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CN112538486B - 控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用 - Google Patents

控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用 Download PDF

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CN112538486B CN202011490418.7A CN202011490418A CN112538486B CN 112538486 B CN112538486 B CN 112538486B CN 202011490418 A CN202011490418 A CN 202011490418A CN 112538486 B CN112538486 B CN 112538486B
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corn
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武玉莹
范田源
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Henan Agricultural University
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Abstract

本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说，涉及控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用。所述基因为ZmBON1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述应用是指在玉米矮化材料育种的应用，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，对玉米ZmBON1基因进行定点突变，使得玉米ZmBON1基因功能缺失，来实现对玉米株高的遗传改良。研究提供了新的矮化育种基因资源，未来可通过该基因改良重要玉米自交系的株型，在生产上得以推广应用。

Description

控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用
技术领域
本发明涉及生物技术和遗传育种领域，具体地说，涉及控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用。
背景技术
矮化育种促进了“第一次绿色革命”。矮杆玉米株型紧凑，适合高密度种植，它能使作物具有较强的抗倒伏能力和较高的光能利用率。玉米的株高由茎的长度和节间数决定，一般情况下，节间数越少，节间长度越小，玉米的株高越低。一定生长期内，缩短节间长度可以有效的降低玉米的高度，按株高的遗传特点可以分为多基因体系和单基因体系。多基因矮杆体系是由多个微效基因的累积效用组成，属于数量性状遗传。每一个矮杆基因对植株的节间的缩短作用几乎相同，多个微效矮杆基因的效用累加，共同对植株的矮化起作用，累加作用越多，则植株越矮。单基因矮杆体系是由一个主效矮杆基因引起玉米植株降低的体系。20世纪以来，已发现玉米矮杆基因有近70个，如br1、br2、bv1、ct1、ct2、D8、D9及RPH1等。且其中大部分矮杆基因是通过构建遗传群体的图位克隆挖掘，工作量大，周期长。而近期有研究以拟南芥微管相关蛋白QWRF为索引预测玉米中的同源蛋白ZmRPH1，并在玉米中过表达该基因的CDS序列获得了矮杆转基因株系。
目前科学家已从模式植物拟南芥中克隆了大量的植物生长和防御响应基因并深入解析了其分子机理。但将这些基因理论研究的成果直接应用到作物分子育种中的报道还不多。如何快速克隆玉米中的株高相关基因，并创制可推广应用的育种材料是所有玉米分子育种家们十分关切的问题。
发明内容
本发明的第一个目的是提供控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供控制玉米株高的基因，所述基因为ZmBON1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
第二方面，本发明提供控制玉米株高的蛋白质，所述蛋白质由SEQ ID NO.1所示的基因编码。
第三方面，本发明提供所述控制玉米株高的基因在玉米矮化材料育种的应用，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，对玉米ZmBON1基因进行定点突变，使得玉米ZmBON1基因功能缺失，来实现对玉米株高的遗传改良。
进一步的，针对玉米中的目标基因ZmBON1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Bar的载体中，用构建的载体转化玉米，实现对ZmBON1的定点突变，进而获得ZmBON1基因功能缺失的转基因玉米植株。
进一步的，针对玉米中的目标基因ZmBON1作用位点的sgRNA序列为5’-GATCGCTTTCTCCGCTCCCG-3’和5’-GTTCAGGCTGAAGAAAGTTC-3’。
进一步的，将两个sgRNA作用位点通过不同表达盒串联到同一载体上。
进一步的，所述携带Bar的载体为pBUE411。
进一步的，通过农杆菌介导法转化玉米。
进一步的，所述玉米为自交系KN5585。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次揭示了玉米ZmBON1基因的生物学功能，通过CRISPR/Cas9技术对玉米ZmBON1基因进行基因编辑，并进一步的获得无外源基因插入的玉米矮化材料，本研究提供了新的矮化育种基因资源，未来可通过该基因改良重要玉米自交系的株型，在生产上得以推广应用。
附图说明
图1为玉米、拟南芥和水稻BON家族基因蛋白序列比对。
图2为玉米、拟南芥和水稻BON家族基因系统进化树。
图3为Zmbon1不同等位基因突变类型示意图。
图4为Zmbon1形态表型。
图5为Zmbon1突变体株高统计。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
玉米防御调控基因ZmBON1的预测
1、同源比对检索玉米BON家族基因
在TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥BON1(AT5G61900)基因的氨基酸序列。以其为索引，利用NCBI BLASTp在线比对工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝Blast Search&LINK_LOC＝blasthome)在Zea mays(taxid：4577)蛋白库中进行比对，获得序列相似性大于50％的两个基因：GRMZM2G494514和GRMZM2G176995(图1)。
2、系统进化树分析预测ZmBON1基因
利用邻接法(Neighbor-joining Method)进行系统进化树分析，发现GRMZM2G494514与AtBON1和OsBON1聚在一起(图2)，将其命名为ZmBON1，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
实施例2
设计基于CRISPR/Cas9的编辑位点
在MaizeGDB下载ZmBON1基因的CDS序列和genomic序列，将CDS序列复制到http://crispor.tefor.net/网站，Genome选择Zea mays(B73 RefGen_v4),PAM选择20bp-NGG-SpCas9,预测Target序列，选择以G开头，Specificity和Predicted Efficiency高的序列，并将候选的Target序列比对回ZmBON1的genomic序列，排除跨内含子的序列。根据以上筛选条件，获得Target 1(GATCGCTTTCTCCGCTCCCG，如SEQ ID NO.2所示)和Target 2(GTTCAGGCTGAAGAAAGTTC，如SEQ ID NO.3所示)两个靶点。
实施例3
基因编辑载体的构建
根据所选的编辑位点以及载体pCBC-MT1T2和pBUE411多克隆位点处的酶切位点设计引物，引物信息见表1，实验所用中间载体pCBC-MT1T2和植物转化双元载体pBUE411-2gR均来自于中国农业大学生物学院陈其军老师，终载体pBUE411携带草铵膦抗性基因Bar。
表1引物信息
Figure BDA0002840541520000041
Figure BDA0002840541520000051
注：下划线部分为Target序列，其余部分为载体骨架同源臂和串联靶标区间同源臂序列。
(1)PCR扩增：以稀释100倍的pCBC-MT1T2为模板进行四引物PCR扩增。ZmBON1-MT1T2-BsF/-BsR为正常引物浓度(10uM)；ZmBON1-MT1T2-F0/-R0稀释20倍，体系如表2所示，反应程序如表3所示。
表2 PCR扩增体系
Figure BDA0002840541520000052
表3 PCR扩增程序
Figure BDA0002840541520000053
(2)纯化回收PCR产物，建立如表4所示酶切-连接体系：
表4酶切-连接体系
Figure BDA0002840541520000061
取5uL转化大肠杆菌感受态。Kan50抗性版筛选。OsU3-FD3+TaU3-RD＝831bp菌落PCR鉴定，OsU3-FD3和TaU3-FD2测序确认。
注：菌落PCR及测序引物：
OsU3-FD3：GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC(如SEQ ID NO.8所示)；
TaU3-RD:CTCACAAATTATCAGCACGCTAGTC(如SEQ ID NO.9所示)；
TaU3-FD:TTAGTCCCACCTCGCCAGTTTACAG(如SEQ ID NO.10所示)；
TaU3-FD2:TTGACTAGCGTGCTGATAATTTGTG(如SEQ ID NO.11所示)。
实施例4
pBUE411-BON1基因编辑载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。
实施例5
农杆菌转化玉米
农杆菌转化玉米自交系KN5585，获得具有20个独立转基因事件的转基因种子。
以新鲜剥离的1mm左右的KN5585玉米自交系幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2ml塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0ml农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含双丙氨膦的筛选培养基上，开始筛选培养两周，然后新的筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
实施例6
发生编辑的转基因玉米植株的鉴定
1、跨Target序列PCR扩增
(1)取取转基因T1代材料的叶片提取DNA，用跨Target 1的引物对：ZmBON1_T1-F(5‘-GGGTCTCCGTGTCGTCTCTGCGA-3’，如SEQ ID NO.12所示)及ZmBON1_T1-R(5‘-GCCAACGAGTAACGTAGCAGTA-3’，如SEQ ID NO.13所示)，和跨Target 2的引物对：ZmBON1_T2-F(5‘-GTAGCTTGTTCTCTAGTGGCCTA-3’，如SEQ ID NO.14所示)及ZmBON1_T2-R(5‘-GTAATGCGCCAGCTGTTGATGGT-3’，如SEQ ID NO.15所示)扩增转基因阳性植株，扩增产物进行测序鉴定。反应体系和程序如表5-6所示。
表5反应体系
Figure BDA0002840541520000081
表6反应程序
Figure BDA0002840541520000082
(2)PCR测序结果分析
将测序后的色谱图导入http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/网站，以上述跨Target1/2扩增引物之间的genomic DNA序列作为reference sequence，进行解码。得到多个不同的等位基因突变体，如图3所示。
2、表型结果鉴定
对所有T1代材料基因型鉴定结果为纯合突变体的株系进行株高测量，并测量同时期同地点种植的野生型株系，发现Zmbon1突变体的株高显著低于KN5585野生型，其中两个代表性株系Zmbon1-1和Zmbon1-2的生长表型和株高统计数据如图4和图5所示。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 河南农业大学
<>
<120> 控制玉米株高的基因、其编码的蛋白质以及应用
<>
<160> 15
<>
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<>
<210> 1
<211> 1734
<212> DNA
<213> 玉米
<>
<400> 1
atggggaact gctgctccga tgaggtgagc cacgccggcg ctcatcccgt cggctccgcc 60 <>
accgccaaag ccgcctccgc agcctccgcc gcggccgatc gctttctccg ctcccgtggt 120 <>
gccggcgcgt ccacgcagat cgagttatct ctctctgcat caaatttggg tgatcaagaa 180 <>
tattttccca agagtaaacc catggttgtt gtgtattcca aaaagagaga tggtacacta 240 <>
gaagaaattg ggcgcagtga agtaatttta aattcattga acccattttg gacgaccaaa 300 <>
atcagtgtgc agtaccagtt tgaggttctt cagcaattgg tgtttcaggt ctttgacatc 360 <>
caccagcagt tccatgatgt cagtgaaaag atgcttaagc tagaggaaca agagtttctt 420 <>
ggagaggcta cctgtctttt gtcagaggtt atcaccaaac gggacagact gctgactctg 480 <>
aagcttggtg tttctgaaca taacttgcca aatcctaata attttggtga gctaactgtt 540 <>
caggctgaag aaagttcagg ttcaaaagca ataatggaga tgatattccg ctgttcggat 600 <>
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gatagtggaa tgcctgttcc aatttgcaag acagaagtaa gaaagaatga tctcaatcct 720 <>
aggtggaggc cagtgagtct gaatctgcaa cagattggaa gtaaggagaa ccctctaatt 780 <>
gtagagtgct ttaacttcag tagcaatggc aaacatgacc tagtcggcaa gatagtcaag 840 <>
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aaatatgttg agagtaacag acatactttc ctagattata tttctgttgg gtgccagttg 1020 <>
aattttatgg taggcgtaga tttcacagct tcaaatggaa atccacggct tccagattct 1080 <>
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ggtgatgttc tacaatatta tgacccaccg aagcgtttcc ccgcttgggg ctttggagca 1200 <>
agacctattg acggtcctgt ttctcattgt tttaatttga atggcagcac ttatcaacct 1260 <>
gaggttgacg gaatacaagg aattatgtca gcttatatca gcgctcttcg taatgtatca 1320 <>
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tctcttgctg agaatcaaca taaatacttc attttgttaa tagtcactga tggcgtggta 1440 <>
actgattttc aagagactat tgatgcgatc ataaaggcat cagattttcc tatatccata 1500 <>
attgttgttg gagttggagg ggctgatttc aaggaaatgg agtttctaga tccaaacaaa 1560 <>
ggagagaaac tggaaagctc aaccgggaga gttgcatcaa gggatatgat acagtttgcc 1620 <>
ccgatgaagg atatgcacgg cactgggata tccacacttc aatcacttct tgctgaggta 1680 <>
ccagggcaat tcatgacata catgaggaca agagaaaccc aaacagacag ttag 1734 <>
<>
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 玉米
<>
<400> 2
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<>
<210> 3
<211> 20
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<213> 玉米
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<>
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 4
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<>
<210> 5
<211> 40
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<>
<210> 6
<211> 33
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<>
<400> 6
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<>
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<211> 36
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<>
<400> 7
attattggtc tctaaacgaa ctttcttcag cctgaa 36 <>
<>
<210> 8
<211> 25
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<400> 8
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<>
<210> 9
<211> 25
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<213> 人工序列
<>
<400> 9
ctcacaaatt atcagcacgc tagtc 25 <>
<>
<210> 10
<211> 25
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<>
<400> 10
ttagtcccac ctcgccagtt tacag 25 <>
<>
<210> 11
<211> 25
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<>
<400> 11
ttgactagcg tgctgataat ttgtg 25 <>
<>
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 12
gggtctccgt gtcgtctctg cga 23 <>
<>
<210> 13
<211> 22
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<213> 人工序列
<>
<400> 13
gccaacgagt aacgtagcag ta 22 <>
<>
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 14
gtagcttgtt ctctagtggc cta 23 <>
<>
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<>
<400> 15
gtaatgcgcc agctgttgat ggt 23 <>
<>
<>
<>

Claims (3)

1.ZmBON1基因在构建矮化玉米植株中的应用，其特征在于，其是利用CRISPR/Cas9基因编辑手段，对玉米ZmBON1基因进行定点突变，使得玉米ZmBON1基因功能缺失，来实现对玉米株高的遗传改良，获得矮化玉米，所述基因ZmBON1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述玉米为自交系KN5585；
针对玉米中的目标基因ZmBON1设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带Bar的载体中，用构建的载体转化玉米，实现对ZmBON1的定点突变，进而获得ZmBON1基因功能缺失的转基因玉米植株；
针对玉米中的目标基因ZmBON1作用位点的sgRNA序列为5’-GATCGCTTTCTCCGCTCCCG-3’和5’-GTTCAGGCTGAAGAAAGTTC-3’，将两个sgRNA作用位点通过不同表达盒串联到同一载体上。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述携带Bar的载体为pBUE411。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过农杆菌介导法转化玉米。
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Identification and analysis of copine/BONZAI proteins among evolutionarily diverse plant species;Baohong Zou等;《Genome》;20160621;第59卷(第8期);参见摘要、第3页右栏最后1段-第6页右栏第1段、表1、图1和图2 *
Soderlund,C等.Zea mays full-length cDNA clone ZM_BFb0120G06 mRNA, complete cds.《Genbank登录号BT064766》.NCBI,2009,核苷酸和氨基酸序列，CDS部分内容. *
Zea mays full-length cDNA clone ZM_BFb0120G06 mRNA, complete cds;Soderlund,C等;《Genbank登录号BT064766》;NCBI;20090224;参见特征及核苷酸序列部分 *

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