CN112646840B

CN112646840B - 一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒e2蛋白的方法及应用

Info

Publication number: CN112646840B
Application number: CN202011565641.3A
Authority: CN
Inventors: 陈创夫; 何金科; 邓肖玉; 王勇; 何延华
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112646840A

Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用。将BVDV‑LC株E2基因连接至pFastBac1重组杆状病毒转移载体，在大肠杆菌中通过同源重组获得重组杆状病毒载体rBacmid‑E2，转染Sf9昆虫细胞后获得第一代重组杆状病毒P1，将P1代病毒继续感染Sf9昆虫细胞获得感染能力高的第二代重组杆状病毒P2，再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。将本发明制备的E2蛋白作为诊断抗原和亚单位疫苗，能够表现出更好的优势，可以作为候选抗原进行疫苗和ELISA试剂盒的开发。

Description

一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的一种复杂的，多临床类型的疾病。该病主要以发热、腹泻、粘膜糜烂溃疡、白细胞减少、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、怀孕母牛流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病。我国畜牧业迅速发展的同时，养殖规模和养殖数量在急剧增加，跨地区的贸易也越来越频繁，导致牛、羊发病率不断提高。其中牛病毒性腹泻黏膜病对牛健康和生产危害较大，给养牛业造成了严重的经济损失。目前，防治该病最有效的方法是筛除病牛并对其余牛进行疫苗接种，但常见的商品化疫苗多为灭活苗，需要多次免疫(一免后一个月需要二次免疫)，保护期短(二免后只能保护4个月)、价格昂贵、不能区分自然感染和疫苗免疫。而且，该疾病商品化的诊断试剂盒来自于美国IDEXX公司，价格昂贵，因而不能满足防治BVDV的要求。

杆状病毒-昆虫细胞表达系统由于具有适当的翻译后修饰，而且具有生物安全性等优点，已被广泛用于疫苗和诊断的开发和生产中。目前已有多种杆状病毒-昆虫细胞系统生产的疫苗被投入使用，如人乳头瘤病毒疫苗、人细小病毒HPVB19、猪圆环病毒疫苗、猪瘟病毒E2蛋白疫苗等等。BVDV具有4个结构蛋白，其中E^rns和E2是主要的保护性抗原，能够诱导病毒中和抗体并保护牛免受BVDV攻击，而E^rns蛋白具有独特的RNase活性，可降解单链和双链RNA，对于限制宿主对双链RNA的先天免疫反应至关重要，帮助BVDV逃避先天免疫在其宿主中建立持续感染。

本发明选用E2蛋白，利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统在昆虫细胞内组装成具有良好反应原性的蛋白，进一步地研究该蛋白在疫苗和诊断方面的应用。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法，包括以下步骤：

将BVDV-LC E2基因序列前端添加His标签后，连接至pFastBac1质粒，得到重组转移载体；

将重组转移载体转化至E.coli DH10Bac^TM中，得到重组杆粒；

用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞收获P1代重组杆状病毒；

将P1代病毒继续感染Sf9昆虫细胞获得感染能力高的第二代重组杆状病毒P2；

再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。

进一步地，所述BVDV-LC E2基因序列见SEQ ID NO.1所示。

进一步地，通过同源重组的方法将重组转移载体转化至E.coli DH10Bac^TM中。

进一步地，Sf9昆虫细胞的培养条件为27℃。

本发明还披露了利用上述的方法制备的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。

本发明还披露了如上述的E2蛋白在制备用于牛病毒性腹泻的疫苗或制剂中的应用。

本发明还披露了如上述的E2蛋白在制备BVDV ELISA检测试剂盒中的应用。

本发明还披露了如上述的E2蛋白在非诊断目的的E2蛋白间接ELISA检测方法中的应用。

进一步地，所述间接ELISA检测方法中，E2蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL，一抗最佳稀释浓度为1:50，二抗最佳稀释浓度为1:4000；E2蛋白最佳包被条件为4℃过夜包被；最佳封闭液为5％的脱脂奶粉；最佳反应时间为60min；二抗的最佳反应时间也是60min；底物最佳作用时间为10min。

本发明提供一种His标签牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的制备方法以及在疫苗、诊断方面的用途，属于兽用生物制品技术领域。将BVDV-LC株E2基因添加His标签序列后连接至pFastBac1重组杆状病毒转移载体，在大肠杆菌DH10Bac^TM中通过同源重组获得重组杆状病毒载体rBacmid-E2，转染Sf9昆虫细胞后获得第一代重组杆状病毒P1，将P1代病毒继续感染Sf9昆虫细胞获得感染能力高的第二代重组杆状病毒P2，再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1.本发明利用杆菌病毒-昆虫细胞表达系统成功构建pFB-E2重组转移载体和rBacmid-E2重组杆粒。

2.本发明利用rBacmid-E2重组杆粒经转染Sf9昆虫细胞，成功获得P1代和P2代重组杆状病毒。

3.本发明构建的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞内成功组装E2蛋白，经过电镜观察发现纯化出的E2蛋白呈颗粒状，具有与天然病毒抗原相似的形态。

4.本发明纯化后的E2蛋白能与BVDV阳性血清发生强烈的特异性反应。

5.本发明构建的E2蛋白免疫小鼠后，能够产生高水平的特异性抗体，与商品化的疫苗相比，对小鼠的免疫效果更好。

6.本发明构建的E2蛋白在小鼠模型上能够产生高水平的中和抗体，甚至略高于商品化的疫苗。

7.在ConA刺激下，本发明构建的E2蛋白对小鼠淋巴细胞的增殖水平极显著升高。在BVDV病毒的刺激下，E2蛋白对小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平显著高于商品化疫苗。

8.本发明利用纯化出的E2蛋白颗粒，建立E2蛋白间接ELISA检测方法，利用棋盘法筛选出E2蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL，一抗最佳稀释浓度为1:50，二抗最佳稀释浓度为1:4000。

9.本发明筛选出E2蛋白间接ELISA检测方法的最佳条件为4℃过夜包被、5％脱脂奶粉封闭，一抗、二抗最佳孵育时间为60min，底物最佳显色时间为10min。

10.本发明利用56份阴性血清确定阳性临界值为0.296，利用240份临床血清样本确定样本符合率为89.58％。

11.本发明构建的E2蛋白间接ELISA检测方法可重复性好、特异性强、敏感性高，可作为BVDV ELISA检测试剂盒的优先抗原。

本发明所获的E2蛋白可用His标签的镍柱直接纯化，不需要繁琐的蔗糖密度梯度离心，可用于大规模的生产。而且纯化出的E2蛋白呈颗粒状，具有与天然病毒抗原相似的形态，能够更好的与佐剂结合。将本发明制备的E2蛋白作为亚单位疫苗，能刺激小鼠产生高水平的特异性抗体，对BVDV病毒具有良好的中和活性，淋巴细胞的增殖水平也显著提高，而且具有纯化速度快、免疫原性强、安全性高等优点，能够区分疫苗免疫和自然感染,可以作为候选疫苗进行进一步的研究。将本发明制备的E2蛋白作为诊断抗原，在检测牛血清中的抗体时，具有特异性强、重复性好、灵敏度高、操作方便，不需要专门的培训人员等优点，可以作为候选抗原进行ELISA试剂盒的开发。

附图说明

图1是pFastBac 1质粒图谱；

图2是重组转移载体的双酶切图；1：质粒；2：用Xho I和Kpn I双酶切的质粒；M：DNA标记；

图3是重组rBacmid-E2杆粒PCR鉴定图；M：DL5000 Marker；1～6：白色菌落；+：蓝色菌落；-：阴性对照；

图4是rBacmid-E2重组杆粒转染Sf9细胞(200×)；A：正常细胞；B：rBacmid-E2重组杆粒的转染后的细胞；

图5是P1病毒Western Blot检测结果；M：Pre-stained Protein Ladder；-：阴性对照(Sf9细胞)；1-2：上清(培养基)；3-4：沉淀(胞体)；+：阳性对照；

图6是P2病毒检测结果；M：Pre-stained Protein Ladder；1：沉淀；2：上清；-：阴性对照；+：阳性对照；

图7是空斑法测定病毒滴度；NC：空白对照；10^-4-10^-8：P2代病毒稀释倍数

图8是间接免疫荧光检测E2蛋白在Sf9细胞的表达(100×)；A：P2病毒感染的细胞；B：P2病毒感染后FITC标记的细胞；

图9是E2蛋白的纯化结果；M：蛋白Marker；1：纯化后的E2蛋白；

图10是E2 Western Blot检测图；1-2：E2蛋白与BVDV阳性血清的Western Blot结果；M：蛋白Marker；

图11是透射电镜观察；A：重组杆状病毒的透射电镜图；B：E2蛋白的透射电镜图；

图12是E2蛋白免疫小鼠后产生的抗体水平；

图13是免疫后小鼠抗体中和活性的检测；A：一免14天后小鼠抗体的中和活性；B：二免14天后小鼠抗体的中和活性；

图14是用MTT试验检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应(*:p<0.05；**:p<0.01)；

图15是最佳包被条件的确定；

图16是最佳封闭液的确定；

图17是血清和二抗最佳孵育时间的确定；

图18是底物最佳孵育时间的确定；

图19是敏感性试验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用，本发明技术的关键点，利用杆状病毒表达系统包装出与天然病毒抗原相似形态的BVDVE2蛋白，并且克服以往密度梯度离心的繁琐过程，直接用His标签的镍柱进行大量纯化，发现纯化出的E2蛋白在疫苗和诊断当中具有很好的效果。

本发明涉及的细胞和质粒：质粒pFastBac 1、感受态细胞DH10Bac^TM、转染试剂Cellfectin^TMII Reagent购自美国Invitrogen公司，Sf9细胞、Grace's Insect Medium、无血清Sf-900^TMII SFM细胞培养基购自美国Thermo Fisher公司。

本发明涉及的主要试剂和仪器：病毒RNA提取试剂盒、cDNA反转录试剂盒、限制性内切酶Xho I和Kpn I、T4 DNA连接酶、pMD19-T载体、胶回收试剂盒购自Takara宝生物工程(大连)有限公司；His标签可溶性蛋白纯化试剂盒、质粒大提试剂盒购自北京康为世纪；0.45μm NC膜购自北京索莱宝公司；兔抗His标签抗体、HRP标记的羊抗兔IgG购自北京Bioss公司；抗E2蛋白的单克隆抗体、FITC标记的山羊抗兔IgG、购自美国Abcam公司；蛋白Marker、ECL显色液、BCA蛋白定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；200目碳膜购自中镜科仪公司；山羊抗鼠IgG(HRP标记)购自北京Bioss公司；TMB单组分显色液、MTT淋巴细胞增殖检测试剂盒购自北京索莱宝公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司。

本发明的实验过程具体如下实施例所示。

实施例1利用杆状病毒表达系统制备E2蛋白

1、密码子优化及目的基因的合成

从NCBI GenBank数据库获得BVDV-LC E2蛋白序列(MK102095.1)，在序列的前端加入His标签蛋白序列，进行密码子优化，使其适应昆虫细胞表达。将优化后的序列上游加入Xho I酶切位点，在下游加入Kpn I酶切位点，送往上海生工生物工程有限公司进行合成，并连接至pMD19-T载体，命名为E2-T克隆载体。本申请优化后的加His标签的E2蛋白序列的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示，蛋白质序列见SEQ ID NO.2所示。

2、pFB-E2重组转移载体的构建及鉴定

用质粒小提试剂盒提取E2-T重组质粒，用Xho I和Kpn I进行双酶切，同时用Xho I和Kpn I双酶切pFastBac1质粒(图1)，酶切完成后胶回收，用T4连接酶在16℃的水浴过夜连接，次日转化至E.coli DH5α感受态细胞构建重组转移载体，双酶切和测序验证都正确的命名为pFB-E2。双酶切体系20μL：质粒10μL，ddH₂0 6μL，buffer 2μL，Xho I和Kpn I分别为1μL，酶切条件：37℃、4h。

用Xho I和Kpn I双酶切pFB-E2质粒，与对照质粒相比，酶切出大小约为5238bp和1059bp的条带(图2)，与预期结果一致，表明成功构建pFB-E2重组转移载体。

3、rBacmid-E2重组杆粒的获得及鉴定

提取pFB-E2质粒，转化至E.coli DH10Bac^TM感受态细胞，涂三抗(50μg/mLKanamycin、7μg/mL Gentamicin、10μg/mL Tetracycline)和显色(100μg/mL X-gal、40μg/mL IPTG)平板后37℃倒置培养过夜。次日，挑取白色菌落，选取白色菌落分别接种于20mL三抗LB培养基中，37℃180rpm培养过夜。小量抽取质粒，用引物pFastbac-F和pFastBac-R验证质粒正确性，阳性命名rBacmid-E2。PCR反应体系25μL：ddH₂O 9.7μL，Mix 12.5μL，模板2μL，上下游引物各0.4μL；PCR反应条件：预变性95℃5min；变性94℃40s，退火56℃30s，延伸72℃400s；再延伸72℃10min。

5'引物pFastbac-F:TATTCCGGATTATTCATACC，SEQ ID NO.3；

3'引物pFastBac-R:ACAAATGTGGTATGGCTGA，SEQ ID NO.4。

提取rBacmid-E2质粒，用pFastbac 1通用引物进行PCR鉴定，结果显示，挑取的白色菌落都出现条带(图3)，与预期结果一致，表明成功构建rBacmid-E2重组杆粒。

4、rBacmid-E2重组杆粒转染Sf9细胞并收获P1代重组杆状病毒

取2mL密度为8×10⁵/mL的Sf9细胞接种至六孔板中，27℃静置使细胞贴壁。将1.5mL Grace's Insect Medium(含有10％FBS、不含抗生素)和8.5mL Grace's InsectMedium(不含FBS、不含抗生素)混合，制备10mL转染培养基，待细胞贴壁后取出六孔板中的培养基，用2mL的转染培养基更换。取100μL Grace's培养基，加入8μL的Cellfectin^TMII转染试剂，再取100μL Grace's培养基，加入3μg的rBacmid-E2质粒，短暂涡旋混合。将100μL稀释的rBacmid-E2质粒和100μL稀释的Cellfectin^TMII Reagent混合，在室温下孵育30分钟。将质粒-脂质体混合物逐滴添加到细胞上，在27℃孵育5h后，缓慢弃去传染试剂并用2mL Sf-900^TMII SFM替换。将细胞在27℃静置培养约4～7天，待细胞出现病毒感染迹象，培养基和细胞分别制电泳样，利用His标签的抗体进行Western Blot，检测E2蛋白表达情况。将剩余培养基转移至2ml离心管中作为P1代病毒，4℃避光保存。

转染后的细胞约在4天出现病毒感染迹象(图4)，此时收获上清和细胞进行Western Blot检测，结果显示，在细胞上清和沉淀都出现蛋白大小约为45kDa的条带(图5)，表明成功获得P1代重组杆状病毒病毒，并且E2蛋白主要在细胞内表达。

5、P2代重组杆状病毒扩增及病毒滴度的测定

取8mL密度为2×10⁶cells/mL的Sf9细胞接种至T25 cm²的细胞培养瓶中，再向培养瓶中加入800μL的P1病毒，27℃培养3天，将培养基转移至15ml离心管中作为P2代病毒，4℃避光保存。P2代病毒滴度的测定：将5×10⁵cells/mL Sf9细胞分配至六孔板中，在27℃培养箱孵育1小时。将4％低熔点琼脂糖置于70℃水浴中，将1.3X Sf-900培养基置于37℃水浴中，待低熔点琼脂糖液化后将二者混合配置成上层琼脂，置于37℃水浴中备用。将P2代病毒按照10^-1至10^-8连续稀释，待Sf9细胞贴壁后缓慢弃去6孔板上清液，立即用1mL相应的病毒稀释液替换，在27℃培养箱孵育1h后，从6孔板中除去病毒接种物并用2mL配置的上层琼脂替换。让凝胶硬化20min后将6孔板在27℃的培养箱中孵育4-10天，每天监测平板，当斑块数连续2天没有变化，加1mL中性红，室温孵育2h后计数噬菌斑。P2代病毒滴度的计算公式为：病毒滴度(pfu/mL)＝1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积。

将P1病毒按照1:10的比例接种至Sf9细胞，结果显示，成功获得P2病毒(图6)。空斑计数的最佳范围是6孔板的每孔3至20个噬菌斑，在10^-7时噬菌斑数量为12个，最终测定P2代重组杆状病毒滴度为6×10⁷pfu/mL(图7)。

6、间接免疫荧光检测E2蛋白的表达

在无菌条件下，将2mL的Sf9细胞(1×10⁶/孔)接种至6孔板中，在室温下孵育1h，让细胞贴至6孔板底部，加入MOI＝10的P2病毒，同时设立阴性对照，27℃培养箱孵育72h。弃上清，加入200μL 80％冷丙酮，室温固定45min(或-20℃固定6h)，弃去丙酮，PBST洗三次，加入1:1000E2蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h，PBST洗三次，再加入1:5000FITC标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育1h，PBST洗三次，用碳酸盐缓冲液稀释的80％甘油封片，倒置荧光显微镜下观察拍照。

收取P2病毒感染的细胞，利用E2蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光，与对照组相比，实验组出现明显的绿色荧光(图8)，表明重组杆状病毒成功表达E2蛋白。

7、P2代重组病毒扩大培养及E2蛋白的纯化

取40mL密度为2×10⁶cells/mL的SF9细胞接种至T 25cm²细胞培养瓶中，再向培养瓶中加400μL P2病毒放大表达，27℃培养3天。将培养物12000rpm离心10min，上清用His标签的Ni柱进行纯化。利用SDS-PAGE与Western Blot检测纯化情况。

将P2病毒扩大培养并纯化，结果显示，成功获得大小约为45kDa的E2蛋白(图9)。利用BVDV的抗体阳性血清为一抗，兔抗牛IgG为二抗，进行Western Blot检测，结果显示，纯化后的E2蛋白能够与BVDV阳性血清发生反应(图10)。

8、E2蛋白的电镜观察

取三张铺有碳膜的铜网，用细滴管吸取浓缩的病毒液，滴在碳膜加强的载网上，形成一滴小液珠，2-5min后用小滤纸条吸除多余的液体。用细滴管加一滴3％磷钨酸负染液至载网上,2-5min后用小滤纸条从液滴边上吸除多余的染液，放在红外灯下烤30min，在透射电镜下进行观察。

BVDV E2蛋白在Bac to Bac杆状病毒表达系统经过Sf9昆虫细胞包装后具有正常的结构和功能，电镜结果显示，rBacmid-E2重组杆粒成功组装成重组杆状病毒(图11A)，分泌的E2蛋白组装成类似于颗粒样结构(图11B)。

实施例2E2蛋白应用性能检测

1、实验动物的免疫

将BALB/c小鼠随机分成3组(PBS组、E2蛋白+佐剂组、商品化疫苗组)，每组6只，免疫前3天收集血清作为空白对照。将E2蛋白与弗氏佐剂1:1混合组装成亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠，首免后隔两周加强免疫一次，首次免疫的佐剂为弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，进行皮下注射，具体免疫剂量如(表1)所示。

表1小鼠免疫方案设计

2、免疫小鼠IgG特异性抗体的检测

免疫后第7、14、21、28、35、42天进行尾静脉采集血液，37℃放置1h，3000rpm离心5min，分离出上层血清，用E2蛋白的间接ELISA方法检测小鼠的特异性抗体。计算结果用SPSS Statistics 25统计软件进行单因素方差分析。

为了研究病毒样颗粒能否在小鼠的在体内诱导特异性抗体水平，用E2蛋白间接ELASA方法进行检测，结果显示在实验的过程中，PBS对照组小鼠抗体水平始终低于cut off值(OD450 nm<0.296)，E2蛋白在一免后的14天内抗体水平持续上升，加强免疫后，抗体水平上升的速度更快、升高。而且与商品化的疫苗相比，对小鼠的免疫效果更好(图12)。

3、免疫小鼠中和抗体的检测

将石河子大学人兽共患病实验室-80℃冰箱保存的BVDV-LC病毒取出，测定其滴度，并稀释至200TCID₅₀/0.1mL。将一免后14天和二免后14天的小鼠血清在56℃水浴中灭活30min，用DMEM培养液按照1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1：256比例稀释。将稀释后的血清与BVDV病毒按照1:1比例混匀形成血清病毒混合液，置于37℃培养箱中孵育1h。将2×10⁵cells/mL的MDBK细胞按照每孔100μL接种于96孔细胞培养板，在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。待细胞融合率约为70-80％，每孔加入100μL的血清病毒混合液，同时设立阴性对照(加入阴性血清和100TCID50病毒混合液)、阳性对照(加入阳性血清和100TCID50病毒混合液)、正常细胞对照，每个样做3个平行。培养72h后弃上清，PBS洗2次，4％多聚甲醛室温固定15min，PBS洗2次，以BVDV阳性血清(1:50稀释)为一抗，每孔加入50μL，37℃培养箱孵育2h，PBST洗3次，以FITC标记的兔抗牛IgG为二抗(1:500稀释)，每孔中加入50μL，37℃培养箱孵育1h，PBST洗3次，在每孔中加入30μL甘油生理盐水，倒置荧光显微镜下观察结果。小鼠血清抗体中和活性计算公式为：中和抗体活性＝(对照组绿色荧光细胞数-试验组绿色荧光细胞数)/对照组绿色荧光细胞数×100％。

结果判定：对照组全部出现荧光斑点，表示实验成立。若有部分荧光斑点出现，则判定病毒没有被完全中和，若无荧光斑点出现，则判定病毒被完全中和。

病毒-血清中和试验结果显示，一免后14天，PBS对照组血清未检测到中和活性，实验组血清从1：2²到1：2⁸比例稀释时，E2+Freund组的中和活性与商品化疫苗组差距不显著(图13A)。二免后14天，E2+Freund从1：2⁴开始时中和活性要高于商品化疫苗组，血清在1：2⁵比例稀释时E2+Freund中和活性仍为100％，甚至在1：2⁸比例稀释时，仍具有20％的中和活性(图13B)。结果表明，E2蛋白在小鼠模型上能够产生高水平的中和抗体，具有很好的免疫原性。

4、淋巴细胞增值实验

按照天津灏洋生物制品公司的淋巴细胞分离说明书分离小鼠脾脏的淋巴细胞，将分离的淋巴细胞进行计数和台盼蓝染色，用含10％FBS的RMPI 1640细胞培养液重悬后置于细胞培养板，在37℃、5％的CO₂培养箱中进行培养。收集生长至对数期的淋巴细胞，调整细胞悬液浓度为1×10⁵cells/孔，按照180μL/孔置于96孔板。加入受试化合物，设立Con A刺激组(5μg)，BVDV病毒刺激组(10μg)，每组设定5复孔，同时设置调零孔(RPMI 1640培养基、MTT、Formazan溶解液)，对照孔(淋巴细胞、RPMI 1640培养液、MTT、Formazan溶解液)，每组设定3重复孔。在37℃、5％CO₂温箱中培养48h后加入10μL MTT溶液。培养4h后吸弃上清，每孔加入110μL的Formazan溶解液，置与摇床上低速振荡10min使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm处测量所有孔的吸光值并计算SI值，SI＝样品组/对照组。

MTT检测结果显示，小鼠淋巴细胞经conA刺激后，E2+Freund组淋巴细胞增殖水平极显著高于PBS对照组(p<0.01)(图14)。小鼠淋巴细胞经BVDV病毒刺激后，E2+Freund淋巴细胞增殖水平极显著高于PBS对照组(p<0.01)，甚至显著高于商品化疫苗(p<0.05)(图14)。结果表明，E2蛋白能够诱导机体产生高水平的特异性细胞免疫反应。

实施例3E2蛋白间接ELISA检测方法的建立

1、E2蛋白间接ELISA检测方法的初步建立

用纯化后的E2蛋白进行包被，包被蛋白浓度为1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL；封闭用5％的脱脂奶粉，37℃封闭2h；一抗用BVDV阳性血清和阳性血清，稀释比例为1:50、1:100、1:200、1:400，37℃孵育1h；二抗用兔抗牛的IgG(HRP标记)，稀释比例为1:4000、1:8000、1:16000，37℃孵育30min，一抗和二抗均用PBST稀释，初步确定出E2蛋白最佳包被浓度以及一抗二抗最佳稀释浓度。

用棋盘法筛选E2蛋白的最佳包被浓度、最佳一抗稀释浓度、最佳二抗稀释浓度，P/N结果显示，E2蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL，一抗最佳稀释浓度为1:50，二抗最佳稀释浓度为1:4000(表2)。

表2棋盘法筛选E2蛋白ELISA最佳条件

2、包被条件的确定

选用3种条件(4℃过夜、37℃2h和37℃2h+4℃过夜)包被E2蛋白，用标准的BVDV阳性血清和阴性血清进行ELISA试验，每个样品至少重复3次，在450nm处测定吸光值后利用P/N值确定最佳包被条件。

P/N值最大为最优条件，因此，E2蛋白最佳包被条件为4℃过夜包被(图15)。

3、封闭液的选择

E2蛋白包被至ELISA板后，选用5％的脱脂奶粉、2％的BSA和2％的明胶，每孔加入200μL，37℃封闭2h，利用P/N值确定最佳封闭条件。

最佳封闭液为5％的脱脂奶粉(图16)。

4、一抗最佳孵育时间的确定

封闭后的ELISA包被板分为三组，将BVDV阳性血清和阴性血清按照1:50稀释，每孔加入100μL，在37℃分别孵育30、60、90min，每组至少3个重复，在450nm处测定吸光值后利用P/N值确定一抗最佳孵育时间。

P/N值最大为最优条件，因此待检血清最佳反应时间为60min(图17)。

5、二抗最佳孵育时间的确定

一抗孵育完成后，将HRP标记的兔抗牛IgG按照1:4000稀释，每孔加入100μL，在37℃分别孵育30、60、90min，每组至少3个重复，在450nm处测定吸光值后利用P/N值确定二抗最佳孵育时间。

二抗的最佳反应时间也是60min(图17)。

6、底物最佳孵育时间的确定

二抗孵育完成后，每孔加入100μL的TMB单组分显色液，在37℃分别避光孵育5、10、15min，之后每孔加入50μL终止液，在450nm处测定吸光值后利用P/N值确定孵育最佳孵育时间。

底物最佳作用时间为10min(图18)。

7、间接ELISA方法阴、阳性血清临界值的确定

用56份BVDV阴性血清计算ELISA检测方法的临界值，计算公式：阳性临界值＝56份阴性血清的OD₄₅₀平均值+3×标准差，阴性临界值＝56份阴性血清的OD₄₅₀平均值+2×标准差。

56份BVDV阴性血清样品OD₄₅₀的平均值为0.218，标准差为0.026，样品的阳性临界值为0.296，样品的阴性临界值为0.270。因此，检测血清样品的OD₄₅₀≥0.296为阳性，OD₄₅₀＜0.270为阴性。

8、间接ELISA方法的特异性试验

分别将牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感Ⅲ型病毒(BPIV-3)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清以及牛病毒性腹泻病毒阳性、阴性血清按照1:50倍稀释后，每孔加入100μL，每个样品至少三个重复，判定E2间接ELISA检测方法与常见的牛疾病有无交叉反应。

利用E2蛋白间接ELISA检测BRV、BCV、BPIV-3及IBRV阳性血清，结果显示均为阴性(表3)，表明E2蛋白间接ELISA检测方法在检测BVDV阳性血清时，不会与牛常见病毒性疾病的血清发生交叉反应。

表3特异性试验结果

9、间接ELISA方法的敏感性试验

将BVDV阳性血清按照九个梯度稀释(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600和1:51200)，采用本研究建立的BVDV E2 ELISA抗体检测方法，每个样品至少三个重复，分别记录450nm处测量的吸光值，判定最低的抗体检出效价，确定E2蛋白间接ELISA检测方法的灵敏度。

当BVDV阳性血清稀释比例为1:12 800时，OD₄₅₀仍大于0.296，呈阳性反应，表明本研究建立的E2蛋白间接ELISA检测方法的灵敏度为1:12800(图19)。

10、间接ELISA方法的重复性试验

用同一批次和3批不同批次纯化的E2蛋白制备ELISA包被板，分别取4份BVDV强阳性、弱阳性和阴性血清进行检测，按照本研究建立的E2蛋白间接ELISA方法进行测定，每个样品重复3次，根据450nm处测量的吸光值进行统计学分析，分别判定E2蛋白在批内重复性和不同批次间的可重复性。

同一批次和不同批次的ELISA结果显示，批内重复性的变异系数为3.1％-7.4％，批间重复性的变异系数为2.5％-9.2％(表4)，均小于10％，表明E2蛋白间接ELISA具有良好的可重复性。

表4重复性检测结果

11、临床样本的初步检测

按照上述建立的E2蛋白ELISA检测方法，检测240份BVDV血清，与商品化的试剂盒(美国IDEXX公司)做比较，判定符合率。

E2蛋白间接ELISA结果显示，在240份血清检测中阳性血清173份，阴性血清67份。IDEXX试剂盒检测结果显示，1240份血清检测中阳性血清198份，阴性血清42份(表5)。与IDEXX结果相比，共检出173份阳性血清，42份阴性血清，符合率为(173+42)÷240×100％＝89.58％。

表5E2蛋白ELISA临床样本的检测

统计分析：计算结果用SPSS Statistics 25软件进行单因素方差分析，抗体水平检测、抗体中和活性的检测、小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平检测图像均用GraphPad Prism 7绘制。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1059

<212> DNA

<213> Bovine viral diarrhea virus

<400> 1

atggtaagcg ctattgtttt atatgtgctt ttggcggcgg cggcgcattc tgcctttgcg 60

atccccgaat gcagatcgga ctggtcatac gcaatagccc gttcagaaaa aatcggtcca 120

ctgggagctg aggagctgac cacccaatgg tacgattatt ctgaaggtat gaggttgaag 180

gacgctatgg tagaggtttg gtgcacgaac ggtaaagtca aattcctgaa gaagtgtgcc 240

cgtgaggccc gttacctggc tgccttgcat accagagctt tgcccaccag cgtcgtgttc 300

aagcaacttc tctctggaca gaagttggcc gataatatcg acatggaaga caacttcgag 360

ttcggtttgt gtccatgcga tgcccgtccc gtcgtgaaag gtaagtttaa caccaccctg 420

ctgaacggcc ctgcgttcca aatggtctgc cccatcggat ggacgggttc agtggagtgc 480

acactggtta acaaggacac tctgcgtacc gcggttgtgc gcacctacaa acgtgccaag 540

cctttccccc gtcgccaagg ctgtgccaca cagaaactgg taggagagga cctctacgat 600

tgcatgttgg gcggcaactg gacatgcatt actggcgatc aggtcaaata cgcaggcggt 660

gaggtcaaga catgtaaatg gtgcggttac aactttcaag gaagcaaggg tttgccgcat 720

tacccgattg gaaagtgtaa gctcggcaac gagactggat acaggctggt cgacgaaacc 780

ccatgcaatc gcgacggcgt ggccatagtc ccccatggta aggtcaagtg taagataggt 840

gacaccgtcg ttcaggtgat tgcaatggac actaagctgg gcccaatgcc atgcacgcca 900

tatgagatca tcccatccga gggcccggtt gaaaagaccg catgcacctt caactacaca 960

aagaccctga aaaacaagca cttcgagcct agggattcat acttccagca gtacatgctg 1020

aagggagaat accagtactg gtttgacctg gacgctatc 1059

<210> 2

<211> 353

<212> PRT

<213> Bovine viral diarrhea virus

<400> 2

Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ala Ile Pro Glu Cys Arg Ser Asp Trp Ser Tyr Ala Ile

20 25 30

Ala Arg Ser Glu Lys Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Glu Leu Thr Thr

35 40 45

Gln Trp Tyr Asp Tyr Ser Glu Gly Met Arg Leu Lys Asp Ala Met Val

50 55 60

Glu Val Trp Cys Thr Asn Gly Lys Val Lys Phe Leu Lys Lys Cys Ala

65 70 75 80

Arg Glu Ala Arg Tyr Leu Ala Ala Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr

85 90 95

Ser Val Val Phe Lys Gln Leu Leu Ser Gly Gln Lys Leu Ala Asp Asn

100 105 110

Ile Asp Met Glu Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala

115 120 125

Arg Pro Val Val Lys Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro

130 135 140

Ala Phe Gln Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Ser Val Glu Cys

145 150 155 160

Thr Leu Val Asn Lys Asp Thr Leu Arg Thr Ala Val Val Arg Thr Tyr

165 170 175

Lys Arg Ala Lys Pro Phe Pro Arg Arg Gln Gly Cys Ala Thr Gln Lys

180 185 190

Leu Val Gly Glu Asp Leu Tyr Asp Cys Met Leu Gly Gly Asn Trp Thr

195 200 205

Cys Ile Thr Gly Asp Gln Val Lys Tyr Ala Gly Gly Glu Val Lys Thr

210 215 220

Cys Lys Trp Cys Gly Tyr Asn Phe Gln Gly Ser Lys Gly Leu Pro His

225 230 235 240

Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Lys Leu Gly Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu

245 250 255

Val Asp Glu Thr Pro Cys Asn Arg Asp Gly Val Ala Ile Val Pro His

260 265 270

Gly Lys Val Lys Cys Lys Ile Gly Asp Thr Val Val Gln Val Ile Ala

275 280 285

Met Asp Thr Lys Leu Gly Pro Met Pro Cys Thr Pro Tyr Glu Ile Ile

290 295 300

Pro Ser Glu Gly Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr

305 310 315 320

Lys Thr Leu Lys Asn Lys His Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln

325 330 335

Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Ala

340 345 350

Ile

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tattccggat tattcatacc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acaaatgtgg tatggctga 19

Claims

1.一种杆状病毒表达系统制备牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将BVDV-LC E2基因序列前端添加His标签后，连接至pFastBac1质粒，得到重组转移载体；所述BVDV-LC E2基因序列见SEQ ID NO.1所示；

通过同源重组的方法将重组转移载体转化至E.coli DH10Bac^TM中，得到重组杆粒；

用重组杆粒转染Sf9昆虫细胞收获P1代重组杆状病毒；Sf9昆虫细胞的培养条件为27℃；

再将P2代病毒扩大培养后纯化得到E2蛋白。

2.利用权利要求1所述的方法制备的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白在非诊断目的的E2蛋白间接ELISA检测方法中的应用；所述间接ELISA检测方法中，E2蛋白的最佳包被浓度为5μg/mL，一抗最佳稀释浓度为1:50，二抗最佳稀释浓度为1:4000；E2蛋白最佳包被条件为4℃过夜包被；最佳封闭液为5％的脱脂奶粉；最佳反应时间为60min；二抗的最佳反应时间也是60min；底物最佳作用时间为10min。