CN112640847B - 一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种内源性癫痫发作动物模型，包含采用化学遗传学或光遗传学激活病毒注射到小鼠的海马CA3区，表达3周后建成，所述激活病毒选自：a)rAAV‑CaMKIIa‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPREs‑pA与rAAV‑VGAT1‑hM3D(Gq)‑mCherry‑WPRE‑pA的混合物，和b)rAAV‑Ef1α‑DIO‑hChR2(H134R)‑EYFP‑WPRE–pA与rAAV‑CaMKII‑CRE‑WPRE‑pA和AAV‑VGAT1‑CRE‑WPRE‑pA的混合物。该癫痫发作动物模型相对于CA1区和VA区多点注射模型更适合于癫痫的机制研究及抗癫痫药物的筛选。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种内源性癫痫发作动物模型及其构建方法，特别涉及一种采用化学遗传学或光遗传学激活病毒构建的内源性癫痫发作动物模型及其构建方法。
背景技术
难治性癫痫近40年来均未取得明显进展。其原因在于对发病机制尚不完全清。既往对癫痫发病机制的探讨多基于传统的癫痫动物模型，如皮罗卡品、海仁酸或电刺激等，这些外源性的癫痫动物模型与人类的癫痫发作存在巨大的差异。癫痫发作过程中参与的脑区或具体参与的神经元亦不明确。因此，这些外源性癫痫模型尚不能完全模拟人类的癫痫发作。现有观点认为人类癫痫的发生可能与谷氨酸和γ-氨基丁酸能神经元有关，而这两种神经元是脑内主要的神经元，目前应用于抗癫痫治疗的新药及物理疗法几乎都与这两种神经元有关，提示这两种神经元可能与癫痫的发病机制有关。随着光遗传学和化学遗传学(DREADDs)方法学越来越多的应用于神经科学，需要通过内源性调控的方法来构建新型的、通用的、可靠的癫痫发作模型，使其更适合于癫痫发病机制的研究及抗癫痫药物的筛选。有望成为扭转目前治疗上被动局面的有效措施。
传统模型的缺点：传统的点燃模型存在一系列问题。第一，例如，匹罗卡品、海人酸及PTZ模型，使用扩散的化学药品本身是可变的，不能精确地查明发病区域和细胞类型，很难区分可塑性机制对组织损伤的贡献。第二，实验者无法控制点燃后激活的细胞子集，从而难以在细胞类型与病理结果之间建立因果关系。缺乏特异性可能反过来导致整个实验室的标准化结果降低。并且这类模型反复进行点燃后，化学物质对脑组织损坏亦严重，部分研究领域实验数据可靠性降低。
CN111839800公开一种化学遗传癫痫持续状态疾病动物模型及其构建方法与应用，所述癫痫持续状态疾病动物模型为小鼠脑内核团(模型一海马CA1区和丘脑腹前核VA区；模型二基底外侧杏仁核BLA区和丘脑腹前核VA区)脑立体定位病毒(化学遗传病毒rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA)注射和小鼠海马CA3区电极阵列埋置，小鼠恢复1周后，腹腔注射氯氮平的代谢产物CNO，使得CNO与病毒表达的受体结合从而激活神经元诱导癫痫持续状态发作，经行为学观察和在体多通道局部场电位记录判断得到癫痫持续状态疾病动物模型。该模型的构建方法仍存在许多不足。第一，该方法需要在脑内多个点(如CA1区、VA区、BLA区等)注射病毒，才能建立癫痫持续状态模型，但两个或多个核团同时激活，难以同时明确核团上下游关系，在癫痫网络研究中明显受限。第二，在脑内多点注射病毒所建的模型，不利于癫痫发作过程中，神经网络中神经递质演变的研究。第三，同一只小鼠脑内多点注射病毒时间成本较长，病毒量相对较多。如需上下游同时进行病毒注射，容易造成注射过程中小鼠死亡；如分开注射，则延长实验时间，增加时间成本。同时也增加小鼠喂养过程中的费用和成本。第四，该模型为癫痫持续状态模型而非癫痫模型，适合于癫痫持续状态领域研究，而不适合于癫痫的机制研究及抗癫痫药物的筛选。
因此，需要探索有利于癫痫机制研究及抗癫痫药物筛选；且更便于清楚明确核团上下游关系，有利于弄清癫痫网络；同时，操作更简便，保证模型动物的存活率的癫痫发作动物及其构建方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用化学遗传学或光遗传学激活病毒构建的内源性癫痫发作动物模型及其构建方法。该动物模型具有以下优点：第一，与经典PTZ等模型一样，它可以在时间上相对精确刺激神经元。实验动物死亡率低，可减少实验组动物使用数量，且同一只老鼠在实验过程中可以前后进行对照，可使实验数据更可靠。第二，它能够操纵特定神经元群的活动，可以通过兴奋不同类型的神经元，研究癫痫的发病机制。第三，不会产生刺激伪像，因此可以在电生理学方面研究刺激过程中神经元活动的时空动态；不会引起明显的脑损伤或神经胶质反应。第四，与既往脑内多点注射病毒模型比较，激活脑区范围较小，可以对癫痫的传播途径及方向更明确的定位，即对癫痫的网络研究最为理想。第五，由于没有外源性损伤性化学物质的干扰，激活脑区比较明确，这种模型在癫痫发作前，发作过程中及发作后神经递质演变的研究领域中具有独特的优势。第六，与既往多点注射病毒模型比较，注射病毒点减少一半，注射时间成本减少一半，病毒成本也减少一半。并且可以同时进行上下游核团病毒的注射，可节省时间成本及小鼠喂养过程中的费用。第七，可适用于抗癫痫药物的筛选。第八，光遗传学验证，进一步确定时间特异性。
为实现本发明的目的提供了如下实施方案。
在一实施方案中，本发明的一种内源性癫痫发作动物模型，包含采用化学遗传学或光遗传学激活病毒注射到小鼠的海马CA3区，表达3周后建成，所述激活病毒选自以下组：
a)rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA(滴度5.04E+12vg/mL)与rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA(滴度5.01E+12vg/mL)的混合物(或称混合病毒)，和
b)rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE–pA(滴度5.48E+12vg/mL)与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA(滴度5.79E+12vg/mL)
和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA(滴度4.73E+12vg/mL)的混合物。
优选的，本发明的一种内源性癫痫发作动物模型，其特征在于：所述a)的混合病毒，其病毒rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA与病毒rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA的体积比为，(1-8)：1，更优选为(6-8)：1。
所述b)的混合病毒，其病毒rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE–pA与病毒rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA和病毒AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA的体积比为7：6：1。
上述本发明的癫痫发作动物模型，进一步包括采用CNO点燃癫痫发作或光刺激点燃癫痫发作。
本发明的另一目的在于提供一种内源性癫痫发作动物模型的构建方法，其特征在于包括采用光遗传学或化学遗传学激活病毒构建而成，具体包括以下步骤：
1)选取8周龄以上的野生型C57BL/6小鼠，麻醉后剃除头毛，消毒后剪开头皮，暴露前囟，以前囟为中心点钻孔，挑破脑膜，暴露脑组织；
2)向海马CA3区注射激活病毒，消毒后缝合头皮，维持小鼠体温维持在约36℃，关入笼子中代养；
3)待激活病毒在CA3区表达3周后，完成内源性癫痫发作动物模型构建；
4)任选的，进一步包括采用注射CNO或光点燃癫痫发作以评判步骤3)构建的模型是否成功，
其中，所述激活病毒选自下列组：
a)rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA(滴度5.04E+12vg/mL)与rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA(滴度5.01E+12vg/mL)的混合物(或称混合病毒)，和
b)rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE–pA(滴度5.48E+12vg/mL)与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA(滴度5.79E+12vg/mL)和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA(滴度4.73E+12vg/mL)的混合物(或称混合病毒)。
优选的，上述本发明的构建方法，所述激活病毒，其中a)组的混合物，rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA与rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA病毒的体积比为(1-8)：1，更优选为(6-8)：1。
优选的，上述本发明的构建方法，所述激活病毒，其中b)组的混合物rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE–pA与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA病毒的体积比为7：6：1。
优选的，上述本发明的构建方法，所述小鼠，其重量为20g至33g，化学遗传学激活病毒注射剂量为200nl至300nl，光遗传学激活病毒注射剂量为200nl。
上述本发明的构建方法，所述评判包括：
1)观察构建动物模型腹腔注射CNO或光刺激点燃癫痫发作行为学；
2)记录癫痫发作后行为学以及在体多通道场电位。
本发明的癫痫发作动物模型，通过光遗传学或化学遗传学方法在CA3区同时兴奋GABA能神经元与谷氨酸能神经元(化学遗传学按6-8:1的比例混合病毒，光遗传学按7：6：1的比例混合病毒)构建癫痫发作动物模型。
本发明的癫痫发作动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1)模型构建
A、化学遗传学激活病毒注射，将rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA(滴度约5.04E+12vg/mL)与rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA(滴度约5.01E+12vg/mL)按优选的(6-8)：1比例混合后，将200nl至300-nl混合注射到CA3区病毒经过表达3周后，进行CNO试验。
B、在光遗传学病毒注射中，将rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA(滴度约5.48E+12vg/mL)与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA(滴度约5.79E+12vg/mL)和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA(滴度约4.73E+12vg/mL)混合，混合体积比例为7：6：1，最终将200nl混合病毒，注射到于CA3处。
2)腹腔注射CNO及光刺激点燃癫痫发作行为学的观察
化学遗传学病毒表达3周后，予以腹腔注射CNO(2mg/kg)，点燃癫痫发作。观察行为学3小时。并同时与传统PTZ模型进行死亡率对比。
3)CNO点燃癫痫发作后行为学及在体多通道场电位记录
被CNO点燃的小鼠，体内安置电极，1周后再行CNO点燃并同时通过在体多通道场电位记录系统记录小鼠癫痫发作的场电位。
4)对化学遗传学点燃模型长时间随访
将被CNO点燃的小鼠进行长时间反复多次点燃，了解其稳定性。
附图说明
图1本发明的癫痫动物模型经CNO腹腔注射点燃癫痫发作后行为学观察结果图；
图2本发明的动物模型经光刺激点燃癫痫发作后行为学观察结果图；
图3建模7周后再次用CNO点燃癫痫发作后行为学观察结果图；
图4建模7周后再次用CNO点燃癫痫发作后场电位和频谱通图；
图5荧光检测本发明的动物模型的病毒感染现象图；
图6经反复多次点燃癫痫发作后行为学观察结果图。
具体实施方式
以下实施例仅是代表性，用于进一步理解和阐明本发明的精神实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1癫痫发作行动物模型的构建
本实验选用野生型C57BL/6小鼠，雌雄不限，8周龄以上，体重在20g至33g。化学遗传与光遗传病毒注射坐标一致，CA3区(坐标：AP-2.3mm；ML，-2.5mm；DV，-2.7mm)。所用病毒均是从商业途径购得。
具体实验过程如下：
1.脑立体定位病毒注射、电极阵列与光纤埋置
1.1病毒注射：
1.1.1麻醉及固定将小鼠称重后用0.8％戊巴比妥腹腔注射进行麻醉，然后固定在立体定向框架中。
1.1.2暴露前囟、坐标定位及钻孔
剪去小鼠头顶部毛发，用碘伏及75％酒精消毒手术区域头皮，沿失状线剪开头皮，充分暴露前囟，将微量进样器连接至微量注射泵推注臂上，以前囟为中心点，调平颅骨平面处于水平位。使用Paxinos小鼠脑图谱确定相关核团坐标。定位用标记笔将其标记，然后用颅骨钻小心于标记点钻孔，以暴露脑膜无出血为宜，用细针尖挑破脑膜，充分暴露脑组织。
1.1.3病毒注射(所用病毒均购买于武汉枢密有限公司)
将实验小鼠分成7个组，将化学遗传学病毒rAAV-CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry-WPREs-pA(简称：CaMKIIa-hM3D(Gq)-mCherry，滴度5.04E+12vg/mL)与rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA(简称：VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry，滴度5.01E+12vg/mL)配制不同体积比的混合物(共有5组混合病毒实验组)，具体见表1。另将化学遗传学病毒VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry(滴度5.01E+12vg/mL)与rAAV-CAMKII-EGFP-WPRE-pA(简称CAMKII-EGFP，滴度5.15E+12vg/mL)按不同体积比配制成混合物(共2组混合病毒)，作为病毒对照组，具体见下表。
表1病毒实验组配制表
表2病毒对照组配制表
化学遗传学激活病毒注射
将上以5组实验组和2组对照组的混合病毒，分别注射入7组小鼠的CA3区，具体操作如下：
实验组：
用5μl微量进样器吸取各混合病毒200nl，以20nl/min的速率分别注射到5组实验组小鼠脑海马的CA3区，留针10min，缓慢拔出针尖。75％酒精消毒后缝合头皮。术后将动物放置在加热垫上，使其核心体温维持在36℃，待动物清醒后关入原笼子中代养。
光遗传学病毒注射
实验组：
首先，将rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA(滴度5.48E+12vg/mL)与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA(滴度约5.79E+12vg/mL)或AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA(滴度约4.73E+12vg/mL)按1:1比例混合。其次，将((DIO-hChR2(H134R)-EYFP+VGAT1-CRE)：(DIO-hChR2(H134R)-EYFP+CaMKII-CRE))也按1:1比例混合，第三，将上述混合病毒再次将((DIO-hChR2(H134R)-EYFP+VGAT1-CRE)：(DIO-hChR2(H134R)-EYFP+CaMKII-CRE))按1:6比例混合。然后用微量进样器吸取200nl混合病毒，于CA3各注射200nl病毒。
对照组：
用5μl微量进样器吸取对照组病毒400nl，以200nl/min的速率分别注射到照组小鼠脑海马的DG+CA3两区。先将200nl注射到DG区，留针10min；缓慢拔出针尖后，再将剩下200nl病毒用同法注射到CA3区，留针10min，缓慢拔出针尖。毕后上述术后处理。
2.埋置电极及光纤
(1)在已注射化学遗传学病毒小鼠中，病毒表达3周且被CNO点燃的小鼠，进行埋置复合电极植入的过程中。麻醉、固定、暴露前囟及定位均同1.1.1至1.1.3。于前额部上方颅骨安装2×1.4×6mm的螺钉作为参考电极，于左侧海马及右侧小脑上方安装2×1.4×2.4mm的螺钉。然后将电极植入病毒测海马CA3(坐标点同上述注射病毒点)，将参考电极丝固定在额叶颅骨上螺钉上。放置好脑固定片。最后，用牙托水和牙托粉将脑固定片、螺钉、颅骨及电极紧密粘合固定在一块。等牙科水泥干后将小鼠分笼饲养至少1周等其恢复。
(2)在光纤植入过程中，将CA3部位注射光遗传学病毒2周的小鼠，用前述相同的方法将小鼠麻醉并剪开头皮暴露前囟和中央十字缝，于左侧海马及右侧小脑上方各安装1×1.4×2.4mm的螺钉，然后用夹持器和光纤调平颅骨平面。将离前囟远端病毒注射的目标核团(CA3：AP-2.3mm；ML，-2.5mm；DV，-2.7mm)颅骨窗口处埋入第一根光纤，光纤埋置深度比病毒注射深度浅0.05mm，以便给光刺激留出照射空间。然后逐层用牙科水泥将两根光纤和螺钉固定在颅骨表面。
3.CNO腹腔注射及光刺激激活神经元诱发癫痫发作
A、注射CNO点燃癫痫发作
用1％的DMSO(二甲基亚砜)液将CNO粉末溶解进行CNO配制，然后配制成终浓度为2mg/kg。将化学遗传学病毒注射3周后的小鼠，按0.1ml/10g(CNO浓度为2mg/kg)标准，进行腹腔注射，观察行为学2～3小时。标记好能被点燃癫痫发作的小鼠。能点燃的小鼠进行场电位检测，埋置好电极并恢复1周后，腹腔注射2mg/kg CNO，然后同时进行视频行为学观察和在体多通道局部场电位记录。
B、光刺激点燃癫痫发作
小鼠恢复1周后将小鼠头顶上的光纤连在光缆线上，光纤旋转器的另一头与波长为473nm的蓝光激光器连接。用一个波形信号发生器连接蓝光激光器控制激光的发放。打开激光器并用光功率计测试光缆线末端的光功率并调试到10～15mW。调试好光功率后关掉激光器，将光缆线再次与小鼠头上的光纤连接，并设置好波形信号发生器的控制参数，参数设置为频率(20Hz)和占空比(0.2)。刺激持续时间分别固定20s或持续性。其余输出参数如下，串参数Burst Duration(2、3、5)s、Burst Interval(0.5、1、2)s，系列参数Train Delay(0、0.05、0.1、0.5)s、Train Duration 20s。通过上述参数调节，蓝光刺激后进行行为学观察，视频录制等，观察结束后的小鼠进行脑组织荧光检测，病毒注射位置不准确或光纤埋置不准确者，剔除实验组。通过不同参数的实验，最终确定刺激参数为：频率(20Hz)和占空比(0.2)，刺激持续时间为20s。串参数Burst Duration 5s、Burst Interval 0.5s，系列参数Train Delay 0s、Train Duration 20s。
4.行为学及相关场电位
4.1行为学观察
4.1.1CNO注射后行为学观察，与PTZ模型比较其死亡率
CNO腹腔注射进行点燃癫痫发作后进行行为学观察，根据Racine评分观察小鼠的癫痫发作情况，记录好癫痫发作级别及发作次数。毕后予以相应统计，结果如图1所示。各实验组的点燃率及发作级别差异不明显：(CaMKIIa-hM3D(Gq)对照组6/10；试验1：1组7/10；试验1：2组7/10；试验1：4组6/10；试验1：6组11/14；试验1：8组9/12。但各实验组癫痫发作次数却有明显的差异，实验1：6组和1：8组优于其它各试验组和对照组1：1组或1：6组，尤其是实验1：6组，3小时内最多达21次，结果见图1。
图1中，(a)图为病毒注射、行为学观察及场电位实验的过程的示意图。(b)图为病毒注射后的荧光图。(c)图为各种不同比例在腹腔注射CNO(2mg/kg)后，与CaMKIIa-hM3D(Gq)组(对照组)比较小鼠的癫痫发作率，其中(CaMKIIa-hM3D(Gq)对照组n＝10，实验组1:1组n＝10，1:2组n＝11，1:4组n＝10，1:6组n＝14，1:8组n＝12，n.s.p>0.05，Fisher’s exacttest)，(d)和(e)为相应的癫痫发作次数和Ranice评分(p>0.05，*p<0.05，**p<0.01，Oen-wayANOVA)。(f)为实验1:6组、1:8组与PTZ模型死亡率的比较(p>0.05，*p<0.05，t检验)。
图1显示不同比例病毒混合物同时兴奋谷氨酸能神经元及GABA能神经元的情况。表1的结果表明：谷氨酸与GABA能神经元在特定的状态下，能诱发出癫痫发作；尤其是少量GABA能神经元兴奋，而此时谷氨酸能神经元也同步处于兴奋状态时，更易诱发癫痫发作。而该模型与传统PTZ模型比较，死亡率较低，约在18％左右，PTZ模型中，腔注射PTZ(24mg/kg)后，死亡率在70％以上。
4.1.2光刺激后行为学观察
依据上述研究结果，本发明人发现单纯兴奋谷氨酸神经元与同时兴奋谷氨酸能神经元和GABA能神经元，癫痫发作次数等存在差异，设想应用光遗传学方法，通过调节不同刺激参数，更精准的调控上述神经元的活动，是否能延长其癫痫发作持续时间，甚至诱发癫痫持续状态。
为此，将混合中的rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA病毒与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA病毒混合后注射到DG和CA3区(每部位200nl)，为对照组。将rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA(简称为
“DIO-hChR2(H134R)-EYFP”)分别与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA(简称为“CaMKII-CRE”)和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA(简称为“VGAT1-CRE”)1:1混合后，再次按1:6((DIO-hChR2(H134R)-EYFP+)：(DIO-hChR2(H134R)-EYFP+CaMKII-CRE))比例混合得到混合病毒，将混合病毒200nl注射到CA3区，作为实验组。病毒感染2周后，予以注射病毒处埋置光纤。第3周后进行蓝光刺激。将频率(20Hz)和占空比(0.2)固定，刺激持续时间固定为持续性。然后通过调节相应刺激参数，观察其点燃率及发作持续时间，结果见图2。
图2显示光遗传学刺激点燃持续时间的特点。其中，a)图为DG+CA3组注射兴奋谷氨酸能神经元光遗传学病毒示意图与相应荧光图。(b)图为CA3注射兴奋GABA能神经元与谷氨酸能神经元光遗传学病毒(1:6)示意图与相应荧光图。(c)图光遗传学点燃癫痫发作的点燃率(1:6组n＝7，发作5只；对照组DG+CA3 n＝8，发作6只)(n.s.p>0.05，Fisher’s exacttest)。(d)图为DG+CA3组光刺激兴奋谷氨酸能神经元，两种不同刺激参数点燃癫痫发作时，癫痫发作的持续时间(n.s.p>0.05，配对t检验)。(e)图为1:6组光刺激兴奋谷氨酸能神经元与GABA能神经元，两种不同刺激参数点燃癫痫发作时，癫痫发作持续的时间(n.s.p>0.05，配对t检验)。
图2的结果表明：在相同刺激条件下，发现对照组和实验组两组癫痫点燃率约在70％左右(图2c)，无明显差异。当把串参数Burst Duration 5s、Burst Interval 0.5s，系列参数Train Delay 0s、Train Duration 20s；两组小鼠抽搐时间均未超过2分钟(Pulse1)。而当将串参数Burst Duration 2s、Burst Interval 2，系列参数Train Delay0s、Train Duration 20s；发现GD+CA3组癫痫发作持续时间无明显差异(图2d)。而1:6组癫痫发作持续时间明显被延长，最长者可持续抽搐达9分钟(Pulse2)(图2e)。表明这两种模型确实存在差异。通过光遗传学方法也进一步证实了1:6组癫痫发作模型比GD+CA3组具有显著的癫痫发作时间更长的效果。
4.2化学遗传学病毒感染第7周行为学观察及场电位实验
于第7周时将上述各组进行再次点燃。结果见图3。图3显示两种病毒不同比例混合后第7周行为学特点。其中，(a)图为第7周各组小鼠的在点燃率(1:1组n＝9，1:2组n＝11，1:4组n＝10，1:6组n＝12，1:8组n＝11，n.s.p>0.05，Fisher’s exact test)。(b)图各比例组第3周与第7周发作次数比较(p>0.05，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，Two-wayANOVA)；(c)图为相应癫痫发作级别(Ranice score)(p>0.05，Two-wayANOVA)。
图3的结果表明：实验1:6组与1:8组的点燃率相对稳定，1:6组更优。各组发作级别无明显差异，虽然各组3小时内发作次数均有所减少，但发作次数在5左右，1:6组发作次数仍明显。这表明GABA能神经元与谷氨酸能神经元在在特定状态下同时激活，对癫痫发作状态存在影响。
予以点燃小鼠进行在体场电位记录，发现CNO注射后，脑电放电形式成连续性，结果见图4。图4显示各对照组和实验组的场电位及频普通，CaMKIIa-hM3D(Gq)对照组(n＝5)，实验组1:1组(n＝3)、1:2组(n＝4)、1:4组(n＝4)、1:6组(n＝5)及1:8组(n＝5)的场电位及频谱图。
图4的结果表明：从场电位及频谱图亦进一步得到证实，GABA能神经元兴奋在癫痫发作过程中确实起到促进作用，并且也可能在癫痫簇集性发作中扮演重要角色。
光遗传学组在光纤埋置第7周再次刺激是无明显差异，故在此不做赘述。
5.两种神经元感染的确认
为了进一步了解单纯的少量GABA能神经元兴奋时，是否存在两种神经元的转染，并且兴奋小剂量GABA能神经元，也能导致癫痫发作，本发明人选择VGAT1-hM3D(Gq)病毒与对照病毒(rAAV-CAMKII-EGFP-WPRE-pA)按1:1及1:6混合(如表2)，然后将混合病毒200nl注射到海马CA3区。病毒感染3周后，予以腹腔注射CNO(2mg/kg)，观察行为学3小时，结果见图5。
图5VGAT1-hM3D(Gq)病毒与CAMKII-EGFP病毒混合感染。其中，(a)图为病毒注射示意图。(b)图为1:1组与1:6组病毒感染荧光图，证实存在两种病毒的感染。(c)图为1:1组(n＝5，发作0只)与1:6组(n＝5，发作1只)癫痫发作点燃率(n.s.p>0.05，Fisher’s exacttest)。
图5结果表明：对照1:1组无癫痫发作(n＝5)，对照1:6组出现一只小鼠癫痫发作(1/5)(图5c)，发作等级4级，发作次数2次；随后多次进行点燃，均为再出现癫痫发作。通过荧光检测进一步证实存在两种病毒的感染，并且有共标现象。如图5所示。证明了两种神经元的同时被感染。
6.反复点燃、长期随访实验
为了进一步验证本发明的癫痫动物模型的可重复性及长时间稳定性。对化学遗传学实验1:6组与1:8组各每隔一周对同一批小鼠进行重复实验，一共进行5次实验。结果见图6。图6显示化学遗传学激活实验1:6组与1:8组长时间点燃随访情况。其中，(a)图为第12周的点燃率(1:6组n＝8,；1:8组n＝6)(n.s.p>0.05，Fisher’s exact test)，(b)图与(c)图分别为相应的发作次数与发作级别(n.s.p>0.05，配对t检验)
图6的结果表明：本发明的癫痫动物模型在第12周再燃率成功率仍然较高，癫痫发作次数与发作级别无明显差异。以上结果表明，同时激活GABA能神经元与谷氨酸能神经元的癫痫发作模型，稳定性较好，尤其是1:6组(如图6b所示)。
Claims (2)
1.一种内源性癫痫发作动物模型的构建方法，包含采用化学遗传学或光遗传学激活病毒注射到小鼠的海马CA3区，表达3周后建成，所述激活病毒选自：
a）rAAV-CaMKIIa-hM3D (Gq)-mCherry-WPREs-pA与
rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA的混合物，和b）rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE –pA与rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA的混合物，
其中，rAAV-CaMKIIa-hM3D (Gq)-mCherry-WPREs-pA和rAAV-VGAT1-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA的体积比为6：1，rAAV-Ef1α-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE–pA）、rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA和AAV-VGAT1-CRE-WPRE-pA的体积比为7：6：1。
2.如权利要求1的癫痫发作动物模型的构建方法，进一步包括采用CNO点燃癫痫发作或光刺激点燃癫痫发作。
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Non-Patent Citations (1)
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Also Published As
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