CN112724200A

CN112724200A - 一种稳定环孢霉素a的稀释液及其应用

Info

Publication number: CN112724200A
Application number: CN201911032666.4A
Authority: CN
Inventors: 林巍靖; 吴冯波; 刘斌虎
Original assignee: Shanghai Inzex Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Inzex Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN112724200B

Abstract

本发明提供了稳定环孢霉素A的稀释液及其应用。具体的，所述稀释液包含环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物具有下述结构：A‑(L₁‑L₂‑CD)n，其中，A、L1、L2、CD和n如说明书定义。本发明的稀释液使环孢霉素A在水性溶液中保持稳定，极大的方便了环孢霉素A的检测。

Description

一种稳定环孢霉素A的稀释液及其应用

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种稳定环孢霉素A的稀释液及其应用。

背景技术

环孢霉素A(Cyclosporine A,CsA)是一种从丝状真菌(Tolypocladium inflatum)培养液中分离出的由11个氨基酸组成的环肽。从20世纪80年代CsA作为免疫抑制剂用于临床以来，在器官移植治疗中发挥了重大作用，奠定并推动了器官移植的发展。目前，全世界已有超过20万例的患者使用环孢霉素A作为器官移植时的抗排斥反应药物。作为免疫抑制剂它还被应用于一些自身免疫性疾病的治疗，如对类风湿关节炎及白塞(Behet’Sdisease，贝赫切特综合征)，取得了较为满意的疗效，对I型糖尿病、牛皮癣和寄生虫病如疟疾、血吸虫等有一定疗效。此外，环孢霉素A还具有广泛的其它生物学活性如抗真菌、抗寄生虫、抗HIV、抗炎、逆转肿瘤细胞多药耐药等作用。但是，由于其存在比较严重的肝肾毒性，所以监测患者血药浓度有利于减少肝肾毒性，提高疗效。

环孢霉素A是由11个氨基酸组成的环肽，其极性较强，基本不溶于水，易溶于有机溶剂。人体吸收后一般与血红蛋白结合，与蛋白结合后的环孢霉素A较为稳定。目前检测环孢霉素A的诊断试剂盒使用的校准品多为血制品，血制品中蛋白复杂，实验前需要对血制品校准品进行预处理。

所以急需一种能够提高环孢霉素A稳定性的水性稀释液，为环孢霉素A的检测提供便利。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高环孢霉素A稳定性的水性稀释液。

本发明第一方面，提供了一种稀释液，所述稀释液包含环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物具有下述结构：

A-(L₁-L₂-CD)n，

其中，A选自下组：无、取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-10元杂芳基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基；或取代或未取代的(C6-C10芳基或5-10元杂芳基)-L3-(C6-C10芳基或5-10元杂芳基)，其中，L3选自下组：无、-S-S-、-(C＝O)-、C1-C4烷基、C1-C4烯基或C1-C4炔基；

n为1、2、3、4、5或6；

各L₁独立地选自：无、取代或未取代的C1-C6亚烷基或取代或未取代的C1-C6羰基；

各L₂独立地选自：无、或-X₁-(C1-C6取代或未取代的亚烷基)-X₂-；

X1和X2各自独立地选自：无、O、S、NH；

各CD独立地选自：α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或羟基取代的C1-C6烷基-环糊精；

除非特别说明，所述的“取代”指所述基团上的氢原子被选自下组的的一个或多个(例如，2个、3个、4个等)选自下组的取代基所取代：卤素、羟基、羧基、氧代(＝O)、NH₂、-CN、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷基、苄基、苯基。

在另一优选例中，A选自下组：苯基、苄基、联苯基和-苯基-S-S-苯基-。

在另一优选例中，n为2、3或4。

在另一优选例中，各L₁独立地选自：C1-C3亚烷基或C1-C3羰基，优选地，亚甲基或-CO-。

在另一优选例中，各L₂为-NH-CH₂CH₂-NH-。

在另一优选例中，各CD为β-环糊精。

在另一优选例中，所述CD-的连接位置为环糊精的一个或多个支链羟甲基或羟基。

在另一优选例中，所述CD-在连接位置在支链羟甲基时，连接后所述支链羟甲基形成-CH₂或-CH₂O-。

在另一优选例中，所述羟基取代的C1-C6烷基-环糊精为羟丙基-环糊精，优选地，2-羟丙基-环糊精、2,3-羟丙基-环糊精、3-羟丙基-环糊精。

在另一优选例中，所述环糊精或其衍生物选自下组：α-环糊精、β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、γ-环糊精、

其中，

表示环糊精基团，较佳地，

表示β-环糊精基团。

在另一优选例中，所述稀释液的溶剂中水含量为50wt％以上，较佳地70wt％以上，更佳地，80wt％以上、90wt％以上、95wt％以上、96wt％以上、98wt％以上、99wt％以上或99.5wt％以上。

在另一优选例中，所述稀释液中水含量为50wt％以上，较佳地70wt％以上，更佳地，80wt％以上、90wt％以上、95wt％以上、96wt％以上或98wt％以上，以所述稀释液总重量计。

在另一优选例中，稀释液中所述环糊精或其衍生物浓度为0.1-10wt％，较佳地，0.2-5wt％，更佳地，0.5-3wt％，最佳地，0.8％-2wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

在另一优选例中，所述稀释液还包括一种或多种选自下组的组分：pH调节剂、环糊精结构支撑剂、防腐剂和渗透压调节剂。

在另一优选例中，所述稀释液最终pH为7-10，较佳地，7-9，更佳地，7.2-8。

在另一优选例中，所述pH调节剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

在另一优选例中，所述环糊精结构支撑剂选自：透明质酸、羧甲基壳聚糖、羟甲基纤维素、鱼皮明胶、葡聚糖，或其组合，更佳地，羧甲基壳聚糖。

在另一优选例中，所述环糊精结构支撑剂浓度为0.05-2wt％，较佳地，0.1-1wt％，更佳地，0.1-0.5wt％，最佳地，0.15-0.3wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

在另一优选例中，所述防腐剂选自：Proclin300、叠氮钠，或其组合。

在另一优选例中，所述防腐剂浓度为0.02-2wt％，较佳地，较佳地，0.05-1wt％，更佳地，0.08-0.5wt％，最佳地，0.08-0.2wt％百分比以所述稀释液总重量计。

在另一优选例中，所述渗透压调节剂选自：氯化钠、氯化钾，或其组合。

在另一优选例中，所述渗透压调节剂浓度为0.5-2wt％，较佳地，0.6-1.5wt％，更佳地，0.7-1.2wt％，最佳地，0.8-1.0wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

本发明第二方面，提供了一种环孢霉素A校准液，所述校准液包括：

如本发明第一方面所述的稀释液，以及环孢霉素A。

在另一优选例中，所述校准液中环孢霉素A浓度为0.01ng/mL-2mg/ml，较佳地，1ng/mL-100μg/ml，更佳地，2ng/mL-10μg/ml。

本发明第三方面，提供了一种环孢霉素A检测试剂盒，包括：

如本发明第二方面所述的环孢霉素A校准液，以及容纳所述校准液的至少一个容器。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括如本发明第一方面所述的稀释液，以及容纳所述稀释液的至少一个容器。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括说明书。

本发明第四方面，提供了一种稳定环孢霉素A的方法，包括步骤，

将环孢霉素A溶于如本发明第一方面所述的稀释液中。

在另一优选例中，所述环孢霉素A为在有机溶液、水溶液或液态样品中存在的环孢霉素A。

在另一优选例中，所述液态样品为血浆或尿液。

在另一优选例中，所述稀释液中环孢霉素A浓度为0.01ng/mL-2mg/ml，较佳地，1ng/mL-100μg/ml，更佳地，1ng/mL-10μg/ml。

在另一优选例中，所述方法还包括将所得环孢霉素A溶液存储于-10-40℃，较佳地，-5-20℃，更佳地，-4-10℃，最佳地，2-8℃。

在另一优选例中，所述存储的时长为十二个月以下、六个月以下、三个月以下、一个月以下或七天以下。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例4中使用的多种环糊精、其衍生物的化学结构式。

图2为实施例1-3中使用的乙二胺修饰的β-环糊精的化学结构式。

图3为环孢霉素A在不同环糊精或其衍生物配制的稀释液中的37℃热加速稳定性实验浓度变化曲线。

图4为环孢霉素A在羧甲基壳聚糖代替透明质酸的不同稀释液中的37℃热加速稳定性浓度变化曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种稳定环孢霉素A的稀释液。本发明的稀释液中加入环糊精或其衍生物，令人惊讶地，在水性溶液中极不稳定的环孢霉素A在本发明的稀释液中稳定性显著提高，且本发明的稀释液溶剂为水或大部分为水，可代替现有技术中的血浆基质，为环孢霉素A的稳定保存和检测带来便利。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

术语

除非另有表述，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C1-6表示1-6个碳)。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、等。

除非另有表述，术语“烯基”指具有一个或多个双键的不饱和烷基。类似地，术语“炔基”指具有一个或多个三键的不饱和烷基。此类不饱和烷基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。

除非另有表述，术语“环烷基”是指具有指定环原子数(例如，C_3-10环烷基)并且完全饱和的或在环顶之间具有不超过一个双键的烃环。“环烷基”也指双环和多环烃环，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷等。

除非另有表述，术语“杂环烷基”是指含有一至五个选自N、O和S的杂原子的环烷基，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环体系。杂环烷基的非限制性例子包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑烷酮、乙内酰脲、二氧戊环、苯邻二甲酰亚胺、哌啶、1,4-二噁烷、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-S-氧化物、硫代吗啉-S,S-氧化物、哌嗪、吡喃、吡啶酮、3-吡咯啉、噻喃、吡喃酮、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基可以经环碳或杂原子连接于分子的其余部分。对于诸如环烷基烷基和杂环烷基烷基的术语，是指环烷基或杂环烷基通过烷基或亚烷基连接体连接到分子的其余部分。例如，环丁基甲基-是连接到分子其余部分的亚甲基连接基上的环丁基环。

除非另有表述，术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如-CH₂CH₂CH₂CH₂-。烷基(或亚烷基)通常具有1-24个碳原子，其中本发明优选具有10个或更少碳原子(如1、2、3、4、5或6个)的那些基团。

除非另有表述，术语"烷氧基"或“烷基氧基”、"烷氨基""或“烷基氨基”和"烷硫基"或“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，指代分别经氧原子、氨基或硫原子连接于分子的其余部分的那些烷基。

除非另有表述，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”等术语表示包括单卤代烷基或多卤代烷基。例如，术语“C_1-6卤代烷基”表示包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有表述，术语“芳基”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多三环)。术语"杂芳基"是指含有1至5个选自N、O、和S的杂原子的芳基(或环)，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(双环、最多三环)其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基(benzotriazin基)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基(isobenzofur基)、异吲哚基、中氮茚基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等等。以上芳基和杂芳基环系统各自的取代基选自下述可接受的取代基的组。

如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

如本文所用，术语“羟基取代的C1-C6烷基-环糊精”指环糊精上的氢和/或羟基被一个或多个羟基取代C1-C6烷基取代的α、β或γ环糊精。优选地，羟基取代的C1-C6烷基包括(但并不限于)：2-羟乙基、2-羟丙基、2,3-羟丙基、3-羟丙基、2-羟丁基、2,3-羟丁基、3-羟丁基等。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。

本发明的某些化合物拥有不对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(例如，分离的对映体)均应包括在本发明范围内。当本文提供的化合物具有确定的立体化学(表示为R或S，或具有虚线或楔形键指明)时，被本领域技术人员将理解那些化合物为基本上不含其他异构体(例如至少80％，90％，95％，98％，99％和至多100％不含其他异构体)。

在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、羟基、羧基、氧代(＝O)、NH₂、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷基、苄基、苯基。

如本文所用，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

稀释液、用途

本发明提供的稀释液包含环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物具有下述结构：A-(L₁-L₂-CD)n，其中，A、L1、L2、CD、n如上定义。

环孢霉素A在水溶液中不稳定，而本发明的稀释液中具有的环糊精或其衍生能够显著提高环孢霉素A在水溶液中的稳定性，所以可以用于稳定环孢霉素A。

所述“稳定”指与环孢霉素A溶于水或不含所述环糊精或其衍生物的溶液相比，环孢霉素A溶于本发明的稀释液后环孢霉素A分解速度减慢，存储时间延长。

本发明的环糊精或其衍生物可通过商业途径购买或者利用市售原料，或通过现有技术中合成方法合成。本领域的普通技术人员可参考本发明实施例中所述的示例性方法以及本领域技术人员所用的相关公开文献操作完成可以来合成本发明的环糊精或其衍生物。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。

合成化学改造、保护官能团方法学对合成本发明的环糊精、其衍生物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，可以参见可例如R.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，ProtectiveGroups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser andM.Fieser，Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis，John Wiley andSons(1994)；和L.Paquette，ed.Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)等文献。

所述稀释液的溶剂中水含量50wt％以上，较佳地70wt％以上，更佳地，80wt％以上、90wt％以上、95wt％以上、96wt％以上、98wt％以上、99wt％以上或99.5wt％以上。

优选地，本发明的稀释液还包括一种或多种选自下组的组分：pH调节剂、环糊精结构支撑剂、防腐剂、渗透压调节剂，或其组合。

本发明的稀释液对pH调节剂的种类没有特别限制，如可使用本领域常用的pH缓冲液，用于将所述稀释液的pH稳定在一定范围。优选地，所述pH调节剂为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

所述环糊精结构支撑剂用于支撑环糊精的结构骨架，可以更好的固定药物小分子，可进一步提高稀释液对药物分子的稳定作用。

优选地，环糊精结构支撑剂选自：在另一优选例中，所述环糊精结构支撑剂选自：透明质酸、羧甲基壳聚糖、羟甲基纤维素、鱼皮明胶、葡聚糖，或其组合，更佳地，羧甲基壳聚糖。

典型的，所述环糊精结构支撑剂浓度为0.05-2wt％，较佳地，0.1-1wt％，更佳地，0.1-0.5wt％，最佳地，0.15-0.3wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

所述防腐剂用于抗菌防霉，防止微生物(如细菌或霉菌)对药物分子的分解和/或对稀释液的污染，可延长稀释液的存储时间。

本发明的稀释液对防腐剂没有特别的要求，可采用本领域常用的防腐剂，优选的防腐剂选自：Proclin300、叠氮钠，或其组合。

所述渗透压调节剂用于调节稀释液的渗透压。渗透压调节剂的选择没有特别要求，如选用各种无机盐。优选地，渗透压调节剂选自：氯化钠、氯化钾，或其组合。

渗透压调节剂浓度优选将稀释液调节至接近人血浆渗透压，如接近生理盐水的浓度。在另一优选例中，所述渗透压调节剂浓度为0.5-2wt％，较佳地，0.6-1.5wt％，更佳地，0.7-1.2wt％，最佳地，0.8-1.0wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

环孢霉素A校准液、试剂盒

本发明的环孢霉素A校准液包括：上述的稀释液，以及环孢霉素A。

典型地，将环孢霉素A溶于所述稀释液即可制备本发明的环孢霉素A校准液。

本发明还提供了环孢霉素A检测试剂盒，所述试剂盒包括所述环孢霉素A校准液。

本发明的主要优点包括：

1.本发明的稀释液中加入环糊精或其衍生物，在水性溶液中极不稳定的环孢霉素A在本发明的稀释液中稳定性显著提高，可长时间保持浓度稳定，保证检测结果的准确性。

2.本发明的稀释液溶剂可以为水或基本为水，与现有环孢霉素A检测校准溶液常用血制品相比，制备简单，成本低。

3.本发明的稀释液制备校准液能够在保证环孢霉素A浓度的情况下，可简化处理步骤，加快检测速度，减小对检测仪器的污染。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

试剂

α-环糊精：sigma,≥98％；

β-环糊精：TCI，＞99％；

γ-环糊精：阿拉丁，98％；

2-羟丙基-α-环糊精：sigma,≥98％；

2-羟丙基-β-环糊精：阿拉丁，97％；其中，部分环糊精结构式如图1所示。

Proclin300(液体生物防腐剂)上海一研生物科技有限公司。

实施例1

环糊精衍生物1的制备:

⑴在100mL三口瓶中，将4,4’-二硫二苯甲酸(DTBA)(200.0mg,0.65mmol)和1-2笨并三氮唑(HOBt)(220.8mg,1.63mmol)溶于40mL无水DMF中，0℃下搅拌30mins。

⑵称取乙二胺修饰的β-环糊精(结构式如图2所示，1.92g，1.63mmol)。和二环己基碳二亚胺(DCC)(337.1mg，1.63mmol)溶于10mL无水DMF中，逐滴加入到上述溶液中。反应体系在0℃并且氮气保护下搅拌过夜，在室温下搅拌反应72h。

⑶将上述步骤的反应混合物过滤，除去不溶物，将滤液旋干，固体残渣再溶于少量水中，然后泼入500mL丙酮中，产生黄色沉淀，室温下继续搅拌2h。

⑷过滤，得到黄色固体粗产物。将粗产物用正丙醇(n-PrOH)：H2O：25％氨水(NH3·H2O)＝6:3:1(v/v/v)的比例混合后作为洗脱剂过硅胶色谱柱进行初步提纯。

⑸将初步提纯的产物再用中低压液相色谱柱进一步提纯，收集水：乙醇＝82:18(v/v)极性的洗脱液，冻干，得到淡黄色固体产物，产率10％。

¹H NMR(400MHz,[d₆],DMSO,TMS):δ＝2.84-3.02(m,8H，-NH-CH₂CH₂-NH-),3.49-3.87(m,56H，H of C-3,C-5,C-6 ofβ-CD),4.39-4.61(m,12H，H of C6-OH of β-CD)，4.83(s,14H,H of C-1 ofβ-CD)，5.66-5.83(m,28H,H of C2-OH,C3-OH ofβ-CD),7.61(d,J＝8.4Hz,4H,H of benzene),7.83(d,J＝8.3Hz,4H,H of benzene),8.43ppm(s,2H,H of-CONH-)；¹³C NMR(100MHz,[d₆]DMSO,TMS)：δ＝48.6，59.9,70.6，72.0,72.3，73.0，81.5，82.9,101.9，126.3,128.3，133.5,138.8,165.8ppm；elemental analysis.Calculated(％)for C₁₀₂H₁₅₈O₇₀N₄S₂·3H₂O：C 45.74，N 2.09，H6.17；Found:C42.83,N 2.15，H6.32；HRMS:m/z:2625.2981[M+H]⁺.

实施例2

环糊精衍生物2的制备：

⑴在100mL三口瓶中，称取乙二胺修饰的β-环糊精(1.92g,1.63mmol)，并使之溶于干燥的DMF中(20mL)。

⑵移取少量三乙胺(0.2ml)加入体系中，室温、氮气保护下缓慢滴加1,3,5-三苄溴(179.6mg,0.503mmol)的DMF(10mL)溶液，滴加完毕后于70℃下继续搅拌7天，然后再在室温下继续搅拌3天。

⑶得到深棕黄色溶液，减压蒸干溶剂后，得到的浅黄色固体溶于最少量的热水中，再以200mL丙酮浸泡，待沉淀充分析出，重复此操作两次，抽滤。

⑷所得固体溶于最少量水中，然后用Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离纯化，紫外-可见分光光度计检测，将有产品的洗脱液旋干并真空干燥，最后得到深棕黄色固体，产率20％。

¹H NMR(300MHz,D₂O,TMS,ppm):2.76-3.72(m,138H),4.92(m,21H),7.91-8.02(m,Ar 3H)；¹³C NMR(D₂O)δ142.12，129.12,125.31，102.00,81.11，73.23，72.07，60.29；Analysis.Calculated for C₁₄₁H₂₃₄O₁₀₂N₆·15H₂O：C 44.21，N 2.12，H6.53.Found:C42.95,N2.39，H6.47.

实施例3

环糊精衍生物3的制备：

⑵移取少量三乙胺(0.2ml)加入体系中，室温、氮气保护下缓慢滴加1,2,4,5-四苄溴(179.6mg,0.503mmol)的DMF(10mL)溶液，滴加完毕后于70℃下继续搅拌7天，然后再在室温下继续搅拌3天。

⑷所得固体溶于最少量水中，然后用Sephadex G-25凝胶色谱柱进行分离纯化，紫外-可见分光光度计检测，将有产品的洗脱液旋干并真空干燥，最后得到深棕黄色固体，产率15％。¹H NMR(300MHz,D₂O,TMS,ppm):3.01-3.75(m,184H),4.70-4.91(s,28H),8.22(s,Ar2H).Analysis.Calculated for C₁₈₆H₃₁₀O₁₃₆N₈·21H₂O：C 42.80，N 2.23，H6.85.Found:C42.67,N 2.45，H6.38.

实施例4

使用常规的溶液配制方法按照下列配方制备(其余为溶剂，且溶剂为水)对照稀释液和样品稀释液1-8，其中百分比为相对稀释液总重量的重量百分比。PBS表示磷酸盐缓冲液。

稀释液(对照)配制：

稀释液1配制：

稀释液2配制：

稀释液3配制：

稀释液4配制：

稀释液5配制：

稀释液6配制：

稀释液7配制：

稀释液8配制：

实施例5

校准品的配制

1.精密天平精确称取环孢霉素A标准品(中国食品药品检定研究所的国家标准物质环孢素(即环孢霉素A)，纯度>98％)5-10mg，洁净窄口试剂瓶称取DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，溶解上述称取的环孢霉素A，使其终浓度在10ug/ml左右。

2.移液器移取适当量的10ug/ml的环孢霉素A的DMF溶液，记下称量重量，计算出所含环孢霉素A的质量。

3.使用上述配制的9组稀释液分别稀释上述称取的环孢霉素A DMF溶液，使环孢霉素A终浓度至1000ng/mL，得到9组不同稀释液的1000ng/mL环孢霉素A校准品。

实施例6

37℃热加速稳定性试验

将实施例6配制的校准品放入37℃隔水培养箱下，每天取样检测，使用的试剂盒是雅培普乐可复试剂盒(化学发光微粒子)。

试验结果如表1所示，其中，数值表示校准品中环孢霉素A浓度(ng/mL)：

表1

各组浓度变化曲线如图3所示，从表1和图3可以明显的看出，原本在水性溶液中极不稳定的环孢霉素A在本发明的稀释液中稳定性显著提高。在加热条件下也能几乎不分解，为制备环孢霉素A水性校准液提供了可能。

实施例7

使用常规的溶液配制方法按照下列配方制备(其余为溶剂，且溶剂为水)对照稀释液和样品稀释液9-16，其中百分比为相对稀释液总重量的重量百分比。

稀释液(对照)配制：

稀释液9配制：

稀释液10配制：

稀释液11配制：

稀释液12配制：

稀释液13配制：

稀释液14配制：

稀释液15配制：

稀释液16配制：

实施例8

37℃热加速稳定性试验

将实施例7配制的校准品放入37℃隔水培养箱下，每天取样检测，使用的试剂盒是雅培普乐可复试剂盒(化学发光微粒子)。

试验结果如表2和图4所示，其中，数值表示校准品中环孢霉素A浓度(ng/mL)：

表2

对比表1和表2，意外的发现，将羧甲基壳聚糖代替透明质酸后，在没有加入环糊精或环糊精衍生物时(对照组)，羧甲基壳聚糖对环孢霉素A表现出一定的稳定作用，当羧甲基壳聚糖与环糊精或环糊精衍生物一起使用时，两者具有更为显著的协同作用，使稳定环孢霉素A的效果进一步提升。

综上，本发明的稀释液能显著提高环孢霉素A的稳定性，可用于制备环孢霉素A校准液，且本发明的稀释液溶剂为水或基本为水，可代替现有技术中的血浆基质，在保证环孢霉素A的检测的准确性前提下，降低了检测成本，简化了血制品复杂基质导致的预处理步骤，大大提高了环孢霉素A的检测效率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种稀释液，其特征在于，所述稀释液包含环糊精或其衍生物，所述环糊精或其衍生物具有下述结构：

A-(L₁-L₂-CD)n，

n为1、2、3、4、5或6；

X1和X2各自独立地选自：无、O、S、NH；

2.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，A选自下组：苯基、苄基、联苯基和-苯基-S-S-苯基-。

3.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述环糊精或其衍生物选自下组：α-环糊精、β-环糊精、2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精、γ-环糊精、

其中，

表示环糊精基团，较佳地，

表示β-环糊精基团。

4.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液的溶剂中水含量为50wt％以上，较佳地70wt％以上，更佳地，80wt％以上、90wt％以上、95wt％以上、96wt％以上、98wt％以上、99wt％以上或99.5wt％以上。

5.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，稀释液中所述环糊精或其衍生物浓度为0.1-10wt％，较佳地，0.2-5wt％，更佳地，0.5-3wt％，最佳地，0.8％-2wt％，百分比以所述稀释液总重量计。

6.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液还包括一种或多种选自下组的组分：pH调节剂、环糊精结构支撑剂、防腐剂和渗透压调节剂。

7.如权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述环糊精结构支撑剂选自：透明质酸、羧甲基壳聚糖、羟甲基纤维素、鱼皮明胶、葡聚糖，或其组合，更佳地，羧甲基壳聚糖。

8.一种环孢霉素A校准液，其特征在于，所述校准液包括：如权利要求1所述的稀释液，以及环孢霉素A。

9.一种环孢霉素A检测试剂盒，其特征在于，包括：所述的环孢霉素A校准液，以及容纳所述校准液的至少一个容器。

10.一种稳定环孢霉素A的方法，其特征在于，包括步骤，将环孢霉素A溶于如权利要求1所述的稀释液中。