地，PCR在每个循环中产生分子的相同拷贝。然而，PCR可具有缺点使得每个分子复制具有随机概率，且此概率根据PCR循环和基因序列而变化，这导致扩增偏差和不准确的基因表达测量。

具有独特的分子标记(molecular labels，ML，也称为分子索引(molecularindexes，MI))的条形码(例如，随机条形码)可以用于计数分子数目。具有对于每个细胞标记是独特分子标记的条形码可以用于计数每个细胞中的分子数目。用于条形码化的非限制性示例性测定包括Precise^TM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))、Resolve^TM测定(Cellular Research,Inc.(Palo Alto,CA))或Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinsonand Company(Franklin Lakes,NJ))。然而，这些方法和技术可以引入误差，如果不加以纠正，可以导致过高估计的细胞计数。

Rhapsody^TM测定可以利用具有大量(例如6561个至65536个)聚(T)寡核苷酸上的独特分子标记的条形码(例如，随机条形码)的非耗尽性池、所述聚(T)寡核苷酸在逆转录(RT)步骤期间与样品中的所有聚(A)-mRNA杂交。除了分子标记之外，条形码的细胞标记可以用于鉴定微孔板的每个孔中的每个单细胞。条形码可以包含通用PCR引发位点。在RT期间，靶基因分子与条形码随机地反应。每个靶分子可以与条形码(例如，随机条形码)杂交，导致产生条形码化互补核糖核苷酸(cDNA)分子(例如，随机条形码化cDNA分子)。在标记之后，可以将来自微孔板的微孔的条形码化cDNA分子汇集到单个管中用于PCR扩增和测序。可以对原始测序数据进行分析，以产生具有独特分子标记的条形码的数目。

本文公开的包括用于确定多于一个细胞中的靶的数目的方法的实施方案。在一些实施方案中，该方法包括：使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核，其中核分离组合物包含核结合试剂，并且其中核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；使用多于一个条形码将多于一个核中的多于一个靶条形码化，以产生多于一个条形码化靶，其中多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且其中多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列；获得多于一个条形码化靶的测序数据；以及使用测序数据中的多于一个条形码的分子标记序列来估计多于一个细胞中的多于一种靶的每一种的数目。

本文公开的包括条形码化组合物的实施方案。在一些实施方案中，条形码化组合物包含：包含核结合试剂的核分离组合物，其中核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；和多于一个条形码，其中多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且其中多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列。

定义

除非另外定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。参见，例如，Singleton等人,Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor,NY 1989)。为了本公开内容的目的，下文定义了以下术语。

如本文使用的，术语“衔接子”可以意指促进缔合的核酸的扩增或测序的序列。缔合的核酸可以包括靶核酸。缔合的核酸可以包括一个或更多个空间标记、靶标记、样品标记、索引标记、条形码、随机条形码或分子标记。衔接子可以是线性的。衔接子可以是预腺苷酸化的衔接子。衔接子可以是双链或单链的。一个或更多个衔接子可以位于核酸的5’端或3’端。当衔接子在5’端和3’端包含已知序列时，已知序列可以是相同或不同的序列。位于多核苷酸的5’端和/或3’端的衔接子可以能够与固定在表面上的一个或更多个寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，衔接子可以包含通用序列。通用序列可以是两个或更多个核酸分子共有的核苷酸序列的区域。两个或更多个核酸分子可以具有不同序列的区域。因此，例如，5’衔接子可以包含相同和/或通用的核酸序列，并且3’衔接子可以包含相同和/或通用的序列。可以存在于多于一个核酸分子的不同成员中的通用序列可以允许使用与通用序列互补的单个通用引物复制或扩增多于一个不同序列。类似地，可以存在于核酸分子的集合中的不同成员中的至少一个、两个(例如，一对)或更多个通用序列可以允许使用与通用序列互补的至少一个、两个(例如，一对)或更多个单个通用引物复制或扩增多于一个不同序列。因此，通用引物包含可与此类通用序列杂交的序列。可以修饰携带靶核酸序列的分子以将通用衔接子(例如，非靶核酸序列)与不同靶核酸序列的一端或两端附接。与靶核酸附接的一个或更多个通用引物可以提供通用引物杂交的位点。与靶核酸附接的一个或更多个通用引物可以彼此相同或不同。

如本文使用的，术语“缔合”或“与...缔合”可以意指两个或更多个物质可以被鉴定为在某个时间点处共定位。缔合可以意指两个或更多个物质在或曾经在相似的容器内。缔合可以是信息学缔合，其中例如，关于两个或更多个物质的数字信息被存储并且可以用于确定一个或更多个物质在某个时间点处共定位。缔合可以是直接或间接的物理缔合。在一些实施方案中，两个或更多个缔合的物质彼此“拴系”、“附接”或“固定”或与共同的固体或半固体表面“拴系”、“附接”或“固定”。缔合可以指用于将标记与固体或半固体支持物(诸如合成颗粒或珠)附接的共价或非共价方式。缔合可以是靶与标记之间的共价键。

如本文使用的，术语“互补性”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸氢键键合，则这两个核酸被认为在该位置处彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中核苷酸中仅一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以将第一核苷酸序列称为第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列与第二序列的相反序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则可以将第一核苷酸序列称为第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，术语“互补体”、“互补”和“反向互补体”可以互换使用。从本公开内容理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以是杂交的分子的互补体。

如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子数目的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶缔合的独特标记的数目的步骤。这种随机方法将计数分子的问题从相同分子的定位和鉴定之一转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。

如本文使用的，术语“一个标记(label)”或“多于一个标记(labels)”可以指与样品中的靶缔合的核酸代码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的接点，例如天然和非天然序列的接点。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份和/或靶。

如本文使用的，术语“非耗尽性储库(non-depleting reservoir)”可以指由许多不同标记组成的随机条形码的池。非耗尽性储库可以包括大量不同的随机条形码，使得当非耗尽性储库与靶池缔合时，每个靶可能与独特的随机条形码缔合。每个标记的靶分子的独特性可以通过随机选择的统计来确定，并且取决于与标记的多样性相比在集合中相同的靶分子的拷贝数。所得的标记的靶分子的集合的大小可以通过条形码化处理的随机性质来确定，并且然后对检测到的随机条形码的数目的分析允许计算原始集合或样品中存在的靶分子的数目。当存在的靶分子的拷贝数目与独特的随机条形码的数目的比率低时，标记的靶分子是高度独特的(即，多于一个靶分子被给定标记标记的概率非常低)。

如本文使用的，术语“核酸”是指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如改变的骨架、糖或核酸碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种(xeno)核酸、吗啉代、锁核酸(locked nucleic acid)、乙二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。

核酸可以包括一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，以为核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。此类杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸中，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而，此线性聚合化合物的各端可以进一步连接而形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以指形成核酸的核苷间骨架。键(linkage)或骨架可以是3’到5’磷酸二酯键。

核酸可以包括修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可以包括那些在骨架中保留磷原子的骨架和那些在骨架中没有磷原子的骨架。合适的其中含磷原子的修饰的核酸骨架可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯诸如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯、手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidate)包括3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、磷酸二酰胺酯(phosphorodiamidates)、硫代磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和硼磷酸酯，具有正常3’-5’连接、2’-5’连接的类似物以及具有反向极性的类似物(其中一个或更多个核苷酸间连接是3’至3’、5’至5’或2’至2’连接)。

核酸可以包括由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可以包括具有吗啉代连接的那些(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的N、O、S和CH₂组分部分的其他的那些。

核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可以意图包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者被非呋喃糖基团替代的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代可以称为糖替代物(surrogate)。可以维持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架替代，特别是被氨基乙基甘氨酸骨架替代。核苷酸可以被保留，并且直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。PNA化合物中的骨架可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这使得PNA具有含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。

核酸可以包括吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含替代核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案的一些中，磷酸二酰胺酯或其他非磷酸二酯核苷间键可以替代磷酸二酯键。

核酸可以包括具有附接至吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于非离子吗啉代的寡聚化合物与细胞蛋白可以具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是非离子核酸模拟物。吗啉代类别内的各种化合物可以使用不同的连接基团来连接。另外类别的多核苷酸模拟物可以指环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环替代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链可以增加DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸酯可以与核酸互补体形成复合体，具有与天然复合体相似的稳定性。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连接，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH₂-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3’-外切核酸酶降解的稳定性和良好的溶解性。

核酸还可以包括核酸碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核酸碱基可以包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))、以及嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。修饰的核酸碱基可以包括其他合成的和天然的核酸碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核酸碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳(G-clamps)诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G-钳诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

如本文使用的，术语“样品”可以指包括靶的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的合适样品包括细胞、组织、器官或生物体。

如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取一部分样品和/或将所述部分放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活检针、活检装置、组织切片装置、微流体装置、刀片格栅和/或超薄切片机。

如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一个随机条形码的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座(bearing)、圆柱体或其他类似配置，包含塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以是颗粒，诸如合成颗粒或珠。

固体支持物可以指“基底”。基底可以是固体支持物类型。基底可以指可以在其上进行本公开内容的方法的连续的固体或半固体表面。例如，基底可以指阵列、盒、芯片、装置和载玻片。

如本文使用的，术语“空间标记”可以指其可以与空间中的位置缔合的标记。

如本文使用的，术语“随机条形码”可以指包含标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。

如本文使用的，术语“基因特异性随机条形码”可以指包含标记和基因特异性的靶结合区的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可以用于对样品中的靶定量。随机条形码可以用于控制标记与靶缔合后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶缔合的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。

如本文使用的，术语“随机条形码化”可以指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来缔合并对与靶缔合的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“基因特异性随机条形码化”互换使用。

如本文使用的，术语“靶”可以指可以与随机条形码缔合的组合物。用于通过所公开的方法、装置和系统进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白。在一些实施方案中，靶是脂质。

如本文使用的，术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒(retroplasmid)逆转录酶、逆转录子逆转录酶、细菌逆转录酶、II型内含子衍生的逆转录酶，及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II型内含子逆转录酶。II型内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)LI.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，尤其是逆转录子、II型内含子、以及多样性产生型逆转录元件)。

本文公开了用于鉴定信号细胞标记的系统和方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)使用多于一个随机条形码将细胞样品中的多于一个靶随机条形码化，以产生多于一个随机条形码化靶，其中多于一个随机条形码中的每一个包含细胞标记和分子标记；(b)获得多于一个随机条形码化靶的测序数据；(c)确定具有与多于一个随机条形码的每个细胞标记缔合的不同序列的分子标记的数目；(d)基于具有与每个细胞标记缔合的不同序列的分子标记的数目，确定多于一个随机条形码的每个细胞标记的等级；(e)基于(c)中确定的具有与每个细胞标记缔合的不同序列的分子标记的数目和(d)中确定的每个细胞标记的等级，生成累积和图；(f)生成累积和图的二阶导数图；(g)确定累积和图的二阶导数图的最小值，其中二阶导数图的最小值对应于细胞标记阈值；以及(h)基于(c)中确定的具有与每个细胞标记缔合的不同序列的分子标记的数目和(g)中确定的细胞标记阈值，将每个细胞标记鉴定为信号细胞标记或噪声细胞标记。

条形码

条形码化，诸如随机条形码化，已经描述于例如US20150299784、WO2015031691和Fu等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.2011May 31；108(22):9026-31和Fan等人,Science(2015)347(6222):1258367中；这些公开物中的每一项的内容在此以其整体并入。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可以用于对靶随机标记(例如，条形码，标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码的不同的条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现的数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值的任何两个之间的数字或范围，则条形码可以称为随机条形码。靶可以是例如包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。如果随机条形码的不同的条形码序列的数目与待标记的任何靶的出现的数目的比例是至少以下或至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1，则条形码可以称为随机条形码。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。

条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1示出了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可以将条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记(dimension label)、空间标记、细胞标记和/或分子标记。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以改变。例如，如图1中所示，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most label)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-most label)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记是处于任何顺序的。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包含可以与mRNA的聚(A)尾相互作用的寡(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸隔开。

标记(例如，细胞标记)可以包含一组独特的定义长度的核酸子序列，例如每个七个核苷酸(相当于一些汉明错误校正代码中使用的比特数目)，其可被设计成提供错误校正能力。可以设计包含七个核苷酸序列的错误校正子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组错误校正子序列可被设计成展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于标记的靶核酸分子的序列数据组中的错误校正序列的审查(在下文更详细地描述)可允许人们检测或校正扩增错误或测序错误。在一些实施方案中，用于产生错误校正代码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生错误校正代码。

条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是以下或包括以下：核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有聚(A)尾的RNA或其任何组合。在一些实施方案中，多于一个靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方案中，靶结合区可以包括可以与mRNA的聚(A)尾相互作用的寡(dT)序列。条形码的一个或更多个标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过一个或更多个间隔区(spacer)与条形码的另一个或两个剩余标记隔开。间隔区的长度可以是，例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有标记被间隔区隔开。

通用标记

条形码可以包含一个或更多个通用标记。在一些实施方案中，一个或更多个通用标记可以是对于附接至给定固体支持物的条形码组中的所有条形码相同的。在一些实施方案中，一个或更多个通用标记可以是对于附接至多于一个颗粒(例如合成颗粒诸如珠)的所有条形码相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包括通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台相关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序引物或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可以用于引发条形码转录的序列。通用标记可以包括可以用于延伸条形码或条形码内的区域的序列。通用标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。

维度标记

条形码可以包含一个或更多个维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于标记(例如，随机标记)发生的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于靶被随机条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间相缔合。维度标记可以在标记的时间处被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被随机条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以将细胞的群体随机条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)对细胞再次进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码对细胞再次进行脉冲处理，等等。每个脉冲(例如，细胞周期的每个时期)的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个时期被标记的信息。维度标记可以探询许多不同的生物阶段。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一种实例中，样品(例如，细胞、细胞的群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后随机标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的响应。

维度标记可以是可激活的。可激活的维度标记可以在特定时间点被激活。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，可激活的维度标记可以被打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至多1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，连接另一种分子，添加修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光囚禁(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将维度标记激活。

在一些实施方案中，维度标记对于附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，合成颗粒)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。

多于一个固体支持物(例如，合成颗粒)可以呈现多达10⁶个或更多个独特的维度标记序列。维度标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

空间标记

条形码可以包含一个或更多个空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包含提供关于与条形码缔合的靶分子的空间取向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。坐标可以是固定的坐标。例如，坐标可以相对于基底固定。空间标记可以参考二维或三维网格。坐标可以相对于界标(landmark)固定。界标可在空间中被鉴定。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(诸如色码、条形码、磁特性、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器、微球、管、微胶囊或液滴)缔合。在一些实施方案中，将多于一个空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。

空间标记对于附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，合成颗粒)是不同的。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，包含相同空间标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的空间标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。

多于一个固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)可以呈现多达10⁶个或更多个独特的空间标记序列。空间标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。空间标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

细胞标记

条形码可以包含一个或更多个细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包含提供用于确定哪个靶核酸来源于哪个细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，合成颗粒)是不同的。在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。

在一些实施方案中，包含相同细胞标记的相同固体支持物上的条形码的百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一种实例，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。

多于一个固体支持物(例如，合成颗粒)可以呈现多达10⁶个或更多个独特的细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一种实例，细胞标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一种实例，细胞标记可以包含长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

条形码序列

条形码可以包含一个或更多个条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包含为与条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包含为与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器(例如，提供粗略近似)的核酸序列。

在一些实施方案中，将一组不同的条形码序列附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)。在一些实施方案中，可以存在或存在约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹个独特分子标记序列或在这些值的任何两个之间的数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一个条形码可以包括约6561个具有不同序列的条形码序列。作为另一种实例，多于一个条形码可以包括约65536个具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，可以存在至少或至多10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特的条形码序列。独特分子标记序列可以附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒)。

条形码的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。条形码的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

分子标记

随机条形码可以包含一个或更多个分子标记。分子标记可以包含条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包含为与随机条形码杂交的特定类型的靶核酸物质提供鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包含为与随机条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸物质的特定出现提供计数器的核酸序列。

在一些实施方案中，将一组不同的分子标记附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒诸如珠)。在一些实施方案中，可以存在或存在约10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹个或数字或范围的独特分子标记序列。例如，多于一个随机条形码可以包括约6561个具有不同序列的分子标记。作为另一种实例，多于一个随机条形码可以包括约65536个具有不同序列的分子标记。在一些实施方案中，可以存在至少或至多10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特分子标记序列。具有独特分子标记序列的随机条形码可以附接至给定固体支持物(例如，合成颗粒)。

对于使用多于一个随机条形码的随机条形码化，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现的数目的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1或在这些值的任何两个之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA物质。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数目与任何靶的出现的数目的比例是至少或至多1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。

分子标记的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

靶结合区

条形码可以包含一个或更多个靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含与靶(例如，靶核酸，诸如待分析的细胞核酸)特异性杂交的核酸序列。例如，靶结合区可以与特定基因序列处的靶核酸杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包含能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。

在一些实施方案中，靶结合区可以包含非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指可以独立于靶核酸的特定序列结合多于一个靶核酸的序列。例如，靶结合区可以包含与mRNA分子上的聚(A)尾杂交的随机多聚体序列或寡(dT)序列。随机多聚体序列可以是，例如，随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，对于附接至给定合成颗粒(例如，珠)的所有条形码，靶结合区是相同的。在一些实施方案中，对于附接至给定合成颗粒的多于一个条形码，靶结合区可以包括两个或更多个不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，靶结合区可以包含寡(dT)，所述寡(dT)可以与包含聚腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5个-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，条形码在本文中可以称为基因特异性条形码。

在一些实施方案中，条形码不包含靶结合区。在一些实施方案中，条形码包含对应于靶结合区的区域，所述区域具有与样品的一个或更多个细胞中的一些、大部分、基本上所有或所有的mRNA分子具有低结合亲和力(例如，不结合)的序列。例如，条形码可以包含对应于靶结合区的区域，所述区域可以具有不与感兴趣的mRNA分子结合的序列。如果第一条形码的靶结合区包含能够与mRNA分子的聚(A)尾杂交的寡(dT)序列，则第二条形码的对应区域可以包含例如与聚(dT)序列不相似或基本上不相似的序列。如果第一条形码的靶结合区包含具有能够与特定基因序列特异性杂交的序列的靶结合区，则第二条形码的对应区域可以包含例如与靶结合区不相似或基本上不相似的序列。

定向特性(Orientation Property)

条形码可以包含一种或更多种可以用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包含不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定向成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的映射。示例性定向特性可以包括电泳迁移率(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导率和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码激活时可以自组装成特定的定向(例如，核酸纳米结构)。

亲和特性(Affinity Property)

条形码可以包含一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包含亲和特性。亲和特性可以包括可以促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学部分和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对于样品上的特定部分(例如，受体)特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处和/或特定细胞类型或分子附近的靶可以被随机标记。在一些实施方案中，亲和特性可以提供空间标记的核苷酸序列之外的空间信息，因为抗体可以将条形码引导至特定位置。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体或融合抗体。

抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合性)部分(像抗体片段)。

抗体片段可以是例如抗体的一部分，诸如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同的抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于针对癌细胞的抗体、针对病毒的抗体、与细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)结合的抗体和治疗性抗体。

通用衔接子引物

条形码可以包含一个或更多个通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码(诸如基因特异性随机条形码)可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指遍及所有条形码的通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下或可以是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个、30个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少或至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26 27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5个-30个核苷酸。

接头

当条形码包含多于一种类型的标记(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，诸如一种分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在某些情况下，接头标记序列的长度是12个核苷酸。接头标记序列可以用于促进条形码的合成。接头标记可以包括错误校正(例如，汉明)码。

固体支持物

在一些实施方案中，本文公开的条形码(诸如随机条形码)可以与固体支持物缔合。固体支持物可以是例如颗粒或合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一个条形码(例如，第一多于一个条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)相差至少一个核苷酸。相同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同的固体支持物上的条形码的细胞标记可以相差至少一个核苷酸。例如，第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一个条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一个条形码的第二细胞标记可以相差至少一个核苷酸。细胞标记可以是例如约5个-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5个-20个核苷酸长。合成颗粒可以是例如珠。

合成颗粒可以是例如硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/Sepharose珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。合成颗粒可以包括材料诸如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。

在一些实施方案中，合成颗粒可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合物颗粒(例如可变形颗粒或凝胶颗粒)(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶颗粒可以包括一种或更多种基于聚合物的凝胶。凝胶颗粒可以例如通过将一种或更多种聚合物前体包封到液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶颗粒。

在一些实施方案中，颗粒可以是可降解的。例如，聚合物颗粒或珠可以例如在期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可以导致聚合物颗粒以受控方式溶解、熔化或降解。凝胶颗粒可以由于化学刺激、物理刺激、生物刺激、热刺激、磁刺激、电刺激、光刺激或其任何组合而溶解、熔化或降解。

试剂(诸如寡核苷酸条形码)可以偶联/固定至合成颗粒的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)和/或凝胶颗粒的外表面或本文描述的任何其他微胶囊。颗粒可以是例如凝胶珠。缔合(例如，偶联或固定)可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，本文描述的试剂与颗粒或任何其他固体支持物(例如，微胶囊)的缔合(例如，偶联或固定)可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定型部分(例如，经由化学交联剂，包括本文描述的化学交联剂)。在施加刺激后，不稳定型部分可以被裂解并释放所固定的试剂。在一些实施方案中，不稳定型部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定至凝胶颗粒的情况下，使二硫键暴露于还原剂可以裂解二硫键并从颗粒释放寡核苷酸条形码。不稳定型部分可以作为凝胶颗粒、珠或微胶囊的一部分、作为将试剂与凝胶珠或微胶囊连接的化学接头的一部分和/或作为试剂的一部分被包括。在一些实施方案中，多于一个条形码的至少一个条形码可以被固定在颗粒上、被部分固定在颗粒上、被封闭在颗粒中、被部分封闭在颗粒中或其任何组合。

在一些实施方案中，颗粒(例如凝胶珠)可以包括宽范围的不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白和/或塑料。聚合物可以包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(双烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯(pyrolle))(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)。

许多化学刺激可以用于触发颗粒的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例可以包括但不限于pH介导的颗粒壁改变、经由交联键的化学裂解使颗粒壁分解、颗粒壁的触发解聚和颗粒壁转换反应。批量(bulk)改变也可以用于触发颗粒的破坏。

通过各种刺激对微胶囊或颗粒的批量或物理改变在设计胶囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生批量或物理改变，其中颗粒破裂是由刺激引起的机械-物理力的结果。这些过程可以包括但不限于压力引起的破裂、颗粒壁熔化或颗粒壁的孔隙率的改变。

生物刺激也可以用于触发颗粒的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命系统中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，颗粒可以包含具有对特定蛋白酶的裂解敏感的肽交联的聚合物。更特别地，一种实例可以包括包含GFLGK肽交联的微胶囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解并且颗粒的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一种实例中，颗粒包括包含纤维素的壳壁。壳聚糖水解酶的添加用作纤维素键裂解、壳壁解聚及其内部内容物释放的生物触发物。

还可以在施加热刺激后诱导颗粒释放其内容物。温度的改变可以引起颗粒的各种改变。热量的变化可能引起颗粒熔化，使得颗粒壁崩解。在其他情况下，热量可以增加颗粒内部组分的内部压力，使得颗粒破裂或爆炸。在又其他的情况下，热量可以使颗粒转化成收缩的脱水状态。热量还可以作用于颗粒壁内的热敏聚合物，从而引起颗粒的破坏。

将磁性纳米颗粒包括在微胶囊的颗粒壁中可以允许颗粒的触发破裂以及将颗粒引导成阵列。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁性颗粒。在一种实例中，将Fe₃O₄纳米颗粒掺入含聚电解质的颗粒中，在振荡磁场刺激的存在下触发破裂。

颗粒也可以由于电刺激的结果被破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒类似，电敏颗粒可以允许颗粒的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对齐、电导率或氧化还原反应。在一种实例中，含电敏材料的颗粒在电场中对齐，从而可以控制内部试剂的释放。在其他实例中，电场可以在颗粒壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。

也可以使用光刺激来破坏颗粒。许多光触发是可能的，并且可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的系统。例如，金属氧化物涂层可以用作胶囊触发物。涂覆有SiO₂的聚电解质胶囊的UV照射可以导致颗粒壁的崩解。在又另一种实例中，可以将可光切换材料(诸如偶氮苯基团)掺入颗粒壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式至反式异构化。在此方面，光子切换的掺入产生在施加光触发后可以崩解或变得更多孔的颗粒壁。

例如，在图2中示出的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔上之后，在框212处可以将颗粒引入微孔阵列的多于一个微孔上。每个微孔可以包含一个颗粒。颗粒可以包含多于一个条形码。条形码可以包含附接至颗粒的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或其任何组合。

本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，颗粒或珠)缔合(例如，附接)。与固体支持物缔合的条形码可各自包含选自以下组的条形码序列，该组包括至少100个或1000个具有独特序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的不同条形码可以包含具有不同序列的条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的条形码的一定百分比包含相同的细胞标记。例如，百分比可以是以下或可以是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。作为另一种实例，百分比可以是至少或至多60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物缔合的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物缔合的条形码可以具有选自下组的不同的细胞标记，该组包括至少100个或1000个具有独特序列的细胞标记。

本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，颗粒诸如珠)缔合(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一个条形码缔合的多于一个合成颗粒的固体支持物将样品中的多于一个靶随机条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可以包括与多于一个条形码缔合的多于一个合成颗粒。不同固体支持物上的多于一个条形码的空间标记可以相差至少一个核苷酸。固体支持物可以例如以二维或三维形式包括多于一个条形码。合成颗粒可以是珠。颗粒可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、Sephadex/Sepharose珠、纤维素珠、聚苯乙烯珠或其任何组合。固体支持物可以包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或其任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可以包埋到半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物缔合。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可以与基底缔合。

如本文使用的，术语“拴系的”、“附接的”和“固定的”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价方式。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于原位固相合成条形码。

在一些实施方案中，固体支持物是颗粒例如珠。颗粒可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他类似配置，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。颗粒可以由例如塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或其任何组合构成。颗粒可以是或包括球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方形、长方形、锥形、圆柱形、圆锥形、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，颗粒的形状可以是非球形的。

颗粒可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe₃O₄；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁性材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、Sepharose、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或其任何组合。

在一些实施方案中，颗粒(例如，标记所附接的颗粒)是水凝胶珠。在一些实施方案中，颗粒包括水凝胶。

本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。每个颗粒可以包含多于一个寡核苷酸(例如，条形码)。多于一个寡核苷酸中的每一个可以包含条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记和靶结合区(例如，寡(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体或其组合)。多于一个寡核苷酸的每一个的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同的实施方式中，不同细胞标记序列的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、在这些值的任何两个之间的数字或范围或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数目可以是至少或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。在一些实施方案中，多于一个颗粒中不多于1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个或更多个包含具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包含具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒中全都不具有相同的细胞标记序列。

在每个颗粒上的多于一个寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是以下或可以是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数目可以是至少或至多10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。例如，多于一个寡核苷酸中的至少100个包含不同的条形码序列。作为另一种实例，在单个颗粒中，多于一个寡核苷酸中的至少100个、500个、1000个、5000个、10000v、15000个、20000个、50000个、这些值的任何两个之间的数字或范围或更多个包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了多于一个包含条形码的颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数目)的比例可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更高。在一些实施方案中，多于一个寡核苷酸的每一个还包含样品标记、通用标记或两者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微米颗粒。

颗粒的尺寸可以不同。例如，颗粒的直径范围可以为从0.1微米至50微米。在一些实施方案中，颗粒的直径可以是以下或可以是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米或在这些值的任何两个之间的数字或范围。

颗粒的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，颗粒的直径可以比孔的直径长或短或者可以比孔的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或在这些值的任何两个之间的数字或范围。颗粒的直径可以与细胞的直径相关(例如，被基底的孔捕获的单细胞)。在一些实施方案中，颗粒的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。颗粒的直径可以与细胞的直径相关(例如，被基底的孔捕获的单细胞)。在一些实施方案中，颗粒的直径可以比细胞的直径长或短或者可以比细胞的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，颗粒的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。

颗粒可以附接至基底和/或包埋到基底中。颗粒可以附接至凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质和/或包埋到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。颗粒在基底(例如凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用颗粒上的条形码上存在的空间标记来鉴定，该空间标记可以用作位置地址。

颗粒的实例可以包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、

微珠、抗体缀合的珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合的珠、蛋白G缀合的珠、蛋白A/G缀合的珠、蛋白L缀合的珠、寡(dT)缀合的珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMag^TM羧基封端磁珠。

颗粒可以与量子点或荧光染料缔合(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多于一个光学通道中发荧光。颗粒可以与氧化铁或氧化铬缔合，使其成为顺磁性或铁磁性。颗粒可以是可鉴定的。例如，可以使用照相机对颗粒成像。颗粒可以具有与颗粒缔合的可检测代码。例如，颗粒可以包含条形码。颗粒可以改变尺寸，例如由于在有机溶液或无机溶液中溶胀。颗粒可以是疏水的。颗粒可以是亲水的。颗粒可以是生物相容的。

固体支持物(例如，颗粒)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如颗粒)可以蚀刻有标识符(例如，数字)。标识符可以通过对颗粒成像来可视化。

固体支持物可以包括半溶性或不溶性材料。当固体支持物包括接头、支架、构建模块(building block)或其他与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这种与其附接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以以溶液中游离，诸如在微量滴定孔中的形式；以流通形式，诸如在柱中；或以浸量尺(dipstick)使用。

固体支持物可以包括膜、纸(paper)、塑料、涂覆表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或其任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何配置的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微米颗粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料包括多孔板或膜(例如，由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成)，和/或晶片、梳、针或针头(例如，适于组合合成或分析的针阵列)或颗粒(例如，合成颗粒，诸如珠)，平坦表面诸如晶片(例如，硅晶片)的凹陷或纳升孔阵列，具有凹陷的晶片(具有或不具有过滤器底部)。

固体支持物可以包括聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可以能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可以能够被泵送到整个循环系统。

固体支持物可以是生物分子。例如，固体支持物可以是或可以包括核酸、蛋白、抗体、组蛋白、细胞区室、脂质、糖类等。是生物分子的固体支持物可以被扩增、翻译、转录、降解和/或修饰(例如，聚乙二醇化、类泛素化、乙酰化、甲基化)。是生物分子的固体支持物可以提供附接至生物分子的空间标记之外的空间和时间信息。例如，生物分子在未被修饰时可以包含第一构象，但是在被修饰后可以改变为第二构象。不同的构象可以将本公开内容的条形码(例如，随机条形码)暴露于靶。例如，生物分子可以包含由于生物分子的折叠而不可及的条形码。在生物分子的修饰(例如乙酰化)后，生物分子可以改变构象以暴露条形码。修饰的时机可以为本公开内容的条形码化方法提供另一个时间维度。

在一些实施方案中，包含本公开内容的条形码试剂的生物分子可以位于细胞的细胞质中。在激活后，生物分子可以移动至核，条形码化可以在核处发生。以这种方式，生物分子的修饰可以为由条形码鉴定的靶编码另外的时空信息。

基底和微孔阵列

如本文使用的，基底可以指固体支持物类型。基底可以指可以包含本公开内容的条形码和随机条形码的固体支持物。基底可以例如包括多于一个微孔。基底可以例如是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括定义体积的小的反应室。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以捕获一个或更多个固体支持物。在一些实施方案中，微孔可以仅捕获一个固体支持物。在一些实施方案中，微孔捕获单个细胞和单个固体支持物(例如，颗粒)。微孔可以包含本公开内容的组合条形码试剂。

固体支持物上的条形码合成

条形码(例如，随机条形码)可以在固体支持物(例如颗粒，诸如合成颗粒或珠)上合成。预合成的条形码(例如，包含可以连接至固体支持物的5’胺)可以通过各种固定技术中的任何一种(包括固体支持物和条形码上的官能团对)附接至固体支持物(例如，颗粒)。条形码可以包含官能团。固体支持物(例如，颗粒)可以包含官能团。条形码官能团和固体支持物官能团可以包括例如生物素、链霉抗生物素蛋白、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。条形码(例如，随机条形码)可以例如通过将条形码上的5’氨基基团与官能化的固体支持物的羧基基团偶联(例如使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)而被拴系至固体支持物。残留的未偶联的条形码可以通过进行多次冲洗步骤从反应混合物中去除。在一些实施方案中，条形码和固体支持物使用类似的附接化学物质经由接头分子(例如短的、官能化的烃分子或聚环氧乙烷分子)间接附接。接头可以是可裂解接头，例如酸不稳定型接头或可光裂解接头。

条形码(例如，随机条形码)可以使用各种固相寡核苷酸合成技术(诸如磷酸二酯合成、磷酸三酯合成、亚磷酸三酯合成和亚磷酰胺合成)中的任一种在固体支持物(例如颗粒)上合成。可以将单个核苷酸以逐步的方式偶联至生长的拴系条形码。可以将若干寡核苷酸的短的、预先合成的序列(或模块)偶联至生长的、拴系的条形码。

条形码(例如，随机条形码)可以通过将在一轮或更多轮分开-汇集(split-pool)合成中散置逐步或模块偶联反应来合成，其中将合成颗粒的总池分成许多单独的较小池，然后每个池经历不同的偶联反应，随后将单独的池重组和混合，以使遍及颗粒池中生长的条形码序列随机化。分开-汇集合成是组合合成过程的实例，其中使用最少数目的化学偶联步骤合成最大数目的化学化合物。由此产生的化合物文库的潜在多样性由每个偶联步骤可用的独特构建模块(例如核苷酸)的数目和用于产生文库的偶联步骤的数目决定。例如，在每一步使用4个不同核苷酸的包括10轮偶联的分开-汇集合成将产生4¹⁰＝1,048,576个独特的核苷酸序列。在一些实施方案中，分开-汇集合成可以使用酶促方法(诸如聚合酶延伸或连接反应)而不是化学偶联进行。例如，在每一轮分开-汇集聚合酶延伸反应中，拴系至给定池中的颗粒的条形码的3’端可以与一组半随机引物的5’端杂交，所述半随机引物例如具有5’-(M)_k-(X)_i-(N)_j-3’结构的引物，其中(X)_i是长度为i个核苷酸的随机核苷酸序列(该组引物包括(X)_i的所有可能组合)，(N)_j是特定核苷酸(或j个核苷酸的系列)，并且(M)_k是特定核苷酸(或k个核苷酸的系列)，其中不同的脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)被添加至每个池中，并通过聚合酶掺入拴系的寡核苷酸中。

条形码化的方法

本公开内容提供了用于估计样品中不同的靶的数目的方法。在一些实施方案中，将多于一个靶条形码化包括将多于一个条形码与多于一个靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化的靶)。将多于一个靶条形码化可以包括产生条形码化靶的索引文库。产生条形码化靶的索引文库可以用包含多于一个条形码(例如，随机条形码)的固体支持物来进行。

使样品和条形码接触

本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。可以使包括例如细胞、器官或组织薄切片的样品与条形码(例如，随机条形码)接触。细胞可以例如通过重力流来接触，其中可以使细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片放置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。可以使样品(例如，细胞)分散遍及基底，例如，通过在基底上生长/培养细胞。

当条形码紧密靠近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比例接触，使得每个不同的靶可以与本公开内容的不同条形码缔合。为了确保靶与条形码之间的有效缔合，可以将靶与条形码交联。

细胞裂解

在细胞和条形码的分布之后，可以将细胞裂解以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生化手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、Tween-20或NP-40)、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或其任何组合的细胞裂解缓冲液来裂解细胞。为了增加靶与条形码的缔合，可以通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。

在一些实施方案中，可以使用滤纸来裂解样品。可以用滤纸上部的裂解缓冲液浸泡滤纸。可以将滤纸用压力施加至样品，这可以促进样品的裂解以及样品的靶与底物的杂交。

在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解来进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加至底物来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约或至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多或更少的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH是约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如，LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1M、0.5M或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1M、0.5M或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度是约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、triton X、tween、NP-40)。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。裂解缓冲液中的去污剂浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的去污剂浓度是约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于所使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中的螯合剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的螯合剂浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中的还原剂浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的还原剂浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M TrisHCl，约pH7.5，约0.5M LiCl，约1％十二烷基硫酸锂，约10mM EDTA和约5mM DTT。

裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或更多分钟。裂解的细胞可以包含至少约100000、200000、300000、400000、500000、600000或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包含至多约100000、200000、300000、400000、500000、600000或700000个或更多个靶核酸分子。

将条形码附接至靶核酸分子

在细胞裂解和核酸分子从其释放之后，核酸分子可以与共定位的固体支持物的条形码随机缔合。缔合可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡(dT)可以与靶的聚(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定的杂交体。在一些实施方案中，可以将从裂解的细胞释放的核酸分子与基底上的多于一个探针缔合(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包含寡(dT)时，可以将mRNA分子与探针杂交并且逆转录。寡核苷酸的寡(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图2中框216处示出的条形码化的非限制性实例中，mRNA分子可以与颗粒上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。

附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包含可以能够与限制性位点突出端(例如EcoRI粘性末端突出端)特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接至包含与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4 DNA连接酶)可以用于连接两个片段。

例如，在图2中框220处示出的条形码化的非限制性实例中，随后可以将来自多于一个细胞(或多于一个样品)的标记的靶(例如，靶条形码分子)汇集至例如管中。标记的靶可以通过例如回收(retrieving)条形码和/或附接靶条形码分子的颗粒来汇集。

可以通过使用磁性颗粒和外部施加的磁场来实现附接的靶条形码分子的基于固体支持物的集合的回收。汇集靶条形码分子后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括，例如，逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不先汇集来自多于一个细胞的标记的靶核酸分子。

核酸延伸反应(例如逆转录)

本公开内容提供了使用核酸延伸反应诸如逆转录来产生靶条形码缀合物的方法(例如，在图2的框224处)。靶条形码缀合物可以包含条形码以及靶核酸的全部或一部分的互补序列(即，条形码化的cDNA分子，诸如随机条形码化的cDNA分子)。缔合的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶而发生。逆转录引物可以是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡(dT)引物的长度可以是以下或可以是约以下：12个-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源聚(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

在一些实施方案中，标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，逆转录引物是寡(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡(dT)引物的长度是12个-18个核苷酸，并且与哺乳动物mRNA的3’端的内源聚(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在各个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

逆转录可以重复地发生以产生多于一个标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次逆转录反应。方法可以包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次逆转录反应。

扩增

可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生标记的靶核酸分子的多于一个拷贝。扩增可以以多重方式进行，其中多于一个靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可以用于向核酸分子添加测序衔接子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸或其组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％或在这些值的任何两个之间的范围或数字。方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。

在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和组装PCR。

标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环至环扩增(circle-to-circle amplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对标记的核酸(例如，标记的RNA、标记的DNA、标记的cDNA)进行聚合酶链式反应，以产生标记的扩增子(例如，随机标记的扩增子)。标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本公开内容的核酸可以包括合成的或改变的核酸。

扩增可以包括使用一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一个或更多个引物。一个或更多个引物可以包含例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一个或更多个引物可以包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一个或更多个引物可以包含少于12个-15个核苷酸。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的靶的3’端或5’端。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的靶的内部区域。内部区域可以距多于一个标记的靶的3’端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一个或更多个引物可以包括一组固定的引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个定制引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个对照引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个基因特异性引物。

一个或更多个引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一个或更多个定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或其任何组合。一个或更多个引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以设计成扩增一个或更多个靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总的标记的靶的子集。一个或更多个引物可以包括至少96个或更多个定制引物。一个或更多个引物可以包括至少960个或更多个定制引物。一个或更多个引物可以包括至少9600个或更多个定制引物。一个或更多个定制引物可以退火至两个或更多个不同的标记的核酸。两个或更多个不同的标记的核酸可以对应于一个或更多个基因。

可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一种方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至颗粒(例如，珠)的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物变成Illumina测序文库。使用150bp×2测序的测序可以揭示读段1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因以及索引1读段上的样品索引。

在一些实施方案中，可以使用化学裂解将核酸从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或修饰的碱基可以用于促进将核酸从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，通过限制性内切核酸酶消化可以将核酸从基底去除。例如，用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含dUTP或ddUTP的核酸可以将核酸从基底去除。例如，可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如，无嘌呤/无嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)内切核酸酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可光裂解基团以及光将核酸从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/抗生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、Ig蛋白A、光不稳定型接头、酸或碱不稳定型接头基团或适配体。

当探针是基因特异性时，可以将分子与探针杂交，并且逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，可以将其扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多于一个靶核酸序列同时扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。

在一些实施方案中，可以例如用桥接扩增在基底上进行扩增。cDNA可以加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡(dT)探针进行桥接扩增。在桥接扩增中，与模板核酸的3’端互补的引物可以是共价地附接至固体颗粒的每对引物的第一引物。当包含模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以将模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而向前延伸以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链构成。在下一循环的加热步骤中，双链体分子可以变性，从颗粒释放模板分子，并且留下通过第一引物附接至颗粒的互补DNA链。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段互补。这种杂交可导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥接，通过共价键连接(secure to)第一引物并通过杂交连接第二引物。在延伸阶段，在同一反应混合物中通过添加核苷酸，第二引物可以按相反方向延伸，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且双链桥可以变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子的一个末端分别经由第一引物和第二引物附接至颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在这第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以与同一的颗粒上先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。现在杂交的两个先前未使用的引物延伸从而将两个新的桥转换成双链桥。

扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。

标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的指数式扩增。标记的核酸的扩增可以包括对标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)来进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的引物同时延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可以涵盖反应的衍生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、抑制PCR、半抑制PCR以及装配PCR。

在一些实施方案中，标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环至环扩增(circle-to-circleamplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多于一个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性内切核酸酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可选地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或其组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。

在一些实施方案中，方法包括重复扩增标记的核酸以产生多于一个扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、11次、12次、13次、14次、15次、16次、17次、18次、19次或20次扩增反应。可选地，方法包括进行至少约25次、30次、35次、40次、45次、50次、55次、60次、65次、70次、75次、80次、85次、90次、95次或100次扩增反应。

扩增还可以包括将一个或更多个对照核酸添加至一个或更多个包含多于一个核酸的样品中。扩增还可以包括将一个或更多个对照核酸添加至多于一个核酸中。对照核酸可以包含对照标记。

扩增可以包括使用一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定型和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代和锁核酸(LNA)以及乙二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。非天然核苷酸的添加可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一个或更多个引物。一个或更多个引物可以包括一个或更多个寡核苷酸。一个或更多个寡核苷酸可以包含至少约7个-9个核苷酸。一个或更多个寡核苷酸可以包含少于12个-15个核苷酸。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的核酸的至少一部分。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的核酸的3’端和/或5’端。一个或更多个引物可以退火至多于一个标记的核酸的内部区域。内部区域可以距多于一个标记的核酸的3’端至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一个或更多个引物可以包括一组固定的引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个定制引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个对照引物。一个或更多个引物可以包括至少一个或更多个管家基因引物。一个或更多个引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一个或更多个定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或它们的产物。一个或更多个引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一个或更多个靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是与本公开内容的阵列附接的探针。

在一些实施方案中，将样品中的多于一个靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括产生条形码化片段的索引文库。不同的条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库包括从样品中的多于一个靶产生多于一个索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以相差以下、相差约以下、相差至少以下或相差至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸或在这些值的任何两个之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，产生条形码化靶的索引文库包括使多于一个靶(例如mRNA分子)与包含聚(T)区和标记区的多于一个寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生单链标记的cDNA分子(每个包含cDNA区和标记区)，其中多于一个靶包括至少两个不同序列的mRNA分子，且多于一个寡核苷酸包括至少两个不同序列的寡核苷酸。产生条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。

随机条形码化可以使用核酸条形码或标签以标记个体核酸(例如，DNA或RNA)分子。在一些实施方案中，其包括从mRNA产生cDNA分子时将DNA条形码或标签添加至cDNA分子。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以添加用于测序(例如下一代测序(NGS))使用的衔接子。例如在图2的框232处，可以使用测序结果来确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)和核苷酸片段的序列。

图3是示出了产生条形码化靶(例如mRNA)(例如，随机条形码化靶)的索引文库的非限制性示例性过程的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以用独特条形码序列(例如，分子标记)、细胞标记和通用PCR位点对每个mRNA分子进行编码。例如，通过将一组条形码(例如，随机条形码)310)与RNA分子302的聚(A)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子302逆转录以产生标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。条形码310中的每一个可以包括靶结合区，例如聚(dT)区312、条形码序列或分子标记314和通用PCR区316。

在一些实施方案中，细胞标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，条形码序列(例如分子标记)可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一个随机条形码中的每一个还包括通用标记和细胞标记中的一个或更多个，其中通用标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的，并且细胞标记对于固体支持物上的多于一个随机条形码是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包含3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包含3个至20个核苷酸。

在一些实施方案中，标记区314可以包含条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一个或更多个。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。通用标记可以是对于固体支持物上的多于一个随机条形码相同的，并且细胞标记是对于固体支持物上的多于一个随机条形码相同的。维度标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。

在一些实施方案中，标记区314可以包括以下、包括约以下、包括至少以下或包括至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个不同标记或在这些值的任何之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每个标记的长度可以是以下、可以是约以下、可以是至少以下或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个核苷酸或在这些值的任何之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以包括、包含括、包括至少或可以是至多10个、20个、40个、50个、70个、80个、90个、10²个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10²⁰个条形码或随机条形码310或在这些值的任何之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且条形码或随机条形码310的组可以例如，各自包含独特标记区314。标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量的条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。

如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集到1个管中，且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。因为独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括以单一反应体积用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用、利用约、利用至少或利用至多10、20、40、50、70、80、90、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10²⁰个多重引物或在这些值的任何之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括靶向特定基因的定制引物326A-C和通用引物328的第1PCR引物池324。定制引物326可以与标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。

如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。例如，巢式PCR标记的扩增子322可以通过巢式PCR进一步扩增。巢式PCR可以包括在单一反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池328可以包含、包含约、包含至少或包含至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个不同的巢式PCR引物330或在这些值的任何之间的数字或范围的不同的巢式PCR引物330。巢式PCR引物332可以包含衔接子334，并与标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以包含衔接子336，并与标记的扩增子322的通用PCR区域316杂交。由此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不包含衔接子334和衔接子336。相反，衔接子334和衔接子336可以连接至巢式PCR的产物，以产生衔接子标记的扩增子338。

如步骤4中示出的，可以使用文库扩增引物将来自步骤3的PCR产物进行PCR扩增用于测序。特别地，可以使用衔接子334和衔接子336对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和衔接子336可以与引物340和引物342杂交。一个或更多个引物340和引物342可以是PCR扩增引物。一个或更多个引物340和引物342可以是测序引物。一个或更多个衔接子334和衔接子336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一个或更多个衔接子334和衔接子336可以用于对衔接子标记的扩增子338测序。引物342可以包含板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以使用下一代测序(NGS)在一个测序反应中测序。

核条形码化方法及组合物

本文公开的包括用于进行单个核捕获和条形码化(例如，在单一步骤中)的方法、组合物和试剂盒。单个核测序可以用于单细胞转录组分析(或其他单细胞组学或多组学分析，诸如蛋白质组学分析，以确定单细胞的蛋白表达谱)，同时使进行或制备单细胞悬液的需要最小化(例如，消除)。制备单细胞悬液在技术上具有挑战性，例如，对于某些样品制品，诸如冷冻的组织。方法包括核的分离步骤。例如，核被膜特异性抗体，诸如抗核纤层蛋白，可以用于将核与其他亚细胞组分分开。

在一些实施方案中，这些抗体可以与表位(诸如强表位，包括生物素、地高辛或荧光素)或代表该特定抗体的分子条形码和/或两者缔合(例如，与之缀合)。缔合的表位(例如，缀合的表位)可以允许在不使用超速离心步骤的情况下快速分离核的步骤。例如，当多于一个样品被汇集在一起以进行单个下游下一代测序(NGS)文库制备程序时，缔合的条形码(例如，缀合的条形码)可以用于进行样品索引化。在一些实施方案中，样品索引化可以包括单个核上的样品索引化。在一些实施方案中，样品索引化可以包括在单个核和单细胞上的样品索引化。

在一些实施方案中，抗体条形码可以是或可以包括核苷酸条形码。例如，核苷酸条形码的长度可以是至少10个碱基对。核苷酸条形码可以是或可以包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)或与逆转录或其他DNA聚合步骤相容的其他合成核苷酸。核苷酸条形码可以任选地包含3’聚(dA)尾，以模拟内源细胞mRNA，并且使条形码与下游文库制备相容。然后条形码序列信息可以在测序后连同每个核一起被去多重化(demultiplex)，以确定核来自哪个样品。条形码化抗体及其用途诸如使用条形码化抗体对细胞进行样品索引化描述于美国专利申请公布第2018/0088112号和美国专利申请第15/937,713号中；每一项的内容通过引用以其整体并入。

核条形码化方法

图4A-图4B示出了核条形码化工作流程(例如，随机条形码化)的非限制性示例性示意图。细胞裂解可以使用匀浆器(例如Dounce匀浆器)、去污剂或酶促方法进行。核可以被例如对与表位(例如，强表位诸如生物素、地高辛(DIG)和荧光素)缀合的核被膜蛋白(诸如核纤层蛋白)特异性的抗体和任选地标记核的条形码寡核苷酸捕获。可以使用针对表位的二级抗体将核沉淀进行纯化(例如，与细胞质碎片(cytoplasmic fragment)分离)，随后使用单细胞分析测定(诸如Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson and Company(FranklinLakes,NJ))进行RNA/DNA捕获。

本文公开的包括用于确定多于一个细胞(诸如图4A-图4B中示出的细胞404)中靶的数目的方法400的实施方案。方法400可以包括细胞裂解、核分开和分离、核裂解和条形码化，以用于单细胞分析(例如，单细胞转录组或蛋白质组分析)。

在一些实施方案中，方法400包括：使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核。所分离的多于一个核可以包括核408，核408包括图4A-图4B中示出的核被膜412。可以使用单细胞方法(诸如Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson and Company(Franklin Lakes,NJ))来分析分离的核的内容物(例如，mRNA内容物或蛋白内容物)，诸如核408的mRNA分子416。核分离组合物可以包含核结合试剂。细胞核结合试剂可以能够与核的一种或更多种组分(例如，图4A-图4B中示出的细胞404的细胞核408的核被膜412上的核被膜蛋白420)特异性结合。

在不同的实施方式中，分离的核的数目可以是不同的。在一些实施方案中，分离的核的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，分离的核的数目可以是至少以下或可以是至多以下：约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²。

在不同的实施方式中，核分离组合物中的核结合试剂的数目可以是不同的。在一些实施方案中，核分离组合物中的核结合试剂的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，核分离组合物中的核结合试剂的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

细胞核结合试剂可以与核的一种或更多种组分结合。在一些实施方案中，与核的一种组分结合的核结合试剂的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与核的一种组分结合的核结合试剂的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在不同的实施方式中，核分离组合物中的核结合试剂能够结合的核组分的数目可以是不同的。在一些实施方案中，核分离组合物中的核结合试剂可以结合的核组分的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，核分离组合物中的核结合试剂可以结合的核组分的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

方法400可以包括使用多于一个条形码将多于一个核中的多于一个靶(例如，图4A-图4B中示出的mRNA分子416)条形码化，以产生多于一个条形码化靶。多于一个条形码中的每一个可以包含分子标记序列和靶结合区，并且多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列可以包含不同的序列。方法400可以包括获得多于一个条形码化靶的测序数据。方法400可以包括使用测序数据中的多于一个条形码的分子标记序列来估计多于一个细胞中的多于一个靶中的每一种的数目。在图4A-图4B中，细胞404可以包含一个或更多个具有线粒体蛋白428的线粒体424。

在一些实施方案中，分离多于一个核包括：使多于一个细胞的多于一个核与核分离组合物接触(例如，图4A-图4B中示出的核被膜蛋白特异性抗体432a-432c)，以产生与核结合试剂结合的核。分离多于一个核可以包括：使用能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，图4A-图4B中示出的表位结合试剂444)分离与核结合试剂结合的核。

核组分和核结合试剂

在一些实施方案中，核结合试剂与第一表位(例如，图4A-图4B中示出的表位436)缔合，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包含第一表位结合试剂。第一表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。在一些实施方案中，第一表位和/或第一表位结合试剂可以是亲和部分，诸如生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮或其任何组合。第一表位和第一表位结合试剂可以是结合对的成员，例如生物素/链霉抗生物素蛋白。

在不同的实施方式中，与核结合试剂缔合的不同第一表位的数目可以是不同的。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的不同第一表位的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的不同第一表位的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。

在不同的实施方式中，与核结合试剂缔合的第一表位的分子数目可以是不同的。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的第一表位的分子数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的第一表位的分子数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100。

在一些实施方案中，核结合试剂包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体(例如，图4A-图4B中示出的核被膜蛋白特异性抗体432a-432c)，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，核结合试剂包括核被膜表面组分结合试剂(例如，核被膜蛋白特异性抗体)，并且核结合试剂可以能够与一种或更多种核被膜表面组分特异性结合。

在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂。糖结合试剂可以包括糖结合蛋白。糖结合蛋白可以包括凝集素。凝集素可以包括甘露糖结合凝集素、半乳糖结合凝集素、N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡萄糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素、岩藻糖结合凝集素或其组合。凝集素可以包括伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁豆凝集素(LCH)、雪花莲凝集素(GNA)、蓖麻凝集蛋白(RCA)、花生凝集蛋白(PNA)、波罗蜜凝集素(AIL)、毛叶苕子凝集素(VVL)、麦胚凝集蛋白(WGA)、接骨木凝集素(SNA)、朝鲜槐白细胞凝集素(MAL)、朝鲜槐血凝素(MAH)、荆豆凝集蛋白(UEA)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)或其组合。凝集素可以是或包括凝集蛋白。凝集蛋白可以是或包括麦胚凝集蛋白(WGA)。糖结合蛋白可以来自或来源于动物、细菌、病毒、真菌或其组合。糖结合蛋白可以来自或来源于植物。植物可以是直生刀豆、兵豆、雪花莲、蓖麻、落花生、波罗蜜、毛叶苕子、普通小麦、西洋接骨木、朝鲜槐、荆豆、橙黄网孢盘菌或其组合。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分包括糖、寡糖、多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括单糖、二糖、多元醇、麦芽寡糖、非麦芽寡糖、淀粉、非淀粉多糖、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖糊精、棉子糖、水苏糖、果寡糖、直链淀粉、支链淀粉、改性淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶、水胶体、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括α-D-甘露糖基残基、α-D-葡糖基残基、高α-甘露糖型支链α-甘露糖苷结构、混合型和二分支复合型N-聚糖的支链α-甘露糖苷结构、二分支和三分支复合型N-聚糖的岩藻糖基化核心区、α1-3和α1-6连接的高甘露糖结构、Galβ1-4GalNAcβ1-R、Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、(Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、GalNAcα-Ser/Thr、GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Ac(唾液酸)、Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,4Glc(NAc)、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)GalNac、Fucα1-2Gal-R、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ1-4GlcNAc、R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1、其衍生物或其组合。核的一种或更多种组分可以包括糖蛋白、糖脂或其组合。

在一些实施方案中，核的一种或更多种组分包括核纤层蛋白、Emerin、Nesprin、Nurim、UNC-83、Klar、ZYG-12、Kms1p、UNC-84、Klaroid、SUN-1、Sad1p、LBR、MAN1、LAP1、LAP2、LINK、核孔复合体、其一部分或其组合。在不同的实施方式中，核的一种或更多种组分的数目可以是不同的。在一些实施方案中，核的一种或更多种组分的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，核的一种或更多种组分的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

核分离颗粒

在一些实施方案中，核结合试剂与核分离颗粒缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以与核分离颗粒(例如，具有图4A-图4B中示出的表面的颗粒448)缔合。能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以被固定在核分离颗粒上或被部分固定在核分离颗粒上。例如，能够与核结合试剂(例如，表位结合试剂444)特异性结合的试剂可以与核分离颗粒可逆地、非可逆地、共价地、非共价地或这些方式组合地缔合。作为另一种实例，能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包埋、部分包埋、非包埋、封闭、部分封闭、非封闭或这些方式组合地在核分离颗粒中。在一些实施方案中，第一表位结合试剂与核分离颗粒经由可裂解接头缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。可裂解接头可以将第一表位结合试剂可操作地连接至核分离颗粒。可裂解接头可以包括可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，提供了空颗粒。在一些实施方案中，空颗粒不包括多于一个条形码、磁特性和/或能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，第一表位结合试剂)。除了不存在多于一个条形码、磁特性和/或第一表位结合试剂之外，空颗粒在所有方面都可以类似于核分离颗粒。在本文公开的方法和组合物的一些实施方案中，提供了游离的第一表位。游离的第一表位可以包含第一表位的全部或一部分。在一些实施方案中，游离的第一表位可以结合未结合的第一表位结合试剂。

在一些实施方案中，核分离颗粒包括核分离珠。核分离颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。核分离颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。核分离颗粒可以是可破坏的。核分离颗粒可以包括核分离可破坏的水凝胶颗粒。

在一些实施方案中，分离与核结合试剂结合的核可以包括：通过磁性移除、离心或其任何组合来分离核分离颗粒。在一些实施方案中，多于一个条形码与核分离颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在核分离颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以不被封闭在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被包埋在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分包埋在核分离颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以不被包埋在核分离颗粒中。

核索引寡核苷酸

在一些实施方案中，核结合试剂可以包含核索引寡核苷酸(例如，与图4A-图4B中示出的核被膜蛋白特异性抗体432a缔合的条形码440a)。核索引寡核苷酸可以包含核索引序列。方法400可以包括：使用多于一个条形码将核索引寡核苷酸条形码化(例如，用于细胞核的样品索引)，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸；并且获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据。将核索引寡核苷酸条形码化可以包括：使用多于一个条形码进行随机条形码化，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。使用多于一个条形码将核索引寡核苷酸条形码化可以包括：使多于一个条形码与核索引寡核苷酸接触，以产生与核索引寡核苷酸杂交的条形码；并且将与核索引寡核苷酸杂交的条形码延伸，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。将条形码延伸可以包括：使用DNA聚合酶将条形码延伸以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。将条形码延伸可以包括：使用逆转录酶将条形码延伸以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

在不同的实施方式中，与核结合试剂缔合(例如，附接、缀合等)的核索引寡核苷酸的数目可以是不同的。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

与核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸可以具有相同的序列(或相同的核索引序列)或不同的序列(或不同的核索引序列)。在一些实施方案中，与具有相同的序列(或相同的核索引序列)的核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与具有相同的序列(或相同的核索引序列)的核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。在一些实施方案中，与具有不同的序列(或不同的核索引序列)的核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与具有不同的序列(或不同的核索引序列)的核结合试剂缔合的核索引寡核苷酸的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在一些实施方案中，方法400可以包括：扩增多于一个条形码化核索引寡核苷酸，以产生多于一个条形码化核索引扩增子。扩增多于一个条形码化核索引寡核苷酸可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增分子标记序列的至少一部分和核索引寡核苷酸的至少一部分。获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据可以包括：获得多于一个条形码化核索引扩增子的测序数据。获得多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据可以包括：对分子标记序列的至少一部分和核索引寡核苷酸的至少一部分进行测序。

条形码化颗粒

在一些实施方案中，多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分固定在条形码化颗粒上。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被封闭在条形码化颗粒中。多于一个条形码中的至少一个条形码可以被部分封闭在条形码化颗粒中。条形码化颗粒可以是可破坏的。条形码化颗粒可以包括条形码化珠。条形码化颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。条形码化颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。条形码化颗粒可以包括可破坏的水凝胶颗粒。

条形码和条形码化

在一些实施方案中，使用多于一个条形码将多于一个靶条形码化以产生多于一个条形码化靶包括：使靶的拷贝与条形码的靶结合区接触；并且使用多于一个条形码逆转录多于一个靶以产生多于一个条形码化靶。方法400可以包括：扩增多于一个条形码化靶以产生多于一个扩增的条形码化靶，然后获得多于一个条形码化靶的测序数据。扩增条形码化靶以产生多于一个扩增的条形码化靶可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增条形码化靶，以产生多于一个扩增的条形码化靶。方法400可以包括：扩增多于一个扩增的条形码化靶，以产生多于一个条形码化靶扩增子。扩增多于一个扩增的条形码化靶可以包括：扩增分子标记序列和多于一个靶的靶序列或其一部分，以产生多于一个条形码化靶扩增子。扩增多于一个扩增的条形码化靶可以包括：使用聚合酶链式反应(PCR)扩增多于一个扩增的条形码化靶，以产生多于一个条形码化靶扩增子。使用多于一个条形码将细胞的多于一个靶条形码化以产生多于一个条形码化靶可以包括：使用多于一个随机条形码将细胞的多于一个靶随机条形码化，以产生多于一个随机条形码化靶。

在一些实施方案中，多于一个条形码中的每一个包含细胞标记序列、通用引物的结合位点或其任何组合，并且多于一个条形码中的至少两个条形码的细胞标记序列包含相同的序列。靶结合区可以包含聚(dT)区多于一个条形码的至少100个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少1000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的至少10000个分子标记序列可以包含不同的序列。多于一个条形码的分子标记序列可以包含随机序列。靶结合区可以包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。

细胞裂解

在一些实施方案中，方法400包括：将多于一个核裂解，然后使用多于一个条形码将多于一个核中的多于一个靶条形码化，以产生多于一个条形码靶。在一些实施方案中，方法400包括：将多于一个细胞裂解而不裂解多于一个细胞的核，然后使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核。

核条形码化组合物

本文公开的包括条形码化组合物的实施方案。在一些实施方案中，条形码化组合物包含：包含核结合试剂的核分离组合物，其中核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；和多于一个条形码，其中多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且其中多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列。在一些实施方案中，组合物包含：能够与核结合试剂特异性结合的试剂。核结合试剂可以与第一表位缔合，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括第一表位结合试剂。在一些实施方案中，第一表位结合试剂与核分离颗粒经由可裂解接头缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。可裂解接头可以将第一表位结合试剂可操作地连接至核分离颗粒。可裂解接头可以包括可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。在一些实施方案中，核结合试剂包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。在一些这样的实施方案中，所述二级抗体与核分离颗粒经由可裂解接头连接。在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂。糖结合试剂可以包括糖结合蛋白。在一些实施方案中，核结合试剂与核分离颗粒缔合。在一些实施方案中，多于一个条形码与核分离颗粒缔合。在一些实施方案中，核结合试剂可以包含核索引寡核苷酸，并且其中核索引寡核苷酸包含核索引序列。多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。

细胞器去除方法和组合物

本文还公开的包括用于进行细胞器去除或分离的方法、组合物和系统，以用于单细胞转录组分析(或其他单细胞组学或多组学分析，诸如蛋白质组学分析，以确定单细胞的蛋白表达谱)。在一些实施方案中，抗体，诸如与表位缔合的抗体，可以用于进行细胞器去除步骤。例如，与一个或更多个强表位缀合的抗体可以用于细胞器去除步骤。通过细胞器去除步骤，可以获得用于NGS文库制备的具有较少污染物的细胞质RNA和/或核RNA。例如，可以获得用于NGS文库制备的纯化的或更澄清的细胞质RNA和/或核RNA。细胞器去除步骤可以用于单细胞文库制备，因为细胞器特异性RNA，诸如线粒体RNA，可以贡献测序读段(例如，大多数测序读段)。在一些实施方案中，细胞器去除步骤包括用线粒体特异性抗体(或另一种线粒体特异性结合试剂)去除线粒体。例如，细胞器去除步骤可以包括在单一步骤中用线粒体特异性抗体(或另一种线粒体特异性结合试剂)去除线粒体，同时在线粒体耗尽的RNA池中进行一个或更多个下游过程。下游过程可以包括用于转录组分析的cDNA合成和用于单细胞蛋白质组学分析的核酸延伸反应。在一些实施方案中，对于单细胞分析(例如，全转录组分析或蛋白质组分析)，可以降低(例如，消除)线粒体污染。

在一些实施方案中，核条形码和分离可以在单一步骤中发生。在一些实施方案中，线粒体内容物(例如，RNA)耗尽可以发生在文库制备开始时。在一些实施方案中，核条形码化和分离以及细胞器去除可以在单一步骤或相近的时间中发生。

图5A-图5B示出了带有细胞器(例如，线粒体)去除的条形码化工作流程(例如，随机条形码化)的非限制性示例性示意图。方法500可以包括细胞裂解(例如，使用光裂解缓冲液裂解细胞而不裂解一种或更多种细胞器)、细胞器结合和去除(诸如，线粒体结合和去除)，随后是单细胞分析(例如，单细胞表达谱分析)。通过例如与表位(例如，强表位诸如生物素、荧光素和DIG)缔合(例如，缀合)的抗体选择性去除细胞器诸如线粒体，可以降低(例如，最小化或避免)NGS文库污染。细胞器去除步骤可以是单细胞工作流程的一部分，诸如参考图4A-图4B描述的核条形码化方法400或Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson andCompany(Franklin Lakes,NJ))。

在一些实施方案中，方法500包括：在使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核之前或之时，使多于一个细胞透化(例如，选择性地透化和/或裂解质膜，同时保持一种或更多种细胞器的膜完整)；以及使用包含细胞器结合试剂(例如，图5A-图5B中示出的抗体532a)的细胞器捕获组合物来耗尽多于一个细胞的一种或更多种细胞器(例如，线粒体524)，其中细胞器结合试剂能够与多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。耗尽一种或更多种细胞器可以包括：使多于一个细胞的一种或更多种细胞器与细胞器捕获组合物接触，以产生与细胞器组分结合试剂结合的一种或更多种细胞器。耗尽一种或更多种细胞器可以包括：使用能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂，耗尽与细胞器结合试剂结合的一种或更多种细胞器。细胞器结合试剂可以与第二表位(例如，表位536)缔合，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂(例如，表位结合试剂544)可以包括第二表位结合试剂。

在不同的实施方式中，细胞器捕获组合物中细胞器结合试剂的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在不同的实施方式中，与细胞器结合的细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂的数目可以是不同的。在一些实施方案中，与细胞器结合的细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，与细胞器结合的细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在不同的实施方式中，细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂可以结合的细胞器的数目可以是不同的。在一些实施方案中，细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂可以结合的细胞器的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，细胞器捕获组合物中的细胞器结合试剂可以结合的细胞器的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在不同实施方案中，去除或耗尽的不同细胞器的数目可以是不同的。在一些实施方案中，去除或耗尽的不同细胞器的数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，去除或耗尽的不同细胞器的数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在不同的实施方案中，去除或耗尽的细胞器的分子数目可以是不同的。在一些实施方案中，去除或耗尽的细胞器的分子数目可以是以下或可以是约以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，去除或耗尽的细胞器的分子数目可以是至少以下或可以是至多以下：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000。

在一些实施方案中，第二表位可以包括生物素、半抗原或其组合。半抗原可以包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗半抗原抗体。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。在一些实施方案中，第二表位和/或第二表位结合试剂可以是亲和部分，诸如生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮或其任何组合。第二表位和第二表位结合试剂可以是结合对的成员，例如生物素/链霉抗生物素蛋白。细胞器结合试剂可以包括能够与多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。

在一些实施方案中，细胞器结合试剂可以包含细胞器表面组分结合试剂，一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括一种或更多种细胞器表面组分，并且细胞器结合试剂可以能够与一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。

细胞器-捕获颗粒

在一些实施方案中，能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂(例如，第二表位结合试剂)与细胞器捕获颗粒(例如，具有图5A-图5B中示出的表面的颗粒548)缔合。能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以被固定在细胞器捕获颗粒上或被部分固定在细胞器捕获颗粒上。例如，能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以可逆地、非可逆地、共价地、非共价地或这些方式组合地与细胞器捕获颗粒缔合。作为另一种实例，能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包埋、部分包埋、非包埋、封闭、部分封闭、非封闭或这些方式组合地在细胞器捕获颗粒中。

在一些实施方案中，细胞器捕获颗粒包括细胞器捕获珠。细胞器捕获颗粒可以包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。细胞器捕获颗粒可以包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

在一些实施方案中，使用细胞器捕获组合物来耗尽多于一个细胞的细胞器可以包括：通过磁性移除、离心或其任何组合来耗尽一个或更多个细胞器捕获颗粒。细胞器可以包括多于一个细胞的线粒体。多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括：ABCD3、ESR2、NOS3、ALB、HIF1A、NR3C1、ATP5A1、HK1、PGR、CASQ1、HSPA1A、PHB、CLTC、HSPD1、PLN、COX4I1、IFM1、SOD1、CPS1、LGALS3、TP53、细胞色素C氧化酶、MAPT、TP5B、ERN1、MT-CO1、VDAC1或其组合。

细胞器去除组合物

在一些实施方案中，组合物包含细胞器捕获组合物，该细胞器捕获组合物包含细胞器结合试剂，其中细胞器结合试剂能够与一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。组合物可以包含能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂。细胞器结合试剂可以与第二表位缔合，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂可以包括第二表位结合试剂。在一些实施方案中，能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂与细胞器捕获颗粒缔合。在一些实施方案中，细胞器结合试剂包含细胞器表面组分结合试剂，一种或更多种细胞器的一种或更多种组分可以包括一种或更多种细胞器表面组分，并且细胞器结合试剂可以能够与一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。

测序

在一些实施方案中，估计不同的条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的数目可以包括确定标记的靶、空间标记、分子标记、样品标记、细胞标记或其任何产物(例如，标记的扩增子或标记的cDNA分子)的序列。扩增的靶可以经历测序。确定条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或其任何产物的序列可以包括进行测序反应以确定样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记的至少一部分的序列，条形码化靶(例如，随机标记的靶)、其互补体、其反向互补体的至少一部分的序列，或其任何组合的序列。

确定条形码化靶或随机条形码化靶(例如，扩增的核酸、标记的核酸、标记的核酸的cDNA拷贝等)的序列可以使用各种测序方法来进行，所述测序方法包括但不限于，杂交测序(SBH)、连接法测序(SBL)、量化增量荧光核苷酸添加测序(quantitative incrementalfluorescent nucleotide addition sequencing)(QIFNAS)、逐步连接与裂解(stepwiseligation and cleavage)、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠、摆动测序(wobble sequencing)、多重测序、聚合集群(polymerized colony，POLONY)测序；纳米格滚环测序(nanogrid rollingcircle sequencing，ROLONY)、等位基因特异性寡核苷酸连接测定(allele-specificoligo ligation assay)(例如，寡核苷酸连接测定(OLA)、使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出、连接的挂锁(padlock)探针的单模板分子OLA、或使用连接的环状挂锁探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)等。

在一些实施方案中，确定条形码化靶(例如，随机条形码化靶)或其任何产物的序列包括配对末端测序、纳米孔测序、高通量测序、鸟枪法测序、染料终止测序、多重引物DNA测序、引物步移、桑格双脱氧测序法、马克西姆-吉尔伯特(Maxim-Gilbert)测序、焦磷酸测序、真单分子测序或其任何组合。可选地，条形码化靶或其任何产物的序列可以通过电子显微术或化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来确定。

可以使用高通量测序方法，诸如使用平台(诸如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos或Polonator平台)的循环阵列测序。在一些实施方案中，测序可以包括MiSeq测序。在一些实施方案中，测序可以包括HiSeq测序。

标记的靶(例如，随机标记的靶)可以包括代表约0.01％的生物体基因组基因至约100％的生物体基因组基因的核酸。例如，可以使用包括多于一个多聚体的靶互补区域，通过从样品中捕获包含互补序列的基因，对约0.01％的生物体基因组基因至约100％的生物体基因组基因进行测序。在一些实施方案中，条形码化靶包括代表约0.01％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物的核酸。例如，可以使用包含聚(T)尾的靶互补区域，通过从样品中捕获mRNA，对约0.01％的生物体转录组转录物至约100％的生物体转录组转录物进行测序。

确定多于一个条形码(例如，随机条形码)的空间标记和分子标记的序列可以包括对多于一个条形码的0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围进行测序。确定多于一个条形码的标记(例如样品标记、空间标记和分子标记)的序列可包括对多于一个条形码中的1个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、10³个、10⁴个、10⁵个、10⁶个、10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁶个、10¹⁷个、10¹⁸个、10¹⁹个、10²⁰个或在这些值的任何两个之间的数字或范围进行测序。对多于一个条形码中的一些或全部进行测序可以包括产生具有、具有约、具有至少或具有至多10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个、10000个或在这些值的任何两个之间的数字或范围内的核苷酸或碱基的读段长度的序列。

测序可以包括对条形码化靶的至少或至少约10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。例如，测序可以包括通过对多于一个条形码化靶进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，产生测序数据，其中序列具有50个、75个或100个或更多个核苷酸的读段长度。测序可以包括对条形码化靶的至少或至少约200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。测序可以包括对条形码化靶的至少或至少约1500个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个或更多个核苷酸或碱基对进行测序。

测序可以包括至少约200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1,000个或更多个测序读段/运行。在一些实施方案中，测序包括每次运行对至少或至少约1500个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10000个或更多个测序读段进行测序。测序可以包括少于或等于约1,600,000,000个测序读段/运行。测序可以包括少于或等于约200,000,000个读段/运行。

样品

在一些实施方案中，多于一个靶可以包括在一个或更多个样品中。样品可以包括一个或更多个细胞或者来自一个或更多个细胞的核酸。样品可以是单细胞或来自单细胞的核酸。一个或更多个细胞可以是一种或更多种细胞类型。一种或更多种细胞类型中的至少一种可以是脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞、循环细胞或其任何组合。

用于在本公开内容的方法中使用的样品可以包括一个或更多个细胞。样品可以指一个或更多个细胞。在一些实施方案中，多于一个细胞可以包括一种或更多种细胞类型。一种或更多种细胞类型中的至少一种可以是脑细胞、心脏细胞、癌细胞、循环肿瘤细胞、器官细胞、上皮细胞、转移性细胞、良性细胞、原代细胞、循环细胞或其任何组合。在一些实施方案中，细胞是从癌组织切下的癌细胞，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌等。在一些实施方案中，细胞来源于癌症，但是从体液收集(例如，循环肿瘤细胞)。癌症的非限制性实例可以包括腺瘤、腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、小细胞癌、大细胞未分化癌、软骨肉瘤以及纤维肉瘤。样品可以包括组织、单层细胞、固定的细胞、组织切片或其任何组合。样品可以包括生物学样品、临床样品、环境样品、生物流体、来自受试者的组织或细胞。样品可以从人类、哺乳动物、犬、大鼠、小鼠、鱼、蝇、蠕虫、植物、真菌、细菌、病毒、脊椎动物或无脊椎动物获得。

在一些实施方案中，细胞是已经被病毒感染并包含病毒寡核苷酸的细胞。在一些实施方案中，病毒感染可以由病毒诸如单链(+链或“有义”)DNA病毒(例如，细小病毒)或双链RNA病毒(例如，呼肠孤病毒)引起。在一些实施方案中，细胞是细菌。这些可以包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，细胞是真菌。在一些实施方案中，细胞是原生动物或其他寄生物。

如本文使用的，术语“细胞”可以指一个或更多个细胞。在一些实施方案中，细胞是正常细胞，例如，处于不同发育阶段的人类细胞，或来自不同器官或组织类型的人类细胞。在一些实施方案中，细胞是非人类细胞，例如其他类型的哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猪、犬、牛或马)。在一些实施方案中，细胞是其他类型的动物细胞或植物细胞。在其他实施方案中，细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。

在一些实施方案中，在将细胞与珠缔合之前，对细胞进行分选。例如，细胞可以通过荧光激活细胞分选或磁性激活细胞分选，或者更通常通过流式细胞术来分选。细胞可以按尺寸过滤。在一些实施方案中，滞留物包含待与珠缔合的细胞。在一些实施方案中，流通物包含待与珠缔合的细胞。

样品可以指多于一个细胞。样品可以指单层细胞。样品可以指薄切片(例如，组织薄切片)。样品可以指可以一维放置在阵列上的固体或半固体细胞集合。

去除不期望的核酸物质的方法

单细胞分析，诸如单细胞全转录组分析(WTA)，可以受到不感兴趣的靶或靶物质(诸如不感兴趣的核酸或核酸物质，在本文中也称为不期望的或不需要的核酸或核酸物质)的存在或高丰度的妨碍。在许多样品中，来源于非核细胞器的核酸(例如，线粒体mRNA和核糖体RNA)可以以高丰度存在和/或不期望地存在。例如，对于异质cDNA样品，PCR通常以过量的循环进行，以充分扩增低表达者；在这些情况下，天然基因表达谱通常被优势的高表达PCR产物所偏斜。校正PCR产物中这种偏倚的方法是分子索引；然而，诸如线粒体mRNA这样的高表达者通常在测序运行中占优势地位，对实验解释的贡献很小，使得分子索引计数的测序成本昂贵。先前增加核酸样品中低丰度物质的相对丰度的努力包括文库归一化方法。本文公开的一些实施方案提供了从多于一个核酸分子中去除不期望的核酸物质(例如，来源于非核细胞器的核酸，mtRNA、rRNA)的方法。

在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供包含多于一个核酸靶分子的样品。在一些实施方案中，样品可以包含一种或更多种不期望的核酸物质。本领域技术人员应该理解，多于一个核酸靶分子和/或不期望的核酸物质可以包括各种核酸靶分子。例如，核酸靶分子和/或不期望的核酸物质可以包括DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、mtDNA分子、siRNA分子或其任何组合。核酸靶分子可以是双链或单链的。在一些实施方案中，多于一个核酸靶分子可以包括来源于一种或更多种非核细胞器的核酸。在一些实施方案中，多于一个核酸靶分子可以包括聚A RNA分子。在一些实施方案中，多于一个核酸靶分子包含至少100个、至少1,000个、至少10,000个、至少20,000个、至少30,000个、至少40,000个、至少50,000个、至少100,000个、至少1,000,000个或更多个核酸物质。

样品可以例如包含多于一个核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸物质(例如，来源于非核细胞器的核酸)。一种或更多种不期望的核酸物质可以以不同的量存在于样品中。例如，一种或更多种不期望的核酸物质可以总计达到样品核酸含量的约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多或100％或在这些值的两个之间的范围。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸物质总计达到样品核酸含量的至少约10％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸物质总计达到样品核酸含量的至少约30％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸物质总计达到样品核酸含量的至少约50％。不期望的核酸物质可以是或可以包括各种类型的核酸分子。例如，一种或更多种不期望的核酸物质中的至少一种可以是核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA、基因组DNA、内含子序列、高丰度序列或其组合。在一些实施方案中，不期望的核酸物质是或包括mRNA物质。mRNA物质可以是，例如，管家基因的mRNA物质、核糖体基因的mRNA物质、线粒体基因的mRNA物质、高丰度基因的mRNA物质中的一种或更多种或其任何组合。在一些实施方案中，不期望的核酸物质是或包括DNA物质。DNA物质可以是，例如，管家基因的DNA物质、核糖体基因的DNA物质、线粒体基因的DNA物质、高丰度基因的DNA物质中的一种或更多种或其任何组合。在一些实施方案中，不期望的核酸物质是或包括DNA物质和RNA物质。

在一些实施方案中，与样品中的多于一个核酸靶分子相比，本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法可以显著降低一种或更多种不期望的核酸物质(例如，来源于非核细胞器的核酸)的丰度。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以降低样品中一种或更多种不期望的核酸物质的丰度。例如，本文公开的方法和组合物可以降低样品中至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1,000种或更多种不期望的核酸物质的丰度。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将样品中一种或更多种不期望的核酸物质的每一种的丰度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，与如本文描述在细胞器耗尽和/或核分离之前初始样品中至少一种核酸靶分子的丰度相比，一种或更多种不期望的核酸物质的丰度可以降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少55％、至少50％、至少65％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更多或这些值的任何两个之间的范围。

应该理解，在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以降低不期望的核酸物质的丰度，而不显著降低与其他核酸靶分子缔合的不同分子标记序列的数目。例如，本文公开的方法和组合物可以降低不期望的核酸物质的丰度，同时保留至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的与其他核酸靶分子缔合的不同分子标记序列。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将不期望的核酸物质的丰度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，同时保留至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的与其他核酸靶分子缔合的不同分子标记序列。在一些实施方案中，降低不期望的核酸物质的丰度不显著降低与其他核酸靶分子缔合的不同分子标记序列的数目。

在一些实施方案中，在使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法之后，不期望的核酸物质的测序读段是总测序读段的少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或更少。在一些实施方案中，不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的40％。在一些实施方案中，不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的30％。在一些实施方案中，不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的20％。在一些实施方案中，不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的10％。在一些实施方案中，在使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法之后，不期望的核酸物质的测序读段降低至不使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法时不期望的核酸的测序读段的少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％。在一些实施方案中，在使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法之后，不期望的核酸物质的测序读段降低至不使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法时不期望的核酸的测序读段的60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或这些值的任何两个值之间的范围，或降低至不使用本文描述的核分离和/或细胞器耗尽方法时不期望的核酸的测序读段的约60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或这些值的任何两个之间的范围。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以通过降低不期望的核酸物质的测序读段:分子标记比率和/或增加核酸靶分子的测序读段:分子标记比率来提高测序效率。例如，不期望的核酸物质的测序读段与分子标记的比率可以小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1。在一些实施方案中，不期望的核酸物质的测序读段与分子标记的比率是20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或这些值的任何两个之间的范围。

实施例

以上讨论的实施方案的一些方面在以下实例中进一步详细公开，其并非意图以任何方式限制本公开内容的范围。

实施例1

核捕获和条形码化工作流程

本实施例显示了用于核捕获和条形码化的工作流程。图6A-图6F是用于核分离和单细胞谱分析的非限制性示例性工作流程的示意图。工作流程可以包括细胞裂解(例如，使用光裂解缓冲液来裂解质膜，而不裂解核膜和/或一种或更多种细胞器)。工作流程可以包括一种或更多种细胞器(例如，线粒体)的选择性耗尽。工作流程可以包括将每个核与包含核索引序列的核索引寡核苷酸缔合(例如，用于样品索引化)。工作流程可以包括将核与一种或更多种细胞组分分离。工作流程可以包括将个体核分区到多于一个分区，并进行核裂解。工作流程可以包括将靶核酸分子和/或核索引寡核苷酸条形码化(例如，随机条形码化)以用于单细胞分析(例如，Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson and Company(FranklinLakes,NJ))、Chromium^TM单细胞3’溶液(10×Genomics(San Francisco,CA)))。

样品组成

样品601可以包括多于一个细胞602。用于本公开内容的方法的样品可以是在技术上难以或不可能产生单细胞悬液的样品(例如，冷冻的细胞、固定的细胞、组织样本、肿瘤样本、上皮组织、福尔马林固定石蜡包埋的细胞及其组合)。细胞可以包含质膜604和细胞核606。细胞核可以包含核被膜608和一种或更多种核酸靶分子612。核被膜可以包含一种或更多种核被膜表面组分610，诸如核被膜蛋白(例如，核纤层蛋白)。核可以包含一种或更多种靶核酸分子(例如，信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、长非编码RNA(长ncRNA或lncRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA))。如本文描述的，细胞可以包含一种或更多种细胞器(例如，核糖体、线粒体)，并且一种或更多种细胞器可以包含一种或更多种细胞器表面组分。线粒体616可以包含细胞器表面组分(例如，线粒体表面组分618)。细胞还可以包含核外细胞组分614。核外细胞组分可以例如包括不期望的核外细胞质组分(例如，对单细胞表达谱分析不必要和/或有害的分子)。核外细胞组分可以包括细胞质碎片。核外细胞组分可以包括细胞器。核外细胞组分可以包括线粒体。核外细胞组分可以包括核糖体。核外细胞组分可包括粗面内质网。核外细胞组分可以包含一种或更多种不期望的核酸(例如，核糖体RNA、线粒体DNA、线粒体RNA)。核外细胞组分可以包含一种或更多种大分子，所述大分子会干扰本文公开的单细胞表达分析方法。核外细胞组分614可以例如包括线粒体、过氧化物酶体、胞质溶胶、囊泡、溶酶体、质膜、叶绿体、内部线粒体基质、线粒体内膜、膜间隙、线粒体外膜、分泌囊泡、光面内质网、粗面内质网、高尔基体、吞噬体、内体、外泌体、质膜、微管、微丝、中间丝、丝状伪足、褶边、片状伪足、肌节、黏着斑、足体、核糖体、微粒体、脂筏、细胞壁及其组合。

质膜裂解

工作流程可以包括样品601的细胞群体602的质膜裂解(步骤600a)。如图6A中描绘的，质膜裂解可以产生包含多于一个的核、细胞器和核外细胞组分(例如，核糖体)的群体的裂解物。方法可以包括裂解多于一个细胞而不裂解核被膜。方法可以包括裂解多于一个细胞而不裂解细胞器膜。方法可以包括裂解多于一个细胞和裂解细胞器膜而不裂解核被膜。质膜裂解可以使用匀浆器(例如Dounce匀浆器)、去污剂或酶促方法进行。

与细胞器表面组分结合试剂接触

工作流程可以包括使裂解物与一种或更多种细胞器表面组分结合试剂接触(步骤600b)。第二表位622可以与细胞器表面组分结合试剂620(例如，细胞器结合试剂)缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。第二表位622可以包括如本文描述的强表位(例如，生物素、荧光素和/或DIG)。细胞器表面组分结合试剂620可以能够与一种或更多种细胞器(例如，线粒体)的一种或更多种组分(诸如，例如线粒体表面组分618)特异性结合(如图6B中描绘的)。使多于一个细胞的一种或更多种细胞器与细胞器表面组分结合试剂接触可以产生一种或更多种与细胞器组分结合试剂结合的细胞器。细胞器表面组分结合试剂620可以包括线粒体特异性抗体(或另一种线粒体特异性结合试剂)。

与细胞器捕获颗粒接触

工作流程可以包括使裂解物与一个或更多个细胞器捕获颗粒接触(步骤600c)。细胞器捕获颗粒630可以包括能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂(例如，如图6B中描绘的第二表位结合试剂632)，如本文描述的。第二表位结合试剂632可以与细胞器捕获颗粒630缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。在一些实施方案中，细胞器表面组分结合试剂620不包括第二表位。在一些这样的实施方案中，细胞器表面组分结合试剂可以包括能够与一种或更多种细胞器(例如，线粒体)的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。步骤600c可以产生一个或更多个经由细胞器表面组分结合试剂与细胞器捕获颗粒结合的细胞器。

去除细胞器捕获颗粒

工作流程可以包括细胞器捕获颗粒的去除(步骤600d)。细胞器捕获颗粒的去除可以通过磁性移除、离心、过滤或其任何组合来进行。步骤600d可以产生耗尽一种或更多种细胞器的裂解物。

与核结合试剂接触

工作流程可以包括使裂解物与一种或更多种核结合试剂接触(步骤600e)。核结合试剂640可以包括第一表位642。第一表位642可以例如包括强表位(例如，生物素、荧光素和/或DIG)，如本文描述的。核结合试剂640可以能够与核的一种或更多种组分(例如，核被膜蛋白)诸如例如核被膜表面组分610特异性结合(如图6C中描绘的)。在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂(例如，糖结合蛋白，凝集素)。使核与核结合试剂接触可以产生与核结合试剂结合的核。核结合试剂640可以包括核索引寡核苷酸644。核索引寡核苷酸644可以包括核索引序列(例如，用于样品索引化)。核索引寡核苷酸644可以在整个工作流程中保持与核缔合。在一些实施方案中，工作流程可以包括在核被包含核索引寡核苷酸的核结合试剂结合后，汇集来自不同样品的核。

与核分离颗粒和空颗粒接触

工作流程可以包括使裂解物与核分离颗粒和空颗粒接触(步骤600f)。核分离颗粒650可以包括能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，如图6D中描绘的第一表位结合试剂652)，如本文描述的。第一表位结合试剂652可以与核分离颗粒缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。核结合试剂可以包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体。多于一个条形码654可以与核分离颗粒缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。

如图6D中描绘的，步骤600f可以产生经由能够与核结合试剂特异性结合的试剂与核分离颗粒结合的核。在一些实施方案中，根据本文提供的方法，可以将样品中的核群体与核外细胞组分分开。在一些实施方案中，根据本文提供的方法，可以将样品中的核群体彼此单独分开(例如，分离)。本文公开的组合物和方法的一些实施方案可以任选地用于降低或消除核分离颗粒聚集。本文提供的方法和组合物的一些实施方案可以用于，例如，(1)降低或消除单独核分离颗粒与两个或更多个核的结合，和/或(2)降低或消除单独核与多于一个核分离颗粒的结合。

在一些实施方案中，在接触后与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比可以是以下或可以是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，在接触后与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比可以是至少以下或是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，在接触后与单个核分离颗粒结合的核的百分比可以是以下或可以是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，在接触后与单个核分离颗粒结合的核的百分比可以是至少以下或至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在一些实施方案中，单个核与核分离颗粒的结合可以遵循泊松分布。在一些实施方案中，单个核与核分离颗粒的结合可以遵循非泊松分布。样品中两个不同的核可以与同一个核分离颗粒结合的概率可以是以下或可以是至少以下：10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2或10^-1或更高。样品中两个不同的核可以与同一个核分离颗粒结合的概率可以是至多10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2或10^-1或更高。单个核可以同时与两个或更多个不同的核分离颗粒结合的概率可以是以下或可以是至少以下：10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2或10^-1或更高。单个核可以同时与两个或更多个不同的核分离颗粒结合的概率可以是至多10^-6、10^-5、10^-4、10^-3、10^-2或10^-1或更高。

在一些实施方案中，工作流程包括使裂解物与核分离颗粒650和空颗粒656接触。在一些实施方案中，空颗粒656不包括多于一个条形码、磁特性和/或能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，第一表位结合试剂)。除了不存在多于一个条形码、磁性和/或能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，第一表位结合试剂)之外，空颗粒在所有方面都可以类似于核分离颗粒。在一些实施方案中，使裂解物与空颗粒接触，然后与核分离颗粒接触。在一些实施方案中，使裂解物同时与空颗粒和核分离颗粒接触。与空颗粒接触可以(1)降低或消除单独核分离颗粒与两个或更多个核的结合，和/或(2)降低或消除单独核与多于一个核分离颗粒的结合。

在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例范围是1:100至100:1。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至多10:1。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至多100:1。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至多1:1000。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至少10:1。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至少1:100。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例是至少1:1000。

在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或在所述值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，核分离颗粒与空颗粒的比例可以是至少以下或可以是至多以下：1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000或1:10000。

本文提供的方法和组合物的一些实施方案采用流式细胞术，以(1)降低或消除单独核分离颗粒与两个或更多个核的结合，和/或(2)降低或消除单独核与多于一个核分离颗粒的结合。例如，可以合并一系列各自包含单个核的液滴和一系列各自包含单个核分离颗粒的液滴，以产生一系列各自包含单个核和单个核分离颗粒的液滴。在液滴内的单个核与单个核分离颗粒结合之后，该系列液滴中的每个液滴可以与另一系列包含如本文描述的游离第一表位的液滴合并。在核分离颗粒上的第一表位结合位点饱和之后，可以汇集多于一个液滴，并进行本公开内容的下游方法。

与游离的第一表位接触

工作流程可以包括使裂解物与游离的第一表位接触(步骤600g)。游离的第一表位660可以包含第一表位642的全部或一部分。游离的第一表位可以结合与核分离颗粒缔合的未结合的第一表位结合试剂(例如，如图6E中描绘的第一表位结合试剂652)。在步骤600g之后，核结合试剂的大部分或全部结合位点可以被饱和(例如，被游离的第一表位或核结合试剂的第一表位结合)，从而降低或防止核分离颗粒与核的任何额外结合。与游离的第一表位接触可以防止工作流程下游核分离颗粒与空颗粒分开时聚集。

在一些实施方案中，游离的第一表位与核分离颗粒的比例可以是以下或可以是约以下：1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000、1:10000或在所述值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，游离的第一表位与核分离颗粒的比例可以是至少以下或可以是至多以下：1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40、1:41、1:42、1:43、1:44、1:45、1:46、1:47、1:48、1:49、1:50、1:51、1:52、1:53、1:54、1:55、1:56、1:57、1:58、1:59、1:60、1:61、1:62、1:63、1:64、1:65、1:66、1:67、1:68、1:69、1:70、1:71、1:72、1:73、1:74、1:75、1:76、1:77、1:78、1:79、1:80、1:81、1:82、1:83、1:84、1:85、1:86、1:87、1:88、1:89、1:90、1:91、1:92、1:93、1:94、1:95、1:96、1:97、1:98、1:99、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000、1:6000、1:7000、1:8000、1:9000或1:10000。

在一些实施方案中，在与游离的第一表位接触之后，包含一个或更多个未结合的第一表位结合试剂的核分离颗粒的百分比可以是以下或可以是约以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或在这些值的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中，在与游离的第一表位接触之后，包含一个或更多个未结合的第一表位结合试剂的核分离颗粒的百分比可以是至少以下或可以是至多以下：0.000000001％、0.00000001％、0.0000001％、0.000001％、0.00001％、0.0001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

分离核分离颗粒

工作流程可以包括核分离颗粒的分离(步骤600h)。核分离颗粒(和与其结合的核)的分离可以包括通过磁性移除、过滤、离心或其任何组合来分离核分离颗粒。步骤600h可以产生耗尽细胞器和/或核外细胞组分的多于一个分离的核分离颗粒(每个核分离颗粒与一个或零个核结合)。

分区、核裂解和条形码化

工作流程可以包括分区、核裂解和条形码化(步骤600i)。多于一个核和与其结合的核分离颗粒可以被分区到多于一个分区。在一些实施方案中，将多于一个核与核分离颗粒分开，然后将所述核分区到多于一个分区。分区可以是微孔、液滴或乳液。多于一个分区中的分区可以包括来自多于一个核的单个核及其缔合的核分离颗粒。多于一个分区中的分区可以包括来自多于一个核的单个核及条形码化颗粒。多于一个分区中的分区可以包括来自多于一个核的单个核、其缔合的核分离颗粒及条形码化颗粒。在一些实施方案中，选择微孔尺寸(例如，微孔深度)以优化核和核分离颗粒捕获效率，同时还提供包含在孔内的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。在分区后，核可以根据本文提供的方法来裂解。条形码化可以包括根据本文提供的方法，使用核分离颗粒和/或条形码化颗粒的多于一个条形码来产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸和/或条形码化靶。步骤600i的产物(例如，条形码化核索引寡核苷酸和/或条形码化靶)可以经历本文提供的下游方法以产生单细胞表达谱。

在一些实施方案中，工作流程的一个或更多个步骤包括离心。在一些实施方案中，工作流程的一个或更多个步骤不包括离心。在一些实施方案中，工作流程的步骤全都不包括离心。在一些实施方案中，工作流程不包括步骤600a、步骤600b、步骤600c、步骤600d、步骤600e、步骤600f、步骤600g、步骤600h和/或步骤600i中的一个或更多个。例如，在一些实施方案中，方法不包括与细胞器表面组分结合试剂接触(步骤600b)、与细胞器捕获颗粒接触(步骤600c)和/或去除细胞器捕获颗粒(步骤600d)。任选地，步骤600a包括裂解多于一个细胞和裂解细胞器膜而不裂解核被膜，并且因此不进行步骤600b、步骤600c和/或步骤600d。在一些实施方案中，对于单细胞分析(例如，全转录组分析或蛋白质组学分析)，可以降低(例如，消除)细胞器污染和/或核外细胞组分污染(例如，线粒体污染)，而无需进行工作流程的步骤600b、步骤600c和/或步骤600d。在一些实施方案中，工作流程的步骤600a、步骤600b、步骤600c、步骤600d、步骤600e、步骤600f、步骤600g、步骤600h和/或步骤600i中的一个或更多个被同时进行。例如，与细胞器表面组分结合试剂接触(步骤600b)和与细胞器捕获颗粒接触(步骤600c)可以同时发生。在一些这样的实施方案中，细胞器表面组分结合试剂与细胞器捕获颗粒缔合。细胞器表面组分结合试剂可以被固定在细胞器捕获颗粒上或被部分固定在细胞器捕获颗粒上。例如，细胞器表面组分结合试剂可以与细胞器捕获颗粒可逆地、非可逆地、共价地、非共价地或这些方式组合地缔合。作为另一种实例，细胞器表面组分结合试剂可以包埋、部分包埋、非包埋、封闭、部分封闭、非封闭或这些方式组合地在细胞器捕获颗粒中。

在一些实施方案中，核结合试剂不包括第一表位。在一些这样的实施方案中，核结合试剂可以包括能够与核的一种或更多种组分(例如，核被膜蛋白)特异性结合的一级抗体，并且核分离颗粒与能够与一级抗体特异性结合的二级抗体缔合。在一些这样的实施方案中，游离的一级抗体(而不是游离的第一表位)可以与裂解物接触，然后分离核分离颗粒。

实施例2

核捕获和条形码化工作流程

本实施例显示了核捕获和条形码化的工作流程。图7A-图7C是用于核分离和单细胞分析的非限制性示例性工作流程的示意图。工作流程可以包括细胞裂解(例如，使用光裂解缓冲液来裂解质膜，而不裂解核膜和/或一种或更多种细胞器)。工作流程可以包括将每个核与包含核索引序列的核索引寡核苷酸缔合(例如，用于样品索引化)。工作流程可以包括将核与一种或更多种细胞组分和/或细胞器分离。工作流程可以包括将个体核分区到多于一个分区，并进行核裂解。工作流程可以包括将靶核酸分子和/或核索引寡核苷酸条形码化(例如，随机条形码化)以用于单细胞分析(例如，Rhapsody^TM测定(Becton,Dickinson andCompany(Franklin Lakes,NJ))、Chromium^TM单细胞3’溶液(10×Genomics(San Francisco,CA)))。

样品组成

样品701可以包括多于一个细胞702。用于本公开内容的方法的样品可以是在技术上难以或不可能产生单细胞悬液的样品(冷冻的细胞、固定的细胞、组织样本、肿瘤样本、上皮组织、福尔马林固定石蜡包埋的细胞及其组合)。细胞可以包含质膜704和细胞核706。细胞核可以包含核被膜708和一种或更多种核酸靶分子712。核被膜可以包含一种或更多种核被膜表面组分710，诸如核被膜蛋白(例如，核纤层蛋白)。核可以包含一种或更多种靶核酸分子(例如，信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、长非编码RNA(长ncRNA或lncRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA))。如本文描述的，细胞可以包含一种或更多种细胞器(例如，核糖体、线粒体)，并且一种或更多种细胞器可以包含一种或更多种细胞器表面组分。线粒体716可以包含细胞器表面组分(例如，线粒体表面组分718)。细胞还可以包含核外细胞组分714。核外细胞组分可以包括不期望的核外细胞质组分(例如，对单细胞表达谱不必要和/或有害的分子)。核外细胞组分可以包括细胞质碎片。核外细胞组分可以包括细胞器。核外细胞组分可以包括线粒体。核外细胞组分可以包括核糖体。核外细胞组分可包括粗面内质网。核外细胞组分可以包含一种或更多种不期望的核酸(例如，核糖体RNA、线粒体DNA、线粒体RNA)。核外细胞组分可以包含一种或更多种大分子，所述大分子会干扰本文公开的单细胞表达分析方法。核外细胞组分714可以包括线粒体、过氧化物酶体、胞质溶胶、囊泡、溶酶体、质膜、叶绿体、内部线粒体基质、线粒体内膜、膜间隙、线粒体外膜、分泌囊泡、光面内质网、粗面内质网、高尔基体、吞噬体、内体、外泌体、质膜、微管、微丝、中间丝、丝状伪足、褶边、片状伪足、肌节、黏着斑、足体、核糖体、微粒体、脂筏、细胞壁及其组合。

质膜裂解

工作流程可以包括样品701的细胞群体702的质膜裂解(步骤700a)。如图7A中描绘的，质膜裂解可以产生包含多于一个的核、细胞器和核外细胞组分(例如，核糖体)的群体的裂解物。方法可以包括裂解多于一个细胞而不裂解核被膜。方法可以包括裂解多于一个细胞而不裂解细胞器膜。方法可以包括裂解多于一个细胞和裂解细胞器膜而不裂解核被膜。质膜裂解可以使用匀浆器(例如Dounce匀浆器)、去污剂或酶促方法进行。在一些实施方案中，工作流程包括使裂解物与细胞器表面组分结合试剂接触、使裂解物与细胞器捕获颗粒接触和/或去除所述细胞器捕获颗粒(例如，实施例1的步骤600b、步骤600c和/或步骤600d)，然后进行步骤700b。

与核结合试剂接触

工作流程可以包括使裂解物与一种或更多种核结合试剂接触(步骤700b)。核结合试剂740可以包括第一表位742。第一表位742可以包括如本文描述的强表位(例如，生物素、荧光素和/或DIG)。核结合试剂740可以能够与核的一种或更多种组分(例如，核被膜蛋白)诸如例如核被膜表面组分710特异性结合(如图7B中描绘的)。在一些实施方案中，核结合试剂包括糖结合试剂(例如，糖结合蛋白，凝集素)。使核与核结合试剂接触可以产生与核结合试剂结合的核。核结合试剂740可以包括核索引寡核苷酸744。核索引寡核苷酸744可以包括核索引序列(例如，用于样品索引化)。核索引寡核苷酸744可以在整个工作流程中保持与核缔合。在一些实施方案中，工作流程可以包括在核被包含核索引寡核苷酸的核结合试剂结合后，汇集来自不同样品的核。

与核分离颗粒接触

工作流程可以包括使裂解物与一个或更多个核分离颗粒接触(步骤700c)。核分离颗粒750可以包括能够与核结合试剂特异性结合的试剂(例如，如图7B中描绘的第一表位结合试剂752)，如本文描述的。第一表位结合试剂752可以与核分离颗粒经由可裂解接头780缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。可裂解接头780可以将第一表位结合试剂752可操作地连接至核分离颗粒750。可裂解接头可以包括可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。核结合试剂可以包括能够与核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且能够与核结合试剂特异性结合的试剂可以包括能够与一级抗体特异性结合的二级抗体，其中所述二级抗体与核分离颗粒经由可裂解接头连接。如图7B中描绘的，步骤700c可以产生经由能够与核结合试剂特异性结合的试剂与核分离颗粒结合的核。

分离核分离颗粒

工作流程可以包括核分离颗粒的分离(步骤700d)。核分离颗粒(和与其结合的核)的分离可以包括通过磁性移除、过滤、离心或其任何组合来分离核分离颗粒。步骤700d可以产生耗尽细胞器和/或核外细胞组分的多于一个分离的核分离颗粒(和与其结合的核)。

裂解接头并去除核分离颗粒

工作流程可以包括裂解可裂解接头(从而实现核与核分离颗粒的分开)和去除核分离颗粒(步骤700e)。可以将多于一个分离的核分离颗粒(和与其结合的核)暴露于实现可裂解接头裂解所必需的条件。这些条件可以包括静电环境(例如，高pH、低pH)、温度(例如，可热裂解)、选择波长的光(例如，可光裂解)、化学化合物(例如，可化学裂解)、酶(例如，可酶促裂解)。在可断裂接头裂解后，核不能再与核分离颗粒缔合。可以通过磁性移除、离心、过滤或其任何组合来从核中去除核分离颗粒，从而产生纯化的核群体。

分区、核裂解和条形码化

工作流程可以包括分区、核裂解和条形码化(步骤700f)。多于一个核可以被分区到多于一个分区。分区可以是微孔、液滴或乳液。多于一个分区中的分区可以包括来自多于一个核的单个核。多于一个分区中的分区可以包括来自多于一个核的单个核及条形码化颗粒。在一些实施方案中，选择微孔尺寸(例如，微孔深度)以优化核和条形码化颗粒捕获效率，同时还提供包含在孔内的测定缓冲液和其他试剂的有效交换。

在一些实施方案中，乳液、微孔或孔仅包含一个核。在一些实施方案中，1个至2,000,000个乳液、微孔或孔各自仅包含一个核。在一些实施方案中，方法包括在每个乳液、微孔或孔中分布至多一个核。在一些实施方案中，将单个固体支持物和单个核分布到乳液、微孔或孔中。在一些实施方案中，1个至2,000,000个乳液、微孔或孔各自具有分布于其中的一个核和一个固体支持物。在一些实施方案中，方法包括在每个乳液、微孔或孔中分布至多一个固体支持物。在一些实施方案中，方法包括在1个至2,000,000个微孔、乳液或孔中的每一个中分布一个固体支持物和一个核。在一些实施方案中，核分布是随机或非随机的。在一些实施方案中，核分布是随机的。在一些实施方案中，核由细胞分选仪分布。在一些实施方案中，通过使一个或更多个孔、微孔或乳液与稀释的核稀释溶液接触来分布核，使得一个或更多个孔、微孔或乳液中被分配至多一个核。

在一些情况下，来自核群体的核可以被分开(例如，分离)到本公开内容的基底的孔中。例如，核群体可以在分开之前被稀释。核群体可以被稀释，使得至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的基底孔接收单个核。核群体可以被稀释，使得至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的基底孔接收单个核。核群体可以被稀释，使得稀释的群体中的核数目是以下或是至少以下：基底上孔数目的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。核群体可以被稀释，使得稀释的群体中的核数目是以下或是至多以下：基底上孔数目的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些情况下，核群体被稀释，使得核数目是基底中孔数目的约10％。

单个核在基底孔中的分布可以遵循泊松分布。例如，基底孔具有多于一个核的概率可以是至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更高。基底孔具有多于一个核的概率可以是至多0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％或更高。单个核在基底孔中的分布可以是随机的。单个核在基底孔中的分布可以是非随机的。核可以被分开，使得基底孔仅接收一个核。

在分区后，核可以根据本文提供的方法来裂解。条形码化可以包括根据本文提供的方法，使用条形码化颗粒的多于一个条形码来产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸和/或条形码化靶。步骤700f的产物(例如，条形码化核索引寡核苷酸和/或条形码化靶)可以经历本文提供的下游方法以产生单细胞表达谱。

在一些实施方案中，工作流程的一个或更多个步骤包括离心。在一些实施方案中，工作流程的一个或更多个步骤不包括离心。在一些实施方案中，工作流程的步骤全都不包括离心。在一些实施方案中，工作流程不包括步骤700a、步骤700b、步骤700c、步骤700d、步骤700e和/或步骤700f中的一个或更多个。例如，核结合试剂可以与核分离颗粒经由可裂解接头缔合(例如，固定、部分固定、封闭、部分封闭)。在一些实施方案中，工作流程的步骤700a、步骤700b、步骤700c、步骤700d、步骤700e和/或步骤700f中的一个或更多个被同时进行。例如，与核结合试剂接触(步骤700b)和与核分离颗粒接触(步骤700c)可以同时发生。

在至少一些先前描述的实施方案中，在一种实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有此类修改和改变都旨在落在由所附权利要求书限定的主题的范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，在对于背景和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。

本领域技术人员将理解，通常，本文使用的术语，并且特别是所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中的术语，通常旨在作为“开放性的”术语(例如，术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果意图所介绍的权利要求陈述的特定数字，则这样的意图将明确地陈述于权利要求中，并且在这种陈述不存在的情况下，不存在这种意图。例如，作为对理解的帮助，所附权利要求书可以包含介绍性措辞“至少一个”和“一个或更多个”的使用，以介绍权利要求陈述。然而，此类措辞的使用不应解读为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含这种介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一个这种陈述的实施方案中，甚至当相同的权利要求包括介绍性措辞“一个或更多个”或“至少一个”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如，“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一个”或“一个或更多个”)；这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字，本领域技术人员将认识到，这种陈述应解释为意指至少所陈述的数字(例如，仅陈述“两个陈述”而没有其他修饰词意指至少两个陈述或两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B、和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如，“具有A、B或C中的至少一个的系统”将包括但不限于具有单独的A，具有单独的B，具有单独的C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B、和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。

此外，当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时，本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。

如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的该范围的子范围和子范围组合。任何列举的范围可以被容易地认为充分地描述了并且使得同一范围能够被分成至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以被容易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言文字诸如“多达(up to)”、“至少”、“大于”、“少于”等包括所引述的数字并且指随后可以被分成如以上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个个体的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1个、2个或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组，等等。

尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不意图限制由所附权利要求书所指出的真实范围和精神。

Claims (243)

1.一种用于确定多于一个细胞中的靶的数目的方法，所述方法包括：

使用核分离组合物分离多于一个细胞的多于一个核，

其中所述核分离组合物包含核结合试剂，并且

其中所述核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；使用多于一个条形码将所述多于一个核中的多于一个靶条形码化，以产生多于一个条形码化靶，

其中所述多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且

其中所述多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列；

获得所述多于一个条形码化靶的测序数据；以及

使用所述测序数据中的所述多于一个条形码的分子标记序列来估计所述多于一个细胞中的多于一种靶中的每一种的数目。

2.根据权利要求1所述的方法，其中分离所述多于一个核包括：

使所述多于一个细胞的多于一个核与所述核分离组合物接触，以产生与所述核结合试剂结合的核。

3.根据权利要求2所述的方法，其中分离所述多于一个核包括：

使用能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂分离与所述核结合试剂结合的核。

4.根据权利要求3所述的方法，

其中所述核结合试剂与第一表位缔合，并且

其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包含第一表位结合试剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一表位包括生物素、半抗原或其组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述半抗原包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。

7.根据权利要求5-6中任一项所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括抗半抗原抗体。

8.根据权利要求5所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述核结合试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其组合。

10.根据权利要求3-9中任一项所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其组合。

11.根据权利要求3所述的方法，

其中所述核结合试剂包括能够与所述核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且

其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与所述一级抗体特异性结合的二级抗体。

12.根据权利要求3所述的方法，其中所述核结合试剂包括糖结合试剂。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述糖结合试剂包括糖结合蛋白。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述糖结合蛋白包括凝集素。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述凝集素包括甘露糖结合凝集素、半乳糖结合凝集素、N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡萄糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素、岩藻糖结合凝集素或其组合。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述凝集素包括伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁豆凝集素(LCH)、雪花莲凝集素(GNA)、蓖麻(Ricinus communis)凝集蛋白(RCA)、花生凝集蛋白(PNA)、波罗蜜凝集素(AIL)、毛叶苕子凝集素(VVL)、麦胚凝集蛋白(WGA)、接骨木凝集素(SNA)、朝鲜槐(Maackia amurensis)白细胞凝集素(MAL)、朝鲜槐血凝素(MAH)、荆豆(Ulexeuropaeus)凝集蛋白(UEA)、橙黄网孢盘菌(Aleuria aurantia)凝集素(AAL)或其组合。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述凝集素是凝集蛋白。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述凝集蛋白是麦胚凝集蛋白(WGA)。

19.根据权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述糖结合蛋白来自或来源于动物、细菌、病毒或真菌。

20.根据权利要求13-18中任一项所述的方法，其中所述糖结合蛋白来自或来源于植物。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述植物是直生刀豆(Canavalia ensiformis)、兵豆(Lens culinaris)、雪花莲(Galanthus nivalis)、蓖麻(Ricinus communis)、落花生(Arachis hypogaea)、波罗蜜(Artocarpus integrifolia)、毛叶苕子(Vicia villosa)、普通小麦(Triticum vulgaris)、西洋接骨木(Sambucus nigra)、朝鲜槐、荆豆、橙黄网孢盘菌或其组合。

22.根据权利要求3-21中任一项所述的方法，其中所述核结合试剂与核分离颗粒缔合。

23.根据权利要求22所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂与所述核分离颗粒缔合。

24.根据权利要求23所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂被固定在所述核分离颗粒上。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂通过可裂解接头与所述核分离颗粒缔合。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述可裂解接头包括可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的方法，其中所述核分离颗粒包括核分离珠。

28.根据权利要求22-27中任一项所述的方法，其中所述核分离颗粒包括：sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠、水凝胶珠或其任何组合。

29.根据权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述核分离颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述核分离颗粒是可破坏的。

31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述核分离颗粒包括核分离可破坏的水凝胶颗粒。

32.根据权利要求22-31中任一项所述的方法，其中分离与所述核结合试剂结合的核包括使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触。

33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，所述方法包括使与所述核结合试剂结合的核与多于一个空颗粒接触，然后使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触。

34.根据权利要求33所述的方法，其中空颗粒与核分离颗粒的比是至少10:1。

35.根据权利要求33-34中任一项所述的方法，其中空颗粒不包含磁特性。

36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中空颗粒不包含能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂。

37.根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中空颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮或其任何组合。

38.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述多于一个空颗粒降低所述核分离颗粒聚集。

39.根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中所述多于一个空颗粒防止所述核分离颗粒聚集。

40.根据权利要求22-39中任一项所述的方法，其中使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触，产生多于一个通过能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂与核分离颗粒结合的核。

41.根据权利要求40所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核分离颗粒结合的核的百分比是至少90％。

42.根据权利要求40所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核分离颗粒结合的核的百分比是至少95％。

43.根据权利要求40所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核分离颗粒结合的核的百分比是至少99％。

44.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比是至少90％。

45.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比是至少95％。

46.根据权利要求40-43中任一项所述的方法，其中在使与所述核结合试剂结合的核与多于一个核分离颗粒接触之后，与单个核结合或未与核结合的核分离颗粒的百分比是至少99％。

47.根据权利要求22-46中任一项所述的方法，其中分离与所述核结合试剂结合的核包括：

通过磁性移除、离心或其任何组合来分离所述核分离颗粒。

48.根据权利要求47所述的方法，所述方法包括，在分离所述多于一个核分离颗粒之前，使多于一个与核分离颗粒结合的核与游离的第一表位接触，其中游离的第一表位包括所述第一表位的全部或一部分。

49.根据权利要求22-48中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码与所述核分离颗粒缔合。

50.根据权利要求22-49中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被固定在所述核分离颗粒上。

51.根据权利要求22-50中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分固定在所述核分离颗粒上。

52.根据权利要求22-51中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被封闭在所述核分离颗粒中。

53.根据权利要求22-52中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分封闭在所述核分离颗粒中。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述核的一种或更多种组分包括核纤层蛋白、Emerin、Nesprin、Nurim、UNC-83、Klar、ZYG-12、Kms1p、UNC-84、Klaroid、SUN-1、Sad1p、LBR、MAN1、LAP1、LAP2、LINK、核孔复合体、其一部分或其组合。

55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，所述核的一种或更多种组分包括糖、寡糖、多糖、其衍生物或其组合。

56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中所述核的一种或更多种组分包括单糖、二糖、多元醇、麦芽寡糖、非麦芽寡糖、淀粉、非淀粉多糖、其衍生物或其组合。

57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述核的一种或更多种组分包括葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖糊精、棉子糖、水苏糖、果寡糖、直链淀粉、支链淀粉、改性淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶、水胶体、其衍生物或其组合。

58.根据权利要求1-57中任一项所述的方法，其中所述核的一种或更多种组分包括α-D-甘露糖基残基、α-D-葡糖基残基、高α-甘露糖型支链α-甘露糖苷结构、混合型和二分支复合型N-聚糖的支链α-甘露糖苷结构、二分支和三分支复合型N-聚糖的岩藻糖基化核心区、α1-3和α1-6连接的高甘露糖结构、Galβ1-4GalNAcβ1-R、Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、(Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、GalNAcα-Ser/Thr、GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Ac(唾液酸)、Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,4Glc(NAc)、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)GalNac、Fucα1-2Gal-R、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ1-4GlcNAc、R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1、其衍生物或其组合。

59.根据权利要求1-58中任一项所述的方法，其中所述核的一种或更多种组分包括糖蛋白、糖脂或其组合。

60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，

其中所述核结合试剂包含核被膜表面组分结合试剂，并且

其中所述核结合试剂能够与一种或更多种核被膜表面组分特异性结合。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，所述方法包括：

将所述多于一个核裂解，然后使用所述多于一个条形码将所述多于一个核中的多于一个靶条形码化，以产生所述多于一个条形码化靶。

62.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，所述方法包括：

将所述多于一个细胞裂解而不裂解所述多于一个细胞的核，然后使用所述核分离组合物分离所述多于一个细胞的多于一个核。

63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，所述方法包括：

在使用所述核分离组合物分离所述多于一个细胞的多于一个核之前，

将所述多于一个细胞的质膜裂解；并且

使用包含细胞器结合试剂的细胞器捕获组合物来耗尽所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器，

其中所述细胞器结合试剂能够与所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。

64.根据权利要求63所述的方法，其中耗尽所述一种或更多种细胞器包括：

使所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器与所述细胞器捕获组合物接触，以产生与细胞器组分结合试剂结合的一种或更多种细胞器。

65.根据权利要求64所述的方法，其中耗尽所述一种或更多种细胞器包括：

使用能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂来耗尽与所述细胞器结合试剂结合的一种或更多种细胞器。

66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，

其中所述细胞器结合试剂与第二表位缔合，并且

其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括第二表位结合试剂。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第二表位包括生物素、半抗原或其组合。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述半抗原包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。

69.根据权利要求66-68中任一项所述的方法，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括抗半抗原抗体。

70.根据权利要求69所述的方法，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。

71.根据权利要求63-70中任一项所述的方法，其中所述细胞器结合试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

72.根据权利要求65-71中任一项所述的方法，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，

其中所述细胞器结合试剂包括能够与所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且

其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括能够与所述一级抗体特异性结合的二级抗体。

74.根据权利要求63-71中任一项所述的方法，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂与细胞器捕获颗粒缔合。

75.根据权利要求74所述的方法，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂被固定在所述细胞器捕获颗粒上。

76.根据权利要求74-75中任一项所述的方法，其中所述细胞器捕获颗粒包括细胞器捕获珠。

77.根据权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述细胞器捕获颗粒包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

78.根据权利要求74-77中任一项所述的方法，其中所述细胞器捕获颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

79.根据权利要求74-78中任一项所述的方法，其中使用所述细胞器捕获组合物来耗尽所述多于一个细胞的细胞器包括：

通过磁性移除、离心或其任何组合来耗尽一种或更多种细胞器捕获颗粒。

80.根据权利要求63-79中任一项所述的方法，其中所述细胞器包括所述多于一个细胞的线粒体。

81.根据权利要求63-80中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分包括：ABCD3、ESR2、NOS3、ALB、HIF1A、NR3C1、ATP5A1、HK1、PGR、CASQ1、HSPA1A、PHB、CLTC、HSPD1、PLN、COX4I1、IFM1、SOD1、CPS1、LGALS3、TP53、细胞色素C氧化酶、MAPT、TP5B、ERN1、MT-CO1、VDAC1或其组合。

82.根据权利要求63-81中任一项所述的方法，

其中所述细胞器结合试剂包含细胞器表面组分结合试剂，

其中所述一种或更多种细胞器的一种或更多种组分包括一种或更多种细胞器表面组分，并且

其中所述细胞器结合试剂能够与所述一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。

83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述核结合试剂包含核索引寡核苷酸，并且其中所述核索引寡核苷酸包含核索引序列。

84.根据权利要求62-83中任一项所述的方法，在将所述多于一个核裂解之前，将所述多于一个核分区。

85.根据权利要求84所述的方法，其中将所述多于一个核分区包括将所述多于一个核分区到多于一个分区，其中所述多于一个分区中的分区包含来自所述多于一个核的单个核。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述多于一个分区包括微孔阵列的微孔。

87.根据权利要求85所述的方法，其中所述多于一个分区包括多于一个液滴。

88.根据权利要求84-87中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区中的两个或更多个分区包含单个核。

89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区中的分区包含单个核和单个核分离颗粒。

90.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区中的分区包含单个核和单个条形码化颗粒。

91.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述多于一个分区中的分区包含单个核、单个核分离颗粒和单个条形码化颗粒。

92.根据权利要求83-91中任一项所述的方法，所述方法包括：

使用所述多于一个条形码将所述核索引寡核苷酸条形码化，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸；并且

获得所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据。

93.根据权利要求92所述的方法，其中将所述核索引寡核苷酸条形码化包括：

使用所述多于一个条形码进行随机条形码化，以产生多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

94.根据权利要求92-93中任一项所述的方法，其中使用所述多于一个条形码将所述核索引寡核苷酸条形码化包括：

使所述多于一个条形码与所述核索引寡核苷酸接触，以产生与所述核索引寡核苷酸杂交的条形码；并且

将与所述核索引寡核苷酸杂交的条形码延伸，以产生所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

95.根据权利要求94所述的方法，其中将所述条形码延伸包括：

使用DNA聚合酶将所述条形码延伸以产生所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

96.根据权利要求94所述的方法，其中将所述条形码延伸包括：

使用逆转录酶将所述条形码延伸以产生所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸。

97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，所述方法包括：

扩增所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸，以产生多于一个条形码化核索引扩增子。

98.根据权利要求97所述的方法，其中扩增所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸包括：

使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所述分子标记序列的至少一部分和所述核索引寡核苷酸的至少一部分。

99.根据权利要求97-98中任一项所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据包括：

获得所述多于一个条形码化核索引扩增子的测序数据。

100.根据权利要求99所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化核索引寡核苷酸的测序数据包括：对所述分子标记序列的至少一部分和所述核索引寡核苷酸的至少一部分进行测序。

101.根据权利要求1-100中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被固定在所述条形码化颗粒上。

103.根据权利要求101-102中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分固定在所述条形码化颗粒上。

104.根据权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被封闭在所述条形码化颗粒中。

105.根据权利要求101-104中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分封闭在所述条形码化颗粒中。

106.根据权利要求101-105中任一项所述的方法，其中所述条形码化颗粒是可破坏的。

107.根据权利要求101-106中任一项所述的方法，其中所述条形码化颗粒包括条形码化珠。

108.根据权利要求107所述的方法，其中所述条形码化颗粒包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

109.根据权利要求101-108中任一项所述的方法，其中所述条形码化颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

110.根据权利要求101-109中任一项所述的方法，其中所述条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。

111.根据权利要求1-110中任一项所述的方法，其中使用所述多于一个条形码将所述多于一个靶条形码化以产生所述多于一个条形码化靶包括：

使所述靶的拷贝与所述条形码的靶结合区接触；以及

使用所述多于一个条形码逆转录所述多于一个靶以产生所述多于一个条形码化靶。

112.根据权利要求1-111中任一项所述的方法，所述方法包括：

扩增所述多于一个条形码化靶以产生多于一个扩增的条形码化靶，然后获得所述多于一个条形码化靶的测序数据。

113.根据权利要求112所述的方法，其中扩增所述条形码化靶以产生所述多于一个扩增的条形码化靶包括：

使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所述条形码化靶，以产生所述多于一个扩增的条形码化靶。

114.根据权利要求112-113中任一项所述的方法，所述方法包括：

扩增所述多于一个扩增的条形码化靶以产生多于一个条形码化靶扩增子。

115.根据权利要求114所述的方法，其中扩增所述多于一个扩增的条形码化靶包括：

扩增所述分子标记序列和所述多于一个靶的靶序列或其一部分，以产生所述多于一个条形码化靶扩增子。

116.根据权利要求114-115中任一项所述的方法，其中扩增所述多于一个扩增的条形码化靶包括：

使用聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多于一个扩增的条形码化靶，以产生所述多于一个条形码化靶扩增子。

117.根据权利要求1-116中任一项所述的方法，其中使用所述多于一个条形码将所述细胞的多于一个靶条形码化以产生所述多于一个条形码化靶包括：

使用多于一个随机条形码将所述细胞的多于一个靶随机条形码化，以产生多于一个随机条形码化靶。

118.根据权利要求1-117中任一项所述的方法，

其中所述多于一个条形码中的每一个包含细胞标记序列、通用引物的结合位点或其任何组合，并且

其中所述多于一个条形码中的至少两个条形码的细胞标记序列包含相同的序列。

119.根据权利要求1-118中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含聚(dT)区。

120.根据权利要求1-119中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码的至少100个分子标记序列包含不同的序列。

121.根据权利要求1-120中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码的至少1000个分子标记序列包含不同的序列。

122.根据权利要求1-121中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码的至少10000个分子标记序列包含不同的序列。

123.根据权利要求1-122中任一项所述的方法，其中所述多于一个条形码的分子标记序列包含随机序列。

124.根据权利要求1-123中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含基因特异性序列、寡(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。

125.根据权利要求1-124中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括组织样品。

126.根据权利要求1-125中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括上皮组织样品。

127.根据权利要求1-126中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括冷冻的细胞。

128.根据权利要求1-127中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括固定的细胞。

129.根据权利要求1-128中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括福尔马林固定石蜡包埋的细胞。

130.根据权利要求1-129中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括肿瘤细胞。

131.根据权利要求1-130中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括固定的肿瘤细胞。

132.根据权利要求1-131中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括冷冻的肿瘤细胞。

133.根据权利要求1-132中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤细胞。

134.根据权利要求1-133中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包括一种或更多种核外细胞组分。

135.根据权利要求134所述的方法，其中核外细胞组分包括线粒体、过氧化物酶体、胞质溶胶、囊泡、溶酶体、质膜、叶绿体、内部线粒体基质、线粒体内膜、膜间隙、线粒体外膜、分泌囊泡、光面内质网、粗面内质网、高尔基体、吞噬体、内体、外泌体、质膜、微管、微丝、中间丝、丝状伪足、褶边、片状伪足、肌节、黏着斑、足体、核糖体、微粒体、脂筏、细胞壁或其任何组合。

136.根据权利要求134-135中任一项所述的方法，其中核外细胞组分包括线粒体。

137.根据权利要求134-136中任一项所述的方法，其中核外细胞组分包括核糖体。

138.根据权利要求134-137中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核外细胞组分包含一种或更多种不期望的核酸物质。

139.根据权利要求134-138中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核外细胞组分中的至少一种的丰度通过分离所述多于一个核而降低。

140.根据权利要求134-139中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核外细胞组分中的至少一种的丰度通过耗尽所述一种或更多种细胞器而降低。

141.根据权利要求1-140中任一项所述的方法，其中所述多于一个细胞包含多于一个靶和一种或更多种不期望的核酸物质。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述不期望的核酸物质来源于非核细胞器。

143.根据权利要求141-142中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质包括核糖体RNA。

144.根据权利要求141-143中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质包括线粒体RNA。

145.根据权利要求141-144中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质包括线粒体DNA。

146.根据权利要求141-145中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质中的至少一种的丰度通过分离所述多于一个核而降低。

147.根据权利要求141-145中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质中的至少一种的丰度通过耗尽所述一种或更多种细胞器而降低。

148.根据权利要求141-147中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质总计达到所述多于一个细胞的核酸含量的约50％。

149.根据权利要求141-147中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质总计达到所述多于一个细胞的核酸含量的约60％。

150.根据权利要求141-147中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质总计达到所述多于一个细胞的核酸含量的约70％。

151.根据权利要求141-147中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸物质总计达到所述多于一个细胞的核酸含量的约80％。

152.根据权利要求141-151中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质占所述多于一个条形码化靶扩增子的少于40％。

153.根据权利要求141-151中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质占所述多于一个条形码化靶扩增子的少于20％。

154.根据权利要求141-151中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质占所述多于一个条形码化靶扩增子的少于10％。

155.根据权利要求141-151中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸物质占所述多于一个条形码化靶扩增子的少于5％。

156.根据权利要求141-155中任一项所述的方法，其中获得所述多于一个条形码化靶的测序数据包括产生多于一个测序读段。

157.根据权利要求156所述的方法，其中所述不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的40％。

158.根据权利要求156所述的方法，其中所述不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的20％。

159.根据权利要求156所述的方法，其中所述不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的10％。

160.根据权利要求156所述的方法，其中所述不期望的核酸物质的测序读段少于总测序读段的5％。

161.一种条形码化组合物，所述条形码化组合物包含：

包含核结合试剂的核分离组合物，

其中所述核结合试剂能够与核的一种或更多种组分特异性结合；和

多于一个条形码，

其中所述多于一个条形码中的每一个包含分子标记序列和靶结合区，并且

其中所述多于一个条形码中的至少两个条形码的分子标记序列包含不同的序列。

162.根据权利要求161所述的组合物，所述组合物包含能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂。

163.根据权利要求162所述的组合物，

其中所述核结合试剂与第一表位缔合，并且

其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包含第一表位结合试剂。

164.根据权利要求163所述的组合物，其中所述第一表位包括生物素、半抗原或其组合。

165.根据权利要求164所述的组合物，其中所述半抗原包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。

166.根据权利要求161-165中任一项所述的组合物，其中所述核结合试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

167.根据权利要求162-166所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

168.根据权利要求164-165中任一项所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括抗半抗原抗体。

169.根据权利要求164所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。

170.根据权利要求162所述的组合物，

其中所述核结合试剂包括能够与所述核的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且

其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂包括能够与所述一级抗体特异性结合的二级抗体。

171.根据权利要求162所述的组合物，其中所述核结合试剂包括糖结合试剂。

172.根据权利要求171所述的组合物，其中所述糖结合试剂包括糖结合蛋白。

173.根据权利要求172所述的组合物，其中所述糖结合蛋白包括凝集素。

174.根据权利要求173所述的组合物，其中所述凝集素包括甘露糖结合凝集素、半乳糖结合凝集素、N-乙酰半乳糖胺结合凝集素、N-乙酰葡萄糖胺结合凝集素、N-乙酰神经氨酸结合凝集素、岩藻糖结合凝集素或其组合。

175.根据权利要求174所述的组合物，其中所述凝集素包括伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁豆凝集素(LCH)、雪花莲凝集素(GNA)、蓖麻凝集蛋白(RCA)、花生凝集蛋白(PNA)、波罗蜜凝集素(AIL)、毛叶苕子凝集素(VVL)、麦胚凝集蛋白(WGA)、接骨木凝集素(SNA)、朝鲜槐白细胞凝集素(MAL)、朝鲜槐血凝素(MAH)、荆豆凝集蛋白(UEA)、橙黄网孢盘菌凝集素(AAL)或其组合。

176.根据权利要求173所述的组合物，其中所述凝集素是凝集蛋白。

177.根据权利要求176所述的组合物，其中所述凝集蛋白是麦胚凝集蛋白(WGA)。

178.根据权利要求172-177中任一项所述的组合物，其中所述糖结合蛋白来自或来源于动物、细菌、病毒或真菌。

179.根据权利要求172-177中任一项所述的组合物，其中所述糖结合蛋白来自或来源于植物。

180.根据权利要求179所述的组合物，其中所述植物是直生刀豆、兵豆、雪花莲、蓖麻、落花生、波罗蜜、毛叶苕子、普通小麦、西洋接骨木、朝鲜槐、荆豆、橙黄网孢盘菌或其组合。

181.根据权利要求161-180中任一项所述的组合物，其中所述核结合试剂与核分离颗粒缔合。

182.根据权利要求181所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂与所述核分离颗粒缔合。

183.根据权利要求182所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂被固定在所述核分离颗粒上。

184.根据权利要求182-183中任一项所述的组合物，其中能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂通过可裂解接头与所述核分离颗粒缔合。

185.根据权利要求184所述的组合物，其中所述可裂解接头包括可化学裂解连接、可光裂解连接、酸不稳定型接头、热敏连接、可酶促裂解连接或其组合。

186.根据权利要求181-185中任一项所述的组合物，其中所述核分离颗粒包括核分离珠。

187.根据权利要求181-186中任一项所述的组合物，其中所述核分离颗粒包括：Sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、水凝胶珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

188.根据权利要求181-187中任一项所述的组合物，其中所述核分离颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

189.根据权利要求181-188中任一项所述的组合物，其中所述核分离颗粒是可破坏的。

190.根据权利要求181-189中任一项所述的组合物，其中所述核分离颗粒包括核分离可破坏的水凝胶颗粒。

191.根据权利要求181-190中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码与所述核分离颗粒缔合。

192.根据权利要求181-191中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被固定在所述核分离颗粒上。

193.根据权利要求181-192中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分固定在所述核分离颗粒上。

194.根据权利要求181-193中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被封闭在所述核分离颗粒中。

195.根据权利要求181-194中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分封闭在所述核分离颗粒中。

196.根据权利要求1-53中任一项的权利要求181-195中任一项所述的组合物，其中所述核的一种或更多种组分包括核纤层蛋白、Emerin、Nesprin、Nurim、UNC-83、Klar、ZYG-12、Kms1p、UNC-84、Klaroid、SUN-1、Sad1p、LBR、MAN1、LAP1、LAP2、LINK、核孔复合体、其一部分或其组合。

197.根据权利要求181-196中任一项所述的组合物，所述核的一种或更多种组分包括糖、寡糖、多糖、其衍生物或其组合。

198.根据权利要求181-197中任一项所述的组合物，其中所述核的一种或更多种组分包括单糖、二糖、多元醇、麦芽寡糖、非麦芽寡糖、淀粉、非淀粉多糖、其衍生物或其组合。

199.根据权利要求181-198中任一项所述的组合物，其中所述核的一种或更多种组分包括葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖糊精、棉子糖、水苏糖、果寡糖、直链淀粉、支链淀粉、改性淀粉、糖原、纤维素、半纤维素、果胶、水胶体、其衍生物或其组合。

200.根据权利要求181-199中任一项所述的组合物，其中所述核的一种或更多种组分包括α-D-甘露糖基残基、α-D-葡糖基残基、高α-甘露糖型支链α-甘露糖苷结构、混合型和二分支复合型N-聚糖的支链α-甘露糖苷结构、二分支和三分支复合型N-聚糖的岩藻糖基化核心区、α1-3和α1-6连接的高甘露糖结构、Galβ1-4GalNAcβ1-R、Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、(Sia)Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr、GalNAcα-Ser/Thr、GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc、Neu5Ac(唾液酸)、Neu5Acα2-6Gal(NAc)-R、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,4Glc(NAc)、Neu5Ac/Gcα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)GalNac、Fucα1-2Gal-R、Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3/4)Galβ1-4GlcNAc、R2-GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc-R1、其衍生物或其组合。

201.根据权利要求181-200中任一项所述的组合物，其中所述核的一种或更多种组分包括糖蛋白、糖脂或其组合。

202.根据权利要求181-201中任一项所述的组合物，

其中所述核结合试剂包含核被膜表面组分结合试剂，并且

其中所述核结合试剂能够与一种或更多种核被膜表面组分特异性结合。

203.根据权利要求161-202中任一项所述的组合物，所述组合物包括细胞器捕获组合物，所述细胞器捕获组合物包含细胞器结合试剂，

其中所述细胞器结合试剂能够与一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合。

204.根据权利要求203所述的组合物，所述组合物包含能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂。

205.根据权利要求203-204中任一项所述的组合物，

其中所述细胞器结合试剂与第二表位缔合，并且

其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括第二表位结合试剂。

206.根据权利要求205所述的组合物，其中所述第二表位包括生物素、半抗原或其组合。

207.根据权利要求206所述的组合物，其中所述半抗原包括地高辛、2,4-二硝基苯酚、荧光素或其组合。

208.根据权利要求203-207中任一项所述的组合物，其中所述细胞器结合试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

209.根据权利要求204-208中任一项所述的组合物，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包含选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉抗生物素蛋白、肝素、适配体、点击化学部分、地高辛、一个或更多个伯胺、一个或更多个羧基、一个或更多个羟基、一个或更多个醛、一个或更多个酮及其任何组合。

210.根据权利要求205-207中任一项所述的组合物，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括抗半抗原抗体。

211.根据权利要求208所述的组合物，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或其组合。

212.根据权利要求211所述的组合物，

其中所述细胞器结合试剂包括能够与所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分特异性结合的一级抗体，并且

其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂包括能够与所述一级抗体特异性结合的二级抗体。

213.根据权利要求203-212中任一项所述的组合物，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂与细胞器捕获颗粒缔合。

214.根据权利要求213所述的组合物，其中能够与所述细胞器结合试剂特异性结合的试剂被固定在所述细胞器捕获颗粒上。

215.根据权利要求213-214中任一项所述的组合物，其中所述细胞器捕获颗粒包括细胞器捕获珠。

216.根据权利要求213-215中任一项所述的组合物，其中所述细胞器捕获颗粒包括：sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、水凝胶珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

217.根据权利要求213-216中任一项所述的组合物，其中所述细胞器捕获颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

218.根据权利要求203-217中任一项所述的组合物，其中所述细胞器包括所述多于一个细胞的线粒体。

219.根据权利要求203-218中任一项所述的组合物，其中所述多于一个细胞的一种或更多种细胞器的一种或更多种组分包括ABCD3、ESR2、NOS3、ALB、HIF1A、NR3C1、ATP5A1、HK1、PGR、CASQ1、HSPA1A、PHB、CLTC、HSPD1、PLN、COX4I1、IFM1、SOD1、CPS1、LGALS3、TP53、细胞色素C氧化酶、MAPT、TP5B、ERN1、MT-CO1、VDAC1或其组合。

220.根据权利要求203-219中任一项所述的组合物，

其中所述细胞器结合试剂包含细胞器表面组分结合试剂，

其中所述一种或更多种细胞器的一种或更多种组分包括一种或更多种细胞器表面组分，并且

其中所述细胞器结合试剂能够与所述一种或更多种细胞器表面组分特异性结合。

221.根据权利要求161-220中任一项所述的组合物，其中所述核结合试剂包含核索引寡核苷酸，并且其中所述核索引寡核苷酸包含核索引序列。

222.根据权利要求221所述的组合物，其中所述多于一个条形码与条形码化颗粒缔合。

223.根据权利要求222所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被固定在所述条形码化颗粒上。

224.根据权利要求222-223中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分固定在所述条形码化颗粒上。

225.根据权利要求222-224中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被封闭在所述条形码化颗粒中。

226.根据权利要求222-225中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码中的至少一个条形码被部分封闭在所述条形码化颗粒中。

227.根据权利要求222-226中任一项所述的组合物，其中所述条形码化颗粒是可破坏的。

228.根据权利要求222-227中任一项所述的组合物，其中所述条形码化颗粒包括条形码化珠。

229.根据权利要求228所述的组合物，其中所述条形码化颗粒包括：sepharose珠、链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、缀合珠、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、水凝胶珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠或其任何组合。

230.根据权利要求222-229中任一项所述的组合物，其中所述条形码化颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

231.根据权利要求222-230中任一项所述的组合物，其中所述条形码化颗粒包括可破坏的水凝胶颗粒。

232.根据权利要求161-231中任一项所述的组合物，

其中所述多于一个条形码中的每一个包含细胞标记序列、通用引物的结合位点或其任何组合，并且

其中所述多于一个条形码中的至少两个条形码的细胞标记序列包含相同的序列。

233.根据权利要求161-232中任一项所述的组合物，其中所述靶结合区包含聚(dT)区。

234.根据权利要求161-233中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码的至少100个分子标记序列包含不同的序列。

235.根据权利要求161-234中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码的至少1000个分子标记序列包含不同的序列。

236.根据权利要求161-235中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码的至少10000个分子标记序列包含不同的序列。

237.根据权利要求161-236中任一项所述的组合物，其中所述多于一个条形码的分子标记序列包含随机序列。

238.根据权利要求161-237中任一项所述的组合物，其中所述靶结合区包含基因特异性序列、寡核(dT)序列、随机多聚体或其任何组合。

239.根据权利要求161-238中任一项所述的组合物，所述组合物包括空颗粒。

240.根据权利要求239所述的组合物，其中所述空颗粒不包含磁特性。

241.根据权利要求239-240中任一项所述的组合物，其中所述空颗粒不包含能够与所述核结合试剂特异性结合的试剂。

242.根据权利要求239-241中任一项所述的组合物，其中所述空颗粒包括选自由以下组成的组的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、Sepharose、纤维素、尼龙、硅酮及其任何组合。

243.根据权利要求161-242中任一项所述的组合物，所述组合物包含游离的第一表位，其中游离的第一表位包含所述第一表位的全部或一部分。

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