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CN112746101B - 一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物 - Google Patents

一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物 Download PDF

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CN112746101B
CN112746101B CN202011561147.XA CN202011561147A CN112746101B CN 112746101 B CN112746101 B CN 112746101B CN 202011561147 A CN202011561147 A CN 202011561147A CN 112746101 B CN112746101 B CN 112746101B
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Abstract

本发明提供一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物。所述骨质疏松诊断标志物为Piwi蛋白结合RNA‑63049，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；所述促进骨质疏松骨再生的核酸药物为Piwi蛋白结合RNA‑63049的拮抗剂。piwi蛋白与piRNA‑63049结合后形成piR‑63049/piwi蛋白复合体，抑制了Wnt2b蛋白的表达，进而使BMSCs成骨分化能力减弱；piRNA‑63049拮抗剂于体内发挥促进骨再生及预防骨质疏松骨量丢失的作用，因此其可作为促进骨质疏松骨再生的核酸药物。

Description

一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种骨质疏松的治疗药物及其应用，尤其涉及一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物。
背景技术
随着我国老龄化人口的加剧，老年人或绝经后女性骨质疏松症成为全社会重要健康问题。骨质疏松症会带来全身骨痛、身高变矮及椎体和髋部的骨折等并发症。这些并发症除了严重影响老年人活动和生活质量，还会带来严重残疾甚至死亡。骨质疏松性症已成为继高血压、糖尿病、心脑血管疾病后最常见的老年疾病，为家庭和社会均带来巨大的负担。骨质疏松症发病的病理生理机制复杂，其基本的原因是由于成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收即骨重建的失平衡，导致骨量丢失，骨微结构的退变和骨折风险的增加，多种因子和信号通路参与了骨重建的过程。
目前，临床上治疗骨质疏松症的药物主要分为两类：一类是抑制骨吸收药物，如双磷酸盐类，但此类药物长期使用可能伴有下颌骨坏死等并发症；另一类是促进骨形成药物，如重组人甲状旁腺激素，但此类药物价格昂贵，不能长期使用。
因此，探讨骨质疏松骨代谢的分子调控机制，对于了解骨质疏松症的发生和防治策略具有重要意义。已有研究提示非编码RNA，如microRNA，lnRNA，circRNA在骨质疏松中可能发挥了重要作用。
Piwi蛋白结合RNA(piRNA)是近年来新发现的一类小RNA分子，早期发现于生殖细胞系中，其对于维持生殖系DNA完整、抑制转座子转录、抑制翻译、参与异染色质的形成、执行表观遗传调控和生殖细胞发生等均有重要作用。近期研究证明，piRNA/PIWI蛋白复合体参与了肿瘤的发生并与肿瘤的预后显著相关。
然而，piRNA作为一种全新的非编码RNA分子，在骨质疏松及骨代谢领域尚未见报道。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物。所述骨质疏松诊断标志物为一种piRNA，其在骨质疏松的大鼠中表达量显著增加，针对该piRNA，本发明中还提供一种拮抗剂，用于调节BMSCs成骨分化过程，起到防止骨质疏松的作用。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种骨质疏松诊断标志物，所述骨质疏松诊断标志物为Piwi蛋白结合RNA-63049(piR-63049)，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
所述SEQ ID NO.1的序列为：CCTCTGTGCACGTGACATCT。
本发明中，对骨质疏松大鼠BMSCs的piRNA做了如下相关研究：
(1)piRNA测序发现骨质疏松大鼠BMSCs中有28个piRNA显著差异表达，包括上调差异表达piRNA 13个和下调差异表达piRNA 15个；
(2)进一步通过细胞实验，发现piR-63049在骨质疏松BMSCs中表达量显著增高，且其表达量与BMSCs成骨分化过程呈负相关。
进一步通过细胞实验，本发明中发现piR-63049在骨质疏松BMSCs中表达量显著增高，且其表达量与BMSCs成骨分化过程呈负相关。因此，本发明中所述piR-63049可作为骨质疏松诊断标志物对骨质疏松进行有效、准确地诊断。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的骨质疏松诊断标志物在制备治疗骨质疏松的药物或制备诊断骨质疏松的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明还提供一种促进骨质疏松骨再生的核酸药物，所述核酸药物为Piwi蛋白结合RNA-63049的拮抗剂。
优选地，所述拮抗剂包括如SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。
本发明中，所述SEQ ID NO.2的序列为GGAGACACGUGCACUGUAGA；
本发明中，以antagomiR表示经过特殊化学修饰的piRNA拮抗剂，通过与体内的成熟piRNA强竞争性结合，阻止piRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制piRNA发挥作用。piRNAantagomiR均为piRNA成熟链的反向互补序列，全链进行甲基化修饰，在5′端和3′端分别有2个和4个碱基硫代修饰，并在3′端连接有高亲和性胆固醇修饰。
本发明构建并合成piR-63049的拮抗剂(antagopiR-63049)，通过尾静脉注射技术导入到骨质疏松大鼠体内，假手术组和空白对照组分别注射等体积生理盐水和piRNA-NC，通过动物实验已验证了antagopiR-63049的疗效和机制。
第四方面，本发明提供一种骨质疏松诊断试剂盒，所述骨质疏松诊断试剂盒中包含扩增Piwi蛋白结合RNA-63049的引物对。
作为本发明优选的技术方案，所述引物对的上游引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
所述SEQ ID NO.3的序列为CGTCTACAGTGCACGTGTCTCC。
同时，本发明中所述引物对的下游引物为随机序列。
第五方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体上含有如第一方面所述的骨质疏松诊断标志物。
第六方面，本发明提供一种重组细胞，所述重组细胞中含有至少一个拷贝的如第五方面所述的表达载体。
第七方面，本发明提供一种成骨相关基因表达抑制剂，所述成骨相关基因表达抑制剂为Piwi蛋白结合RNA-63049，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
优选地，所述成骨相关基因包括Runx2、OCN、OPN、ALP或wnt5a中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供一种Wnt2b蛋白表达抑制剂，所述Wnt2b蛋白表达抑制剂为Piwi蛋白结合RNA-63049，其具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。
本发明中，前期通过对临床样本和骨质疏松大鼠piRNA测序，发现piR-63049在骨质疏松患者骨组织和骨质疏松大鼠中高表达，而后qPCR验证其在BMSC成骨分化过程中的应用并且通过生物信息学分析发现其下游靶点可能是wnt2b。
因此，本发明中通过构建wnt2b的荧光素酶报告质粒，验证piR-63049与wnt2b的结合情况，并发现piR-63049通过抑制wnt2b从而介导wnt/β-catenin信号通路进而抑制成骨。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明中探讨了piR-63049在骨质疏松BMSCs成骨分化过程中的调控机制，piR-63049与piwi蛋白结合后形成piR-63049/piwi蛋白复合体，并抑制了Wnt2b蛋白的表达，进而使BMSCs成骨分化能力减弱；因此在骨质疏松BMSCs细胞中，piR-63049的表达量明显较高，因此可将其作为诊断骨质疏松的生物标志物；
(2)本发明中还提供了一种治疗骨质疏松的药物，即antagopiR-63049，其为piR-63049的拮抗剂，通过实验验证antagopiR-63049于体内发挥促进骨再生及预防骨质疏松骨量丢失的作用，因此可将其作为促进骨质疏松骨再生的核酸药物进行使用，防治骨质疏松。
附图说明
图1为本发明中piR-63049调控BMSCs成骨分化的原理示意图。
图2(A)为实施例1中对骨质疏松大鼠BMSCs进行piRNA测序所得到的piRNA表达火山图。
图2(B)为实施例1中显著差异表达piRNA的热图。
图2(C)为实施例1中上调差异表达piRNA qPCR验证结果图。
图2(D)为实施例1中下调差异表达piRNA qPCR验证结果图。
图3(A)为实施例2中细胞核和细胞质中内参GAPDH和核纤层蛋白的蛋白凝胶电泳图。
图3(B)为实施例2中piR-63049在骨质疏松BMSCs细胞中的表达量统计图。
图3(C)为实施例2中骨质疏松患者外周血中piR-hsa-174669的相对表达量统计图。
图3(D)为实施例2中piR-63049在BMSCs成骨分化过程中的表达量统计图。
图3(E)为实施例3中Wnt2b在BMSCs成骨分化过程中表达量统计图。
图3(F)为实施例3中Wnt2b蛋白互作用网络图。
图3(G)为实施例3中Wnt2b敲低后β-catenin和Gsk3β蛋白表达量统计图。
图3(H)为实施例3中Wnt2b敲低后BMSCs的ALP染色结果显微图。
图3(I)为实施例3中Wnt2b敲低后BMSCs成骨分化能力结果统计图。
图3(J)为实施例3中piR-63049与Wnt2b-3′UTR端的结合位点序列。
图3(K)为实施例3中荧光素酶报告基因实验的荧光显微结果图。
图3(L)为实施例3中荧光素酶报告基因实验的荧光定量结果统计图。
图4(A)为实施例4中敲低或过表达piR-63049后piR-63049和Wnt2b的表达量对比图，其中I图为piR-63049的相对表达量，II图为Wnt2b的相对表达量。
图4(B)为实施例4中敲低或过表达piR-63049后BMSCs增值能力统计图，其中I图表示敲低piR-63049，II图表示过表达piR-63049。
图4(C)为实施例4中敲低或过表达piR-63049后ALP染色结果显微图。
图4(D)为实施例4中敲低或过表达piR-63049后不同骨标志基因的表达量统计图，其中I图为Alp基因，II图为Runx2基因，III图为Opn基因。
图4(E)为实施例4中敲低或过表达piR-63049后不同骨标志基因的凝胶电泳图谱。
图5(A)为实施例5中不同组中大鼠骨的micro CT结果图，其中I图为对照组1，II图为对照组2，III图为对照组3，IV图为实验组。
图5(B)为实施例5中不同组中静态骨参数的检测结果统计图，其中I图为骨量(BMD)，II图为小梁骨间距(BV/TV)，III图小梁骨厚度(Tb.Th)，IV图为小梁骨数量(Tb.N)。
图5(C)为实施例5中不同组中大鼠骨组织双荧光染色图(标尺100μm)，其中，I图为假手术组，II图为骨质疏松生理盐水组，III图为骨质疏松药物对照组，IV图为骨质疏松药物组。
图5(D)为实施例5中不同组中动态骨参数的检测结果统计图，其中I图为骨矿沉积率(MAR)，II图为相对骨形成率(BRF/BS)。
图5(E)为实施例5中piR-63049在大鼠外周血和骨组织中的表达量统计图，其中I图为外周血，II图为骨组织。
图5(F)为实施例5中不同成骨标志基因的表达量统计图，其中I图为Opn基因，II图为Ocn基因，III图为Alp基因。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
首先，结合图1对piR-63049调控BMSCs成骨分化的潜在机制进行简单概括：
在骨质疏松BMSCs中，piR-63049由细胞核进入胞质，与piwi蛋白结合后形成piR-63049/piwi蛋白复合体，并与Wnt2b 3′-UTR端结合，抑制Wnt2b蛋白表达，进而使Lrp/Fzd受体介导的Wnt/β-catenin通路活性减低，BMSCs成骨分化能力减弱。
实施例1
本实施例中对骨质疏松大鼠BMSCs piRNA做如下相关研究：
对骨质疏松大鼠BMSCs进行piRNA测序，所得piRNA表达火山图如图2(A)所示；
再对piRNA测序发现的piRNA进行差异表达分析，得到骨质疏松大鼠BMSCs中有28个piRNA显著差异表达，包括上调差异表达piRNA 13个和下调差异表达piRNA 15个；
其中，显著差异表达piRNA热图如图2(B)所示；
通过qPCR对上调的差异表达piRNA和下调的差异表达piRNA分别进行验证，所得结果如图2(C)和图2(D)所示(其中，n＝10，*p＜0.05)；由此确定了包括piRNA-63049在内的多条与骨质疏松相关的piRNA。
实施例2
本实施例用于研究piR-63049表达量和骨质疏松严重程度的相关性。具体步骤如下：
(1)构建去卵巢骨质疏松及假手术组大鼠模型，术后第0w、4w、8w、12w进行microCT扫描并计算骨量和骨微结构相关参数(包括骨密度BMD，相对骨体积BV/TV，骨小梁数目及骨小梁厚度等)；
(2)提取以上时间点大鼠BMSCs，qPCR检测piR-63049表达量，通过统计学分析piR-63049表达量与骨质疏松严重程度的相关性；
具体结果如下：
其核质分离marker鉴定结构如图3(A)所示，其中分别显示了细胞核和细胞质中内参GAPDH和核纤层蛋白(Lamin)的表达量；
piR-63049在骨质疏松BMSCs细胞质和细胞核中的表达量如图3(B)所示，由图可知，细胞质中的表达量较多细胞核与细胞质中piR-63049的表达量存在明显差异，细胞质中的表达量较多；
骨质疏松患者外周血中piR-hsa-174669(与大鼠piR-63049同源)的相对表达量如图3(C)表示，其中骨质疏松患者的piR-hsa-174669较对照组而言显著升高；
piR-63049在BMSCs成骨分化过程中的表达量如图3(D)表示，由图可知，随着时间延长，piR-63049的表达量逐渐降低。
实施例3
本实施例用于探究piR-63049的作用靶点，据piRNA的功能生物信息学分析结果提示，piR-63049在胞质中可能通过抑制Wnt2b表达而抑制BMSCs的成骨分化。因此，本实施例中构建包含Wnt2b 3′-UTR端的荧光素酶报告基因质粒，用于验证Wnt2b是否为piR-63049的作用靶点。
具体结果如下：
如图3(E)所示，Wnt2b在BMSCs成骨分化过程中表达量随时间延长而逐渐升高；如图3(F)所示，Wnt2b蛋白互作用网络图，其中，实线表示共同通路关系，虚线表示可结合关系；由图可知，Wnt2b蛋白与多种基因的表达量有密切联系；
如图3(G)所示，Wnt2b敲低后，β-catenin、Gsk3β蛋白表达量减低，其中NC表示空白对照；如图3(H)和图3(I)所示，Wnt2b敲低后BMSCs成骨分化能力减低；
如图3(J)表示，piR-63049与Wnt2b-3′UTR端的结合位点序列；
荧光素酶报告基因实验结果如图3(K)所示，图中分别显示了空白对照组(Control、记为对照组1)、模拟物的空白对照组(mimics control，记为对照组2)与实验组(piR-63049mimics)的检测结果，其定量分析结果如图3(L)所示，其中实验组与空白对照组和模拟物的空白对照组的荧光量有显著的差别，该结果表明piR-63049与Wnt2b-3′UTR端可结合。
实施例4
本实施例在分子水平验证piR-63049通过靶向调节Wnt2b抑制BMSCs成骨分化的机制。具体实验步骤如下：
(1)应用FISH实验验证piR-63049在细胞中的分布；
(2)构建包含Wnt2b 3′-UTR端的荧光素酶报告基因质粒，与piR-63049共同转染293T细胞，检测荧光表达量，验证piR-63049与Wnt2b的结合位点；
(3)敲低大鼠BMSCs细胞系中piR-63049(即敲低实验组piR-63049inhibitor，并记为实验组1，其中，Inhibitor表示抑制序列，加进去会干扰目的序列合成，inhibitorcontrol是随机序列，不干扰目的基因合成)，CCK8实验检测敲低piR-63049对BMSCs增殖的影响，流式细胞术检测敲低piR-63049对BMSCs细胞周期的影响；
(4)应用成骨诱导液对piR-63049敲低后的BMSCs进行成骨诱导，转染并诱导后第7、14天应用qPCR、western blot检测成骨marker基因及蛋白表达，于第3、7、10、14天ALP染色、茜素红染色检测BMSCs成骨分化；
(5)敲低大鼠BMSCs细胞系中piR-63049，同时设Wnt2b敲低补救实验，应用qPCR检测piR-63049与wnt2b的表达趋势，应用qPCR、western blot、免疫荧光检测wnt/β-catenin通路关键基因和蛋白的表达；
除敲低大鼠BMSCs细胞系中piR-63049，作为对照，本实施例中还过表达了大鼠BMSCs细胞系中piR-63049(即为过表达实验组piR-63049mimics，记为实验组2，其中mimics是运用化学方法合成的piRNA模拟物，本领域技术人员能够通过本领域常规技术手段获得，能模拟细胞中成熟piRNA的高水平表达，以增强内源piRNA的调控作用，用于功能获得性(gain-of-function)研究)，并进行与敲低的细胞系相同的实验；
同时，针对实验组1和实验组2设置对于的对照实验，即Inhibitor control(对照组1)、mimics control(对照组2)以及空白对照组control(对照组3)；具体实验结果及分析如下：
如图4(A)所示，不论是敲低piR-63049还是过表达piR-63049，Wnt2b的表达趋势与piR-63049显著负相关；
且如图4(B)所示，不论是敲低piR-63049还是过表达piR-63049，BMSCs增值能力未见明显改变；
如图4(C)所示，ALP染色显示，敲低后BMSCs成骨分化能力减弱，而piR-63049过表达后BMSCs成骨分化能力增强；
如图4(D)和图4(E)所示，敲低piR-63049可致成骨标志基因Alp、Runx2、Opn表达显著增高，而过表达piR-63049可致成骨标志基因Alp、Runx2、Opn表达显著降低。
实施例5
本实施例用于在体内水平验证antagopiR-63049对大鼠骨质疏松骨量丢失的防治功能。具体步骤如下：
(1)构建去卵巢骨质疏松大鼠模型(OVX)，尾静脉注射antagopiR-63049即得到骨质疏松药物组，记为OVX+antagopiR-63049组，并编号为实验组，检测antagopiR-63049在大鼠各器官的分布，检测piRNA-63049在BMSCs中表达量；
同时本实施例中还设置了三组对照组，包括正常大鼠模型(Sham组，即假手术组，并编号为对照组1)，骨质疏松生理盐水组(OVX组，并编号为对照组2)和骨质疏松药物对照组(记为OVX+antagopiR control组，并编号为对照组3)；
(2)micro CT检测骨量及骨微结构变化；
(3)生物力学仪检测骨组织宏观和微观力学特征；
(4)硬组织切片、骨形态计量学方法检测骨重建中新骨形成能力；
(5)qPCR、western blot检测骨组织成骨相关基因及蛋白表达。
antagopiR-63049治疗后，具体结果如下：
如图5(A)和图5(B)所示，micro CT结果显示antagopiR-63049治疗大鼠静态骨形成参数：骨量(BMD)、小梁骨间距(BV/TV)、小梁骨厚度(Tb.Th)以及小梁骨数量(Tb.N)显著增加；
如图5(C)和图5(D)所示，大鼠动态骨形成参数：骨矿沉积率(MAR)、相对骨形成率(BRF/BS)显著增加；
如图5(E)所示，piR-63049在大鼠骨和外周血中表达量显著减低；
如图5(F)所示，成骨标志基因Opn、Ocn和Alp表达显著增高。
综上所述，本发明中发现piR-63049在骨质疏松BMSCs中表达量显著增高，且其表达量与BMSCs成骨分化过程呈负相关；antagopiR-63049于体内发挥促进骨再生及预防骨质疏松骨量丢失的作用，因此可将其作为促进骨质疏松骨再生的核酸药物进行使用，从而防治骨质疏松。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市人民医院
<120> 一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物
<130> 20201223
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cctctgtgca cgtgacatct 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
ggagacacgu gcacuguaga 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgtctacagt gcacgtgtct cc 22

Claims (1)

1.一种Piwi蛋白结合RNA-63049的拮抗剂在制备治疗骨质疏松的药物中的应用，其特征在于，所述Piwi蛋白结合RNA-63049的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述拮抗剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114277119B (zh) * 2021-12-09 2023-05-16 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种环状RNA circ-Arsb在制备防治骨质疏松产品中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103210085A (zh) * 2010-05-21 2013-07-17 农业科学维也纳大学 用于治疗或诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物
CN109439749A (zh) * 2018-09-26 2019-03-08 北京恩泽康泰生物科技有限公司 用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒
CN110106249A (zh) * 2019-05-09 2019-08-09 深圳市人民医院 长链非编码rna nonhsag039951.2作为骨质疏松诊断标志物的应用
CN110157794A (zh) * 2019-05-09 2019-08-23 深圳市人民医院 长链非编码rna nonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040171028A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
CN110719776A (zh) * 2017-03-31 2020-01-21 密苏里大学管委会 治疗抗药性肿瘤的组合物及其使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103210085A (zh) * 2010-05-21 2013-07-17 农业科学维也纳大学 用于治疗或诊断骨障碍和/或心血管障碍的组合物
CN109439749A (zh) * 2018-09-26 2019-03-08 北京恩泽康泰生物科技有限公司 用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒
CN110106249A (zh) * 2019-05-09 2019-08-09 深圳市人民医院 长链非编码rna nonhsag039951.2作为骨质疏松诊断标志物的应用
CN110157794A (zh) * 2019-05-09 2019-08-23 深圳市人民医院 长链非编码rna nonhsat005760.2作为骨质疏松诊断标志物的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of the piRNA Complex from Rat Testes;Nelson C. Lau et al.;《Science》;20060721;第363卷;摘要、附表S2 *
The Inhibition of MicroRNA-139-5p Promoted Osteoporosis of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Targeting Wnt/Beta-Catenin Signaling Pathway by NOTCH1;Yimiao Feng et al.;《J. Microbiol. Biotechnol.》;20191118;第30卷(第3期);摘要、第449页左栏第4段-第457页左栏第4段 *
绝经后骨质疏松症肾虚证与骨髓基质干细胞分化失衡内在联系的探微;梁文娜 等;《中华中医药杂志》;20201001;第35卷(第10期);第4794-4796页 *

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