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CN112625130A - 抗-tigit抗体及使用之方法 - Google Patents

抗-tigit抗体及使用之方法 Download PDF

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CN112625130A CN202011012193.4A CN202011012193A CN112625130A CN 112625130 A CN112625130 A CN 112625130A CN 202011012193 A CN202011012193 A CN 202011012193A CN 112625130 A CN112625130 A CN 112625130A
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Abstract

揭露与TIGIT结合的抗体与抗原结合片段。本揭露进一步涉及通过施用于此揭露之组合物用于治疗免疫相关疾病(例如，癌症或感染或感染性疾病)的方法与组成物。

Description

抗-TIGIT抗体及使用之方法
技术领域
本揭露关于与T细胞免疫球蛋白及ITIM域(TIGIT)结合的抗体及其抗原结合片段。本揭露进一步关于用于使用于此揭露之抗TIGIT抗体与抗原结合片段于例如治疗免疫相关疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的方法与组成物。也提供了用于筛选与产生所揭露之抗TIGIT抗体与抗原结合片段的方法与组成物。
背景技术
在慢性抗原暴露的情况下，例如在癌症或病毒感染中，T细胞可能会精疲力竭/功能失调。精疲力竭的T细胞可表现出不良的增殖能力与细胞激素产生。精疲力竭的T细胞还可以向上调控结合于由肿瘤细胞及抗原呈现细胞(antigen-presenting cells，APC)所表现之配体的抑制受体/免疫检查点(Zarour(2016)Clin Cancer Res.22(8)：1856-64)。
TIGIT是一种免疫检查点蛋白，是免疫球蛋白超家族的成员，由多个域组成，包括细胞外IgV域，I型跨膜区与胞质尾巴。尾巴由基于免疫受体酪胺酸的抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifITIM与免疫球蛋白尾巴酪胺酸(immunoglobulin tail tyrosine，ITT)状基序组成，两者均参与转译后修饰及随之而来的TIGIT活化调控TIGIT(Manieri et al.(2017)Trends Immunol.38(1)：20-8)。
TIGIT作为共抑制受体，在自然杀手(NK)细胞与T细胞上表现，它们可以通过不同的蛋白质与APC相互作用。TIGIT与CD155(PVR)高亲和力结合，并与CD112(PVRL2，nectin-2)弱相互作用(Levin et al.(2011)Eur J Immunol.41(4)：902-15；Stanietsky et al.(2009)Proc Natl Acad Sci USA.106(42)：17858-63；Yu et al.(2009)Nat Immunol.10(1)：48-57)。这些配体都在APC以及多种非造血细胞类型(包括肿瘤细胞)上表现，并与CD226共享(Bottino et al.(2003)J Exp Med.198(4)：557-67；Casado et al.(2009)Cancer Immunol Immunother.58(9)：1517-26；Mendelsohn et al.(1989)Cell.56(5)：855-65)。共刺激受体CD226以比TIGIT低约10倍的亲和力结合两个配体，从而可以剂量依赖性抑制CD226和CD155之间的相互作用(Lozano et al.(2012)J Immunol.doi：10.4049/jimmunol.1103627)。除配体竞争外，TIGIT还可以顺式直接与CD226结合并破坏其同二聚作用和其共刺激功能(Johnston et al.(2014)Cancer Cell.26(6)：923-37)。
在效应T细胞中，TIGIT可以例如通过抑制效应细胞活化，抑制增殖从而限制效应细胞池及/或藉由降低效应细胞功能与细胞激素产生来充当细胞内在抑制剂(Joller andKuchroo(2017)Curr Top Microbiol Immunol.410：127-56)。TIGIT还可以在调节性T细胞(Tregs)上高表现，从而促进其抑制功能。TIGIT+Tregs表现更高水平的Treg签名基因，例如Foxp3、CD25与CTLA-4，并在Treg特异性去甲基化区域(TSDR)中显示增强的去甲基化，从而导致更高的谱系稳定性(Joller et al.(2014)Immunity 40(4)：569-81；Fuhrman et al.(2015)J Immunol.195(1)：145-55)。因此，在调节细胞中，TIGIT可通过直接诱导抑制介体来促进谱系稳定性并增强其抑制功能。TIGIT在效应细胞和调节细胞中的功能，特别是那些可能限制免疫细胞对肿瘤和持久性病原体做出有效反应的能力，使其成为有吸引力的免疫治疗靶标。
已经描述了能够靶向TIGIT的试剂(Johnston et al.(2014)Cancer Cell.26(6)：923-37；Chauvin et al.(2015)J Clin Invest.125(5)：2046-58；Srivastava et al.(2017)In：Proceedings of the AACR Annual Meeting；Cancer Res.77(13Suppl)：Abstract 2612；Hung et al.(2018)Oncoimmunology 7(8)：e1466769；也参见ClinicalTrials.gov，e.g.，NCT04256421，NCT04165070，NCT02913313，NCT04262856)。然而，这些试剂在临床上显示出有限的治疗效用，尤其是当用作单一疗法时(参见，例如，Johnston et al.(2014)Cancer Cell.26(6)：923-37)。因此，仍然需要可调节其功能并克服当前治疗选择的局限性的TIGIT靶向剂。
发明内容
在一些实施例中，本揭露部分提供了新颖的抗体与抗原结合片段，其与TIGIT结合，例如特异性结合。这些被投予为单独试剂或为组合疗法之一部分。
在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段特异性结合TIGIT。在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段能够减少或阻断TIGIT和CD155的相互作用。在一些实施例中，与参考抗TIGIT抗体或抗原结合片段相比，于此揭露之抗体和抗原结合片段具有一或更多之优异的特性。在一些实施例中，这些性质对于治疗性抗体是所需的，并且可以包括以下一种或多种：对人类TIGIT的高结合亲和力；人类TIGIT、食蟹猴(cyno)TIGIT及/或小鼠TTGIT之间的交叉反应；有效的T细胞活化活性；有效的体内抗癌活性；及/或有效的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(例如，针对调节性T细胞)，例如与参考抗TIGIT抗体或抗原结合片段相比。由于这些改善的特性中的一些或全部，于此揭露之抗TIGIT抗体和抗原结合片段可用于治疗患有免疫相关疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的人类患者。
在一些实施例中，本揭露提供一种经分离之抗体或抗原结合片段，其特异性地结合至人类T细胞免疫球蛋白与ITIM域(T cell immunoglobulin and ITIM domain，TIGIT)，其中该抗体或抗原结合片段包括：
(a)三个重链互补性决定区(heavy chain complementarity determiningregions、HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(light chain complementaritydetermining regions，LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)之胺基酸序列；
(b)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：24(LCDR3)之胺基酸序列；
(c)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(d)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：19(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(e)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：20(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(f)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：21(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(g)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：7(HCDR1)、序列辨识号：8(HCDR2)与序列辨识号：9(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：10(LCDR1)、序列辨识号：11(LCDR2)与序列辨识号：12(LCDR3)之胺基酸序列；或
(h)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：13(HCDR1)、序列辨识号：14(HCDR2)与序列辨识号：15(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：16(LCDR1)、序列辨识号：17(LCDR2)与序列辨识号：18(LCDR3)之胺基酸序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含三个重链互补决定区(HCDR)，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列识别的胺基酸序列号：3(HCDR3)；以及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)和序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列(germline)重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：39的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区与序列辨识号：39的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。序列辨识号：40的胺基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：39的胺基酸序列的重链可变区与含有序列辨识号：40的胺基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含经突变以修饰效应子功能的人类IgG1重链恒定区或人类IgG1重链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区包含序列辨识号：43的胺基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区包含序列辨识号：43的胺基酸序列，其被突变为包含在位置239、330与332之胺基酸取代。在序列辨识号：43之位置239的S被以D取代；在序列辨识号：43之位置330的A被以L取代；及在序列辨识号：43之位置332的I被以E取代。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区包含序列辨识号：44的胺基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区还包含C端离胺酸(K)。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类Ig κ轻链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含序列辨识号：45的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括：
(a)包含序列辨识号：43的胺基酸序列的重链恒定区与包含序列辨识号：45的胺基酸序列的轻链恒定区；或
(b)包含序列辨识号：44的胺基酸序列的重链恒定区与包含序列辨识号：45的胺基酸序列的轻链恒定区。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括：
(a)重链，其包含序列辨识号：46的胺基酸序列；与轻链，其包含序列辨识号：48的胺基酸序列；或
(b)重链，其包含序列辨识号：47的胺基酸序列；与轻链，其包含序列辨识号：48的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含：重链恒定区，其包含序列辨识号：44的胺基酸序列；和轻链恒定区，其包含序列辨识号：45的胺基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：47的胺基酸序列的重链与含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，重链恒定区或重链更包括C端离胺酸(K)。
在一些实施例中，本揭露提供了与人类TIGIT特异性结合的分离的抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段结合至人类TIGIT之一区域，该区域包括在序列辨识号：22之位置106的Y。在一些实施例中，该区域还包括更包括以下之一或更多：在序列辨识号：22之位置56的Q；在序列辨识号：22之位置74的G；在序列辨识号：22之位置110的Y；及在序列辨识号：22之位置111的H。在一些实施例中，该区域至少包括：在序列辨识号：22之位置56的Q；与在序列辨识号：22之位置106的Y。在一些实施例中，该区域至少包括：在序列辨识号：22之位置56的Q；在序列辨识号：22之位置74的G；在序列辨识号：22之位置106的Y；与在序列辨识号：22之位置110的Y。在一些实施例中，该区域是非线性的。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与参考抗体或抗原结合片段竞争与人类TIGIT的结合，其中参考抗体或抗原结合片段包含三个重链互补决定区(HCDR)，其包含胺基酸序列序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的序列；以及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段与参考抗体或抗原结合片段结合到人类TIGIT的相同区域，其中该参考抗体或抗原结合片段包含三个重链互补决定区(HCDR)，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸序列；以及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：39的胺基酸序列的重链可变区与含有序列辨识号：40的胺基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含包含序列辨识号：44的胺基酸序列的重链恒定区和包含序列辨识号：45的胺基酸序列的轻链恒定区。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：47的胺基酸序列的重链与含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，重链恒定区或重链还包含C端离胺酸(K)。
在一些实施例中，本揭露提供了包含所述抗体及/或抗原结合片段的医药组成物。在一些实施例中，医药组成物包含一或更多之抗体及/或一或更多之抗原结合片段，以及至少一种药学上可接受的载体。
在一些实施例中，于此还提供了用于所述抗体及/或抗原结合片段的治疗方法和用途，例如用于活化及/或杀死一或更多之免疫细胞。
在一些实施例中，本揭露提供了在需要其的个体中活化及/或杀死一个或更多之免疫细胞的方法，包括对个体投予有效量之于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗(pembrolizumab))。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物，用于在需要其的个体中活化及/或杀死一个或更多之免疫细胞。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在需要其的个体中活化及/或杀死一或更多之免疫细胞的用途。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供于此所述的抗体或抗原结合片段在制备用于活化及/或杀死需要其的个体中的一个或更多之免疫细胞的药物中的用途。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法与用途，例如用于治疗癌症。
在一些实施例中，本揭露提供了在有需要的个体中治疗癌症的方法，其包括向个体施用治疗有效量的于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物，用于治疗有此需要的个体的癌症。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在治疗有此需要的个体中的癌症的用途。在一些实施例中，癌症表达CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗有此需要的个体中的癌症的药物中的用途。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法和用途，例如，用于治疗感染或传染病。
在一些实施例中，本揭露提供了一种在有需要的个体中治疗感染或感染性疾病的方法，该方法包括向该个体施用治疗有效量的于此所述的抗体或抗原结合片段或药物于此所述的组成。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物，用于治疗有此需要的个体的感染或感染性疾病。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在治疗需要其的个体中的感染或传染性疾病中的用途。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗需要其的个体的感染或传染性疾病的药物中的用途。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体(例如，派姆单抗)。
在一些实施例中，还提供了编码本揭露的抗体或抗原结合片段的核酸。核酸可以是分离的核酸及/或掺入分离的载体中的核酸的形式。
在其他实施例中，本揭露提供了产生所述抗体及/或抗原结合片段的方法。在一些实施例中，本揭露提供了产生抗体或抗原结合片段的方法，包括在适合于产生抗体或抗原结合片段的条件下培养宿主细胞或修饰成包含一个或更多之编码抗体或抗原结合片段的核酸的细胞群。抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，该方法进一步包括分离，纯化及/或回收产生的抗体或抗原结合片段。
附图说明
第1图显示，SDS-PAGE凝胶，其显示了在NS0细胞中表现的重组人类与小鼠TIGITIgV域的纯度。在SDS-PAGE分析之前，藉由Strep-Tactin XT Superflow管柱分别纯化来自培养基的蛋白质。泳道1：基准标示物；泳道2：人类TIGIT，3μg(未还原)；泳道3：人类TIGIT，3μg(还原)；泳道4：小鼠TIGIT，3μg(未还原)；泳道5：小鼠TIGIT，3μg(还原)。
第2A-2E图显示，通过不同的抗TIGIT抗体，包括参考抗体15A6(第2A图)与MBSA43(第2B图)以及抗体7D4(第2C图)、2C9(第2D图)与3A9(第2E图)对人类TIGIT与人CD155结合的抑制作用的图。使用TIGIT：CD155均相分析法藉由AlphaLISA进行测定。指出每种抗体的半数最大抑制浓度(IC50)。
第3A-3C图显示，显示抗TIGIT抗体7D4(第3A图)、2C9(第3B图)与3A9(第3C图)与表现人类TIGIT之Jurkat细胞(TIGIT/Jurkat)的流式细胞分析技术结合的图。将藉由中位数荧光强度(MFI)测量的抗体结合水平相对于抗体浓度作图。显示了每种抗体的平衡结合常数(KD)。
第4图显示，显示抗TIGIT抗体7D4、2C9与3A9对人类、食蟹猴与小鼠TIGIT的物种交叉反应性的图。藉由使用每种物种的重组TIGIT IgV域涂覆板，进行基于ELISA的分析。用抗体的连续稀释液培养后，藉由侦测与HRP缀合的抗小鼠Fcγ多株抗体来测量每种抗TIGIT抗体的结合力。藉由四参数对数拟合方程式绘制结合曲线(four-parameter logistic fitequation)，并测定结合力(EC50)。
第5A图显示，藉由不同的抗人类TIGIT抗体，包括参考抗体15A6与MBSA43，以及抗体7D4、2C9与3A9进行人类TIGIT/CD155阻断生物分析的结果。
第5B图显示，抗体7D4与15A6之间抑制CD155/CHO结合TIGIT/Jurkat细胞的比较。使用基于TIGIT/CD155细胞的报告系统进行分析。
第6图显示，将15A6(参考抗体)或抗体7D4与拮抗性抗PD-1抗体(派姆单抗)结合以评估T细胞活化的分析结果。使用基于PD-1/PD-L1+TIGIT/CD155组合细胞的报告系统(Promega)进行分析。藉由发光强度测量T细胞活化。
第7图显示，通过培养不同抗TIGIT抗体的连续稀释液来诱导表现人类TIGIT的Jurkat细胞的IL-2分泌，所述抗TIGIT抗体包括参考抗体15A6与MBSA43，以及抗体7D4、2C9与3A9。
第8A-8B图显示，将7D4抗体的连续稀释液与来自三个不同健康人类捐献者的PBMC一起培养后的白细胞介素2(IL-2)(第8A图)和干扰素-γ(IFN-γ)(第8B图)分泌。在固定的CD155与T细胞活化之抗CD3抗体存在下。
第9A-9B图显示，MJ[G11]细胞的示例性特征。第9A图显示了由MJ[G11]细胞表现的人类调节性T细胞样表型标记(CD3+CD4+CD25highCD127lowFoxP+)。MJ[G11]细胞以结合了荧光染剂的抗人类抗体染色，包括抗CD4-Per-CP，抗CD25-APC、抗CD127-PE与抗FoxP3-Alexa488。FoxP3在细胞内进行染色，而其他抗体则染色细胞表面。第9B图显示了流式细胞分析技术图，其显示了经由由MJ[G11]细胞之人类TIGIT的组成型表现。用与PE荧光染剂结合之抗TIGIT抗体MBSA43对细胞染色。
第10A-10B图显示，重组之抗TIGIT抗体(hz7D4人类IgG1(“hIgG1”)、15A6hIgG1与1D3hIgG1)与人类CD155之间对于表现人类TIGIT的Jurkat细胞(第10A图)与MJ[G11]细胞(图10B)之结合的竞争测定结果的图。培养与清洗后，藉由流式细胞分析技术定量剩余的结合的DyLight 650-缀合的CD155-人Fc融合体。数据以最大荧光强度的百分比表示，其定义为在不存在阻断抗体(控制组)的情况下，藉由使用DyLight650结合之CD155-人类Fc融合蛋白染色细胞而获得的平均荧光强度。计算抑制一半最大荧光强度(IC50)所需的每种抗体的浓度。
第11图显示，流式细胞分析技术图，其显示了不同的抗TIGIT抗体与表现小鼠TIGIT的CHO细胞(mTIGIT/CHO)的结合。
第12A-12B图显示，在单一疗法中用抗TIGIT抗体治疗的小鼠的CT26肿瘤细胞生长曲线。绘制每个治疗组的肿瘤大小(中位数SE)(第12A图)与单个肿瘤生长曲线(第12B图)。当肿瘤体积超过2,000mm3时，处死小鼠。
第13图显示，流式细胞分析技术图，显示了抗TIGIT抗体hz7D4、1E3、1A11、15A6与1D3与表现cyno TIGIT的CHO细胞(cynoTIGIT/CHO)以1μg/ml的抗体浓度结合。
第14图显示，显示不同抗TIGIT抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的图，所述抗TIGIT抗体包括亲本抗体hz7D4 hIgG1，Fc工程化的hz7D4变体1A11与1E3hIgG1-DLE以及参考抗体15A6 hIgG1与1D3 hIgG1。将NK细胞和钙黄绿素AM染色的MJ[G11]细胞与不同浓度的抗体共培养4小时。7D4的小鼠IgG2a同型(7D4 mIgG2a)用作阴性对照。
第15A-15B图显示，来自抗原决定位结合分析的结果。第15A图显示了针对人类TIGIT蛋白的变性(DeNat)和天然(Nat)形式的不同抗体的斑点印迹分析。第15B图显示了微数组分析图，其显示了7D4抗体与包含7、10与13个胺基酸残基的人类TIGIT肽环结合的构象抗原决定位作图。鉴定了保守的7D4结合肽环，其在YFCIY的共有基序中具有胺基酸残基Y106。
第16图显示，包含信号肽的人类、食蟹猴与小鼠TIGIT IgV域的胺基酸序列比对(以斜体显示)。将位于TIGIT/PVR界面上的保守(V/I)(S/T)Q，AX6G与T(F/Y)P基序装箱。Q56、N70、G74与Y110的胺基酸残基用星号(*)表示。保守的7D4结合肽环YFCIY在灰色框中突出显示。粗体表示突变为丙胺酸以评估TIGIT/7D4结合的单个胺基酸残基。
第17图显示了针对人类TIGIT IgV域的不同点突变的7D4的ELISA结合分析。
第18图标出，带状图，其显示了人类TIGIT/PVR(CD155)复合体的相互作用。TIGIT的胺基酸残基Q56、N70、G74与Y113位于TIGIT/PVR的界面。用粗斜体数字表示通过人类TIGIT IgV域的点突变的ELISA结合分析法鉴定的参与1A11结合的胺基酸残基Q56、N70、G74、Y106、Y110与H111。胺基酸残基Y106位于面对TIGIT/PVR界面的β-褶板结构中。
第19图显示，针对人类TIGIT IgV域的不同点突变的1A11的ELISA结合分析。
具体实施方式
通过参考以下详细描述，可以更容易地理解所公开的组合物和方法。除非于此另外定义，否则与本揭露内容结合使用的所有科学和技术术语具有与该技术领域中具有通常知识者通常理解的相同含义。
出于任何目的，通过引用将于此引用的所有参考文献并入。在所引用的参考文献与于此的公开内容冲突的程度上，以说明书为准。
除非上下文另有明确规定，否则于此所用的单词的单数形式也包括复数形式；作为示例，术语“一”，“一个”与“该”应理解为单数或复数。举例来说，“一个元素”是指一个或更多之元素。除非特定上下文另外指出，否则术语“或”表示“及/或”。除非上下文另外指出，否则所有范围，包括以“在X值和Y值之间”形式表示的范围，都包括端点与之间的所有点。
术语“抗体”在最广义上使用是指一种免疫球蛋白分子，藉由该免疫球蛋白分子之可变区内的至少一个抗原识别位点，识别并结合于一标靶(target)，例如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或其组合。抗体的重链由重链可变区(VH)与重链恒定区(CH)构成。轻链由轻链可变区(VL)与轻链恒定区(CL)构成。为了本申请案的目的，增强的重链与轻链可变区各自包括三个互补决定区(CDR1、CDR2与CDR3)与四个构架区(FR1、FR2、FR3与FR4)，被从N端到C端设置为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3与FR4。“抗体”可以是天然存在的或人造的，如经由一般融合瘤技术产生的单株抗体。抗体可包括一个或更多之重链及/或轻链。术语“抗体”包括全长单株抗体与全长多株抗体，以及抗体片段，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv与单链抗体。抗体可以是免疫球蛋白的五种主要类别中的任何一种：IgA、IgD、IgE、IgG与IgM，或其亚类(subclass)(例如同型IgG1、IgG2(如，IgG2a、IgG2b)、IgG3、IgG4)。该术语还涵盖人类抗体、嵌合抗体、人源化抗体与任何包含抗原识别位点之经修饰的免疫球蛋白分子，只要其显示出一种或更多之所需的生物学活性(例如，结合TIGIT等)即可。
描述抗体中CDR和FR区位置的编码系统已被各种团体所定义。一种此类的系统是Kabat编码系统(参见，例如，Kabat et al.“Sequences ofProteins of ImmunologicalInterest，”Diane Publishing Company(1992)；也参见Kabat et al.“Sequences ofProteins of Immunological Interest，”U.S.Department of Health and HumanServices，U.S.Government Printing Office(1987and 1991))。由Kabat编码系统定义的示例性CDR序列在表2中列出，并且可以用于于此揭示之任何示例性抗体与抗原结合片段。在一些实施例中，本揭露的抗体与抗原结合片段包括与于此所述的CDR序列以100％同一性匹配的CDR序列。在一些实施例中，本揭露的抗体与抗原结合片段包含与于此所述的CDR序列以90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性匹配的CDR序列。
用于定义抗体中CDR与FR区位置的其他编码系统包括，例如IMGT编码系统(International ImMunoGeneTics Information System
Figure BDA0002697162600000141
Chothia编码系统(例如，参见A1-Lazikani et al.J Mol Biol.1997；273：927-48)与化学计算组(ChemicalComputing Group，CCG)编码系统(例如，参见Molecular Operating Environment(MOE)，2013.08；Chemical Computing Group ULC，Montreal，QC，Canada，H3A 2R7，2018)。
如于此所使用，术语“单株抗体”意指从实质上同质(homogeneous)的抗体族群中所获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能自然发生的突变以外，构成该群体的各个抗体是相同的。单株抗体针对单个抗原之抗原决定位具有高度特异性。相对地，一般的(多株)抗体制品通常包括针对(或特异于)不同抗原决定位的一大群抗体。修饰语“单株”代表抗体的特征为从实质上同质的抗体族群所获得，而不应解释为需要藉由任何特定方法产生抗体。于此描述了用于产生单株抗体的示例性方法，而其他方法为该领域已知的。
于此所述的单株抗体具体包括“嵌合”抗体，其中一部分重链及/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体中的对应序列及此类抗体的片段相同或同源，只要它们与TIGIT结合及/或显现出所需之生物学活性。
如于此所使用之术语“嵌合抗体”系指，抗体，于其中(a)恒定区被改变，置换或交换，而使抗原结合位点(可变区)与不同或改变之类别、效应子功能及/或物种的一恒定区连接。类；及/或(b)可变区或其一部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区或其一部分改变、置换或交换。修饰语“嵌合”意指抗体的特征为具有来自大于一种物种之结构要素，而不应解释为需要藉由任何特定方法产生抗体。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用该领域已知的方法将来自非人类供体抗体(例如，小鼠供体抗体)的可变区序列连接至人类恒定区。例如，小鼠抗人类TIGIT抗体可以藉由将其恒定区以来自人类免疫球蛋白之恒定区取代来修饰。由于经人类恒定区的取代，因此相较于原始小鼠抗体，嵌合抗体可以保留其识别人类TIGIT的特异性，同时具有经减低之人体内的免疫原性(immunogenicity)。
如于此所使用，术语“人源化抗体”是指包含至少一些人类序列和至少一些非人类序列之抗体的形式。通常，此抗体主要包含人类序列与一小部分之赋予对标靶抗原之结合特异性的非人类序列。此类抗体包括嵌合抗体，其包含衍生自非人类抗体的最少序列并保留非人内抗体的反应性，同时在人中为免疫原性较低。通常，人源化抗体是藉由将来自人受体抗体的高变区序列置换为来自与感兴趣之抗原(例如，人类TIGIT)结合之非人类供体抗体(例如，小鼠供体抗体)的高变区序列而产生的。在一些例子中，受体抗体的构架区序列也可以供体抗体的对应序列来置换(例如，经由反向突变)。除了衍生自供体与受体抗体的序列外，人源化抗体还可以藉由在框架区中及/或经置换的非人类残基内之残基取代来修饰，以优化与最适化抗体特异性、选择性、亲和力及/或活性，如于此所讨论。
在一些实施例中，于此揭露之抗体与抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，所揭露之抗体与抗原结合片段含有源自非人类抗体的最小序列。在一些实施例中，所揭露之抗体与抗原结合片段保留了非人类抗体的亲和力，但是包含在一个或更多之CDR及/或框架中的修饰。在一些实施例中，所揭露之抗体与抗原结合片段也显现出非人类抗体并未显现的一种或更多之所需的特性，包括，但不限于较低之免疫原性与经减低的毒性。在一些实施例中，非人类抗体为一小鼠抗体。在一些实施例中，非人类抗体为一小鼠抗人类TIGIT抗体。示例性的小鼠抗人类TIGIT抗体于此描述，且包括，但不限于7D4、2C9与3A9。在一些实施例中，将非人类抗体，或其抗原结合片段或抗原结合域作为比较物或“参考”抗体、抗原结合片段或抗原结合域，例如，以评估比较结合亲和力(comparative binding affinity)。
如于此所使用，术语抗体之“抗原结合片段”系指保留对抗原(例如，TIGIT)结合之能力的一抗体或蛋白质的一个或更多之片段。抗原结合片段也可以保留免疫效应子活性。已经显示，全长抗体的片段可以执行全长抗体之抗原结合功能。术语抗体之“抗原结合片段”中涵盖的结合片段的例子包括：(i)一Fab片段，由VL、VH、CL与CH1域组成的单价片段；(ii)一F(ab′)2片段，其为包含两个藉由在铰链区之一双硫键连接之Fab片段的双价片段；(iii)一Fd片段，由VH与CH1结构组成；(iv)一Fv片段，由一抗体之单臂的VL与VH域组成；(v)一dAb片段，其包括单个可变域，例如VH域(参见，例如，Ward et al.(1989)Nature341：544-6；andIntl.Pub.No.WO 1990/005144)；(vi)一经分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL与VH系由不同的基因所编码，然而它们可以经由合成之连接符(synthetic linker)来连接(例如，使用重组方法)，此可使它们被做成一单一蛋白链，于其中VL与VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(single chain Fv，scFv))。参见，例如Bird et al.(1988)Science242：423-6；and Huston et al.(1988)Proc Natl Acad Sci.USA 85：5879-83。此类单链抗体也意图包含在术语抗体之“抗原结合片段”内。在一些实施例中，将scFv分子并入融合蛋白中。也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体(diabody)。双抗体是二价双特异性抗体，于其中VH与VL域在一单一多肽链上表现，但使用的连接符太短，以至于不允许同一条链上之两域之间进行配对，从而迫使这些域与另一条链之互补域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger等(1993)Proc Natl Acad Sci.USA 90：6444-8；和Poljak等(1994)Structure 2：1121-3)。可以使用该技术领域已知的一般技术来获得抗原结合片段，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选结合片段的效用(例如，结合亲和力)。抗原结合片段可藉由切割完整蛋白，例如藉由蛋白酶或化学切割来制备。
除非另有说明，如于此所使用，术语“T细胞免疫球蛋白与ITIM域”或“TIGIT”是指来自任何脊椎动物来源之TIGIT的任何天然形式，而脊椎动物来源包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如，人与猴子)与囓齿动物(例如，小鼠与大鼠)。TIGIT在该领域中也称为DKFZp667A205、FLJ39873、含V-set与免疫球蛋白域之蛋白质9(V-set and immunoglobulindomain-containing protein 9)、含V-set与跨膜域之蛋白质3(V-set and transmembranedomain-containing protein 3)、VSIG9、VSTM3及WUCAM。此术语涵盖“全长”未经处理之TIGIT(例如，具有序列辨识号：22之胺基酸序列的全长人类TIGIT)，以及由于如选择性剪接事件(alternative splicing event)、可变启动子使用(variable promoter usage)、转录后修饰(post-transcriptional modifications)、转译后修饰(post-translationalmodifications)等之细胞表现或处理而产生的任何形式的TIGIT(例如，经过处理的没有信号序列之人类TIGIT，即具有序列辨识号：22之胺基酸22-244之胺基酸序列的TIGIT)。此术语也涵盖TIGIT的功能变体或片段，包括，但不限于保留TIGIT的一种或更多之生物学功能的剪接变体(splice variants)、等位基因变体(allelic variants)与同功型(isoforms)(即，除非上下文指示该术语仅用于指野生型蛋白，否则包括变体和片段)。示例性之人类TIGIT的胺基酸序列可以在UniProt登录号Q495A1下找到。
术语“抗TIGIT抗体”或“结合TIGIT的抗体”意指结合，例如特异性结合TIGIT之任何形式的抗体或其抗原结合片段的。该术语涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多株抗体与生物学功能性抗体片段，只要它们结合，例如特异性结合TIGIT即可。在一些实施例中，于此所揭露之抗TIGIT抗体或抗原结合片段可以结合，例如特异性结合于TIGIT之胞外域(extracellular domain)中之一个或更多之胺基酸。在一些实施例中，TIGIT之细胞外域包括序列辨识号：22之胺基酸24-138。
如于此所使用，术语“特异性”、“特异性结合”或“特异地结合”是指在异质族群(heterogeneous population)之蛋白质与其他生物制剂(biologics)中，抗体或抗原结合片段(例如，抗TIGIT抗体)与标靶抗原(例如，TIGIT)之间的结合反应。藉由在一给定组之条件(set ofcoditions)下比较对于适当抗原的结合与对于替代抗原或抗原混合物的结合，可以测试抗体的结合之特异性。若抗体以比替代抗原或抗原混合物高至少2、5、7、10或更多倍之亲和力结合适当的抗原，则其认为是特异性的。“特异性抗体”或“标靶特异性抗体”是仅结合标标靶抗原(例如，TIGIT)，但不与其他抗原结合(或显现最小结合)的抗体。在一些实施例中，特异性结合标靶抗原(例如，TIGIT)的抗体或抗原结合片段也具有小于1x10-6M，小于1x10-7M，小于1x10-8M、小于1x10-9M、小于1x10-10M、小于1x10-11M、小于1x10-12M或小于1x10-13M之针对该标靶的KD。在一些实施例中，KD为1pM至500pM。在一些实施例中，KD介于500pM至1μ、1μM至100nM或100mM至10nM之间。
术语“抗原决定位”是指能够被抗体识别并特异性结合的抗原部分。当抗原是多肽时，抗原决定位可以形成自经由多肽之三级折迭而并列的连续胺基酸或不连续胺基酸。可以使用该领域已知的任何抗原决定位匹配技术(epitope mapping)来鉴定与抗体结合的抗原决定位，包括通过直接观察抗原-抗体复合物之用于抗原决定位鉴定的X射线晶体学(X-ray crystallography)，以及监测抗体对抗原之片段或突变的结合，或监控抗体与抗原之不同部分的溶剂可及性(solvent accessibility)。匹配抗体抗原决定位的示例性方法在于此之实施例中描述(参见，例如实施例20)，且为该领域已知的。示例性之策略包括，但不限于基于数组的寡肽扫描(array-based oligo-peptide scanning)、限制性蛋白水解(limited proteolysis)、定点诱变(site-directed mutagenesis)、高通量诱变匹配(high-throughput mutagenesis mapping)、氢-氘交换(hydrogen-deuterium exchange)与质谱分析(参见，例如，Gershoni et al.(2007)21：145-56；and Hager-Braun and Tomer(2005)Expert Rev Proteomics 2：745-56)。
竞争性结合与抗原决定位合并(epitope binning)也可用于确认共享相同或重迭之抗原决定位的抗体。可以使用交叉阻断分析法评估竞争性结合，例如于“Antibodies，ALaboratory Manual，”Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow and Lane(1stedition1988，2nd edition 2014)中所述的分析。在一些实施例中，当测试抗体或结合蛋白减少参考抗体或结合蛋白对标靶抗原，如TIGIT的结合(例如，包含选自表2与3中鉴定之那些的CDR及/或可变区的结合蛋白)时，确认竞争结合在交叉阻断试验中至少降低了约50％(例如，50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.5％或更多，或任何百分比在两者之间)，及/或反之亦然。在一些实施例中，竞争性结合可以归因于共享的或相似的(例如，部分重迭的)抗原决定位，或者归因于立体阻碍(steric hindrance)，其中抗体或结合蛋白结合于附近的抗原决定位上(参见，例如，Tzartos，Methods in Molecular Biology(Morris，ed.(1998)vol.66，pp.55-66))。在一些实施例中，竞争性结合可以用于对共有相似抗原决定位的结合蛋白进行分类。例如，于结合竞争的结合蛋白可以“放入(binned)”为一组具有重迭或附近抗原决定位的结合蛋白，而那些不竞争的蛋白则被放置在没有重迭或附近抗原决定位的结合蛋白的分开之组(即，箱(bin))中。
与参考抗体“结合至相同之抗原决定位的抗体”系指在竞争分析中阻断了参考体对其抗原之结合达50％或更多的抗体，及/或相反，在竞争分析中，参考抗体将抗体对其抗原之结合阻断了50％或更多。示例性竞争分析于此进行了描述与示例。
如于此所使用，术语“胺基酸”与“残基”是指天然存在的与合成的胺基酸，以及以类似于天然存在的胺基酸的方式起作用的胺基酸类似物与胺基酸模拟物。天然存在的胺基酸是由遗传密码(genetic code)所编码的胺基酸，以及后来在体内(in vivo)被修饰的胺基酸，例如羟脯胺酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷胺酸(γ-carboxyglutamate)与O-磷酸丝胺酸(O-phosphoserine)。胺基酸类似物是指具有与天然胺基酸相同之基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、胺基与R基团结合的α碳，例如硒代半胱胺酸(selenocysteine)、高丝胺酸(homoserine)、正亮胺酸(norleucine)与蛋胺酸亚砜(methionine sulfoxide)。此类的类似物可以具有经修饰的R基团(例如，硒代半胱胺酸，正亮胺酸)或经修饰的肽主链(例如，高丝胺酸)，但是保留与天然胺基酸相同之基本化学结构。胺基酸模拟物是指具有与胺基酸的一般化学结构不同的结构但以相似于天然胺基酸的方式起作用的化合物。表1中提供了示例性胺基酸的三字母与一字母代码。
表1、示例性之胺基酸的三字母代码与一字母代码
Figure BDA0002697162600000191
Figure BDA0002697162600000201
Figure BDA0002697162600000211
在特定位置，例如在抗体的Fc区中的“胺基酸修饰”是指特定残基的取代或缺失，或与特定残基邻接的至少一个胺基酸残基的插入。与特定残基“邻接”的插入是指在其一至两个残基内插入。插入可以在特定残基的N-端或C-端。在一些实施例中，于所述的胺基酸修饰是取代。
对于胺基酸序列，术语“同一性(identity)”或“同源性”是指藉由比较序列来所确定的两个或更多之多肽的序列之间的关系。术语“同一性”还指多肽之间的序列相关性的程度，其由两个或更多之胺基酸残基的串之间的匹配数目决定。两个序列之间的“同一性”百分比是该序列共享的相同位置之数目的函数(即，同一性百分比等于相同位置之数目/位置之总数x 100)，并考虑了缺口数，与各缺口的长度，其需要被引入才能实现两个序列的最佳比对(optimal alignment)。序列的比较与两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法(mathematical algorithm)来完成。为了进行序列比较，通常将一个序列做为参考序列，将其与测试序列进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入一计算机，必要时指定子序列坐标(subsequence coordinates)，并指定序列算法程序参数(sequence algorithm program parameters)。可以使用默认程序参数，也可以指定替代参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。另外地或可替代地，本揭露的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列(query sequence)”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关序列。例如，可以使用Altschul et al.((1990)JMol Biol.215(3)：403-10)的BLAST程序执行此类搜索。
通常，介于于此揭露之蛋白质及其变体，包括TIGIT的变体和抗体可变域的变体(包括个别的变体CDR)之间的胺基酸同一性或同源性与于此所述之序列为至少80％相同或同源，例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、几乎100％或100％的同一性或同源性。
以相似的方式，相对于编码于此所鉴定之抗体与其他蛋白质的核酸序列的“核酸序列同一性”百分比被定义为在与特定抗体或其他蛋白质之编码序列中之核苷酸残基相同的候选序列中的核苷酸残基百分比。
如于此所使用，术语“经分离的(isolated)”是指从其源环境(例如，自然环境，若其自然存在的话)被移出的材料。例如，自然存在于活生物体(living organism)中的多核苷酸或多肽，为未经分离的，而与于活生物体中之一些或全部共存物质分开之相同多核苷酸或多肽，为经分离的。
如于此所使用，“经分离的抗体”为一抗体，其已经鉴定并与其来源环境的一种或更多之(例如，大部分)组分(以重量计)，例如与融合瘤细胞培养物或用于生产的其他细胞培养物(例如重组的表现抗体的生产细胞，例如小鼠骨髓瘤NS0细胞或中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells)(例如CHO-S细胞))的组分分离。在一些实施例中，进行分离使得其充分除去可能以其他方式干扰抗体对所需应用(例如，用于抗TIGIT抗体的治疗性)的组分。制备经分离的抗体的方法是该领域已知的，并且包括，但不限于蛋白质A层析(protein A chromatography)、阴离子交换层析(anion exchange chromatography)、阳离子交换层析(cation exchange chromatography)、病毒保留过滤(virus retentivefiltration)与超滤(ultrafiltration)。
结合“亲和力”是指在单个抗原性位点(antigenic site)介于抗体与抗原之间之相互作用的强度。在每个抗原性位点内，抗体“臂(arm)”的可变区经由弱的非共价力(non-covalent force)与抗原在许多位点相互作用。通常，相互作用越多，亲和力就越强。KD和亲和力成逆相关。在一些实施例中，本揭露之抗TIGIT抗体或其抗原结合片段保持以约1×10- 6M或更小的KD结合TIGIT(例如，人类TIGIT)的能力。
如于此所使用，术语“KD”是指平衡解离常数，其由kd与ka的比率(即kd/ka)所获得，并且通常表示为莫耳浓度(M)。如于此所使用的术语“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如于此所使用的术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。在于此所述之实施例中描述了测量抗体之KD值的示例性方法(参见，例如，实施例5)，其他方法为该领域已知的。
“亲和力增强的”抗体是一个或更多之改变于其一个或更多之CDR中的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，此导致抗体对标靶抗原的亲和力得到改善。在一些实施例中，亲和力增强的抗体对靶抗原具有奈莫耳(nanomolar)或甚至皮莫耳(picomolar)的亲和力。产生亲和力增强的抗体的示例性方法在于此所述之实施例中描述(参见，例如实施例13、14与17)，并且为该领域已知的，包括藉由VH与VL域混编(VH-and VL-domainshuffling)、CDR及/或框架残基的随机诱变(random mutagenesis)等的亲和力增强。
于此之术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，包括天然序列Fc区与变体Fc区。可以例如在抗体的产生或纯化过程中，或藉由重组地建造编码抗体重链的核酸来移除Fc区的C端离胺酸。因此，完整抗体的组成物可以包括移除了C端离胺酸残基的抗体族群、未移除C端离胺酸残基的抗体族群以及具有带有与不带有C端离胺酸残基的抗体混合物的抗体族群。用于本揭露的抗体的合适的天然序列Fc区包括人类IgG1、IgG2(例如，IgG2a、IgG2b)、IgG3与IgG4。
如于此所使用，“Fc受体”或“FcR”描述了与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施例中，FcR是天然序列人类FcR。在一些实施例中，FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FCγRI、FCγRII与FCγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体与剪接形式。于此之术语“FcR”涵盖其他FcR，包括未来要被鉴定的那些。
“效应细胞”是指表现一种或更多之FcR并执行效应子功能的白血球。在一些实施例中，细胞至少表现FCγRIII及/或执行ADCC效应子功能。介导ADCC之人类白血球的例子包括外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)、自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞、单核细胞(monocyte)、细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell)与嗜中性白细胞(neutrophil)。
“效应子功能”是指归因于抗体之Fc区的那些生物活性，其随抗体同型而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(C1q binding and complementdependent cytotoxicity，CDC)；Fc受体结合(Fc receptor binding)；抗体依赖性的细胞媒介之细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(cell surface receptor)的向下调控(例如，B细胞受体)；与B细胞活化。
“抗体依赖性的细胞媒介之细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性的一种形式，其中所分泌的免疫球蛋白结合到存在于某些细胞毒性效应细胞(例如NK细胞，单核细胞)上的Fc受体上，使细胞毒性效应细胞能特异性结合到带有抗原的标靶细胞上，并随后用细胞毒素(cytotoxin)杀死标靶细胞。为了评估ADCC活性，在一些实施例中，可以进行体外(invitro)ADCC分析，例如美国专利号5,500,362或5,821,337或6,737,056中所述的那些。用于此类分析的有用的效应细胞包括PBMC与NK细胞。替代地，或另外地，可以在体内，例如在诸如Clynes et al.((1998)PNAS(USA)95：652-6)中揭露的动物模型中评估ADCC活性。于此的实施例中也描述了用于评估ADCC活性的示例性分析法(参见，例如实施例19)。
如于此所使用，术语“免疫细胞”包括为造血来源并且在免疫反应中起作用的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞，例如B细胞与T细胞(例如，细胞毒性T细胞、辅助T细胞)；自然杀手细胞；与髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞与粒细胞。术语“T细胞”包括细胞毒性(CD8+)T细胞和辅助(CD4+)T细胞。术语T细胞还包括T辅助1型T细胞(T helper 1 type T cell)与T辅助2型T细胞(T helper 2 type T cell)。术语“抗原呈现细胞”包括专业的抗原呈递细胞(professional antigen-presenting cell)(例如，B淋巴细胞(B lymphocyte)、单核细胞(monocyte)、树突状细胞(dendritic cell)与兰格汉氏细胞(Langerhans cell))以及其他抗原呈现细胞(例如角质形成细胞(keratinocyte)、内皮细胞(endothelial cell)、星形胶质细胞(astrocyte)、成纤维细胞(fibroblast)与寡树突细胞(oligodendrocyte))。
于此所使用，术语“免疫反应”包括受T细胞共刺激的调节影响的T细胞介导的及/或B细胞介导的免疫反应。示例性的免疫反应包括B细胞反应(例如，抗体产生)、T细胞反应(例如，细胞激素产生、细胞之细胞毒性)，及细胞激素应答细胞，例如巨噬细胞的活化。如于此所使用，关于免疫反应的术语“向下调控(downmodulation)”包括任何一种或更多之免疫反应的减少，而关于免疫反应的术语“向上调控(upmodulation)”包括任何一种或更多之免疫反应的增加、增强或刺激。将理解的是，一种类型的免疫反应的向上调控可导致另一种类型的免疫反应的相应向下调控。例如，特定细胞激素之产生的向上调控可导致细胞免疫反应的向下调控。
如于此所使用，术语“共刺激受体(costimulatory receptor)”包括将共刺激信号传递至免疫细胞，例如CD28或ICOS的受体。如于此所使用，术语“抑制性受体(inhibitoryreceptor)”包括将反信号(negative single)传递至免疫细胞的受体(例如，CTLA-4或PD-1)。
如于此所使用，相对于活化的免疫细胞，术语“共刺激(costimulate)”包括共刺激分子提供诱导增殖或效应子功能的第二非活化受体介导的信号(“共刺激信号costimulatory signal”)的能力。例如，共刺激信号可以导致例如，在已经接受T细胞受体介导的信号(T cell-receptor-mediated signal)的T细胞中之细胞激素分泌。已经例如通过活化受体(activating receptor)接收到细胞受体介导的信号的免疫细胞于此称为“经活化的免疫细胞(activated immune cell)”。
即使在免疫细胞上不存在共刺激受体(如，CD28或ICOS)，也可发生由抑制受体转导的抑制信号，因此，这不仅仅是介于抑制受体与共刺激受体之间之共刺激分子之结合的竞争的功能(Fallarino et a1.(1998)J.Exp.Med.188：205)。抑制信号传递至免疫细胞可导致免疫细胞无反应、变应性缺失或程序性死亡。在一些实施例中，抑制信号的传输操作藉由不涉及细胞凋亡(apoptosis)的机制进行。如于此所使用，术语“细胞凋亡”包括程序性细胞死亡，其可以使用该领域已知的技术表征。细胞凋亡细胞死亡可以例如经由细胞收缩(cell shrinkage)、膜起泡(membrane blebbing)与染色质聚集(chromatincondensation)最终导致细胞碎裂为特征。经历细胞凋亡的细胞也表现出核小体间DNA切割(internucleosomal DNA cleavage)的特征性模式。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法与用途，例如用于活化及/或杀死一种或更多之免疫细胞。在一些实施例中，于此所述的治疗方法与用途可用于在一个体中增加、增强或刺激的免疫反应或功能。在一些实施例中，通过于个体中活化效应细胞(例如，T细胞)、扩展(增加)效应细胞群体及/或杀死的靶细胞(例如靶标肿瘤细胞)来增加、增强及/或刺激免疫反应或功能，为以本揭露之抗体或抗原结合片段之处理的结果。
如于此所使用，“免疫细胞活化”以及该根术语(root term)的多个变化(例如，“活化免疫细胞”)是指免疫细胞增殖、活化或增强免疫细胞的一种或更多之标志物的表现(例如，CD69、CD71)、信号物质(例如，IFN-γ、IL-2)分泌的诱导、溶细胞分子(例如，穿孔素(perforin)、颗粒酶B(granzyme B))的分泌的诱导、增强的细胞毒性、细胞激素的产生、细胞迁移、细胞增殖，或这些特性中之任意两个或更多的组合。在一些实施例中，免疫细胞活化的特征在于细胞激素的分泌(例如，IFN-γ、IL-2或两者的分泌)。在一些实施例中，免疫细胞活化的特征在于增强的T细胞功能。免疫细胞活化可以在体外测量，例如，藉由评估依据抗原或TCR介导的刺激的T细胞增殖。于此描述了评估免疫细胞活化的示例性方法(参见，例如，实施例7-9)，其他方法是该领域已知的。
“增强T细胞功能”是指诱导，引起或刺激T细胞以具有持续的或扩增的生物学功能，或更新或重新激活耗尽或失活的T细胞。增强T细胞功能的例子包括相对于干预前之此种水平，细胞毒性T细胞分泌IFN-γ增加，增殖增加以及抗原应答性(例如，病毒、病原体或肿瘤清除率)增加。在一些实施例中，增强之水平为至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、200％，并且可以使用该技术领域具有通常知识者已知的方法来测量。
“免疫相关疾病”是指当生理途径在正常生理中对损伤或伤害作出反应，发起损伤或伤害的修复，及/或进行先天与后天防御，引起直接与反应强度(例如，由于异常调节或过度刺激所致)或对自我的反应相关之额外的侮辱或伤害时发生的任何病理状态。于此所述的与免疫相关的疾病的特定例子包括，癌症(肿瘤形成(neoplasia))、免疫介导的发炎疾病(immune-mediated inflammatory disease)、非免疫介导的发炎疾病(non-immune-mediated inflammatory diseases)、感染性疾病(infectious diseases)与免疫缺陷性疾病(immunodeficiency diseases)。在一些实施例中，免疫相关疾病可以是特征在于对抗原刺激的响应性降低之T细胞的疾病，病症或病状。在一些实施例中，免疫相关疾病可以是其中T细胞无能或具有降低之分泌细胞激素，增殖或执行细胞溶解活性的能力的疾病。在一些实施例中，降低的反应性导致表现免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的免疫相关疾病的例子包括，未解决的急性感染、慢性感染与肿瘤免疫。
“肿瘤免疫性”是指肿瘤逃脱免疫识别(tumors evade immune recognition)与清除的过程。因此，作为治疗概念，当此类逃脱减弱，并且肿瘤被免疫系统识别并攻击时，肿瘤免疫性为“经处理(treated)的”。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合，肿瘤缩小(tumorshrinkage)与肿瘤清除(tumor clearance)。
“免疫原性(immunogenicity)”或“免疫原性(immunogenic)”是指特定试剂或组合物引发免疫反应，例如T细胞反应的能力。免疫反应可以是抗体介导的或细胞介导的，或两者皆有。肿瘤具有免疫原性，而增强肿瘤的免疫原性可藉由免疫反应帮助清除肿瘤细胞。在一些实施例中，可以藉由以于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段的治疗来增强肿瘤的免疫原性。
如于此所使用，术语“检查点抑制剂(checkpoint inhibitor)”是指抑制一种或更多之减少对于一免疫刺激之免疫反应的分子的任何治疗剂，包括任何小分子化合物、抗体、核酸分子或多肽或其任何片段，从而允许更广泛的免疫活性。
如于此所使用，术语“抑制(inhibit)”或“的抑制(inhibition of)”是指与控制组(例如，一未处理的样品)相比在统计学上显著之可测量的量减少，并且可以包括但不要求完全的预防或抑制。
如于此所使用，术语“癌症”与“肿瘤”可以单数或复数形式互换使用，并且意指经历了使其宿主生物病理化的恶性转化的细胞。藉由良好建立的技术，例如组织学检查，可以很容易地区分原发性癌细胞与非癌细胞。如于此所使用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，而且包括源自癌细胞祖先的任何细胞。此包括转移的癌细胞，以及源自癌细胞的体外培养物与细胞株。癌症可表现为实体瘤，例如通过诸如计算器断层扫描(computedtomography，CT)扫描、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、X射线，超音波或触诊之物理检查(physical examination)的程序检查之如基于肿瘤块可检测到的肿瘤，及/或其由于可从个体获得的样品中一种或更多之癌症特异性抗原的表现而为可侦测的。肿瘤也可以是造血(或血液学(hematologic)或血液(hematological)或与血液相关的)癌症，例如源自血细胞或免疫细胞的癌症，可以称为“液体肿瘤”。于此描述的癌症的特定实例包括大肠直肠癌与白血病。在一些实施例中，癌症是大肠直肠癌。
如于此所用，术语“感染”是指致病因子侵入生物体的身体组织，它们的繁殖以及宿主组织对感染因子及其产生的毒素的反应。该术语包括急性与慢性感染。示例性的传染原包括病原体，例如病毒与相关的因子，如类病毒(viroids)与普里昂蛋白(prions)；细菌；真菌；及寄生虫。“感染病”，也称为传染病或传染病，是由感染引起的疾病。一种示例性的感染或传染性疾病是人类T细胞白血病病毒1型相关疾病(human T cell leukemia virustype 1-associated disease)。
术语“个体(subject)”与“患者(patient)”于此可互换使用，以指任何动物，例如任何哺乳动物，包括，但不限于人类，非人类灵长类，囓齿类动物等。在一些实施例中，个体或患者为一哺乳动物。在一些实施例中，个体或患者是一人类。
如于此所使用，术语“试剂”是指化合物，化合物的混合物，生物大分子(biological macromolecule)或由生物材料制成的萃取物。术语“治疗剂”是指能够调节生物学过程及/或具有生物学活性的试剂。于此所述的抗TIGIT抗体与抗原结合片段是示例性治疗剂。
“医药组成物”是指制剂，其形式为允许投予并随后提供活性试剂之预期生物学活性及/或达到治疗效果，并且不包含对要向其施用制剂的个体产生不可接受的毒性的其他成分。该医药组成物可以是无菌的。
如于此所使用，“药学上可接受的载体”包括以所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的载体、稀释剂、赋形剂或稳定剂。在一些实施例中，药学上可接受的载体为水性pH缓冲溶液。药学上可接受的载体的例子包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐与其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，例如甘胺酸、麸酰胺酸、天门冬酰胺酸、精胺酸或离胺酸；单醣、双糖与其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精(dextrin)；螯合剂，如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐的相对离子(salt-forming counterions)，例如钠；及/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。这种载体用于药物活性物质的用途是该领域众所周知的。除非任何一般载体与活性试剂不兼容，否则可考虑将其用于所揭露之组成物中。
一“有效量”之例如于此揭露的抗体或抗原结合片段是足以执行一明确陈述之目的的量，例如在投予后产生治疗作用，如免疫反应的向上或向下调控、一或更多之免疫细胞的活化、一或更多之免疫细胞的杀死、肿瘤生长速率或肿瘤体积的减少、免疫相关疾病(例如癌症、感染或传染病)症状的减少或一些其他治疗效果指标。术语“治疗有效量”是指有效治疗于一个体中之疾病或病症的抗体或抗原结合片段的量。在癌症的情况下，治疗有效量的抗体或抗原结合片段可以减少癌细胞的数量、减小肿瘤的尺寸、抑制(例如，减慢或停止)肿瘤转移、抑制(例如，减慢或停止)肿瘤生长及/或缓解一种或更多之症状。“预防有效量”是指在必要的剂量与时间之期间内有效达到所需之预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或疾病早期于个体中被使用，因此预防有效量将小于治疗有效量。
如于此所使用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“治疗的(therapeutic)”(以及语法相关的术语)是指疾病的任何后果的任何改善，例如延长的生存期，较低的发病率及/或减轻之由其他治疗方式导致的副作用。如本领域中容易理解的，涵盖了疾病的完全根除，但对于治疗行为并非必需的。于此所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”也可以指将所述抗体或抗原结合片段投予于个体，例如患有或怀疑患有免疫相关疾病的个体，例如癌症，感染或传染病。治疗可以是治愈(cure)、痊愈(heal)、减轻(alleviate)、缓解(relieve)、改变(alter)、补救(remedy)、改善(ameliorate)、减轻(palliate)或改善(improve)其他方式影响疾病，疾病之症状或个体对疾病的易感性。在一些实施例中，除了治疗患有疾病的个体之外，还可以预防性地提供于此揭露之组成物以预防或减少发展该疾病的可能性。
抗TIGIT抗体
在一些实施例中，本揭露关于结合及/或调节TIGIT活性的抗体及其抗原结合片段，以及它们在治疗组成物中的用途。在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段特异性结合TIGIT。在一些实施例中，于此揭露之抗体与抗原结合片段能够减少或阻断TIGIT与CD155的相互作用。在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段可以单独使用或作为药学组成物或组合疗法(combination therapy)的一部分被投予。
在一些实施例中，于此揭露之抗体与抗原结合片段是人源化的。在一些实施例中，于此揭露之抗体与抗原结合片段含有源自非人类(例如，小鼠)抗体的最小序列，并保留非人类抗体的反应性，同时在人中的免疫原性较低。在一些实施例中，相较于参考抗TIGIT抗体或抗原结合片段，于此揭露之抗体与抗原结合片段具有一或更多之经改善的性质，包括，例如结合亲和力，交叉反应性，T细胞活化活性，体内抗癌活性或抗体依赖性细胞媒介细胞毒性。具体而言，在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段可证明以下之一或更多：例如相较于参考抗TIGIT抗体或抗原结合片段，对人类TIGIT的高结合亲和力；人类TIGIT、食蟹猴(cyno)TIGIT及/或小鼠TIGIT之间的交叉反应；有效的T细胞活化活性；有效的体内抗癌活性；及/或强有力之对TIGIT表现之调节性T细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。由于这些改善的特性中的一些或全部，所揭露之抗体和抗原结合片段可以用作治疗剂，例如用于治疗或推迟个体(例如，人类)中与免疫有关的疾病(例如，癌症，感染或传染性疾病)的进展。
在一些实施例中，于此揭露之抗体和抗原结合片段结合例如在免疫细胞上表现的TIGIT。抗体或抗原结合片段可以藉由例如流式细胞分析技术分析以≤1mM、≤100nM、≤10nM或其之间的任何量的解离常数(KD)结合TIGIT。在一些实施例中，通过例如流式细胞术分析技术测量，KD在0.1nM至10nM之间。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是包含两条重链与两条轻链的四链抗体(也称为免疫球蛋白)。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是两链半体(一条轻链与一条重链)或一免疫球蛋白的抗原结合片段。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是免疫球蛋白的抗原结合片段，其保留结合标靶抗原(例如TIGIT)及/或提供免疫球蛋白之功能的能力。
在一些实施例中，于此揭露之抗体或抗原结合片段可以包含选自表3中列出的那些的成对的重链与轻链可变区组，或来自成对的重链与轻链组的六个CDR序列组，例如，表2中列出的一组CDR。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段还包含人重链与轻链框架(任选地具有一个或更多之反向突变，例如，以改善结合亲和力)及/或人重链与轻链恒定区或其片段。例如，抗体或抗原结合片段可包含人类IgG重链恒定区(任选地具有一个或更多之突变，例如以修饰效应子功能)与人类κ或λ轻链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含具有人类Ig κ轻链恒定区的人类免疫球蛋白G亚型1(IgG1)重链恒定区。
本揭露之示例性抗体的胺基酸序列列于表2-5中列出。
表2、抗TIGIT抗体之Kabat CDR的胺基酸序列
Figure BDA0002697162600000301
Figure BDA0002697162600000311
表3、抗TIGIT抗体之可变区的胺基酸序列
Figure BDA0002697162600000312
Figure BDA0002697162600000321
Figure BDA0002697162600000331
Figure BDA0002697162600000341
表4、抗TIGIT抗体之恒定区的胺基酸序列
Figure BDA0002697162600000342
Figure BDA0002697162600000351
表5、选择之抗TIGIT抗体全长Ig链的胺基酸序列
Figure BDA0002697162600000352
Figure BDA0002697162600000361
Figure BDA0002697162600000371
Figure BDA0002697162600000381
在一些实施例中，所揭露之抗体或抗原结合片段可包含上表所列的任何组之重链与轻链可变区，或来自重链与轻链组的六个CDR序列的组，例如，藉由将六个CDR移植到选定的人类供体抗体框架中。在一些实施例中，于此所揭露之抗体或抗原结合片段可包含与上表所列序列同源的胺基酸序列，只要抗体或抗原结合片段保持结合TIGIT的能力(例如，具有小于1×10-8M的KD)及/或保留于此所揭露之抗体和抗原结合片段的一种或更多之功能特性(例如，减少或阻断TIGIT与CD155的相互作用的能力等)。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列(germline)重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：39的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：40的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：39的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：40的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：39的胺基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区，及与序列辨识号：40的胺基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的1A11之重链与轻链可变区，或来自成对的1A11重链与轻链的六个CDR序列。
于此所述之示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含，三个重链互补决定区(HCDR)，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3的胺基酸序列(HCDR3)；及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列(germline)重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：39的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：40的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：39的胺基酸序列的重链可变区与含有序列辨识号：40的胺基酸序列的轻链可变区。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：46的胺基酸序列的重链与含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：46的胺基酸序列至少90％相同的重链，及与序列辨识号：48的胺基酸序列至少90％相同的轻链。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：46的胺基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链胺基酸序列，及与序列辨识号：48的胺基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链胺基酸序列。在一些实施例中，重链进一步包含C端离胺酸(lysine，K)。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：47的胺基酸序列的重链与和含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：47的胺基酸序列至少90％相同的重链，及与序列辨识号：48的胺基酸序列至少90％相同的轻链。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：47至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链胺基酸序列，及/或与序列辨识号：48至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链胺基酸序列。在一些实施例中，重链进一步包含C端离胺酸(K)。
于此所述之的示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段包括包含序列辨识号：44的胺基酸序列的重链恒定区与包含序列辨识号：45的胺基酸序列的轻链恒定区。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：47的胺基酸序列的重链与含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，重链恒定区或重链还包含C端离胺酸(K)。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是1A11。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)，序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：24(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：41的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：42的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：41的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：42的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：41的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：42的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：41至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：42至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的1E3之重链与轻链可变区，或来自成对的1E3重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是1E3。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：25的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：26的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：25的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：26的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：25的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：26的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：25至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：26至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的7D4之重链与轻链可变区，或来自成对的7D4重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是7D4。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：31的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：32的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：31的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：32的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：31的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：32的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：31至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：32至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的hz7D4之重链与轻链可变区，或来自成对的hz7D4重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是hz7D4。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)，序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：19(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：33的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：34的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：33的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：34的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：33的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：34的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：33至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：34至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的1G3之重链与轻链可变区，或来自成对的1G3重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是1G3。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)，序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：20(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：35的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：36的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：35的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：36的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：35的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：36的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：35至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：36至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的2F1之重链与轻链可变区，或来自成对的2F1重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是2F1。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：21(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：37的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：38的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：37的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：38的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：37的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：38的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：37至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：38至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的3H2之重链与轻链可变区，或来自成对的3H2重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是3H2。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含以下序列的胺基酸序列：序列辨识号：7(HCDR1)，序列辨识号：8(HCDR2)与序列辨识号：9(HCDR3)；及三个LCDR，其包含序列辨识号：10(LCDR1)，序列辨识号：11(LCDR2)与序列辨识号：12(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：27的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：28的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：27的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：28的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：27的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：28的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：27至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：28至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的2C9之重链与轻链可变区，或来自成对的2C9重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是2C9。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含，三个HCDR，其包含序列辨识号：13(HCDR1)、序列辨识号：14(HCDR2)与序列辨识号：15(HCDR3)的胺基酸序列；及三个LCDR，其包含序列辨识号：16(LCDR1)、序列辨识号：17(LCDR2)与序列辨识号：18(LCDR3)的胺基酸序列。
在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：29的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：30的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含：重链可变区，其包含序列辨识号：29的胺基酸序列；及轻链可变区，其包含序列辨识号：30的胺基酸序列，或与所揭露之续列至少90％相同之序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：29的胺基酸序列至少90％相同的重链可变区，及与序列辨识号：30的胺基酸序列至少90％相同的轻链可变区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含与序列辨识号：29至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的重链可变区胺基酸序列；及/或与序列辨识号：30至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的轻链可变区胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段包含成对的3A9之重链与轻链可变区，或来自成对的3A9重链与轻链的六个CDR序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或其抗原结合片段是3A9。
在一些实施例中，于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段(例如，以上讨论的任何示例性抗体或抗原结合片段)包含IgG1重链恒定区，或经突变以修饰效应子(effector)功能之一人类IgG1重链恒定区。在一些实施例中，重链恒定区是人类IgG1重链恒定区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，其包含序列辨识号：43的胺基酸序列。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，其包括经突变以包括在位置239、330与332之胺基酸取代之序列辨识号：43之胺基酸序列。在序列辨识号：43之位置239的S被以D取代；在序列辨识号：43之位置330的A被以L取代；在序列辨识号：43之位置332的I被以E取代。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，其包含序列辨识号：44的胺基酸序列。在一些实施例中，重链恒定区还包含C端离胺酸(K)。
在一些实施例中，于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段(例如，以上讨论的任何示例性抗体或抗原结合片段)包含IgG2(例如，IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重链恒定区，或经突变以修饰效应子功能之IgG2(例如，IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重链恒定区。在一些实施例中，重链恒定区是人类IgG2(例如，IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4重链恒定区。
在一些实施例中，于此所述的抗TIGIT抗体或抗体或抗原结合片段(例如，以上讨论的任何示例性抗体或抗原结合片段)包含Ig κ轻链恒定区。在一些实施例中，所述Ig κ轻链恒定区是人类Ig κ轻链恒定区。在一些实施例中，抗TIGIT抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含序列辨识号：45的胺基酸序列。
在一些实施例中，于此所述的抗TIGIT抗体或抗体或抗原结合片段(例如，以上讨论的任何示例性抗体或抗原结合片段)包含Igλ(lambda)轻链恒定区。在一些实施例中，Igλ轻链恒定区是人类Igλ轻链恒定区。
在一些实施例中，于此揭露之抗体或抗原结合片段特异性结合人类TIGIT，其中所述抗体或抗原结合片段结合至人类TIGIT之一区域，此区域包括在序列辨识号：22之位置106的Y。在一些实施例中，以下之一或更多序列辨识号：22之位置56的Q；序列辨识号：22之位置74的G；序列辨识号：22之位置110处的Y；及在序列辨识号：22之位置111的H。在一些实施例中，此区域还包括在序列辨识号：22之位置56的Q。在一些实施例中，该区域还包括在序列辨识号：22之位置74的G。在一些实施例中，该区域还包括在序列辨识号：22之位置110的Y。在一些实施例中，该区域还包括在序列辨识号：22之位置111的H。在一些实施例中，此区域包括以下全部：序列辨识号：22之位置56的Q；序列辨识号：22之位置74的G；序列辨识号：22之位置106的Y；序列辨识号：22之位置110的Y；与序列辨识号：22之位置111的H。
在一些实施例中，该区域至少包括：在序列辨识号：22之位置56的Q；与序列辨识号：22之位置106的Y。在一些实施例中，该区域至少包括：在序列辨识号：22之位置56的Q；在序列辨识号：22之位置74的G；序列辨识号：22之位置106的Y；与序列辨识号：22之位置110的Y。在一些实施例中，此区域是非线性的。
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段与参考抗体或抗原结合片段竞争结合人类TIGIT，其中参考抗体或抗原结合片段包含三个重链互补决定区(HCDR)，其包含胺基酸序列序列辨识号：1(HCDR1)，序列辨识号：2(HCDR2)和序列辨识号：3(HCDR3)的序列；及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)和序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，该抗体或抗原结合片段与参考抗体或抗原结合片段结合到人类TIGIT的相同区域，其中该参考抗体或抗原结合片段包含，三个重链互补决定区(HCDR)，其包含序列辨识号：1(HCDR1)，序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)的胺基酸性序列；及三个轻链互补决定区(LCDR)，其包含序列辨识号：4(LCDR1)，序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)的胺基酸序列。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含人类生殖系列重链与轻链框架区，或人类生殖系列重链与轻链框架区经突变以包含一个或更多之胺基酸取代。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：39的胺基酸序列的重链可变区和含有序列辨识号：40的胺基酸序列的轻链可变区。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含包含序列辨识号：44的胺基酸序列的重链恒定区和包含序列辨识号：45的胺基酸序列的轻链恒定区。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段包含含有序列辨识号：47的胺基酸序列的重链与含有序列辨识号：48的胺基酸序列的轻链。在一些实施例中，重链恒定区或重链还包含C端离胺酸(K)。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段是1A11。在一些实施例中，参考抗体或抗原结合片段是于此揭露的另一种示例性抗体或抗原结合片段。
于此揭露之抗体和抗原结合片段可以包括进一步的修饰(例如，一个或更多之胺基酸取代，缺失及/或插入)，同时保持与TIGIT结合的能力。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含特定的修饰(例如相对于参考序列)，并且除了指定的修饰外，任选地包含至多约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个胺基酸修饰。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区除了任何指定的胺基酸修饰外还包含多达约2个，多达约5个或多达约10个胺基酸的修饰。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，该重链恒定区除了任何指定的胺基酸修饰之外还包含多达约2个，多达约5个或多达约10个胺基酸的修饰。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区除了任何指定的胺基酸修饰之外还包含多达约2个，多达约5个或多达约10个胺基酸的修饰。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区除了任何指定的胺基酸修饰之外还包含多达约2个，多达约5个或多达约10个胺基酸的修饰。
在一些实施例中，胺基酸取代是单个残基。插入通常将在约1至约20个胺基酸残基的数量级，尽管只要保留了生物学功能(例如，与TIGIT结合)即可以容许相当大的插入。缺失通常在约1至约20个胺基酸残基的范围内，尽管在某些情况下，只要保留生物学功能(例如，与TIGIT结合)，缺失可能要大得多。取代，缺失，插入或其任何组合可用于获得最终的衍生物或变体。通常，这些改变是在尽可能少的胺基酸上进行的，以最小化分子的改变，特别是抗原结合蛋白的免疫原性与特异性。然而，在某些情况下，只要保留生物学功能(例如，与TIGIT结合)，即可以容许较大的变化。保守取代通常根据提供功能相似胺基酸的表进行，例如以下表6所示的示例性表与其他在本领域中为已知者。
表6
Figure BDA0002697162600000481
Figure BDA0002697162600000491
在一些实施例中，可以藉由选择比表6所示的保守度低的取代度来进行功能或免疫学特性的实质性改变。例如，可以进行更显著影响的取代：在改变区域中的多肽主链的结构，例如α-螺旋或β-褶板结构；标靶位点上分子的电荷或疏水性；或大部分侧链。通常可在多肽特性上产生最大变化的取代是其中(a)亲水残基(例如丝胺酸或苏胺酸)取代为疏水残基(或被其取代)，例如白胺酸，白亮胺酸、苯丙胺酸、缬胺酸或丙胺酸；(b)半胱胺酸或脯胺酸取代为(或被其取代)其他残基；(c)具有正电侧链的残基，例如离胺酸、精胺酸或组胺酸取代为(或被其取代)麸胺酸或天门冬胺酸等电负性残基；或(d)具有庞大的侧链例如苯丙胺酸的残基取代为(或被其取代)没有侧链的甘胺酸。
在抗体或抗原结合片段中使用变体抗体序列的一些实施例中，变体通常表现出相同的定性生物学活性并会引发相同的免疫反应，尽管也可以选择变体以根据需要修饰抗原结合蛋白的特征。此外，在一些实施例中，本揭露的抗体可以被化学修饰(例如，一个或更多之化学部分可以连接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，例如，以改变抗体或抗原结合片段的一或更多之功能特性。
可以在框架或CDR区域内进行改变(例如取代)，例如以维持或改善抗体亲和力。此类改变可以在“热点(hotspots)”中进行，即由在体细胞增强过程中经历高频突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury(2008)Methods Mol.Biol.207：179-96)，及/或与抗原接触的残基，并测试所得变异体VH或VL的结合亲和力。藉由构建与从二级库(secondarylibrary)中重选来进行亲和力增强，例如在Hoogenboom et al.in Methods in MolecularBiology 178：1-37(O′Brien et al.，ed.，Human Press，Totowa，N.J.，(2001))中，已有描述。在亲和力增强的一些实施例中，藉由多种方法(例如，易错(PCRerror-prone PCR)、链改组(chain shuffling)或寡核苷酸定向诱变(oligonucleotide-directed mutagenesis))中的任一种将多样性引入选择用于增强的可变基因中。然后创建一个二级库。然后筛选该库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中几个CDR残基(例如一次4-6个残基)是随机的。可以例如使用丙胺酸扫描诱变(alaninescanning mutagenesis)或建模(modeling)来特异性地鉴定涉及抗原结合的CDR残基。特别是HCDR3与LCDR3通常是为目标。在于此之实施例中描述了用于亲和力增强的示例性方法(参见，例如，实施例13、14与17)。
除了在框架或CDR区域内进行的修饰外，还可对本揭露内容的抗体进行改造，使其包括在Fc区域内的修饰，通常可改变抗体或抗原结合片段的一或更多之功能特性，例如血清半衰期(serum half-life)、补体固定(complement fixation)、Fc受体结合(Fcreceptor binding)及/或抗原依赖性细胞毒性(antigen-dependent cellularcytotoxicity)。此类的抗体在于此描述与举例说明。在一些实施例中，将一或更多之胺基酸修饰引入本揭露的抗体或抗原结合片段的Fc区中，从而产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一个或更多之胺基酸位置包含胺基酸修饰(例如，取代)的人类Fc区序列(例如，人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。可以例如使用EU编码系统来描述Fc区内的胺基酸位置(Kabat et al.“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”U.S.Departmentof Health and Human Services，U.S.Government Printing Office(1991))。在一些实施例中，此类的变体包含具有一个或更多之胺基酸取代的Fc区，以修饰效应子功能，例如以改善或增强ADCC，例如在Fc区的239、330及/或332位上的取代(EU残基的编号)(参见，例如，Lazar et al.(2006)Proc NatlAcad Sci USA 103(11)：4005-10)。
于此所述的胺基酸取代可以藉由列出绝对残基位置，然后列出取代的(即，置换)胺基酸之三个字母或一个字母的代码来表示。例如，可以将序列辨识号：43(残基的EU编号)的位置239位丝胺酸的天门冬胺酸取代表示为“Ser239Asp”或“S239D”。在该例子中，丝胺酸是被取代的胺基酸(或“被取代的”胺基酸)，而天门冬胺酸是要取代丝胺酸的胺基酸(或“置换”胺基酸)。
在一些实施例中，于此所述的抗体或抗原结合片段能够结合人类TIGIT，食蟹猴(cyno)TIGIT及/或小鼠TIGIT。在一些实施例中，于此所述的抗体或抗原结合片段除人类TIGIT外还能够与小鼠TIGIT结合。在一些实施例中，于此所述的抗体或抗原结合片段除人类TIGIT外还能够与食蟹猴TIGIT结合。在一些实施例中，于此所述的抗体或抗原结合片段能够结合人类TIGIT，但不能结合小鼠或食蟹猴TIGIT。在一些实施例中，于此所述的抗体或抗原结合片段能够与人类TIGIT、食蟹猴TIGIT与小鼠TIGIT结合。
在一些实施例中，于此揭露之抗体或抗原结合片段可以单独使用(例如，作为抗体或抗原结合片段)，与一或更多之另外的试剂连接(例如，作为抗体-药物缀合物)，或为较大之大分子(macromolecule)的一部分(例如，双特异性抗体或多特异性抗体)。例如，在一些实施例中，抗体或抗原结合片段是双特异性或多特异性抗体中的抗原结合域及/或是其一部分。在一些实施例中，抗原结合域是抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合域及/或抗原结合片段是单链可变片段(scFv)或Fab片段。在一些实施例中，单独或作为较大的大分子的一部分使用的于此揭露之抗体和抗原结合片段可包括进一步的修饰(例如，一个或更多之胺基酸取代，缺失及/或插入)，同时保留TIGIT结合功能。
在一些实施例中，本揭露提供了分离的及/或基本上纯化的核酸分子(也称为多核苷酸)，其编码全长多肽或包含于此所述之抗体和抗原结合片段的片段的多肽。在一些实施例中，单个核酸可以同时包含于此所揭露之抗体或抗原结合片段的重链可变区与轻链可变区的编码序列，并且还任选地包含一个或更多之恒定区的编码序列。或者，这些编码序列中的一些或全部可以驻留在分开的核酸分子上。当从合适的表现载体表现时，由这些多核苷酸编码的多肽能够结合TIGIT(例如，人类TIGIT)。
于此还提供了多核苷酸，其编码来自本揭露的示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段的重链及/或轻链的至少一个CDR区，并且通常编码所有三个CDR区。于此还提供了编码本揭露的示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段的重链及/或轻链的全部或基本上所有可变区序列的多核苷酸。由于遗传密码的简并性(degeneracy ofthe genetic code)，多种核酸序列将编码于此所揭露之的各示例性胺基酸序列。
于此还提供了表现载体、宿主细胞与产生本揭露的抗TIGIT抗体和抗原结合片段的方法。
在一些实施例中，本揭露提供了编码于此揭露之抗体或抗原结合片段的分离的核酸。在一些实施例中，本揭露提供了分离的载体，其包含编码于此揭露之抗体或抗原结合片段的分离的核酸。在一些实施例中，本揭露提供了分离的细胞或细胞族群，其包含分离的核酸，或载体，其包含编码于此揭露之抗体或抗原结合片段的分离的核酸。在一些实施例中，本揭露提供了在适于产生抗体或抗原结合片段的条件下，藉由培养经修饰以包含编码于此所述的抗体或抗原结合片段的一个或更多之核酸序列的宿主细胞或细胞群体来产生抗体或抗原结合片段的方法。在一些实施例中，该方法进一步包括分离，纯化及/或回收产生的抗体或抗原结合片段的步骤。
术语“载体”旨在指能够运输及/或控制已与其连接的另一多核苷酸的表现的多核苷酸分子。载体的一种类型是“质体”，其是指环状的双链DNA环，其中可以连接另外的DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体(episomal mammalian vector))。在导入宿主细胞后，可以将其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体(non-episomal mammalian vector))整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体可以指导与其可操作连接的基因的表现。此类载体在于此中称为“表现载体”或“重组表现载体”。通常，在重组DNA技术中有用的表现载体通常是质体的形式。本揭露意在包括质体以及其他形式的表现载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型反转录病毒(retroviruses)或慢病毒(lentiviruses)、腺病毒(adenoviruses)与腺相关病毒(adeno-associated viruses))，其具有相同的功能。
用于接收编码抗TIGIT抗体重链及/或轻链可变区或其抗原结合片段的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类的载体允许可变区或其片段表现为具有恒定区的融合蛋白，从而导致全长抗体或其抗原结合片段的产生。在一些实施例中，这样的恒定区是人类的。在一些实施例中，恒定区是人类IgG1重链恒定区。在一些实施例中，恒定区是人类Ig κ轻链恒定区。在其他实施例中，恒定区是小鼠IgG2(例如，IgG2a)重链恒定区。在一些实施例中，恒定区是小鼠Ig κ轻链恒定区。
术语“宿主细胞”是指被人工改造为包含编码肽序列的核酸的细胞(或细胞族群)，其将转录并转译，并任选地将肽分泌到细胞生长培养基中。为了重组产生目的，通常藉由一般方法合成或选殖编码肽的胺基酸序列的核酸，并将其整合到表现载体中。术语“宿主细胞”不仅指特定的个体细胞，而且指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在于此所使用之术语的范围内。
带有和表现编码抗TIGIT抗体链或抗原结合片段的核酸的宿主细胞可以是原核或真核的。在一些实施例中，哺乳动物宿主细胞用于表现与产生本揭露的抗TIGIT多肽。例如，它们可以是表现内源性免疫球蛋白基因的融合瘤细胞株，也可以是具有外源性表现载体的哺乳动物细胞株。这些包括任何正常的会死的，或正常或异常的永生的动物或人类细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞株，包括CHO细胞株，各种COS细胞株、HeLa细胞、骨髓瘤细胞株、转化的B细胞与融合瘤。示例性宿主细胞包括，但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如CHO-S)、人类胚肾(human embryonic kidney，HEK)细胞(例如293T)、猴肾(COS)细胞(例如COS-1，COS-7)、幼仓鼠肾(baby hamster kidney，BHK)细胞(例如，BHK-21)、非洲绿猴肾(African green monkey kidney)细胞(例如，BSC-1)、HeLa细胞、人类肝癌细胞(例如，Hep G2)、骨髓瘤细胞(例如，NS0、653SP2/0)与淋巴瘤细胞，或其任何衍生的、永生的或转形的细胞。在一些实施例中，宿主细胞或细胞族群包含一个或更多之CHO细胞(例如，CHO-S)。在一些实施例中，宿主细胞或细胞群体包含一个或更多之骨髓瘤细胞(例如，NS0)。
在一些实施例中，可以将编码抗TIGIT抗体或抗原结合片段的重链及/或轻链的一或更多之核酸分子，或包含这种核酸分子的一或更多之表现载体，引入合适的宿主细胞中(例如，一个或更多之CHO-S细胞或一个或更多之NS0细胞)，使用适合所选宿主细胞的任何方法(例如，转形、转染、电穿孔、感染)创建重组宿主细胞，从而使核酸分子可操作地连接至一个或更多之表现控制组件(例如，在载体中，在藉由细胞中的过程产生的构筑体中，或整合到宿主细胞基因组中)。在一些实施例中，可以将所得重组宿主细胞维持在适于表现或产生的条件下(例如，在诱导剂的存在下，在合适的非人类动物中或在补充有合适的盐、生长因子、抗生素、营养补品等)，从而产生编码的多肽。若需要，可以分离或回收编码的蛋白质(例如，从动物、宿主细胞或培养基中)。该过程包括在转基因非人类动物的宿主细胞中表现(参见，例如国际公开号WO 1992/003918)。此外，可以使用已知技术来增强来自生产细胞系的抗体链或其抗原结合片段的表现。例如，麸酰胺酸合成酶(glutamine synthetase)与DHFR基因表现系统(DHFR gene expression system)是在特定条件下增强表现的常用方法。可以使用常规技术，例如限制性稀释选殖体(limited dilution cloning)、凝胶微滴技术(gel micro-drop technology)或该领域已知的任何其他方法，来鉴定高表现的细胞选殖体。
医药组成物
在一些实施例中，本揭露提供了医药组成物，其包含一或更多之于此揭露之抗体及/或一或更多之抗原结合片段和至少一种药学上可接受的载体。
合适的载体包括当与治疗组合物结合时保留治疗组合物的功能并且通常与患者的免疫系统不反应的任何材料。药学上可接受的载体包括生理上兼容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、组胺酸、右旋糖，甘油、乙醇、甲磺酸盐等中的一或更多之，及其的组合。在一些实施例中，组成物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可延长抗体或抗原结合片段的保质期或有效性。
在一些实施例中，于此所述之医药组成物包含抗体或抗原结合片段的多个复本。在一些实施例中，于此所述之医药组成物包含至少一种其他试剂。在一些实施例中，医药组成物可以包含一或更多之另外的治疗剂，例如，一或更多之能够治疗或延迟免疫相关疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的进展的药剂。这种治疗剂的非限制性实例包括检查点抑制剂，例如靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、OX40、CD40、LAG3、TIM3、GITR及/或KIR的检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是对其标靶具有抑制或激动活性的抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂被抑制性抗体或其他类似的抑制性分子所靶向。在其他实施例中，检查点抑制剂被激动剂抗体或其他类似的激动剂分子所靶向。在一些实施例中，检查点抑制剂靶向PD-1及/或PD-L1。
治疗用途与组成物
于此揭露之抗体、抗原结合片段及/或医药组成物可用于各种治疗应用中。于此揭露使用公开的抗体、抗原结合片段及/或医药组成物治疗个体的免疫相关疾病(例如，癌症或感染或感染性疾病)的方法。抗体及/或抗原结合片段可以单独施用或与一或更多之其他治疗剂组合投予，并且可以任何药学上可接受的制剂，剂量和给药方案投予。可以评估于此所述的抗体或抗原结合片段治疗的毒性以及功效指标，并据此进行调整。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法和用途，例如用于活化及/或杀死一或更多之免疫细胞。在一些实施例中，于此所述的治疗方法和用途可用于增加，增强或刺激个体的免疫反应或功能。在一些实施例中，例如，藉由活化效应细胞(例如，T细胞)，扩大效应细胞族群及/或杀死个体中的标靶细胞(例如，标靶肿瘤细胞)来增加，增强及/或刺激至少一种免疫反应或功能为以本揭露的抗体或抗原结合片段治疗的结果。
在一些实施例中，以本揭露之抗体、抗原结合片段及/或组成物治疗的个体中的一或更多之免疫细胞(例如，T或NK细胞，例如细胞毒性T细胞)具有一或更多之增加或增强的作用。与治疗前的这些特性相比，这些特性包括启动、活化、增殖、细胞激素释放及/或细胞溶解活性。在一些实施例中，与治疗前的数目相比，以本揭露之抗体、抗原结合片段及/或组成物治疗的个体中的免疫细胞(例如，T或NK细胞，例如细胞毒性T细胞)的数目增加了。在一些实施例中，与治疗前的数目相比，与本揭露相比，以抗体、抗原结合片段及/或组成物治疗的个中的经活化的免疫细胞(例如，活化的T或NK细胞，例如活化的细胞毒性T细胞)的数目增加了。在一些实施例中，与治疗前的活性相比，活化的免疫细胞的特征在于产生IFN-γ的CD4+及/或CD8+T细胞及/或细胞溶解活性增强。在一些实施例中，与治疗之前的释放相比，活化的免疫细胞可表现出增加的细胞激素(例如，IFN-γ，TNF-α和白介素(例如，IL-2))的释放。
在一些实施例中，本揭露提供了一种在需要其的个体中活化及/或杀死一个或更多之免疫细胞的方法，其包括向该个体投予有效量的于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的药物组成物。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗(pembrolizumab)。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物，用于在需要其的个体中活化及/或杀死一个或更多之免疫细胞。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞，一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在活化及/或杀死需要其的个体中的一个或更多之免疫细胞中的用途。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞、一或更多之细胞毒性T细胞、一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供于此文所述的抗体或抗原结合片段在制造用于活化及/或杀死需要其的个体中的一个或更多之免疫细胞的药物中的用途。在一些实施例中，活化一或更多之免疫细胞包括活化一或更多之天然杀手细胞，一或更多之细胞毒性T细胞，一或更多之辅助T细胞及/或一或更多之单核细胞。在一些实施例中，一或更多之免疫细胞包含一或更多之天然杀手细胞及/或一或更多之细胞毒性T细胞。在一些实施例中，杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节性T细胞。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法和用途，例如用于治疗癌症。可以治疗多种癌症及/或可以延迟其发展。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。癌症(例如，大肠直肠癌)可以处于早期、中间或晚期。
在一些实施例中，本揭露提供了一种在有此需要的个体中治疗癌症的方法，该方法包括对个体投予治疗有效量的于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是大肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物，用于在需要其的个体中治疗癌症。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是大肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在治疗有此需要的个体中的癌症的用途。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是大肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供于此所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗有此需要的个体中的癌症的药物中的用途。在一些实施例中，癌症表现CD155。在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，所述癌症是结肠直肠癌。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，于此提供了所描述的抗体及/或抗原结合片段的治疗方法和用途，例如用于治疗感染或传染病。在一些实施例中，感染或传染性疾病是急性或慢性感染(例如，急性或慢性病毒感染)。在一些实施例中，感染或感染性疾病是逆转录病毒感染，例如影响T细胞的反转录病毒感染，例如人类T细胞白血病病毒1型相关疾病(human T cellleukemia virus type 1-associated disease)。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人类T细胞白血病病毒1型相关疾病。
在一些实施例中，本揭露提供了一种在有此需要的个体中治疗感染或传染性疾病的方法，其包括对个体投予治疗有效量的于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人类T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合投予。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段，或于此所述的医药组成物，用于在有需要的个体中治疗感染或传染性疾病。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露提供了于此所述的抗体或抗原结合片段或于此所述的医药组成物在治疗有此需要的个体中的感染或传染性疾病中的用途。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人类T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段或医药组成物与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
在一些实施例中，本揭露内容提供了于此所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗需要其的个体的感染或传染性疾病的药物中的用途。在一些实施例中，感染或感染性疾病是人T细胞白血病病毒1型相关疾病。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段将与至少一种其他治疗剂组合施用。在一些实施例中，至少一种其他治疗剂包括检查点抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1拮抗剂抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。
可以通过任何合适的方式投予本揭露的抗TIGIT抗体，抗原结合片段及/或组合物(及/或任何其他治疗剂)，包括肠胃外，肺内和鼻内，且若需要的话，局部治疗(localtreatment)病灶内投予(intralesional administration)。示例性的肠胃外给药途径包括肌内，静脉内，动脉内，腹膜内和皮下。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，部分取决于给药是急性还是慢性。于此考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药，推注给药和脉冲输注。在一些实施例中，本揭露的抗TIGIT抗体，抗原结合片段及/或组合物在被诊断出患有疾病之后并且在疾病被治愈或消除之前被施用。在一些实施例中，个体处于疾病的早期阶段。在一些实施例中，所述个体处于疾病的中期。在一些实施例中，个体处于疾病的晚期。在一些实施例中，当鉴定出个体处于危险中但在个体发展出疾病症状之前，投予本揭露的抗TIGIT抗体，抗原结合片段及/或组合物。.
本揭露的抗TIGIT抗体，抗原结合片段及/或组合物可以单独施用或与至少一种其他治疗剂(例如检查点抑制剂，抗癌剂等)组合施用。当与另外的治疗剂组合施用时，可以根据其标准剂量及/或给药方案来施用另外的治疗剂。或者，与其标准剂量及/或给药方案相比，可以以更高或更低的量及/或频率投予另外的治疗剂。在一些实施例中，相较于其标准剂量及/或给药方案，另外的治疗剂以较低的量及/或频率投予。
另外的治疗剂(例如，可以与于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段组合施用的治疗剂)可以包含适合于所治疗的特定适应症的任何活性剂(例如，癌症或感染或传染性疾病))，例如具有互补活动且彼此之间没有不利影响的活动。在一些实施例中，另外的治疗剂是检查点抑制剂，免疫调节剂，细胞毒性剂或细胞抑制剂。在一些实施例中，另外的治疗剂是检查点抑制剂。
如于此所述，检查点抑制剂的治疗策略通常基于以下假设：治疗促进及/或增强针对弱或差抗原性肿瘤(例如，CTLA-4)的T细胞应答的引发，或治疗可恢复及/或恢复对抗原有反应，但由于抗原呈现的长期性质(例如PD-1，PD-L1)而变得“精疲力竭”之T细胞活力(Chen and Mellman(2013)Immunity 39(1)：1-10)。合适的检查点抑制疗法和试剂例如抗PD-1，抗PD-L1和抗CTLA-4抗体的例子是本领域已知的。参见例如，WO 2001/014424、WO2013/173223、WO 2016/007235。
在一些实施例中，检查点抑制剂(例如，可以与于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段组合施用的检查点抑制剂)是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)途径的抑制剂。CTLA-4，也称为CD152，是一种向下调控之免疫反应的蛋白质受体。CTLA-4在调节性T细胞中组成性表现，但在激活后仅在常规T细胞中向上调控。如于此所用，术语“CTLA-4抑制剂”是指CTLA-4及/或CTLA-4途径的任何抑制剂。示例性的CTLA-4抑制剂包括但不限于抗CTLA-4抗体。示例性的抗CTLA-4抗体包括但不限于依匹莫单抗(ipilimumab)(MDX-010)和曲美木单抗(tremelimumab)(CP-675,206)，两者都是完全人类的。依匹莫单抗是一种IgG1，血浆半衰期约为12-14天。曲美木单抗是一种IgG2，血浆半衰期约为22天。参见，例如，Phan et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100：8372-7；Ribas et al.(2005)J Clin Oncol.23：8968-77；Weber et al.(2008)J Clin Oncol.26：5950-6。在一些实施例中，检查点抑制剂是依匹莫单抗。在一些实施例中，检查点抑制剂是曲美木单抗。
在一些实施例中，检查点抑制剂(例如，可以与于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段组合施用的检查点抑制剂)是程序性死亡1(PD-1)途径的抑制剂。程序性细胞死亡1(PD-1)途径代表一种免疫控制开关，肿瘤细胞可能参与该开关，以克服主动性T细胞免疫监视。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)在各种肿瘤中组成性表现或诱导。如于此所用，术语“PD 1抑制剂”是指PD-1及/或PD-L1途径的任何抑制剂。示例性的PD-1抑制剂包括但不限于抗PD-1和抗PD-L1抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体包括但不限于尼武单抗和派姆单抗(MK-3475)。例如，Nivolumab是一种完全人免疫球蛋白G4(IgG4)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，可破坏PD-1受体与其配体PD-L1和PD-L2的相互作用，从而抑制细胞免疫反应(Guo et al.(2017)J Cancer 8(3)：410-6)。在一些实施例中，检查点抑制剂是尼武单抗。例如，Pembrolizumab是一种有效且高度选择性的IgG4/κ(kappa)同种型人源化单克隆抗体，旨在直接阻断PD-1及其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。派姆单抗可增强健康人类捐献者、癌症患者与灵长类动物培养血细胞中的T淋巴细胞免疫反应。Pembrolizumab也据报导可调节白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFN-γ)与其他细胞激素的水平。在一些实施例中，检查点抑制剂是派姆单抗。示例性的抗PD-L1抗体包括但不限于阿妥珠单抗(atezolizumab)、阿伐单抗(avelumab)与杜鲁伐单抗(durvalumab)。例如，阿妥珠单抗是一种IgG1人源化单克隆抗体，据报导可通过将表现的PD-L1靶向多种恶性细胞来阻断PD-1/PD-L1相互作用。PD-1/PD-L1途径的这种阻断可能会刺激针对肿瘤的免疫防御机制(Abdin et al.(2018)Cancers(Basel)10(2)：32)。在一些实施例中，检查点抑制剂是阿妥珠单抗、阿伐单抗或杜鲁伐单抗。
在一些实施例中，检查点抑制剂(例如可以与于此所述的抗TIGIT抗体或抗原结合片段组合施用的检查点抑制剂)靶向PD-1/PD-L1、CTLA-4、OX40、CD40、LAG3、TIM3、GITR及/或KIR。在一些实施例中，检查点抑制剂靶向CTLA-4，OX40、CD40及/或GITR。在一些实施例中，检查点抑制剂被抑制性抗体或其他类似的抑制性分子(例如，抑制性抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1抗体)靶向。在一些其他实施例中，将检查点抑制剂与激动剂一起靶向所述靶；或将所述激动剂与靶点结合。此类的例子包括刺激目标OX40、CD40及/或GITR。在一些实施例中，靶向OX40，CD40及/或GITR的检查点抑制剂是激动剂抗体。针对OX40的激动剂抗体可具有双重作用，抑制调节性T细胞抑制，同时增强效应T细胞功能。也已经显示出激动剂抗GITR抗体使效应T细胞对调节性T细胞诱导的抑制作用更具抗性(Karaki et al.(2016)Vaccines(Basel)4(4)：37)。同样，激动剂CD40抗体表现出T细胞依赖性抗肿瘤活性。树突状细胞上CD40的激活增加了肿瘤抗原的交叉呈递，从而增加了激活的肿瘤导向效应T细胞的数量(Ellmark et al.(2015)Oncoimmunol.4(7)：e1011484)。
如于此所用，术语“组合”或“组合疗法”是指将至少一种抗TIGIT抗体，抗原结合片段或组合物与另外的药剂或疗法(例如，检查点抑制剂)一起投予，作为一种治疗方案的一部分，该方案旨在藉由一或更多之被投予药物的共同作用提供有益的作用。在一些实施例中，所述组合还可包含一或更多之另外的试剂，包括但不限于化学治疗剂和减少免疫抑制的试剂(例如第二检查点抑制剂)。组合的有益作用包括但不限于由治疗剂组合产生的药代动力学或药效学协同作用。这些治疗剂的组合给药通常在限定的时间段内进行(例如，数分钟、数小时、数天或数周，取决于所选择的组合)。
如于此所用，以“组合”投予或“共同投予”是指在个体患有疾病，病症或病状(例如癌症，感染或传染病)期间向个体提供两种或更多种不同的治疗。这包括两种或多种治疗的同时投予，以及以任何顺序连续投予。例如，在一些实施例中，在已经诊断出个体患有疾病之后并且在疾病已经治愈或消除之前，或当个体被确定为有风险但在个体出现疾病症状之前，进行两种或更多种治疗。在一些实施例中，当开始第二种治疗的递送时，一种治疗的递送仍在发生，从而存在重迭。在一些实施例中，第一和第二治疗同时开始。这些类型的递送有时在于此中被称为“同时(simultaneous)”、“同时(concurrent)”或“伴随(concomitant)”递送。在其他实施例中，一种治疗的递送在第二种治疗的递送开始之前结束。在于此中有时将这种类型的传递称为“连续(successive)”递送或“顺序(sequential)”递送。
在一些实施例中，两种治疗(例如，于此揭露的抗TIGIT抗体，抗原结合片段或组成物与检查点抑制剂)包含在同一组合物中。此类组成物可以以任何合适的形式与藉由任何适合的途径投予。在其他实施例中，两种治疗(例如，于此揭露之抗TIGIT抗体、抗原结合片段或组成物与检查点抑制剂)以单独之组成物以任何合适的形式与藉由任何适合的途径投予。例如，在一些实施例中，包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段的组成物与包含检查点抑制剂的组成物可以在不同的时间点以任何顺序同时或顺序地施用；较佳为，在任何时间点。无论哪种情况，充足实时投予，以提供所需的治疗或预防效果。
在同时或顺序递送的实施例中，由于组合投予，治疗可能更有效。在一些实施例中，第一治疗更有效，例如，相较于第一治疗在不存在第二治疗的情况下投予，较少之第一治疗(例如，较低剂量)看到相同之效果。在一些实施例中，第一治疗更有效，从而使症状或与疾病相关的其他参数的减少大于在不存在第二治疗的情况下递送第一治疗所观察到的减少。在其他实施例中，第二治疗观察到类似情况。
通常，在本揭露的医药组成物中采用治疗有效量的抗TIGIT抗体或抗原结合片段。可以通过该领域已知的一般方法将抗体或抗原结合片段配制成药学上可接受的剂型。
单独或与至少一种另外的治疗剂组合的抗TIGIT抗体或抗原结合片段的示例性剂量方案包括，例如，一次单次推注(single bolus)一种或两种药剂，或在预定时间段内分几次剂量。对于任何特定的个体，可以根据个人需要与治疗医师的专业判断随时间调整特定的剂量方案。肠胃外组成物可以配制成剂量单位形式，以便于投予与剂量均匀。如于此所使用，剂量单位形式是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位；每个单元包含预定量的活性剂，该活性剂经计算可产生所需的治疗效果，并与所需的药学上可接受的载体结合。
可以基于活性剂的独特特性与要实现的特定治疗效果来选择包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段及/或任何其他治疗剂的组合物的剂量值。医师或兽医可以在医药组成物中使用的抗体或抗原结合片段的起始剂量低于达到所需治疗效果所需的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。通常，用于治疗免疫相关疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的本揭露组成物的有效剂量可以根据许多不同因素而变化，包括所治疗的特定病症、被治疗的个体、个体的生理状态、疾病的原因、药剂的递送部位、个体是人类还是动物、治疗是预防性还是治疗性，以及医学从业人员已知的其他因素。选择的剂量水平还可以取决于多种药代动力学因素，包括所用本揭露内容的特定组成物的活性、投药途径、给药时间，所用特定化合物的排泄速率、治疗之持续时间，与所使用的特定组合物结合使用的其他药物、化合物及/或材料、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况与所治疗对象的既往病史，以及类似因素。
于此所述的治疗有效量之抗体与抗原结合片段通常将提供治疗益处而不会引起实质性毒性。抗体或抗原结合片段的毒性与治疗功效可通过标准药学方法，例如在细胞培养或动物模型中确定。细胞培养分析法与动物研究可用于确定LD50(对50％族群致命的剂量)和ED50(对50％族群有效的治疗剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD50/ED50之比。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段显现出高的治疗指数。从细胞培养分析法和动物研究(例如在小鼠及/或灵长类动物中)获得的数据用于配制适用于人类的一剂量范围。在一些实施例中，所述剂量在循环浓度的范围内，所述循环浓度包括具有最小毒性或无毒性的ED50。剂量可根据多种因素在该范围内变化，例如上述因素。治疗医师可以根据个体的病情选择确切的制剂、投予途径与剂量。
在一些实施例中，于此所述的抗TIGIT抗体，抗原结合片段或组成物在单一情况下投予。在其他实施例中，在多种情况下投予于此所述的抗TIGIT抗体、抗原结合片段或组成物。单一剂量之间的间隔可以是例如每小时、每天、每周，每两周，每月或每年。基于测量个体中所投予的活性剂(例如抗体或抗原结合片段)的血液水平，间隔也可以是不规则的，以维持该试剂的血浆浓度相对一致。抗TIGIT抗体或抗原结合片段的投予剂量与频率也可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，可以在一长段时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些个体可能会在余生中继续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的时间间隔使用相对较高的剂量，直到疾病的进展减少或终止，及/或直至个体显示出一或更多之疾病症状的部分或完全缓解。此后，可以给个体施用较低的，例如预防性剂量方案。
在一些实施例中，还提供了用于于此所述的治疗应用的套组。在一些实施例中，本揭露提供了包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段的套组。在一些实施例中，套组进一步包含一或更多之另外的组分，包括但不限于：使用说明书；其他试剂，例如其他治疗剂(例如，一检查点抑制剂)，药学上可接受的载体等；以及用于将抗体或抗原结合片段以准备用于投予的装置、容器或其他材料。使用说明可以包括用于治疗应用的指南，包括例如在患有或怀疑患有免疫相关疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的个体中的建议剂量及/或投予方式。
在一些实施例中，本揭露提供了套组，其包括抗TIGIT抗体或抗原结合片段语包装插页，所述包装插页包含使用抗体或抗原结合片段在个体中治疗或延迟免疫相关疾病(例如，癌症，感染或传染病)的进展的说明书。在一些实施例中，本揭露内容提供了套组，其包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段，至少一种其他治疗剂(例如，一检查点抑制剂)和包装插页，该包装插页包括用于使用该组合以治疗或延迟进展个体中与免疫相关的疾病(例如，癌症或感染或传染性疾病)的发生的说明书的说明书。个体可以是例如人类。套组中可包括单独或与一或更多之其他治疗剂组合之于此所述的任何示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段。
在一些实施例中，本揭露提供了套组，其包括抗TIGIT抗体或抗原结合片段和包装插页，所述包装插页包含使用抗体或抗原结合片段在个体中活化及/或杀死一个或更多之免疫细胞的说明书。在一些实施例中，本揭露内容提供了套组，其包含抗TIGIT抗体或抗原结合片段、至少一种其他治疗剂(例如，一检查点抑制剂)与包装插页，所述包装插页包括用于使用该组合来活化及/或杀死个体中一个或更多之免疫细胞的说明书。在一些实施例中，个体是人类。套组中可包括单独或与一或更多之其他治疗剂组合的于此所述的任何示例性抗TIGIT抗体或抗原结合片段。
实施例
以下实例提供本揭露的说明性实施例。该技术领域具有通常知识者将认识到可以在不改变本揭露的精神或范围的情况下进行多种修改和变化。此类的修改和变化涵盖在本揭露的范围内。提供的示例并不以任何方式限制本揭露本揭露。
实施例1：TIGIT免疫原(immunogen)之产生
编码人类与小鼠之TIGIT IgV域的eDNA片段分别被合成(Integrated DNATechnologies，Inc.)并次选殖(subcloned)进一哺乳动物表现载体pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。藉由使用Effectene(Qiagen)将各个之表现构筑体(expressionconstructs)转染至小鼠骨髓瘤NS0细胞(European Collection of Authenticated CellCultures(ECACC))来产生重组蛋白。以潮霉素B(hygromycin B)(400μg/ml)筛选2周后，将细胞以5x105细胞/ml之起始接种密度接种于无添加血清之化学性界定培养基HyQNS0(Hyclone)中培养于摇瓶中。5天后收取培养基，并藉由Strep-Tactin XT Superflow色层分析法(chromatography)(IBA Technology，Inc.)从上清液分别纯化人类与小鼠TIGIT IgV域。藉由SDS-PAGE分析重组之人类与小鼠TIGIT IgV域的纯度(第1图)。将经纯化的蛋白质用于动物免疫。
实施例2：抗TIGIT单株抗体之产生
将10只6至12周大的SJL/J小鼠以50μg重组之人类与小鼠TIGIT IgV域之各个在完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant)存在下以1∶1(v/v)之体积比混合的混合物经由腹膜内注射(intraperitoneal injection)来进行免疫。将动物藉由注射在不完全弗氏佐剂(incomplete Freund’s)存在下以1∶1(v/v)之体积比混合之相同的免疫原进行免疫追加(boost)。经由ELISA依据血清抗体效价而定，以每周一次的时间间隔投予总数一至四次的免疫追加。
使用来自具有抗人类或小鼠TIGIT IgV域之最高血清抗体效价的8只小鼠的脾细胞(Splenocytes)与淋巴细胞以与骨髓瘤NS0细胞(ECACC)融合。筛选抗人类与小鼠TIGITIgV之融合瘤细胞，与一人类Fc域融合(Sino Biological Inc.)。提供一0.5μg/ml之固定浓度的重组CD155-人类Fc融合蛋白(Sino Biological Inc.)的竞争以确认具有阻断TIGIT与CD155之交互作用的融合瘤株(clones)。选择了五种具有TIGIT/CD155阻断能力的融合瘤单株，并藉由AlphaLISA竞争分析(AlphaLISA competition assays)进一步评估。
实施例3：AlphaLISA竞争分析
为了评估经由抗TIGIT抗体之TIGIT对CD155之结合的抑制，使用TIGIT：CD155均相分析套组(Homogeneous Assay Kit)(PBS Biosciences，＃72029)来执行AlphaLISA分析。将包含TIGIT-生物素(最终浓度为0.2ng/μl)之溶液的等分试样(6μl)与4倍系列稀释的测试抗体(最终体积为2μl)添加到384孔盘中。将培养盘以上盖盖住并于室温培养30分钟。之后，于各孔中添加2μl组胺酸标签之CD155(终浓度为0.05ng/μl)，并在室温下培养60分钟。最后，加入等分试样(5μl)的抗生蛋白链菌素结合的供体(donor)珠(最终浓度为10μg/ml)与5μl的抗His标签受体(acceptor)珠(最终浓度为20μg/ml)，并将培养盘于黑暗中在室温下培养30分钟。于EnSpire Alpha 2390(Perkin-Elmer Life Sciences)上测量AlphaLISA讯号。将15A6(U.S.Patent No.10,189,902)与MBSA43(Thermo Fisher Scientific，＃16-9500-82)使用为参考抗体。
结果显示于第2A-2E图中。三种抗TIGIT单株抗体7D4、2C9与3A9分别显示0.32、0.40与0.55nM之TIGIT/CD155阻断能力(IC50)。选择这些抗体用于进一步之功能研究。
实施例4：抗TIGIT单株抗体之V基因定序
从约106个细胞之分泌抗TIGIT IgG的融合瘤株7D4、2C9与3A9分离出总RNA分离，且依据制造商之步骤，使用SMARTer RACE 5’/3’Kit(Takara Bio USA，Inc.，＃634913)藉由RT-PCR获得编码各抗体之重链与轻链可变区的eDNA片段。7D4、2C9与3A9抗体之胺基酸序列列于表2-5中。
实施例5：抗TIGIT抗体对表现人类TIGIT之Jurkat细胞的结合
将系列稀释之经蛋白质A管柱纯化之7D4、2C9与3A9抗体分别与5x105个人类TIGIT表现之Jurkat细胞(TIGIT/Jurkat)于冰上培养于50μl之FACS缓冲溶液(0.2％BSA于含有0.09％迭氮化钠(sodium azide)之杜氏磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco′s phosphate-buffered saline，DPBS)中)1小时。于清洗后，将细胞以结合PE染剂之抗小鼠IgG染色，并藉由流式细胞分析技术(flow cytometry)分析抗体结合强度。
结果显示于第3A-3C图。7D4、2C9与3A9分别对于TIGIT/Jurkat细胞显现0.27、2.0与1.86nM之平衡结合常数(equilibrium binding constants)(KD)。
实施例6：抗TIGIT抗体对人类、食蟹猴(cynomolgus monkey，cyno)与小鼠的结合
为了评估抗TIGIT抗体7D4、2C9与3A9的物种交叉反应性(species cross-reactivity)，进行针对人、食蟹猴与小鼠TIGIT之ELISA结合分析。于4℃将各于50μl之DPBS的1μg/ml的人类、食蟹猴(R&D Systems，Inc.，＃9380-TG)与小鼠TIGIT隔夜涂覆于96孔盘。在以含0.05％之Tween20的磷酸缓冲盐溶液(PBST)清洗后，分别添加系列稀释的7D4、2C9与3A9抗体，并将培养盘在37℃培养1小时。在以PBST清洗培养盘三次后，将培养盘与结合山葵过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)之抗小鼠Fcγ多株抗体于37℃培养1小时。在以PBST清洗培养盘3次后，将100μl的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(3，3′，5，5′-tetra-methylbenzidine，TMB)基质(Thermo Fisher Scientific，＃34018)加入各孔中。显色5至10分钟后，将50μl终止溶液(2N HCl)添加到各孔中，并藉由分光亮度计在450nm的波长读取培养盘。
结果显示于第4图中。7D4、2C9与3A9显现在次nM(sub-nM)范围中之对于人类TIGIT的EC50值。7D4对于小鼠TIGIT显现10.53nM之EC50值。
实施例7：TIGIT/CD155阻断分析
根据制造商的步骤，使用TIGIT/CD155阻断生物分析套组(Promega，＃J2405)藉由基于细胞的荧光素酶报告基因分析来测定抗TIGIT抗体对于抑制TIGIT：CD155细胞信号转导的效力。简而言之，将经冷冻之表现CD155的CHO-K1细胞(CD155/CHO)与表现TIGIT的Jurkat细胞(TIGIT/Jurkat)融化，且以新鲜培养基恢复，并在37℃下隔夜培养。于隔日，将CD155/CHO细胞以4x104细胞/孔的密度接种在96孔培养盘于100μl培养基中。将抗TIGIT抗体的系列稀释液(体积为40μl)添加至各孔中，接着以1.5x105个细胞/孔的密度添加40μlTIGIT/Jurkat细胞。将细胞于37℃共培养6小时。随后，添加80μlOne Glo试剂，并将培养盘在室温下培养15分钟。然后将反应溶液转移至用于发光测量的白盘中。
结果显示于第5A-5B图。抗TIGIT抗体7D4、2C9与3A9阻断了TIGIT与CD155的交互作用，导致以剂量依赖性方式之T细胞活化(第5A图)。此外，在TIGIT/CD155阻断分析中，相较于参考抗体15A6，7D4显现较高之T细胞活化的提升(第5B图)。
实施例8：PD-1/PD-L1与TIGIT/CD155组合阻断分析
为了评估抗TIGIT抗体7D4与参考抗体15A6组合抗PD-1拮抗剂抗体(pembrolizumab)的效力，根据制造商的步骤，使用PD-1+TIGIT组合生物分析套组(Promega，＃J2120)来进行基于细胞的荧光素酶报告基因分析。
简而言之，将经冷冻之表现PD-L1+CD155的CHO-K1细胞解冻，并以之4×104细胞/孔的密度接种在96孔培养盘于100μl培养基中。将细胞在37℃下培养以使细胞附着。于隔天，将培养基除去，并将抗-TIGIT与抗PD-1抗体的系列稀释液添加于各孔中(体积为40μl)。最后，将1x105个冷冻恢复之PD-1+TIGIT/Jurkat细胞添加至各孔中(体积为40μl)。于一6小时培养后，将80μl Bio-Glo试剂添加至各个孔中，并使用亮度计对冷光进行定量。
结果显示于第6图。抗PD-1抗体pembrolizumab与7D4或参照15A6的组合于1：1之抗PD-1：抗TIGIT抗体浓度比(范围从0.1至100μg/ml)，相较于pembrolizumab单独，具有更高脂T细胞活化活性。此外，相较于参考抗体15A6，7D4与pembrolizumab的组合显现较高之T细胞活化的提升。
实施例9：藉由7D4、2C9与3A9之T细胞活化
将CD155/CHO细胞以4x104个细胞/孔的密度接种到96孔盘中的100μlRPMI 1640培养基中，并隔夜培养。于隔天，在去除培养上清液后，分别添加抗TIGIT抗体(7D4、2C9与3A9)与参考抗体(15A6与MBSA43)一系列稀释液(40μl/孔)，然后1.5x105个细胞/孔之密度添加TIGIT/Jurkat细胞于40μl培养基中。于共培养26小时之后，将培养盘以4000rpm离心5分钟，并藉由ELISA来分析上清液中IL-2的浓度。
结果如第7图所示。不同的抗TIGIT抗体以浓度依赖性方式增加经由TIGIT/Jurkat细胞的IL-2分泌。
为了评估来自人类外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclearcells，PBMCs)之表现TIGIT之细胞的活化，在7D4的10倍系列稀释液存在下，于37℃下。以涂覆于培养盘之重组的人类CD155-Fc融合蛋白(1μg/ml于DPBS中在96孔培养盘中)处理来自3个独立健康捐献者的PBMC(5x104细胞/孔)1小时。将抗人类CD3抗体(OKT3)以1μg/ml的最终浓度添加至各孔中。于48小时之培养后，将培养盘在1500rpm下离心3分钟，并藉由ELISA分析IL-2与IFN-γ的上清液浓度。
结果显示于第8A-8B图中。在来自三个不同健康人类捐献者的PBMC中，在T细胞活化抗CD3抗体OKT3存在下，7D4阻断了表现TIGIT的T细胞与CD155之间的交互作用所产生的T细胞抑制信号。经活化的T细胞也分泌促发炎细胞激素(proinflammatory cytokines)IL-2与IFN-γ。捐献者1-3显示出响应于7D4的添加的剂量依赖性T细胞活化，而捐献者1显示出最强的响应。捐献者2与3中藉由抗CD3抗体之T细胞活化的基础水平(于0μg/ml之7D4)高于捐献者1。
实施例10：重组抗TIGIT抗体的构筑、表现与纯化
为了表现重组之小鼠抗体，将编码各抗体之重链与轻链可变区的cDNA片段次选殖进哺乳动物表现载体pFUSEss-CHIg-mG2a(Invivogen)与pSecTag2/Hygro(Thermo FisherScientific)中。使用Effectene(Qiagen)将含有各抗体的重链与轻链之cDNA的质体共转染到小鼠骨髓瘤NS0细胞中。在以潮霉素B(400μg/ml)与G418(800μg/ml)选择4周后，藉由重组人类TIGIT IgV域为涂覆层，抗小鼠IgGFcγ-HRP为侦测试剂的ELISA，从培养基中筛选出几个表现量高的细胞株。挑选各抗体的高表现选殖株，并在摇瓶中以5x105细胞/ml的初始接种密度于无添加血清之化学性界定培养基HyQNS0(Hyclone)中培养，无需添加血清。5天后收取培养基，并藉由蛋白质A(MabSelect SuRe)管柱(Cytiva)从上清液中纯化抗体。
实施例11：7D4之抗体人源化
依照Fan et al.((2017)Biochem Biophys Rep 9：51-60)的方法进行同源性模拟(homology modeling)。抗TIGIT抗体7D4之小鼠VH与VL区的CDR区分别移植至人类生殖系列(germline)家族之IGHV3-11与IGKV3-11框架区。人类框架区中的数个胺基酸残基被回复突变(back mutated)为原始的小鼠残基，以维持抗体结合亲和力。hz7D4抗体之胺基酸序列列于表2-5中。
分别合成hz7D4的VH与VL区的核苷酸序列，并将其次选殖至带有信号肽序列的哺乳动物表现载体pFUSE-CHIg-hIG1(Invivogen)(Invivogen)与包含人κ链恒定区的pSecTag2/Hygro(Invitrogen)中。参考人类IgG1抗体15A6与1D3分别依据美国专利号10,189,902与10,017,572中的VH与VL序列产生。重组之hz7D4、15A6与1D3 hIgG1抗体在CHO-S细胞(Thermo Fisher Scientific)中产生，并藉由蛋白质A(MabSelect SuRe)柱进行纯化。
实施例12：人源化7D4(hz7D4)抗体之细胞竞争结合分析
包括hz7D4之抗TIGIT抗体与参考抗体(15A6与1D3)被用于与CD155竞争针对表现人类TIGIT的细胞的结合。MJ[G11](美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，CRL-8294)是一种携带人T细胞白血病病毒(human T cell leukemiavirus，HTLV-I)的CD3+CD4+T淋巴瘤细胞系。MJ[G11]细胞的特征在于，以包括CD4、CD25、CD127与FoxP3之调节性T细胞表型抗体标记进行免疫染色，被发现是一种调节性T细胞样细胞系(第9A图)。又，MJ[G11]细胞本质地表现人类TIGIT，如以PE结合之抗人类TIGIT，MBSA43抗体之免疫染色所显示(第9B图)。将抗TIGIT抗体的3倍系列稀释液添加至在50μl FACS缓冲液中(0.2％BSA于含0.09％迭氮化钠的DPBS中)中之5x105的表现人类TIGIT的Jurkat细胞或3x105的MJ[G11]细胞并在冰上培养30分钟。然后，将10μl DyLight 650结合之CD155-人类Fc融合蛋白添加至细胞，以使人类TIGIT-Jurkat细胞的终浓度达到1μg/ml，而MJ[G11]细胞的终浓度达到1.5μg/ml，且于4℃培养30分钟。清洗细胞并将其藉由FACSCalibur细胞仪(Becton Dickinson)。基于标准化之中位数荧光强度(median fluorescenceintensity，MFI)值计算IC50值
结果显示于第10A-10B图中。抗TIGIT hIgG1抗体hz7D4、15A6与1D3阻断CD155对于TIGIT/Jurkat与MJ[G11]细胞者之结合。达成hz7D4的50％CD155结合抑制(IC50)所需的阻断抗体的浓度，对于TIGIT/Jurkat细胞为0.2nM(第10A图)，而对于MJ[G11]细胞为0.3nM(第10B图)。
实施例13：噬菌体展示抗体库的构建与hz7D4的亲和力增强
将人源化的7D4(hz7D4)scFv基因选殖进噬菌粒(phagemid)载体pKH于Nco I与NotI限制性切点。以含有一段NNK序列的引子，将编码重链与轻链之CDR3区的胺基酸序列随机突变。重链CDR3(HCDR3)与轻链CDR3(LCDR3)库分别被扩增，藉由在50μl反应溶液中的重迭延伸PCR(overlapping extension-PCR)，经由两个等莫耳量的片段与25pmol载体选殖引子进行95℃，30秒，60℃，30秒及72℃，1分钟的30个循环的融合。将扩增的产物进行凝胶纯化，以Nco I与Not I消化，并次选殖进pKH噬菌粒中。藉由电穿孔将质体库转形至大肠杆菌(Escherichia coli)TG1细胞中。将携带hz7D4 scFv之重链CDR3(HCDR3)或轻链CDR3(LCDR3)的最终M13噬菌体抗体库(repertoire)分别利用KM13辅助噬菌体制造出来。
实施例14：hz7D4抗小鼠TIGIT的亲和力增强
为了使hz7D4抗小鼠TIGIT的亲和力增强，将来自重链CDR3(HCDR3)库的噬菌体(109cfu)与1nM之生物素化的小鼠TIGIT IgV域在1ml含3％脱脂牛奶之PBS/0.1％Tween-20中于室温培养1小时。藉由与50μlM280链霉亲和素(streptavidin)磁珠(Thermo FisherScientific，＃11205D)一起培养15分钟来捕获噬菌体。藉由以PBS/0.1％Tween-20清洗十次，接着以PBS洗涤十次，每次5分钟来消除非特异性噬菌体。将结合之噬菌体以0.1M甘胺酸(pH 2.0)洗脱，以1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，并再次感染至对数期TG1细胞中。在第二轮淘选(panning)中，将噬菌体(109cfu)用于对抗0.1nM之生物素化小鼠TIGIT IgV域。
确定结合至小鼠TIGIT IgV域之噬菌体选殖株的核苷酸序列。选择三个选殖株，分别命名为1G3、2F1与3H2。表2列出包括HCDR3之CDR胺基酸序列。
将所选择的三个在HCDR3区具有不同胺基酸序列的scFv选殖株转化为在Fc区具有DLE突变的小鼠IgG2a同型(isotype)(mIgG2a-DLE)，并如上所述在CHO-S细胞中表现并纯化重组之抗体。据报导具有S239D/A330L/I332E(DLE)突变的抗体Fc变体可增强效应子功能(Lazar et al.(2006)Proc Natl Acad Sci USA 103：4005-10)。将人类与小鼠TIGIT的ELISA结合，及三个hz7D4衍生的抗体选殖株(1G3、2F1与3H2)对小鼠TIGIT/CD155的竞争进行分析，并总结于表7中。将hz7D4与参考抗体1G9(Bio X Cell，＃BE0150)包含为比较物。
表7、针对hz7D4衍生抗体1G3、2F1与3H2之ELISA结合测量
Figure BDA0002697162600000721
实施例15：抗TIGIT抗体与小鼠TIGIT表现之CHO细胞的结合
将表7中列出的经蛋白质A管柱纯化的抗TIGIT抗体分别与5x105之小鼠TIGIT表现的CHO细胞(mTIGIT/CHO)在50μl FACS缓冲液(0.2％BSA于含有0.09％迭氮化钠之杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)中)中以2μg/ml的终浓度在冰上培养1小时。于清洗后，细胞用结合有PE染剂之抗小鼠IgG染色，并藉由流式细胞分析技术分析抗体结合强度。
第11图显示流式细胞分析技术图，其显示了不同的抗TIGIT抗体对mTIGIT/CHO细胞的结合。细胞结合程度与表7中所示的ELISA结合数据一致。
实施例16：在同基因(syngeneic)结肠癌肿瘤模型中之抗肿瘤功效
对于同基因肿瘤模型实验，将6至8周大的BALB/c小鼠皮下(s.c.)注射2×105个细胞之CT26结肠癌细胞(ATCC，CRL-2638)。当肿瘤平均达到～80mm3时，将小鼠分组(n＝9)，并将其以每周两次腹膜内(i.p.)注射200μg抗体(1G9、2F1与3H2)或PBS控制(control)处理3周。监测肿瘤生长并测量肿瘤体积。
结果显示于第12A-12B图中。hz7D4衍生之小鼠亲和力增强的2F1与3H2mIgG2a-DLE抗体抑制了在BALB/c小鼠中之CT26肿瘤的生长。在以2F1与3H2处理的组别中观察到肿瘤生长延迟。以2F1与3H2抗体处理之9只小鼠中有六只具有长达120天的完全反应(completeresponse)(临床终点(clinical endpoint))。
实施例17：hz7D4抗人类与食蟹猴TIGIT的亲和力增强
对于hz7D4 scFv抗人类与食蟹猴TIGIT的亲和力增强，将重链与轻链CDR3库中的噬菌体(109cfu)分别与0.1nM生物素化的人类TIGIT IgV域在1ml含3％脱脂牛奶之PBS/0.1％Tween-20中于室温培养1小时。藉由与50μl之M280链霉亲和素磁珠(Thermo FisherScientific)一起培养15分钟来捕获噬菌体。藉由以PBS/0.1％Tween-20清洗十次，接着以PBS洗涤十次，每次5分钟来消除非特异性噬菌体。将结合之噬菌体以0.1M甘胺酸(pH 2.0)洗脱，以1M Tris-HCl(pH 8.0)中和，并再次感染至对数期TG1细胞中。在第二轮筛选中，将噬菌体(109cfu)用于对抗0.1nM之生物素化食蟹猴TIGIT IgV域。
确定结合至人类与食蟹猴TIGIT IgV域两者之噬菌体选殖株的核苷酸序列。所有重链CDR3(HCDR3)选殖株均含有LGRGYWYFDV(序列辨识号：3)的野生型HCDR3胺基酸序列。通过轻链库筛选的两个轻链CDR3(LCDR3)选殖株，分别命名为1A11与1E3，分别含有QLFRSGSA(序列辨识号：23)与STFTVINL(序列辨识号：24)之LCDR3胺基酸序列。
为了增强ADCC效应子功能，将所选择之在LCDR3区具有不同的胺基酸序列的scFv选植体1A11与1E3转换为在Fc区具有DLE突变的人类IgG1同型(hIgG1-DLE)。两种重组之抗体1A11 hIgG1-DLE与1E3 hIgG1-DLE在CHO-S细胞中表现，并藉由蛋白质A(MabSelectSuRe)管柱进行纯化。表2-5中列出人源化之1A11 hIgG1-DLE与1E3 hIgG1-DLE抗体的胺基酸序列。
实施例18：抗TIGIT抗体与表现食蟹猴TIGIT之CHO细胞的结合
包括hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE、1E3 hIgG1-DLE与参考抗体(15A6 hIgG1 and1D3 hIgG1)的抗TIGIT抗体分别与5x105之食蟹猴TIGIT表现的CHO细胞(cynoTIGIT/CHO)在50μl FACS缓冲液(0.2％BSA于含有0.09％迭氮化钠之杜氏磷酸缓冲盐溶液(DPBS)中)中以1μg/ml的终浓度在冰上培养1小时。于清洗后，将细胞以结合有Alexa-647染剂之抗人类IgG染色，并藉由流式细胞分析技术分析抗体结合强度。结果显示于第13图中。
实施例19：hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE与1E3 hIgG1-DLE之抗体依赖性之细胞媒介的细胞毒性功能(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity function)
在不同的抗TIGIT抗体，包括hz7D4 hIgG1、1A11 hIgG1-DLE与1E3 hIgG1-DLE及参考抗体(15A6 hIgG1与1D3 hIgG1)存在下，使用T淋巴瘤细胞株MJ[G11](ATCC，CRL-8294)来评估经由表现FcRγIIIa(F176V)之人类NK92细胞株(ATCC，PTA-6967)的抗体依赖性之细胞媒介的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ADCC)。首先将MJ[G11]细胞膜以10μM之钙黄绿素(calcein)AM荧光染剂染色，然后于37℃培养30分钟。将细胞以培养基清洗三次。通过台盼蓝(trypan blue)计数细胞数，并将细胞密度调整为2x105细胞/ml。将不同的抗TIGIT抗体的系列稀释液，以从10-5至10μg/ml之范围的浓度每种为20μl的体积，添加到96孔V型底微量滴定盘中。清洗NK92细胞，并将其调整为1.6x105个细胞/ml之培养基。将8,000个NK92(效应细胞(effector cells)，E)与10,000MJ[G11](靶细胞(target cells)，T)细胞各50μl加到同一孔中，以使E∶T比＝0.8∶1。之后将滴定盘于37℃培养4小时。将滴定盘以500xg离心5分钟以沉淀细胞。然后将来自每个样品孔的100μl上清液转移到96孔黑色微量滴定盘中，并藉由滴定盘读取仪分析荧光(激发：488nm，发射：518nm)。将无抗体的靶细胞的荧光光强度作为靶细胞的自发释放。将为了实现靶细胞的完全裂解之20μl之1％Triton X-100的添加作为最大释放。根据荧光强度，藉由以下方程序计算在经处理之抗体存在下透过NK92细胞之靶细胞之裂解的百分比：
Figure BDA0002697162600000751
结果显示于第14图中。Fc工程改造的1A11与1E3(hIgG1-DLE)变体两者皆增强了藉由人类自然杀手细胞之抗体依赖性之细胞媒介的细胞毒性(ADCC)，从而杀死了表现TIGIT的MJ[G11]细胞，而1A11 hIgG1-DLE显现出经测试之抗体之最强的ADCC活性。缺乏人Fc的对照组中的7D4 mIgG2a表现出基础水平的ADCC活性(即，无任何抗体的共同培养的效应细胞与靶细胞的水平)。
实施例20：7D4与人源化7D4变体1A11之抗原决定位匹配(mapping)
为了确定所选的抗TIGIT抗体是否识别人类TIGIT的连续(线性)或不连续(构形)抗原决定位，使用斑点印迹(dot blot)转移设备将以或不经过SDS与还原剂变性之0.1μg重组之人类TIGIT IgV蛋白直接转移到硝酸纤维素膜上。于阻断与清洗步骤后，将膜条分别以7D4、2C9、3A9与MBSA43抗体进行免疫印迹(immunoblotted)，并分别藉由抗小鼠Fcγ-HRP侦测。结果显示于第15图。抗TIGIT单克隆抗体7D4、2C9与3A9仅与天然形式的人类TIGIT蛋白结合，此指出它们识别TIGIT构形抗原决定位。相对地，抗体MBSA43与天然TIGIT及变性TIGIT两者结合，此指出其识别TIGIT线性抗原决定位。
使用PEPperMAP构形抗原决定位匹配法(PEPperMAP Conformational EpitopeMapping)，经由重组之7D4抗体(在小鼠IgG2a同型中)鉴定人类TIGIT(序列辨识号：22)的结合区。使用胜肽合成仪在微芯片上合成覆盖整个TIGIT IgV域(序列辨识号：22，底线标示)的环状胜肽，其具7、10或13个胺基酸残基之环肽长度(loop loop peptide length)。对于每个斑点的重迭胜肽序列相差一个胺基酸残基。接着，将微芯片与重组之7D4抗体杂合。于清洗后，藉由与Dylight 680结合之抗小鼠IgG来将斑点强度进行定量。如第15B图中所示，7D4显示了与包含共有基序(consensus motif)YFCIY之7、10与13个胺基酸环状胜肽的最强结合信号。
人类TIGIT(IgV域底线标示)
Figure BDA0002697162600000752
Figure BDA0002697162600000761
(序列辨识号：22)
为了进一步鉴定与重组7D4 mIgG2a抗体相互作用的TIGIT胺基酸残基，使用标准分子技术藉由定点诱变(site-directed mutagenesis)在人类TIGIT IgV域中生成了单个丙胺酸取代突变。然后进行ELISA结合分析以评估7D4结合强度。
第16图显示人类、食蟹猴与小鼠TIGIT IgV域之胺基酸序列比对。突变成丙胺酸以研究TIGIT/7D4结合的单个胺基酸残基系以粗体表示。为了抗原决定位匹配(epitopemapping)，下列将10个突变用于ELISA结合分析：Q56A、N70A、D72A、G74A、Y106A、F107A、Y110A、H111、Y113A与F123A。Q56、N70、D72、G74与Y113的胺基酸残基靠近TIGIT/CD155复合物的界面(Stengel et al.(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109：5399-5404)，而Y106、F107与Y110位于TIGIT中亲本小鼠7D4抗体结合共有基序YFCIY上。基于第15B图所示的微数组数据的荧光信号强度，依照制造商的步骤，在Expi293F细胞(Thermo FisherScientific，＃A14527)中产生重组之TIGIT IgV点取代突变体，并藉由Strep-Tactin XTSuperflow色谱法(IBA Technology，Inc.)将其从培养上清液分别纯化。
第17图显示7D4与TIGIT突变体的ELISA结合结果。Q56与Y106单个丙胺酸取代突变体完全消除了7D4的结合。G74、Y110与H111单个丙胺酸取代突变体在浓度高达10μg/ml时显示于7D4结合方面显著降低(超过野生型的50％)。这些数据显示，位于面向TIGIT/PVR界面的β-褶板(β-sheet)的三个胺基酸残基Y106、Y110与H111参与了hz7D4对TIGIT的结合。第18图显示，根据Stengel et al.((2012)Proc Natl Acad Sci USA 109：5399-5404)之用于分析人类PVR(CD155)与TIGIT的共结晶的分子结构模型。
为了鉴定与人源化7D4变体1A11(在人类IgG1-DLE同型中)相互作用的TIGIT胺基酸残基，以单个丙胺酸取代突变体进行ELISA结合分析以评估1A11结合强度。第19图显示了1A11对各种TIGIT突变体的ELISA结合结果。与亲本小鼠7D4抗体相似，Q56与Y106单个丙胺酸取代突变体完全消除了1A11的结合。G74、Y110与H111单个丙胺酸替代突变体在浓度高达10μg/ml时显示于1A11结合方面显著降低(超过野生型的40％)。
虽然本揭露已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本揭露，任何熟习此技艺者，在不脱离本揭露之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本揭露之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。
序列表
<110> 财团法人工业技术研究院
<120> 抗TIGIT抗体及使用之方法
<150> US 62/904,752
<151> 2019-09-24
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 HCDR1
<400> 1
Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 HCDR2
<400> 2
Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 HCDR3
<400> 3
Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 LCDR1
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 LCDR2
<400> 5
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 LCDR3
<400> 6
His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 7
Tyr Thr Phe Thr Asp Ser Tyr Ile Asn
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 HCDR2
<400> 8
Arg Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 HCDR3
<400> 9
Glu Ala Trp Leu Leu Phe Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 LCDR1
<400> 10
Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 LCDR2
<400> 11
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 LCDR3
<400> 12
Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 HCDR1
<400> 13
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 HCDR2
<400> 14
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Ala Thr His
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 HCDR3
<400> 15
Thr Gly Ile Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 LCDR1
<400> 16
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Ile His
1 5 10 15
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 LCDR2
<400> 17
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 LCDR3
<400> 18
Gln His Asn Trp Glu Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G3 HCDR3
<400> 19
Asp Met Val Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F1 HCDR3
<400> 20
Val Ile Val Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3H2 HCDR3
<400> 21
Ile Arg Leu Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 22
<211> 244
<212> PRT
<213> 人类
<400> 22
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1 5 10 15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20 25 30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35 40 45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50 55 60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65 70 75 80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85 90 95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Ala Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100 105 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115 120 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130 135 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145 150 155 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165 170 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180 185 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210 215 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225 230 235 240
Thr Glu Thr Gly
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 LCDR3
<400> 23
Gln Leu Phe Arg Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 LCDR3
<400> 24
Ser Thr Phe Thr Val Ile Asn Leu
1 5
<210> 25
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 重链可变区
<400> 25
Gln Val Gln Leu Lys His Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 26
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 7D4 轻链可变区
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 重链可变区
<400> 27
Asp Ile Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Arg Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Trp Leu Leu Phe Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2C9 轻链可变区
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 29
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 重链可变区
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Ala Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Ile Asp Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ile Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3A9 轻链可变区
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Asn Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz7D4 Heavy chai nvariable region
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hz7D4 轻链可变区
<400> 32
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G3 重链可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Met Val Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1G3 轻链可变区
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F1 重链可变区
<400> 35
Asp Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Ile Val Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2F1 轻链可变区
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3H2 重链可变区
<400> 37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3H2 轻链可变区
<400> 38
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Arg Tyr Pro Thr Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 重链可变区
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 轻链可变区
<400> 40
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Arg Ser Gly Ser Ala Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 重链可变区
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 轻链可变区
<400> 42
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Thr Phe Thr Val Ile Asn Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG1 重链恒定区
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 44
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgG1-DLE 重链恒定区
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Kappa 轻链恒定区
<400> 45
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 46
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 重链
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 47
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 重链
<400> 47
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 48
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1A11 轻链
<400> 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Phe Arg Ser Gly Ser Ala Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210> 49
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 重链
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 50
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 重链
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Phe Thr Asn Ser Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Arg Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 51
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 1E3 轻链
<400> 51
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Thr Phe Thr Val Ile Asn Leu Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100 105 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115 120 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130 135 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145 150 155 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165 170 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180 185 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195 200 205
Arg Gly Glu Cys
210

Claims (33)

1.一种经分离之抗体或抗原结合片段，其特异性地结合至人类T细胞免疫球蛋白与ITIM域(T cell immunoglobulin and ITIM domain,TIGIT)，其中该抗体或抗原结合片段包括：
(a)三个重链互补性决定区(heavy chain complementarity determining regions、HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(light chain complementarity determiningregions,LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)之胺基酸序列；
(b)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：24(LCDR3)之胺基酸序列；
(c)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(d)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：19(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(e)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：20(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(f)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：21(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：6(LCDR3)之胺基酸序列；
(g)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：7(HCDR1)、序列辨识号：8(HCDR2)与序列辨识号：9(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：10(LCDR1)、序列辨识号：11(LCDR2)与序列辨识号：12(LCDR3)之胺基酸序列；或
(h)三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：13(HCDR1)、序列辨识号：14(HCDR2)与序列辨识号：15(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：16(LCDR1)、序列辨识号：17(LCDR2)与序列辨识号：18(LCDR3)之胺基酸序列。
2.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)之胺基酸序列。
3.如权利要求1或权利要求2之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，人类生殖系列(germline)重链与轻链框架区(framework region)，或经突变以包括一或更多之胺酸取代之人类生殖系列重链与轻链框架区。
4.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链可变区，其与序列辨识号：39之胺基酸序列至少90％相同，及一轻链可变区，其与序列辨识号：40之胺基酸序列至少90％相同。
5.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链可变区，其包括序列辨识号：39之胺基酸序列，及一轻链可变区，其包括序列辨识号：40之胺基酸序列。
6.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括一人类IgG1重链恒定区，或经突变以修饰效应子(effector)功能之一人类IgG1重链恒定区。
7.如权利要求1至权利要求6之任一项之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链恒定区，其包括序列辨识号：43之胺基酸序列，或一重链恒定区，其包括经突变以包括在位置239、330与332之胺基酸取代之序列辨识号：43之胺基酸序列。
8.如权利要求7之抗体或抗原结合片段，其中：
在序列辨识号：43之位置239的S被以D取代；
在序列辨识号：43之位置330的A被以L取代；及
在序列辨识号：43之位置332的I被以E取代。
9.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链恒定区，其包括序列辨识号：44之胺基酸序列。
10.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一人类Igκ轻链恒定区。
11.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一轻链恒定区，其包括序列辨识号：45之胺基酸序列。
12.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链恒定区，其包括序列辨识号：44之胺基酸序列，及一轻链恒定区，其包括序列辨识号：45之胺基酸序列，或其中该抗体或抗原结合片段包括，一重链，其包括序列辨识号：47之胺基酸序列，及一轻链，其包括序列辨识号：48之胺基酸序列。
13.如权利要求1之抗体或抗原结合片段，其中该重链恒定区或重链更包括一C端离胺酸(lysine,K)。
14.一种经分离之抗体或抗原结合片段，其特异性地结合至人类TIGIT，其中该抗体或抗原结合片段结合至人类TIGIT之一区域，该区域包括在序列辨识号：22之位置106的Y。
15.如权利要求14之抗体或抗原结合片段，其中该区域更包括以下之一或更多：
在序列辨识号：22之位置56的Q；
在序列辨识号：22之位置74的G；
在序列辨识号：22之位置110的Y；及
在序列辨识号：22之位置111的H。
16.如权利要求15之抗体或抗原结合片段，其中该区域至少包括：
在序列辨识号：22之位置56的Q；及
在序列辨识号：22之位置106的Y。
17.如权利要求15或权利要求16之抗体或抗原结合片段，其中该区域至少包括：
在序列辨识号：22之位置56的Q；
在序列辨识号：22之位置74的G；
在序列辨识号：22之位置106的Y；及
在序列辨识号：22之位置110的Y。
18.如权利要求14至权利要求17之任一项之抗体或抗原结合片段，其中该抗体或抗原结合片段与一参考抗体或抗原结合片段竞争与人类TIGIT的结合，或与一参考抗体或抗原结合片段结合于相同之人类TIGIT之一区域，其中该参考抗体或抗原结合片段包括，三个重链互补性决定区(HCDRs)，其包括序列辨识号：1(HCDR1)、序列辨识号：2(HCDR2)与序列辨识号：3(HCDR3)之胺基酸序列；及三个轻链互补性决定区(LCDRs)，其包括序列辨识号：4(LCDR1)、序列辨识号：5(LCDR2)与序列辨识号：23(LCDR3)之胺基酸序列。
19.如权利要求18之抗体或抗原结合片段，其中该参考抗体或抗原结合片段包括，一重链可变区，其包括序列辨识号：39之胺基酸序列，及一轻链可变区，其包括序列辨识号：40之胺基酸序列。
20.如权利要求19之抗体或抗原结合片段，其中该参考抗体或抗原结合片段，包括一重链，其包括序列辨识号：47之胺基酸序列，及一轻链，其包括序列辨识号：48之胺基酸序列。
21.如权利要求7至9、12、13或20之任一项之抗体或抗原结合片段，其中该重链更包括一C端离胺酸(K)。
22.一种医药组成物，其包括如权利要求1至权利要求21之任一项之抗体或抗原结合片段与一药学上可接受之载体。
23.一种如权利要求1至21之任一项之抗体或抗原结合片段，在制备用于活化及/或杀死于一需要之个体中之一或更多之免疫细胞之药物的用途。
24.如权利要求23之用途，其中活化一或更多之免疫细胞包括，活化一或更多之自然杀手细胞、一或更多之毒杀性T细胞、一或更多之辅助型T细胞，及/或一或更多之单核球(monocyte)细胞。
25.如权利要求23或权利要求24之用途，其中杀死一或更多之免疫细胞包括杀死一或更多之调节T细胞(regulatory T cell)。
26.如权利要求23至25之任一项之用途，其中该药物组合至少一额外之治疗剂被投予。
27.一种如权利要求1至21之任一项之抗体或抗原结合片段，在制备用于治疗在一需要之个体中之癌症之药物的用途。
28.如权利要求27之用途，其中该癌症表现CD155。
29.如权利要求27之用途，其中该癌症为大肠直肠癌。
30.如权利要求27之用途，其中该药物组合至少一额外之治疗剂被投予。
31.一种如权利要求1至21之任一项之抗体或抗原结合片段，在制备用于治疗在一需要之个体中之感染或传染疾病之药物的用途。
32.如权利要求31之用途，其中该感染或传染疾病为一人类T细胞白血病病毒第1型(human T cell leukemia virus type 1)相关疾病。
33.如权利要求31之用途，其中该药物组合至少一额外之治疗剂被投予。
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