CN112626151A - 一种提高木质纤维素降解的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高木质纤维素降解的方法及应用，属于酶催化和废弃物资源化利用技术领域。本发明通过研究意外发现，在木质纤维素降解过程中，通过添加强聚电解质——聚二甲基二烯丙基氯化铵polyDADMAC，提高了木质纤维素酶的活性，从而提高对木质纤维素降解效率，增加了可溶性糖的释放，特别是，提高了纤维二糖水解酶Cel7A对木质纤维素的降解，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于酶催化和废弃物资源化利用技术领域，具体涉及一种提高木质纤维素降解的方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
纤维二糖水解酶Cel7A是水解木质纤维素的酶系组成中的一种最为重要的酶，其组分占到纤维素酶系的30％-70％。为此，提高Cel7A的水解活性对于提高木质纤维素降解活性非常重要。但是木质纤维素的成分较为复杂，其主要由纤维素，半纤维素和木质素等三大组分组成。木质素组分的存在会大大抑制纤维素酶Cel7A的水解活性，为此，探究出Cel7A的协同因子可以更好的解决Cel7A的抑制，提高木质纤维素的酶解活性。
目前，研究人员多数使用非离子型表面活性剂，比如Tweens，PEGs等，作为纤维素酶的协同因子，通过覆盖木质素表面的结合位点，从而减少纤维素酶的非产出性吸附。但是，更为有限的协同因子需要进一步的探究。
我国目前存在大量的秸秆资源，木质纤维素储备量丰富，期待更为绿色有效的生物转化，但是纤维素酶的生产成本以及有效的降解活性严重地束缚“绿色制造”行业的发展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种提高木质纤维素降解的方法及应用。本发明通过研究意外发现，在木质纤维素降解过程中，通过添加强聚电解质——聚二甲基二烯丙基氯化铵polyDADMAC，提高了木质纤维素酶的活性，从而提高对木质纤维素降解效率，增加了可溶性糖的释放，特别是，提高了纤维二糖水解酶Cel7A对木质纤维素的降解，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供强聚电解质在木质纤维素降解酶降解木质纤维素中的应用。
经研究发现，通过添加强聚电解质，能够显著提高木质纤维素降解酶对木质纤维素的降解效率，增加可溶性糖的释放，因此所述应用具体为强聚电解质在提高木质纤维素降解酶降解活性和/或提高木质纤维素降解酶降解木质纤维素效率中的应用。
本发明的第二个方面，提供一种提高木质纤维素降解的方法，所述方法包括：在利用木质纤维素降解酶催化降解木质纤维素过程中，添加强聚电解质。
其中，所述木质纤维素降解酶包括纤维二糖水解酶Cel7A。
所述强聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵polyDADMAC。
本发明的第三个方面，提供上述方法在秸秆资源化利用中的应用。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供一种提高木质纤维素降解的方法，在木质纤维素降解过程中，通过添加强聚电解质——聚二甲基二烯丙基氯化铵polyDADMAC，能够有效提高木质纤维素酶的活性，木质纤维素的降解效率，增加了可溶性糖的释放，提高了纤维二糖水解酶Cel7A对木质纤维素的降解，从而有利于对废弃秸秆的资源化利用，具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供强聚电解质在木质纤维素降解酶降解木质纤维素中的应用。
经研究发现，通过添加强聚电解质，能够显著提高木质纤维素降解酶对木质纤维素的降解效率，增加可溶性糖的释放，因此所述应用具体为强聚电解质在提高木质纤维素降解酶降解活性和/或提高木质纤维素降解酶降解木质纤维素效率中的应用。
本发明的一个或多个具体实施方式中，电解质包括①聚酸类：电离后成为阴离子高分子，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸(b)、聚苯乙烯磺酸(c)、聚乙烯磺酸(d)、聚乙烯磷酸(e)等；②聚碱类:电离后成为阳离子高分子，如聚乙烯亚胺CH2-CH2-NH、聚乙烯胺(f)、聚乙烯吡啶(g)等。此外，还有无机类的聚磷酸盐(h)、聚硅酸盐(i)和天然的核酸、蛋白质。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述强聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵polyDADMAC。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述木质纤维素降解酶包括纤维二糖水解酶Cel7A。
本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种提高木质纤维素降解的方法，所述方法包括：在利用木质纤维素降解酶催化降解木质纤维素过程中，添加强聚电解质。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述木质纤维素降解酶包括纤维二糖水解酶Cel7A。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述强聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵polyDADMAC。
本发明的一个或多个具体实施方式中，所述方法中控制催化条件包括：
催化反应温度控制为30～50℃，pH为4-7，通过控制反应温度和pH，有利于催化反应的加速进行。
催化反应体系可以为柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，或磷酸盐缓冲液中的任意一种，控制浓度为10～50mM。
所述强聚电解质在混合体系中的浓度控制为0.1～5％，优选为0.1～1％。
本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述方法在秸秆资源化利用中的应用。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
一、纤维素酶Cel7A的表达和纯化
1)划线接种产纤维素酶菌株于麸皮平板培养基中，30℃倒置培养约5-7天至其生孢。取一定量的含有菌体的琼脂块接种于100ml丝状真菌种子培养基中，30℃振荡培养(200rpm)48小时。用剪头的5ml枪尖吸取20ml种子培养基接种于200ml产酶培养基中，30℃振荡培养7天。离心产酶培养的菌液，收集上清液。
2)收集后的酶液用浓缩管浓缩，4℃条件下5000g离心，直至将酶液浓缩至约3ml。吸取浓缩后的酶液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min去除不溶物。吸取上清酶液于1.5ml离心管中，至于冰上备用。提前用50mM的Tris-HCL缓冲液冲洗分子筛S-400，冲洗约2倍柱体积(240ml)的缓冲液。用2.5ml注射器取2ml浓缩酶液上样。收集洗脱峰蛋白，得到Cel7A酶液，备用。
二、表面活性剂溶液的配制
在50mM的柠檬酸缓冲液中分别配置1％的Tweens，PEGs和polyDADMAC，反应体系的最终浓度为0.1％(w/v)。
三、以微晶纤维素和木质素为底物进行酶催化反应试验，并用高压液相测定Cel7A的活性。
准确称取30mg的微晶纤维素和木质素于1.5ml离心管中，每管加入60μg纯化的Cel7A蛋白。按比例加入含有1％相应的添加剂的缓冲液后用柠檬酸缓冲液补足至1ml。糖化反应为4.8，45℃条件下旋转孵育2天。使用HPLC检测糖的浓度。
四、添加化学品对木质纤维素疏水性的影响
在温度为50℃，50mM醋酸盐缓冲液，pH为4.8的条件下，以玫瑰红为标志物，分别测定了向木质素体系和微晶纤维素体系中添加Tween20，Tween40，Tween60，Tween80，PEG2000，PEG4000，PEG6000，强聚电解质polyDADMAC，进行多组平行实验，分别测定了不同种类的添加剂对木质素和纤维素疏水性的影响。
结果表1所示，添加强聚电解质polyDADMAC的条件下，Cel7A活性最强。
结果发现，添加化学品对微晶纤维素的疏水性影响不大，添加化学品对木质素的疏水性有所降低，并且不用的化学品对木质素的疏水性影响变化不大。
表1添加化学品对不同的生物质样品疏水性的影响
五、添加化学品对木质纤维素电荷的影响
分别向Tween20，Tween40，Tween60，Tween80，PEG2000，PEG4000，PEG6000，polyDADAMAC，DTAB及粒径<400目的生物质样品中加入适量体积醋酸盐缓冲液(50mM,pH4.8)使其含量为0.01％(w/v)，将制备的样品超声0.5h使其充分分散，取悬浊液检测其zeta电位。
如表2所示，与对照相比，添加Tween20，Tween40，Tween60，Tween80，PEG2000，PEG4000，PEG6000，生物质样品的zeta电位的所带电荷性质没有变化，但是添加正电荷聚电解质添加剂polyDADAMAC之后，生物质样品的zeta电位的性质发生了改变，由负电荷变成了正电荷。
表2添加化学品对不同的生物质样品zeta电位的影响
六、添加剂对Cel7A降解木质纤维素活性的影响
1.不同的添加剂对木质纤维素降解活性的影响
在温度为50℃，50mM柠檬酸盐缓冲液，pH为4.8的条件下，分别添加Tween20，Tween40，Tween60，Tween80，PEG2000，PEG4000，PEG6000，强聚电解质polyDADMAC，进行多组平行实验，分别测定了不同种类的添加剂对Cel7A活性的影响。
结果如表3所示，添加强聚电解质polyDADMAC的条件下，Cel7A活性最强。
2.强聚电解质polyDADMAC对不同的预处理木质纤维素糖化效率的影响。
在温度为50℃，50mM柠檬酸盐缓冲液，pH为4.8的条件下，添加强聚电解质polyDADMAC，分别以微晶纤维素和木质素，预处理过的木糖渣，和磺化的玉米秸秆为底物，进行多组平行实验，分别测定了不同种类的添加剂对Cel7A活性的影响。
结果如表4所示，添加强聚电解质polyDADMAC的条件下，以磺化玉米秸秆为底物时，Cel7A活性最强。
由此推测添加正电荷添加剂能够提高纤维素酶对木质纤维素降解效率的原因。
表3不同的添加剂对木质纤维素酶解效率的影响
表4强聚电解质polyDADMAC对不同的预处理木质纤维素糖化效率的影响
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.强聚电解质在木质纤维素降解酶降解木质纤维素中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为强聚电解质在提高木质纤维素降解酶降解活性和/或木质纤维素降解酶提高降解木质纤维素效率中的应用。
3.如权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述强聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵。
4.如权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述木质纤维素降解酶包括纤维二糖水解酶Cel7A。
5.一种提高木质纤维素降解的方法，其特征在于，所述方法包括：在利用木质纤维素降解酶催化降解木质纤维素过程中，添加强聚电解质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素降解酶包括纤维二糖水解酶Cel7A；
所述强聚电解质包括聚二烯丙基二甲基氯化铵。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，催化反应温度控制为30～50℃，pH为4-7。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，催化反应体系为柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，或磷酸盐缓冲液中的任意一种，控制浓度为10～50mM。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述强聚电解质在混合体系中的浓度控制为0.1～5％，优选为0.1～1％。
10.权利要求5-9任一项所述方法在秸秆资源化利用中的应用。
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