CN112760282A

CN112760282A - 一种骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法

Info

Publication number: CN112760282A
Application number: CN201911065585.4A
Authority: CN
Inventors: 尹申意; 张函槊
Original assignee: Beijing Genex Health Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Cornerstone Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN112760282B

Abstract

本发明公开了一种骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法。本发明提供了骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养方法及配套试剂，该技术核心是：用温和细胞解离试剂处理骨与软组织肿瘤实体瘤组织，最大程度保证了组织中肿瘤细胞活力；配制特殊无血清培养基，利用悬浮培养体系对骨与软组织肿瘤来源的实体瘤细胞进行体外培养，保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明方法得到的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养物可用于多种细胞水平体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可预见，这种培养方法在骨与软组织肿瘤实体瘤的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养方法。

背景技术

骨与软组织肿瘤是严重危害人类健康及生命的疾病，近年来发病率逐渐上升，原发恶性骨肿瘤多见于青少年和中年人，常见的是骨肉瘤、尤文肉瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脊索瘤等。常见的软组织恶性肿瘤是滑膜肉瘤、纤维肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤等。骨与软组织肿瘤发病率占恶性肿瘤发病率约1％，但其种类较多，致使不规范诊疗很普遍，当前各临床指南均推荐软组织肉瘤采用临床试验的治疗方式。

尽管世界各国的科研和医疗机构对骨与软组织肿瘤的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。骨与软组织肿瘤是一类复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。骨与软组织肿瘤的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将骨与软组织肿瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是骨与软组织肿瘤研究领域乃至骨与软组织肿瘤诊断治疗领域的趋势。

现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养技术及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理骨与软组织肿瘤实体瘤组织，最大程度的保证了组织中肿瘤细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行体外培养，保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。

第一方面，本发明要求保护一种培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的方法。

本发明所要求保护的培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的方法，可包括如下步骤：

利用骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞；

所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白IGF-I、人重组蛋白BDNF、ITS-X(Insulin,Transferrin,Selenium,EthanolamineSolution)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、N-2 Supplement、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成。其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白IGF-I的终浓度为50-100ng/mL；所述人重组蛋白BDNF的终浓度为50-200ng/mL；所述ITS-X的终浓度为1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的终浓度为0.5-2mM；所述N-2 Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。

进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为

抗真菌剂。所述GlutaMAX为“GlutaMAX^TMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“GlutaMAX^TMSupplement”的成分为L-alanyl-L-glutamine，是L-glutamine的替代物，浓度为200nM，溶剂为0.85％NaCl溶液。所述N-2 Supplement为“N-2 Supplement(100X)”(如Gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品)。所述“N-2 Supplement(100X)”中含有终浓度为1mM的人全铁转铁蛋白(Human Transferrin(Holo))、500mg/L的重组胰岛素全链(InsulinRecombinant Full Chain)、0.63mg/L的孕酮(Progesterone)、10mM的腐胺(Putrescine)、0.52mg/L的亚硒酸盐(Selenite)。所述ITS-X的溶剂为EBSS溶液(Earle's平衡盐溶液)，溶质及浓度如下：胰岛素1g/L；转铁蛋白0.55g/L；亚硒酸钠0.00067g/L；乙醇胺0.2g/L。所述GlutaMAX是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。所述GlutaMAX为“GlutaMAX^TM Supplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述Y-27632为“Y-27632dihydrochloride(一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，Ki分别为220nM和300nM)”(如MCE#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品)。

在本发明的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述GlutaMAX的品牌货号为Gibco#35050061；所述人重组蛋白bFGF的品牌货号为Peprotech AF-100-18B-50；所述人重组蛋白HGF的品牌货号为Peprotech AF-100-39-100；所述人重组蛋白MSP的品牌货号为R&D#352-MS-050；所述人重组蛋白IGF-I的品牌货号为Peprotech#AF-100-11；所述人重组蛋白BDNF的品牌货号为Peprotech#450-02；所述ITS-X的品牌货号为Gibco#51500056；所述N-acetyl-L-cysteine的品牌货号为Sigma#A9165；所述N-2 Supplement的品牌货号为Gibco#17502001；所述Y-27632的品牌货号为MCE#129830-38-2；所述AdvancedDMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010。

其中，所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞可用样本解离液对骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离处理后获得。

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶II的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶III的终浓度为250-350U/mL(如290U/mL)；所述胶原酶IV的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；余量均为PBS。

其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

在本发明的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶II的品牌货号为Gibco#17101-015；所述胶原酶III的品牌货号为Solarbio#C8490；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

进一步地，可按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离：按0.1-0.3mL(如0.1mL)所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织(如剪成0.8-1.2mm³的小块)用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。

在所述方法中，可按照包括如下步骤的方法用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞：使用细胞培养容器M，利用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞，37℃，5％CO₂条件下进行培养，每2-4天(如3天)更换一次培养基，直至细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块。

其中，初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板。

其中，所述细胞培养容器M可为如下任一：(I)聚苯乙烯材质的细胞培养容器、聚碳酸酯材质的细胞培养容器、聚甲基丙烯酸甲酯材质的细胞培养容器、COC树脂材质的细胞培养容器、环烯烃聚合物材质的细胞培养容器或低吸附表面的细胞培养容器；(II)对(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰后的细胞培养容器。

进一步地，所述细胞培养容器为细胞培养皿、细胞培养孔板或用于细胞培养的微孔板芯片(如实施例13中图5所示的微孔板芯片)等。

所述(II)中，可按照包括如下步骤的方法对所述(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰：对所述(I)中的细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟；然后用1％CYTOP溶液覆盖所述细胞培养容器表面，晾干所述1％CYTOP溶液即完成CYTOP修饰。

其中，所述1％CYTOP溶液的组成如下：每100mL所述1％CYTOP溶液中含有1mLCYTOP，余量为氟油。

其中，所述CYTOP为perfluoro(1-butenylvinylether)polymer。所述氟油可为品牌货号为3M#FC40的氟油，或与其组成相同的其他产品。

在本发明的具体实施方式中，所述CYTOP的品牌货号具体为Asashi glass#CTL-809M；所述氟油的品牌货号具体为3M#FC40。

进一步地，在所述方法中，还可包括如下对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％(如75％)的乙醇清洗骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本表面10到30秒；用样本清洗液清洗所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本10-20次(如10次)，用无菌的PBS溶液清洗所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。

其中，所述样本清洗液由双抗P/S(青霉素-链霉素)和PBS组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；余量均为PBS。

在本发明的具体实施例中，所述双抗P/S的品牌货号为Gibco#15140122；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离前处理的步骤需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

进一步地，进行所述解离前处理的所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本的离体时间需为2小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于样本保存液中。

其中，所述样本保存液由胎牛血清、双抗P/S(青霉素-链霉素)、HEPES和HBSS(Hank's平衡盐溶液)组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1-5％(如2％，％表示体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；余量均为HBSS。

进一步地，在所述方法中，用所述样本解离液对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离处理后还可包括如下步骤：用8-15倍(如10倍)体积的消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；用100μm或40μm无菌细胞滤网过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；后用3-5mL(如5mL)无菌PBS重悬细胞；再800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；然后用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。

其中，所述消化终止液由胎牛血清、双抗P/S(青霉素-链霉素)和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％(如10％，％表示体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；余量均为DMEM培养基。

进一步地，在所述方法中，还可包括如下步骤：待所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块时，对所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行传代。

其中，进行所述传代时采用的细胞消化液组成如下：每10mL所述细胞消化液中含有4-6mL(如5mL)Accutase，终浓度为5mM的EDTA(即10μL 0.5M EDTA)，1.5-2.5mL(如2mL)TrypLE Express，余量为PBS。

进一步地，所述Accutase为“StemPro^TM Accutase^TM Cell DissociationReagent”(如Gibco#A11105-01，或与其组成相同的其他产品)。所述Accutase是一种单一成分的酶，在D-PBS，0.5mM EDTA溶液中溶解。所述TrypLE Express为“TrypLE^TM ExpressEnzyme(1X),no phenol red”(如Gibco#12604013，或与其组成相同的其他产品)。所述“TrypLE^TM Express Enzyme(1X)no phenol red”中含有200mg/L的KCl、200mg/L的KH₂PO₄、8000mg/L的NaCl、2160mg/L的Na₂HPO₄·7H₂O、457.6mg/L的EDTA；还含有重组蛋白酶。

在本发明的具体实施例中，所述Accutase的品牌货号为Gibco#A11105-01；所述0.5M EDTA的品牌货号为Invitrogen#AM9261；所述TrypLE Express的品牌货号为Gibco#12604013；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

更进一步地，进行所述传代时采用的消化温度为37℃。

更进一步地，进行所述传代时采用的消化终止液即为前文所述的消化终止液。

更加具体地，进行所述传代的步骤：收集待传代的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，计数，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板)，培养条件为37℃，5％CO₂。上述传代步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。

进一步地，所述方法还可包括对经过2-3次传代扩增后的所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤。

其中，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)，如20:2:1；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

在本发明的具体实施例中，所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010；所述DMSO的品牌货号为Sigma#D2438；所述甲基纤维素的品牌货号为Sigma#M7027。

更进一步地，进行所述冻存的具体步骤：收集待冻存的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述细胞冻存液，按0.5-2×10⁶/mL(如10⁶/mL)的密度重悬细胞沉淀，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。上述冻存步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。

更进一步地，进行所述复苏的具体步骤：将装有待复苏细胞的冻存管从液氮中取出，在37-39℃(如37℃)无菌水中迅速融化细胞；离心(如800-1000g，如800g室温离心5-10分钟，如10分钟)后用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为10⁵个/cm²容器底面积)，每管细胞(10⁶个)复苏至3.5cm培养皿)，培养条件为37℃，5％CO₂。

第二方面，本发明要求保护一种用于培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的成套试剂。

本发明所提供的用于培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的成套试剂，具体可由前文所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基和如下试剂中至少一种组成：前文所述样本解离液、所述样本保存液、所述细胞消化液、所述样本清洗液、所述消化终止液、所述细胞冻存液和所述1％CYTOP溶液。

所述样本保存液可用于样本离体后的暂时保存，可以在有样本离体后，短时间内维持样本中细胞的活性。所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。

所述样本清洗液可用于样本的清洗和消毒。所述样本清洗液需现配现用。

所述样本解离液可用于样本的解离，可以将样本中的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞从组织中解离出来。所述样本解离液需现配现用，其中的胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III和胶原酶IV可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶I储液由所述胶原酶I和PBS组成；其中所述胶原酶I的终浓度为2000U/mL；10×胶原酶II储液由所述胶原酶II和PBS组成；其中所述胶原酶II的终浓度为2000U/mL；10×胶原酶III储液由所述胶原酶III和PBS组成；其中所述胶原酶III的终浓度为2900U/mL；10×胶原酶IV储液由所述胶原酶IV和PBS组成；其中所述胶原酶IV的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。所述胶原酶I、所述胶原酶II、所述胶原酶III和所述胶原酶IV的酶活定义见前文。

所述细胞消化液可用于细胞团块的消化和传代，可以将骨与软组织肿瘤实体瘤肿瘤团块消化成单个细胞。所述细胞消化液需现配现用。

所述消化终止液可用于终止样本解离或细胞消化过程。所述消化终止液配制好后可在4℃保存一个月。

所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基可用于骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的培养。所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基配制好后需用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。其中的人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白IGF-I和人重组蛋白BDNF可以储液(母液)形式-80℃长期保存，具体可为1000倍储液(母液)。N-acetyl-L-cysteine和Y-27632可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为1000倍储液(母液)。

1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白HGF储液由人重组蛋白HGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白HGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白MSP储液由人重组蛋白MSP、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白MSP的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白IGF-I储液由人重组蛋白IGF-I、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白IGF-I的终浓度为100μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。1000×人重组蛋白BDNF储液由人重组蛋白BDNF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白BDNF的终浓度为100μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。上述五种1000倍储液中，所述BSA是可以100倍储液(母液)形式存在(现配现用)，具体由BSA和PBS组成，其中BSA(Sigma#A1933)的终浓度为0.1g/mL，余量均为PBS。另外，1000×N-acetyl-L-cysteine储液由N-acetyl-L-cysteine和超纯水组成，其中所述N-acetyl-L-cysteine的浓度为0.5M，余量均为超纯水。1000×Y-27632由Y-27632和超纯水组成，其中Y-27632的终浓度为10mM，余量均为超纯水。

所述细胞冻存液需现配现用。其中，所述1％甲基纤维素溶液可在4℃长期保存。

第三方面，本发明要求保护前文所述的成套试剂在培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞中的应用。

前文所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基，以及其在培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞中的应用也属于本发明的保护范围。

在上述各方面中，所述骨与软组织肿瘤实体瘤可为原发性骨与软组织肿瘤实体瘤。所述骨与软组织肿瘤实体瘤具体可为骨肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡软组织肉瘤、透明细胞肉瘤或纤维瘤。

在上述各方面中，所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞分离自骨与软组织肿瘤实体瘤患者的手术样本。其中，手术样本获得的骨与软组织肿瘤实体瘤组织标本最好重量超过20mg。

在本发明中，以上所有的所述PBS均可为1×PBS，pH7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：KH₂PO₄ 144mg/L，NaCl 9000mg/L，Na₂HPO₄·7H₂O 795mg/L。

本发明提供了一种从新鲜骨与软组织肿瘤实体瘤中提取培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的方法和配套试剂，该方法具有以下优点：

1、组织样本用量少，仅需20mg左右的骨与软组织肿瘤实体瘤手术样本；

2、培养周期短，仅需3-10天即可获得10⁷数量级的骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞；

3、培养稳定性高，用本方法对合格的骨与软组织肿瘤实体瘤手术标本进行体外培养的成功率高达70％；

4、细胞纯度高，利用本方法得到的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养物中，肿瘤细胞的比例可以达到70％-95％，杂细胞干扰少。

利用本发明方法得到的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在骨与软组织肿瘤实体瘤的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为滑膜肉瘤组织经过处理后得到的单细胞。标尺为100μm，100倍放大。

图2为滑膜肉瘤组织原代培养后得到的细胞团块。标尺为100μm，100倍放大。

图3为滑膜肉瘤组织原代培养后得到的骨与软组织肉瘤细胞HE染色图。标尺为100μm，40倍放大。

图4为滑膜肉瘤组织原代培养后得到的肿瘤细胞团块免疫荧光染色图。标尺为100μm，40倍放大。

图5为本发明微孔板芯片设计图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、配制用于培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的试剂

1、样本保存液(100mL)

样本保存液(100mL)的具体配方如表1所示。

表1样本保存液(100mL)

样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。

2、样本清洗液(100mL)

样本清洗液(100mL)的具体配方如表2所示。

表2样本清洗液(100mL)

样本清洗液需现配现用。

3、样本解离液(10mL)

样本解离液(10mL)的具体配方如表3所示。

表3样本解离液(10mL)

注：样本解离液现配现用。

表3中，胶原酶储液的配制如表4-表7所示。

表4 10×胶原酶I储液(100mL)

10×胶原酶I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表5 10×胶原酶II储液(100mL)

10×胶原酶II储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表6 10×胶原酶III储液(100mL)

10×胶原酶III储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表7 10×胶原酶IV储液(100mL)

10×胶原酶IV储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表4-表7中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶II、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

4、细胞消化液(10mL)

细胞消化液(10mL)的具体配方如表8所示。

表8细胞消化液(10mL)

细胞消化液现配现用。

5、消化终止液(100mL)

消化终止液(100mL)的具体配方如表9所示。

表9消化终止液(100mL)

消化终止液配制后，可在4℃保存一个月。

6、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(100mL)

骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(100mL)的具体配方如表10所示。

表10骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(100mL)

骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

表10中，人重组蛋白储液的配制如表12-表16所示，N-acetyl-L-cysteine储液的配制如表17所示，Y-27632储液的配制如表18所示。配制这些储液时所需的100×BSA溶液配制如表11所示。

表11 100×BSA溶液(1mL)

100×BSA溶液现配现用。

表12 1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)

1000×人重组蛋白bFGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表13 1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)

1000×人重组蛋白HGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表14 1000×人重组蛋白MSP储液(2.5mL)

1000×人重组蛋白MSP储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表15 1000×人重组蛋白IGF-I储液(1mL)

1000×人重组蛋白IGF-I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表16 1000×人重组蛋白BDNF储液(1mL)

1000×人重组蛋白BDNF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表17 1000×N-acetyl-L-cysteine储液(5mL)

1000×N-acetyl-L-cysteine储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表18 1000×Y-27632储液(3.125mL)

1000×Y-27632储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

7、细胞冻存液

细胞冻存液的具体配方如表19所示。

表19细胞冻存液

细胞冻存液现配现用。

表19中，1％甲基纤维素溶液的配制如表20所示。

表20 1％甲基纤维素溶液(10mL)

1％甲基纤维素溶液配制后可在4℃长期保存。

8、1％CYTOP溶液

表21 1％CYTOP溶液(100mL)

1％CYTOP溶液配制完成后，可于常温长期保存。

实施例2、骨与软组织肿瘤实体瘤术后标本/活检穿刺标本的获取

1、与三甲医院合作，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。

2、主治医生医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养，样本的选取标准为：原发性骨肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡软组织肉瘤、透明细胞肉瘤、纤维瘤，手术标本重量超过20mg的样本。

3、主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。例如2018年1月1日提供的样本，患者住院号为T001512765，则样本实验编号为201801012765。

4、术中由外科医生，在手术室无菌环境中采集新鲜标本，置于事先准备好的样本保存液(见实施例1)中。样本离体后在冰上暂存，两小时内运输到实验室进行下一步操作。

实施例3、骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本解离前处理

下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

下述操作中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。

1、样本称重。

2、用75％(体积百分含量)乙醇清洗样本表面10到30秒。

3、用样本清洗液清洗样本5次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。

4、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。

实施例4、骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本解离

下述实施例中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。

1、用眼科剪将组织剪碎成1mm³左右的小块。

2、按0.1mL样本解离液(见实施例1)每mg组织的用量，用事先37℃预热的样本解离液处理剪碎的组织样本，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。

3、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。

4、用100μm无菌细胞滤网过滤细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。

7、用骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。

如图1所示，解离得到的单细胞悬液中，除了肿瘤细胞以外还混杂着大量各种类型的其他细胞，如红细胞，淋巴细胞，纤维细胞等等。本方法的优势之一就是在后续的培养过程中，只有肿瘤细胞可以进行大量扩增，而其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞。

实施例5、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养

1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞悬浮培养，所用培养基即为实施例1中的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(其中，人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白IGF-I的终浓度为50ng/mL；人重组蛋白BDNF的终浓度为100ng/mL；N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；Y-27632的终浓度为10μM)，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

2、每天观察细胞状态，每3天更换一次培养基，直至细胞形成直径100μm左右的团块。

如图2所示，经过3-10天的培养，肿瘤细胞大量扩增形成直径100μm大小的细胞团块，肿瘤细胞总数量可以超过10⁷，其他类型的细胞数量明显减少甚至消失。本方法经过大量样本测试，骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到70％。

实施例6、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞传代

1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。

2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。

3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。

4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，细胞计数。

7、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养，所用培养基即为实施例1中的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔10⁶个细胞的密度铺板，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

实施例7、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的冻存

悬浮培养的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存：

3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每15分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。

4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液，细胞计数。

5、800g室温离心10分钟，弃去上清。

6、用细胞冻存液(见实施例1)，按10⁶/mL的密度重悬细胞沉淀，2mL冻存管每管1mL细胞悬液，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。

实施例8、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的复苏

液氮中保存的骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞可以进行复苏：

1、提前五分钟准备37℃无菌水。

2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。

3、800g室温离心10分钟，弃去上清。

4、用骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，使用低吸附表面进行骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养，每管细胞复苏至3.5cm培养皿中，37℃，5％CO₂条件下在细胞培养箱中进行培养。

实施例9、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的HE染色鉴定

下述实施例中用到的试剂耗材说明：

HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#G1120)；

阳离子防脱玻片(北京中杉金桥生物科技有限公司)；

二甲苯、甲醇、丙酮(北京化学试剂公司，分析纯)；

中性树脂胶(北京益利精细化学品有限公司)。

1、将悬浮细胞制成浓度为10⁴/mL的细胞悬液，滴加10μL于阳离子防脱玻片上，自然晾干。

2、在风干的细胞上小心滴加50μL经4℃预冷过的甲醇/丙酮混合液(体积比1:1)，然后将玻片放入4℃冰箱固定10mins。

3、取出固定细胞的玻片，室温自然晾干。

4、用200μL PBS清洗玻片两次。

5、待玻片上水分微干时加入100μL苏木精染液染色1mins。

6、吸去苏木精染液，用200μL自来水清洗玻片3次。

7、滴加100μL分化液分化1mins。

8、吸去分化液，依次用自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。

9、吸去玻片表面水分，滴加200μL伊红染液染色40s。

10、吸去伊红染液，依次用75％、80％、90％、100％乙醇漂洗脱水20s、20s、40s、40s。

11、等乙醇晾干后，滴加50μL二甲苯进行细胞通透。

12、等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片，在显微镜下观察并拍照。

图3展示了体外培养得到的骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞HE染色效果图，可以看到这些细胞普遍具有核质比高、核深染、核内染色质凝集、多核、细胞大小不均一等肿瘤细胞特征。

实施例10、骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的免疫荧光染色鉴定

下述实施例中用到的试剂说明：

多聚甲醛(北京化学试剂公司，分析纯)，用超纯水溶解多聚甲醛粉末，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液；

甲醇、二甲基亚砜(北京化学试剂公司，分析纯)；

双氧水(北京化学试剂公司，35％)；

甲醇、二甲基亚砜、35％双氧水按照4:4:1(体积比)的比例混合制成丹氏漂洗液；

牛血清白蛋白(Sigma，#A1933)，用PBS溶液溶解牛血清白蛋白，制成3％(3g/100mL)的BSA溶液；

免疫荧光一抗抗体(Abcam，#ab92547)；

免疫荧光二抗抗体(CST，#4408)；

Hoechst染液(北京索莱宝生物科技有限公司，#C0021)；

按以下步骤对骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞团块进行免疫荧光染色，一抗为抗Vimentin的抗体。

1、收集培养皿中的细胞团块，用PBS清洗一遍后，用4％多聚甲醛重悬细胞沉淀，4℃过夜固定。

2、800g离心弃去上清，用预冷的甲醇溶液重悬细胞沉淀，在冰上放置1小时。

3、800g离心弃去上清，丹氏漂洗液重悬细胞沉淀，室温放置2小时。

4、800g离心弃去上清，依次用75％、50％、25％(体积百分含量)用PBS稀释的甲醇溶液清洗细胞，每次10分钟。

5、800g离心弃去上清，用3％BSA溶液悬浮细胞沉淀，室温封闭2小时。

6、按1：500的比例，用3％BSA溶液稀释一抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，4℃一抗过夜。

7、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。

8、按1：2000的比例，用3％BSA溶液稀释二抗，并用抗体稀释液(3％BSA溶液)重悬细胞沉淀，室温二抗2小时。

9、800g离心弃去上清，用PBS溶液清洗细胞沉淀5次，每次20分钟。

10、按1/100的体积比加入100×Hoechst染液，室温染色20分钟。

11、用PBS溶液清洗细胞沉淀2次，每次10分钟。使用激光共聚焦显微镜观察细胞团块的染色情况。

图4展示了体外培养的骨与软组织肉瘤原代肿瘤细胞团块免疫荧光染色的效果图，可以看到组成细胞团块的细胞都是Vimentin阳性，与患者病理结果一致，证实了本方法培养得到的是纯度较高的肿瘤细胞。

实施例12、不同类型骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞体外培养

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本病理类型有区别。进行测试的各样本情况见表22。

表21多种病理类型骨与软组织肉瘤原代肿瘤细胞体外培养情况

可以看到，本方法对各种类型的骨与软组织肉瘤实体瘤样本进行原代肿瘤细胞体外培养，均可以达到非常高的成功率。

实施例12、用CYTOP修饰的细胞培养耗材进行骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞培养

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，CYTOP的修饰方法均完全一致，仅细胞培养耗材材质有所区别(表23)。

其中CYTOP修饰的方法为：首先对细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟。然后用适量(以96孔板为例，每孔20μL，适量是指完全覆盖培养皿底部)1％CYTOP溶液覆盖培养皿或培养平板表面，待CYTOP溶液完全晾干后即可使用。

表22 CYTOP修饰耗材对骨与软组织肿瘤实体瘤原代肿瘤细胞培养的影响

注：聚苯乙烯(Polystyrene，缩写PS)。

由表22可见：可以看到CYTOP修饰后可以大幅度提高样本培养成功率。

实施例13、微孔板芯片加工

本实施例中使用注塑加工的方式，用PMMA材料(或者PS、PC、COC、COP、LAS等材料)加工得到用于培养本发明骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞所用的微孔板芯片。该芯片可以用于骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养以及体外药敏检测实验。微孔板芯片设计图纸见图5。

实际应用过程中，具体是采用PMMA材料(或者PS、PC、COC、COP、LAS等材料)制备得到设计图纸见图5的微孔板芯片的结构，然后再通过上述的CYTOP修饰方法(见实施例11)对其表面进行CYTOP修饰，就得到了这里所说的可用于骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养的微孔板芯片。

Claims

1.一种培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：利用骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞；

所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、人重组蛋白IGF-I、人重组蛋白BDNF、ITS-X、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2Supplement、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白IGF-I的终浓度为50-100ng/mL；所述人重组蛋白BDNF的终浓度为50-200ng/mL；所述ITS-X的终浓度为1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞是用样本解离液对骨与软组织肿瘤实体瘤实体瘤组织进行解离处理后获得的；

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶III、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶II在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；所述胶原酶III在所述样本解离液中的终浓度为250-350U/mL；所述胶原酶IV在所述样本解离液中的终浓度为150-250U/mL；余量均为PBS；

进一步地，是按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离的：按0.1-0.3mL所述样本解离液每mg组织的用量，将剪碎后的所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织用事先37℃预热的所述样本解离液进行处理，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法中，是按照包括如下步骤的方法用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的：使用细胞培养容器M，利用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基悬浮培养所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞，37℃，5％CO₂条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基；

所述细胞培养容器M为如下任一：(I)聚苯乙烯材质的细胞培养容器、聚碳酸酯材质的细胞培养容器、聚甲基丙烯酸甲酯材质的细胞培养容器、COC树脂材质的细胞培养容器、环烯烃聚合物材质的细胞培养容器或低吸附表面的细胞培养容器；(II)对(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰后的细胞培养容器；

进一步地，所述细胞培养容器为细胞培养皿、细胞培养孔板或用于细胞培养的微孔板芯片；

进一步地，所述(II)中，是按照包括如下步骤的方法对所述(I)中的细胞培养容器进行CYTOP修饰的：对所述(I)中的细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟；然后用1％CYTOP溶液覆盖所述细胞培养容器表面，晾干所述1％CYTOP溶液即完成CYTOP修饰；

更进一步地，所述1％CYTOP溶液的组成如下：每100mL所述1％CYTOP溶液中含有1mLCYTOP，余量为氟油。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括如下对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％的乙醇清洗骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本表面；用样本清洗液和无菌的PBS溶液先后清洗所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本；

具体的，所述样本清洗液由双抗P/S和PBS组成；其中，所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；余量均为PBS。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：进行所述解离前处理的所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织样本的离体时间为2小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于样本保存液中；

具体的，所述样本保存液由胎牛血清、双抗P/S、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1-5％(体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；余量均为HBSS。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，用所述样本解离液对所述骨与软组织肿瘤实体瘤组织进行解离处理后还包括如下步骤：用消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；离心后用无菌PBS重悬细胞；再离心，然后用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀；

具体的，所述消化终止液由胎牛血清、双抗P/S和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％(体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；余量均为DMEM培养基。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：在用所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细培养基对所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行培养的过程中，还包括如下步骤：待所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞形成直径80-120μm的团块时，对所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行传代；

具体的，进行所述传代时采用的细胞消化液组成如下：每10mL所述细胞消化液中含有4-6mL Accutase，终浓度为5mM的EDTA，1.5-2.5mL TrypLE Express，余量为PBS；和/或

进行所述传代时采用的消化终止液为权利要求6中所述的消化终止液；

和/或

所述方法还包括对经过2-3次传代扩增后的所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤；

具体的，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

8.一种用于培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞的成套试剂，由权利要求1-7任一中所述骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞培养基和如下试剂中至少一种组成：权利要求1-7任一中所述样本解离液、所述样本保存液、所述细胞消化液、所述样本清洗液、所述消化终止液、所述细胞冻存液和所述1％CYTOP溶液。

9.权利要求8所述的成套试剂在培养骨与软组织肿瘤实体瘤原代细胞中的应用。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法或成套试剂或应用，其特征在于：所述骨与软组织肿瘤为骨肉瘤、滑膜肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡软组织肉瘤、透明细胞肉瘤或纤维瘤。