CN112513707A

CN112513707A - 对象的描绘

Info

Publication number: CN112513707A
Application number: CN201980035292.3A
Authority: CN
Inventors: J·霍尔姆
Original assignee: Chemometec AS
Current assignee: Chemometec AS
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-04-17
Also published as: US20210156782A1; US11933707B2; CN112513707B; EP3781977A1; US20240241024A1; WO2019202005A1

Abstract

一种用于表征样品中的一个或多个对象的方法，该方法包括以下步骤：任选地使用一个或多个透镜收集来自样品的透射、折射、散射、衍射和/或发射光，包括荧光和/或冷光，从而形成收集光；通过所述收集光在传感器表面上形成对象的至少第一图像和第二图像，其中，对于至少第一和第二图像，不同地非对称调制收集光，或者形成对象的至少第三图像和第四图像，其中，第三图像和第四图像的焦平面具有不同的位置，或者形成对象的光的至少第五图像，其中，对于至少第五图像，收集光在与周围环境相比不同的至少两个位置处被调制，或者形成对象的至少第六图像和第七图像，其中，对于至少第六图像和第七图像，不同地非对称调制收集光，并且第六图像和第七图像的焦平面具有不同的位置；及处理至少第一和第二图像，或至少第三和第四图像，其中，处理至少是从第四图像减去第三图像，至少第五图像，或至少第六和第七图像，以用于表征样品中的一个或多个对象。

Description

对象的描绘

技术领域

本发明涉及在图像细胞计数法或显微镜法中描绘或表征对象的任务，所述对象例如是生物颗粒和/或生物颗粒的元素或部分。

背景技术

图像细胞计数法和显微镜法是生物学领域以及其他领域中的基本工具。几十年来，使生物颗粒(作为单个颗粒或颗粒簇)可视化以及使生物分子在单个细胞和细胞核中的精确分布可视化的能力为科学家提供了细胞机制的重要信息。图像细胞计数法的主要工具是：一般的显微镜法，其中考虑颗粒和光之间的直接相互作用；以及发射显微镜法，例如荧光显微镜法，其中发射到颗粒上的光引起更高波长的光发射。

不管所研究的样品如何，图像细胞计数法的目的都是产生描绘存在于样品中的对象或结构的图像，该图像用于定量和/或定性特征提取。因为在图像细胞计数法和显微镜法中的样品图像通常可以在很大程度上被认为是样品背景的描绘，相对于样品背景，对象或结构的描绘可以被描述为其中对象或结构相对于图像性质的对比度不同于背景的对比度的条件。所描绘的样品与样品的对象或结构之间的差异，即对比度，是图像细胞计数法及显微镜法的关键要素。

对比度通常表示为来自对象的信号与来自背景的信号的比率，即对比度等于S_对象除以S_背景，其中“S”代表与所讨论的效应相关的信号强度，例如源自所考虑的效应的测量信号的结果。从该关系中可以清楚地看出，增加的对比度可以是增加来自对象的信号或减少来自背景的信号的结果。在明视场成像或背景明亮的其它技术的情况下，信号可以是正的即比背景更亮，或者是负的即比背景更暗。对比度取决于所使用的方法，通常涉及解析信号强度的方法能力，其中有时必须通过例如应用降噪方法(例如数值滤波)来改善对比度可靠性，或者通过在相同条件下记录两个或更多个图像来确定平均图像以减少随机噪声。具有最大对比度的方法例如是检测荧光信号，其中背景信号实际上不存在，而来自对象的信号在理论上很大程度上受限于激发光强度和存在于或结合于对象的荧光染料分子的数量的组合。在正常条件下，这可以产生极高的对比度。然而，基于荧光显微镜法的分析是劳动密集型的，通常需要混合样品和荧光试剂，因此需要具有专门训练的操作者。此外，将荧光分子结合到对象的方法通常是非常有选择性的，这意味着通常只有所考虑的对象的某一部分可以产生信号。最后，用荧光染料进行复染将限制用于测量其它荧光染料的可用通道的数量。因此，存在对自动化图像细胞计数法和自动化图像细胞计数分析以及自动化显微镜法和分析的高需求，其可以产生诸如生物颗粒的对象或结构的描绘。

尽管常规的显微镜法是视场的2维表示，即，可见对象在图像捕获装置的检测元件的2维阵列上的分布，但是通常感兴趣的是确定对象或对象的部分在3维中的空间位置。现有技术中获得这种信息的方法通常基于在光学系统的焦平面向上和/或向下移动通过样品的条件下记录一系列图像。随后处理所得到的图像集合，称为焦点堆栈，以便确定样品中不同对象或对象的部分的高度。这种焦点堆栈的处理可能是计算密集的或复杂的，使得执行起来很繁琐，例如当分析涉及记录几个视场以便覆盖大量样品时。此外，该方法需要仔细控制光学系统的对准，因为与完美对准的偏差将导致对象的图像表示在整个图像堆叠中横向“移动”，这意味着必须在分析之前补偿这种“对象移动”。

已经开发了若干用于自动图像获取的系统，这些系统可以生成大量的图像数据。关于对象或结构的描绘，图像细胞计数法领域内的主要瓶颈是对所获取的图像中的单细胞和/或其细胞核的正确识别和/或分割。一些研究集中在这个问题上，其通常可以分为两种方法。

第一种方法依赖于通过光学显微镜法图像，例如明视场、暗视场、反射率、透射率、相差显微镜法(PC)、微分干涉对比显微镜法(DIC)和可变浮雕对比显微镜法(VAREL)来确定细胞区室和/或细胞轮廓。第二种方法基于用两种或更多种光谱上不同的荧光染料对细胞质和细胞核进行染色。该方法通常能够分割细胞和细胞核或其它细胞成分。然而，除了荧光技术的一般限制之外，图像细胞计数法和显微镜法中的限制因素是可用于产生荧光的激发光源和发射滤光器的数量。因此，使用一种、两种或更多种光谱上不同的荧光染料来检测细胞质和细胞核，极大地限制了可用于分析生物颗粒样品的荧光通道的数量，并因此导致数据输出减少。荧光染色的另一个潜在的不利影响是染色本身改变了细胞的化学性质和状态，从而改变了人们想要研究的条件。

基于光学显微镜法的现有技术的许多方法对于识别对象的任务具有几个限制，所述对象例如是生物颗粒和/或生物颗粒的部分或片段。这主要是因为通常必须应用复杂的装置以便在大量样品(例如样品背景)和感兴趣对象之间建立必要的对比度。基于简单图像的方法，例如明视场、暗视场、反射率、透射率或相差显微镜法，当面临该任务时通常不足，而依赖于更复杂的光学设置的方法，例如DIC和VAREL显微镜法更为成功。大多数这样的方法基于复杂的光学部件，并且当应用于困难的条件(例如低光学放大率)时，或者当使用由双折射材料(聚合物)制成的样品室时，甚至可能在性能上受到损害。

目前应用的方法的一个缺点是，可能难以构造光学部件，例如对于光学显微镜的一般应用以及专门应用是最佳的物镜。这意味着通常需要改变部件，例如当从DIC显微镜法改变为荧光显微镜法时，或者使用基于折衷的部件，从而使其对于不同的应用是次优的。

通常，在图像细胞计数法或显微镜法中经常遇到的另一任务是确定焦点，或者通常是确定和/或调节对象沿主光轴的位置的任务。当对象位于或靠近焦平面时，则可以在图像平面上获得最佳描绘。如果对象定位得离焦平面太远，则图像平面上的描绘受到损害，通常被描述为“离焦”。因此，能够确定对象沿光轴的绝对或相对位置提供了有价值的信息，能够确定沿光轴的位置的现有技术的方法通常包括光学元件、样品和/或成像装置相对于彼此的移动。这种操作需要复杂的机械装置，因此需要增加复杂性和/或延长分析时间。

发明内容

本发明涉及一种用于表征样品中的一个或多个对象的方法，该方法包括以下步骤：

-任选地使用一个或多个透镜收集来自样品的透射、散射、衍射或发射光，包括荧光和/或冷光，从而形成收集光，

-通过所述收集光在传感器表面上形成

-对象的至少第一图像和第二图像，其中，对于至少第一和第二图像，不同地非对称调制收集光，或者

-对象的至少第三图像和第四图像，其中，第三图像和第四图像的焦平面具有不同的位置，或者

-对象的光的至少第五图像，其中，对于至少第五图像，收集光在与周围环境相比不同的至少两个位置处被调制，

-对象的至少第六图像和第七图像，其中，对于至少第六图像和第七图像，不同地非对称调制收集光，并且第六图像和第七图像的焦平面具有不同的位置，及

-为了表征样品中的一个或多个对象而处理

-至少第一和第二图像，或

-至少第三和第四图像，其中，处理至少是从第四图像减去第三图像，

-至少第五图像，或

-至少第六和第七图像。

基于荧光信号的检测来描述诸如生物对象这样的对象的先前方法已经极大地受到复杂协议的困扰，并且显然受到自由荧光激发/发射通道的数量的限制，因此导致由于荧光特异性而具有不可靠性能的冗长过程。因此，对于描绘生物样品的任务，例如为了掩蔽和分割对象或确定焦点，非常优选透射光显微镜法的方法，因为这种方法的应用用于在过程中不使用荧光信号而不限制任何荧光的可能应用。现有技术的简单方法在困难条件下仅提供有限的对比度，因此不总是适用的，而根据本发明的方法和系统通常通过仅在图像细胞仪或显微镜的光学系统的设计中的有限复杂性而提供显著的改进。

实施本发明的实施例已经令人惊讶地发现，可以使用通常在所有应用中产生最佳性能的部件来构造图像细胞仪或显微镜，所述应用例如优化的透射光显微镜法和荧光显微镜法，而不必面对为了无需互换主要光学部件(例如显微镜物镜)而进行折衷的任务。相反，本发明的优选实施例包括放置在图像细胞仪或显微镜的光路中的光学部件的微小移动。

此外，根据本发明的图像记录可以在不移动光学部件的情况下进行，所述光学部件例如为样品室、物镜、透镜、图像捕获装置，其通常可以引起特性的变化，例如在相同视场的记录图像中对象的成像位置、焦点或光学放大率的变化。

本发明的实施例提供了针对该问题的几个新颖和创造性的方法。本发明的许多优选实施例包括基于相位对比的描绘方法，其允许在不使用荧光的情况下掩蔽单独的生物对象或颗粒(诸如细胞)和/或生物对象的元素或区域(诸如细胞的细胞核和细胞质)，从而使用于分析生物对象、这种对象的元素或区域的图像细胞仪或显微镜的可用荧光激发/发射通道最大化，并且从而增加系统的可能的数据输出。此外，现有技术的方法应用专用光学部件来形成对比度提高的图像(例如相位对比或DIC图像)需要专用光学部件(例如收集物镜)，由于必要的设计，当应用于例如荧光成像的其它光学方法时，其通常是次优的。因此，本发明的实施例的高度优选的优点是能够执行用于增强的可视化和掩蔽的方法，应用对于许多光学应用实际上是最佳的光学布置，而除了调制装置的可能引入和/或位移之外不需要进行任何修改。

本发明的其它同样优选的实施例使用用于描绘样品中的对象的方法，允许用于确定图像细胞计系统或显微镜的焦点和/或确定对象沿光轴的位置的简单且可靠的方法。这种焦点确定可以优选地用于验证和/或确定系统的焦平面的位置，和/或确定对象沿着主光轴在样品和图像捕获装置之间的位置，即样品室的z轴，即沿着来自样品的光沿一个或多个透镜的方向在样品中的位置。根据本发明的方法允许在除了插入和/或移动调制装置之外不需要改变光学部件的布置的情况下描绘对象的z轴位置。现有技术的方法通常依赖于修改光学部件的布置，诸如在一系列图像中改变图像细胞仪或显微镜的焦点，随后分析与大量对象有关的参数以确定所述z位置，例如确定焦平面的位置。已经发现，根据本发明的方法允许在除了插入和/或移动调制装置之外不改变任何光学部件的布置的情况下确定焦点和/或位置，从而就其本身而言描绘各个对象的位置信息，这显然可以被组合到大量对象的位置信息中。本发明的一个优选实施例是利用仅为所考虑的对象(诸如生物对象)的物理尺寸的一部分的幅度的精度和准确度来描绘各个对象的z轴位置。

在几个优选实施例中的图像细胞仪或显微镜的成像配置是与无限校正显微镜配置类似的配置。这意味着物镜形成在无限远处成像的一束平行光或光束。然后，聚焦透镜将该束光或光束聚焦在像平面上。术语“平行光束”在下文中通常用于表示物镜和聚焦透镜之间的平行或基本平行的光或光束的集合。

本发明的一个优选方法基于在实际上相同的条件下记录两个或更多个相位对比图像，不过相位对比元件在两个或更多个图像中处于不同位置。通过将至少两个图像彼此相减来计算两个或更多个图像中的图像信息的差。在这样的减影图像中的图像信息基本上代表在所收集的图像中的相位对比条件的差异，因此任何信息，例如所描绘的信息，基本上涉及在样品中的对象(诸如生物对象)的相位对比性质。图像中显示无相位对比变化的部分，例如通常包括液体材料的样品的背景区域，从而实际上不显示“信号”，而图像中显示相位对比变化的部分，例如生物对象，诸如细胞或细胞的元素，显示信号。因此，由此得出结论，根据本发明记录和处理图像所产生的描绘(例如图像呈现)的对比度是相当大的。

本发明的另一优选方法基于在实际上相同的条件下记录两个或多个相位对比、明视场、暗视场、散射、反射率、透射率、发射如荧光或类似的图像，不过掩蔽元件在两个或多个图像中处于不同的位置。掩蔽元件通常是光学材料，其中一些区域是透明的，而其它区域是不透明的。通过将至少两个图像彼此相减来计算两个或更多个图像中的图像信息的差异。在这种减影图像中的图像信息基本上代表在所收集的图像中的光散射条件的差异，因此任何信息，例如所描绘的信息，基本上涉及在样品中的对象(诸如生物对象)的散射特性。图像中显示无光散射变化的部分，例如通常包括液体材料的样品的背景区域，从而实际上不显示“信号”，而图像中显示光散射变化的部分，例如生物对象，显示信号。因此，由此得出结论，根据本发明记录和处理图像所产生的描绘(例如图像呈现)的对比度是相当大的。

已经令人惊讶地发现，使用本发明的优选方法，可以以足够对比度和/或z轴高度描绘样品的对象，例如生物对象或甚至生物对象的部分或切片，例如显示样品的视觉图像所必需的，或者甚至将这样的描绘应用于可视化和/或掩蔽和/或定位对象的任务，例如生物对象和/或生物对象的部分或片段，以及将这样的描绘应用于确定图像细胞仪或显微镜的焦点的任务。

在本申请全文中，第二图像可以是第一图像，第一图像可以是第二图像，第四图像可以是第三图像，第三图像可以是第四图像，第七图像可以是第六图像，第六图像可以是第七图像。

表述“非对称”应相对于描绘系统的光轴(例如，穿过物镜和/或一个或多个透镜的光的一般路径)、相对于收集光、相对于到达传感器表面的收集光、相对于落到样品上的光、相对于来自样品的光的方向、相对于来自样品的收集光的主角度(光可具有不均匀的角度分布，及/或收集光的主角度可偏离一个或多个透镜的光轴，例如，在侧向散射(研究来自由照射元件照射的样品的散射光，其中相对于样品表面的法向角的入射角大于10°、优选大于12°、更优选大于15°、且最优选大于20°))、或如果主轴不与光轴重合，那么可相对于落到样品上的来自照射的光的主轴来理解。

收集光还可以是可见光范围之外的辐射，甚至是基本粒子的传播，因为这样的粒子具有波的性质。

由于本发明的目的是表征样品中的一个或多个对象，因此感兴趣的是来自样品的光-样品如何影响光。无论是透射、折射、散射(例如米氏散射、瑞利散射、拉曼散射、布里渊散射、康普顿散射、布拉格散射)、衍射还是发射(例如荧光、磷光生物化学电致发光)光，只要所研究的光携带关于样品和样品中的对象的信息，来自样品的光就不太重要。

透镜不是必需的。传感器表面可以例如定位在半球、椭圆抛物面或类似物体的内部，其中样品位于中心点或焦点或靠近中心点或焦点中任何一个的点。来自样品的光可以由传感器表面收集而不需要任何透镜系统，并且软件被配置为计算样品和/或对象如何彼此定位。调制相对于来自样品的光将是非对称的。

来自样品的光可以由一个或多个透镜收集，或者由一个或多个静电透镜、单透镜、四极透镜或磁透镜，或者可以引导光或粒子的某个其它装置收集，从而形成收集光，该光可以聚焦到可以记录二维图片的电子装置的图像平面或传感器表面上，所述电子装置例如数码相机，如CCD或CMOS数码相机。

不同地非对称调制形成第一图像和形成第二图像的收集光并不一定意味着调制用于两个图像的收集光。非对称调制用于图像之一的收集光就足够了。如果调制形成两个图像的收集光，则调制不能相同。

不同地非对称调制形成第一图像和第二图像的收集光可以意味着调制至少一个图像的收集光的一部分，例如通过在一侧阻挡而在另一侧不阻挡或者在一侧比另一侧更多地阻挡。代替阻挡光的一部分，可以调制该部分，使得光的该部分的仅一小部分通过调制，而光的其余部分不受影响。由于不是研究调制，而是光的调制是一种在光线的不同部分中提取光所携带的关于样品中的对象的不同信息的方式，因此如何调制光(通过100％阻挡光的一部分，通过让一部分光的一部分(例如30％透射率)与其余光的另一部分(例如90％透射率)通过，或者比其余光更多或更少地相移一部分光)并不重要——只要是非对称调制光即可。

如果对象位于第一透镜的焦平面上，则用通过第一透镜的来自对象的光照射的第二透镜将在第二透镜的焦平面上形成对象的清晰的焦点对准的描绘图。如果对象位于比第一透镜的焦平面稍远离第一透镜的位置，则描绘图将在第二透镜的焦平面的前方聚焦。同样，如果对象定位成比第一透镜的焦平面稍靠近第一透镜，则描绘图将在第二透镜的焦平面之后聚焦。在后两种情况下，对象的描绘图都将是稍微模糊的。第一和第二透镜可以是相同的透镜，使得来自样品的光通过一个透镜聚焦到传感器表面上。

如果调制在对象和对象的描绘图之间的收集光的一侧(例如收集光的上侧)，这意味着非对称调制收集光，则位于第一透镜的焦平面上的对象的描绘图将在强度上稍有损失，但不被另外操纵。如果相反地，对象定位成比第一平面的焦平面稍远离第一透镜，则收集光的相同调制将导致对象的描绘图在传感器表面上向上移动，因为所移除的光将有助于描绘图的下部。如果相反，对象定位成比第一平面的焦平面稍靠近第一透镜，则具有相反的结果，即，描绘图在传感器表面上向下移动。

通过比较(例如通过数值减法)其中在两个图像之一中已经非对称调制了收集光的两个图像，或者其中在两个图像中已经以不同的方式非对称调制了收集光的两个图像，增加了对象边缘处的对比度。为了观察细胞的边界可能是相当大的挑战，尤其是当细胞位于表面上时，因为除了细胞核之外，细胞的其余部分非常薄，但是使用本发明的方法，即使在细胞的边界处的对比度也足够高，使得可以容易地观察边界。

当例如通过非对称地插入调制装置来非对称调制光时，对象定位得离第一透镜的焦平面越远，对象的描绘图将在传感器表面上移动得越多。因此，描绘图移动了多少取决于距第一透镜的焦平面的距离。该关系或多或少是线性的。除了确定对象在传感器表面上的x坐标和y坐标之外，该方法还可以确定每个对象的z坐标。还可以确定z坐标的绝对值，无论对象是在第一透镜的焦平面的后面还是前面。

可以利用确定对象的z坐标来调整透镜系统，使得特定对象聚焦。确定特定对象的z坐标，其是对象与第一透镜的焦平面之间的距离。由光学系统的特性所限定，可以将对象和焦平面之间的距离与透镜所需的移动相关联，以便在预定位置建立焦平面。将第一透镜移动所确定的特定对象与第一透镜的焦平面之间的距离，且特定对象聚焦。这种方法速度很快。

如果对于对象的光的至少第五图像，在与周围环境相比不同的至少两个位置调制收集光，则我们也将以对比度增加的图像结束。与周围环境相比不同地调制的两个位置的每一个将形成图像，其中与当未调制收集光时相比，离焦的对象将移动。因此，两个形成的图像将不同地移动对象离焦，并且两个图像将彼此垂直叠加，从而在离焦的对象的边界处产生对比度增加的图像。在与周围环境相比不同的至少两个位置调制收集光并且仅在一个图像中捕获对象将实现更快移动的研究，因为同时捕获两个叠加的图像。

通过比较第三图像和第四图像(例如通过减法)，其中两个图像的焦平面具有不同的位置，增加了细胞边界的对比度，消除/减少了背景变化，并且增加了信噪比。焦平面可以是第一透镜的焦平面，或者焦平面可以是第二透镜的焦平面。

如果第三图像的焦平面在传感器表面上，而第四图像的焦平面不在传感器表面上，则第四图像将略微模糊，并且第四图像中的对象的描绘图将略微大于第三图像中的描绘图。从第四图像减去第三图像或反之亦然将形成在边界处对比度增加的图像。位于表面上的细胞的边界将更加可见。

第六图像的收集光和第七图像的收集光被不同地非对称调制，并且第六图像的焦平面和第七图像的焦平面具有不同的位置，这使得能够对离开样品和/或样品的对象的光的每个部分的相位进行更加有效的重构。可能必须记录较少的图像，从而节省时间并减少样品的漂白。

在该方法的实施例中，该方法还可以包括以下步骤：用来自照射元件的入射光照射样品，或者使样品暴露于化学反应、电流和/或电压、或应力。

该步骤涉及从样品收集光的来源。样品可以由光源照射。离开样品的透射或散射光或光致发光将携带样品中的对象的信息，并且可以使用本方法来收集和研究。

该源可以是在反应期间和/或反应之后与样品中发射光的对象反应的化学物质。

该源可以是被驱动通过样品的电流或跨样品施加的电势，其使得样品中的对象发射可以被研究的光。

样品可以以各种形式暴露于机械应力，这将导致样品中的对象发光。

如果样品是具有某种晶体结构的固体，则来自光源的入射光可以经历布拉格衍射，这也可以用这种技术来研究。

所有这些种类的源可以用于从样品产生光，所述光将包括关于样品中的对象的信息。

在该方法的实施例中，该方法可以包括将样品置于图像细胞仪、成像流式细胞仪、不是流式细胞仪的图像细胞仪、或显微镜中的步骤。

当执行根据本发明的方法时，像成像流式细胞仪或不是流式细胞仪的图像细胞仪那样的图像细胞仪是非常适合使用的仪器，因为明视场图像、暗视场图像和荧光图像都可以用于描绘对象。

显微镜也是在执行根据本发明的方法时使用的非常适合的仪器。为了增加对比度，不仅能够确定对象的横向坐标，而且能够确定z坐标，并且能够在短时间内将对象移动到焦点中，这些都是显微镜的期望功能。

在该方法的实施例中，处理至少第一和第二图像的步骤可以包括

-从第二图像减去第一图像，或从第七图像减去第六图像，

-计算第一图像和第二图像的平均值，或第六图像和第七图像的平均值，

-计算第一图像和第二图像之间的比率，或第六图像和第七图像之间的比率，

-将第一图像和第二图像、第三图像和第四图像、或第六图像和第七图像互相关，或

-对第一图像和/或第二图像、第三图像和/或第四图像、第五图像、或第六图像和/或第七图像进行去卷积。

从第二图像减去第一图像或从第七图像减去第六图像将给出对比度增加的结果图像。

第一图像和第二图像的平均值可以理解为意味着该平均值是每个像素的平均值，从而第一图像和第二图像的平均值导致又一个图像，其中每个像素的值是第一图像和第二图像的相同像素的值的平均值。

使第一图像和第二图像、第三图像和第四图像、或第六图像和第七图像互相关将导致对比度增加的结果图像，或第一图像和第二图像、第三图像和第四图像、或第六图像和第七图像之间的量化平移。量化平移具有可以更容易地确定对象的描绘图的平移的优点。

对第一图像和/或第二图像、第三图像和/或第四图像、第五图像、或第六图像和/或第七图像去卷积的优点在于，可以提高分辨率，并且如果对至少第一图像和第二图像、第三图像和第四图像或第六图像和第七图像去卷积，则可以重构来自对象的光的相位信息，并且还可以重构样品和/或对象的三维图像。

在该方法的实施例中，

-处理至少第一和第二图像可以包括将第一图像与第二图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像中的平移来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理至少第三和第四图像可以包括将第三图像与第四图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像之间的对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理至少第五图像可以包括基于对象中的至少一个对象来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，其中，在第五图像中确定一个或多个对象的描绘图的延长，或者

-处理至少第六和第七图像可以包括将第六图像与第七图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像中/之间的平移和/或对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点。

描绘图在第一图像和第二图像之间或者在第六图像和第七图像之间不改变位置的对象将被聚焦。如果对象没有位于一个或多个透镜或第一透镜的焦平面中，则调制将仅改变在第一和第二图像之间或在第六和第七图像之间的对象的描绘图的位置。

在多个对象中，当从第三图像到第四图像时描绘图的大小(相对或绝对数量)增加或减小最多的对象将被认为分别在第三图像和第四图像中在第一透镜的焦平面中或接近第一透镜的焦平面。该方法可以包括被配置为比较第三图像和第四图像中的所有或大多数对象的大小且确定第三图像和/或第四图像中最接近第一透镜的焦平面的对象的软件。

对于对象和/或对象内的元素的描绘图(如果对象是细胞，则对象内的元素例如是下面提到的细胞的部分)，当焦点从对象的前面移动到对象的后面时描绘图的对比度将从较亮变为较暗，反之亦然。对于多个对象，较亮并且在焦点移动之后也保持较亮的对象全部位于焦平面的同一侧，而较暗并且在焦点移动之前和之后都保持较暗的对象全部位于焦平面的另一侧。在焦点移动期间改变对比度的对象在焦点移动之前和/或之后靠近焦平面。在一个或多个透镜的焦平面中的对象产生具有最小对比度的描绘图，因此描绘图从具有或要具有低对比度或比其它对象的描绘图低的对比度改变的对象将表明焦平面在所述对象处的焦平面的改变之前或之后。基于该信息，软件可以被配置为确定焦平面在哪里以及在焦点移位之前或之后哪些对象接近焦平面或在焦平面中。

由于操纵而导致的对象描绘图的细长形状将始终在相同的方向上。如果第五图像中的对象的描绘图具有基于样品中的对象所预期的形状，即，第五图像的平面中的两个垂直方向上的长轴具有与对象的长轴和短轴的关系相对应的关系，则可以假定对象在第一透镜的焦平面中。

在该方法的实施例中，来自样品的光沿着一个或多个透镜的方向可以限定轴线，其中

-处理至少第一图像和第二图像可以包括将第一图像与第二图像进行比较并且基于至少一个对象在至少第一图像和第二图像之间移动了多少来确定至少一个对象沿轴线的位置，

-处理至少第五图像可以包括基于至少一个对象的描绘图的延长来确定所述对象沿着轴线的位置，

-处理至少第六图像和第七图像可以包括将第六图像与第七图像进行比较，并且基于至少一个对象在至少第六图像和第七图像之间移动了多少来确定所述至少一个对象沿轴线的位置。

当例如通过非对称地插入像例如阻挡器这样的调制装置来非对称调制光时，对象定位得离第一透镜或一个或多个透镜的焦平面越远，对象的描绘图将在传感器表面上移动得越多。因此，描绘图移动了多少取决于距第一透镜的焦平面的距离。该关系或多或少是线性的。除了确定对象在传感器表面上的x坐标和y坐标之外，该方法还可以确定每个对象的z坐标。还可以确定z坐标的绝对值，无论对象是在第一透镜或一个或多个透镜的焦平面的后面还是前面。

在该方法的实施例中，来自样品的光可以包括来自样品的至少第一波长和第二波长的发射光，并且其中该方法包括确定对象中的至少一个发射了具有第一波长还是第二波长的光的步骤。

即使不是全部，也是大多数透镜以较高或较低的程度显示色差。原因是折射率随波长而变化。如果本发明的上述方法已经用于确定哪些对象在相同平面中(具有相同的z坐标)，或者已经确定所有对象或一种或多种特定种类的对象中的全部对象以某种其它方式在相同平面中，并且对象在第一透镜的焦平面中，则一个或多个透镜的色差将由于非对称调制而导致不同波长的收集光在传感器表面上不同地移动。优选地，可以在使用光谱窄带的成像模式中进行z位置的第一确定。这可以是例如基于LED的侧向散射模式。如果确定了每个对象的z位置，则为了在随后的测量中确定它们的光谱分布，所有对象都在相同的焦平面中不是先决条件。

许多玻璃，例如镧重燧石、燧石钡冕、硼硅酸盐冕和萤石冕，都有折射率随着波长至少在300nm至2500nm的范围内增加而下降的特性。这意味着从对象发射的较短波长将经历较高的折射率，并且第一和第二透镜对于较短波长将具有比较长波长更短的焦距。如果来自具有短波长的对象的收集光聚焦在屏幕表面的前面，并且例如通过在收集光的上部分处阻挡来对称调制收集光，则所描绘的对象将在传感器表面上向上移动。相同的调制在更短波长的光的情况下将更多地向上移动对象的描绘图。相同的调制在较长波长的光的情况下将较少地向上移动对象的描绘图。最终，对于波长长得多的光，焦点将在传感器屏幕后面，并且移动将向下。

对于300nm和2500nm以外的波长，玻璃仍可具有折射率随波长增加而下降的特性。如果感兴趣的是研究玻璃不显示这种特性的波长范围内的对象，则必须找到由其它材料制成的透镜。当然，如果在感兴趣的范围内，折射率随着波长的增加而增加，那么只要折射率不从随着波长的增加而增加变为减小，这就不是问题，反之亦然。

在该方法的实施例中，该方法可以包括确定从样品发射的光的波长的步骤。

通过校准系统，例如通过利用和不利用非对称调制从样品的位置或从第一透镜的焦平面发送具有一些已知波长的光通过透镜并到达传感器表面，将有可能基于对象的描绘图响应于非对称调制而移动多少来确定例如从对象发射的光的波长。将有可能研究哪些对象例如由于在一个波长的荧光或发光而发射光，以及哪些对象在另一个波长发射，以及涉及哪些波长。基于折射率对波长和所涉及的透镜在已知波长下的焦距的依赖性，软件可以被配置为计算特定波长将在何处基于特定的非对称调制而在传感器表面上移动。该计算可以代替或附加于校准使用。

在该方法的实施例中，非对称调制收集光可以意味着

-阻挡收集光中的一些，和/或

-相移收集光中的一些。

阻挡一些收集光可以意味着插入阻挡光的一侧或一部分光的调制装置，或者插入具有开口或被切除的一部分的板，其中非对称地定位开口或被切除部分。

相移一些收集光可以意味着插入相移光的一侧或一部分的相移器，或者插入具有开口或被切除部分的相移器，其中非对称地定位开口或被切除部分，并且不对光进行相移或者对光进行与相移器的其余部分不同的相移。对于一个图像而不是另一个图像，非对称地相移收集光，或者对于一个图像以一种方式而对于另一个图像以另一种方式非对称地相移收集光，将导致对比度的差异，使得例如从另一个图像减去一个图像的数值减法将给出对比度增加和背景减少的结果图像。相移光而不是阻挡光将不会降低从样品到达传感器表面的收集光的强度，并且可以研究更微弱的对象和/或需要更少的光照射样品，导致更少的漂白。

在该方法的实施例中，其中

-可以非对称调制和对称非对称调制第一和第二图像，

-可以对称调制在与周围环境相比不同的至少两个位置调制的收集光，或者

-可以非对称调制和对称非对称调制第六和第七图像。

两个非对称调制或两个位置关于相同的轴或方向对称，因为每个非对称调制关于例如一个或多个透镜的光轴不对称。

对称非对称调制第一和第二图像或第六和第七图像的光意味着通过在对称轴的一侧插入具有开口的板、插入阻挡器或插入移相器来调制每个图像的收集光，并且其中当沿对称轴镜像时，一个图像的板、开口、阻挡器和/或移相器是另一个图像的板、开口、阻挡器和/或移相器的镜像。

在两个位置的第一位置和两个位置的第二位置对称调制第五图像的收集光意味着在第二位置的调制基本上对应于在第一位置的相同调制，其中第一位置和第二位置是关于对称轴彼此的镜像。

调制第五图像的收集光的两个位置可以关于对称轴彼此对称。

优点是一个图像不会比其它图像模糊得多。当来自样品的光强度已经很低时，这一点尤其重要。另一个优点是，对象描绘图的真实位置总是被认为在一个图像中的描绘图和在另一个图像中的描绘图的中间的位置。

在该方法的实施例中，通过在收集光中插入以下可以实现非对称调制收集光，或者在与周围环境相比不同的至少两个位置调制收集光

-具有至少一个或两个开口的板，

-至少一个或两个不透明区域，和/或

-至少一个或两个相移区域。

两个开口、不透明区域或对光进行相移的两个区域优选地彼此不相邻和/或邻接和/或彼此不接触。

具有一个开口的板中的开口将用作将增加景深的孔。即使对象的描绘图在传感器表面的前面或后面聚焦，开口也将使描绘图在传感器表面上清晰显现，这将使得更容易测量和/或计算描绘图由于非对称定位的开口而在传感器表面上移动了多少。开口优选大于0.5mm且小于25mm，更优选大于1mm且小于16mm，甚至更优选大于3mm且小于13mm，最优选大于6mm且小于11mm。这将提供高的景深。

在板中具有两个开口的情况下，每个开口也将用作将增加景深的孔。第五图像将是彼此叠加的对象的两个描绘图。由于两个描绘图都将是焦点对准的，所以描绘图将是清晰的，并且将易于测量和/或计算描绘图由于两个开口而在传感器表面上移动了多少。两个开口中的每一个的尺寸优选地与一个开口的尺寸相同。

非对称地定位在收集光中的一个不透明区域将非对称地影响收集光，从而使对象在传感器表面上的描绘图非对称地移动，而不会使收集光的强度降低得与具有一个开口的板一样多。这样仍然可以研究非常微弱的对象。同样，当形成第五图像时，可使用在收集光中非对称地定位的两个不透明区域。两个不透明区域将具有与针对在收集光中非对称地定位的一个不透明区域所提及的相同的优点。

非对称地定位在收集光中的一个相移区域将影响收集光，从而使对象在传感器表面上的描绘图非对称地移动，而不会使收集光的强度降低。这样仍然可以研究非常微弱的对象。同样，当形成第五图像时，可以使用在收集光中非对称地定位的两个相移区域。相移区域将具有与针对在收集光中非对称地定位的一个相移区域所提及的相同的优点。

第五图像还可以用于确定每个对象的z坐标。在两个对象中，第一对象位于第一透镜的焦平面中，第二对象不位于第一透镜的焦平面中，第一对象的描绘图将在第二透镜的焦平面中聚焦，而第二对象的描绘图将不在第二透镜的焦平面中聚焦。第二对象的描绘图将稍微放大或伸长，并且可能在传感器表面上存在两个不同的描绘图，每一个来自至少两个位置的一个，其中与周围环境相比，不同地调制收集光。对描绘图或同一对象的两个描绘图之间的距离的放大将是关于将对象定位为距焦平面多远的度量。

在该方法的实施例中，照射元件可以是在200nm和1,000nm之间的范围内发射的光源，在第一优选实施例中，该范围在250nm和800nm之间，更优选地在300nm和700nm之间的范围内，或者在第二优选实施例中，该范围在250nm和400nm之间。

如果范围在250nm和400nm之间，则描绘图的对比度增加。

在该方法的实施例中，一个或多个对象可以在悬浮液或胶体中，其中悬浮液或胶体的分散介质是固体、液体或气体。

如果悬浮液或胶体的分散介质是液体或气体，则对象可以在对象沉降在底部之前四处移动。使用本发明的方法可以研究对象的移动性，直到对象沉降在底部。

在该方法的实施例中，

-处理至少第一和第二图像可以包括将第一图像与第二图像进行比较并确定样品中的对象的相位量化特性，

-处理至少第五图像可以包括确定样品中的对象的相位量化特性，或

-处理至少第六和第七图像可以包括将第六图像与第七图像进行比较并且确定样品中的对象的相位量化特性，

优选地其中相位量化特性包括相位的改变或相移。

当光穿过样品或至少一部分样品时，量化光的相位特性或相移是有利的，因为相移的确定可以优选地用于确定样品和/或对象(例如生物颗粒或生物细胞)的物理厚度和/或光学厚度。

在该方法的实施例中，处理一个或多个图像以表征样品中的一个或多个对象可以包括分割对象的步骤。

分割图像可以意味着选择或隔离图像的某些部分。这可能导致图像被划分或分割成两个或多个区域，或者它可能导致单个区域与原始图像隔离。可以为分离或隔离的区域分配特定值。例如，可以为隔离的背景赋予零值或选定的背景值。对于具有多个隔离区域的图像，可以为每个区域分配不同的值。掩蔽可进一步包括勾勒图像的一个或多个区域的轮廓以确定区域的边缘或边界。由于本发明提供了一种可以提供对比度增加的对象的描绘图的图像的方法，所以本发明适合于分割对象。因此，根据本发明分割对象是快速的，并且例如不需要为了荧光测量而必须对对象进行染色，其中染色可以化学地影响对象，使得对象例如更易于漂白。

在该方法的实施例中，对象可以是细胞，并且分割细胞可以包括识别细胞的部分，例如细胞质、线粒体、高尔基体、溶酶体、脂质球、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶或通常生物颗粒的任何元素或区域。

在许多情况下，当研究和表征细胞时，分割细胞是非常重要的任务。通常，研究活细胞是有利的。因此，优点是该过程快速并且不需要如染色剂的可能杀死细胞的化学物质。也可以避免可能漂白细胞的过长的暴露时间。

本发明还涉及一种用于表征一个或多个对象的系统，所述一个或多个对象如样品中的生物对象和/或生物对象的元素或区域，其中所述系统被配置为执行根据前述权利要求中的任一项所述的方法步骤。

描绘诸如生物对象或生物对象的部分或片段的对象或对象的部分的任务是产生揭示在图像细胞仪或显微镜的视场中可见的所述对象、生物对象或生物对象的部分或片段的存在、形式、形状或边界、位置或焦点的信息的任务。

样品通常是样品材料的一部分，例如一定体积的样品材料、生物对象附着于其上的表面区域，例如组织学样品或组织样品或基质壁，例如生物对象在基质上生长的地方。事实上，任何待成像的对象，作为图像细胞仪或显微镜中的样品、表面或结构，无论尺寸如何，任何景象(如景物)都可以被认为是样品，因为本发明的方法可以应用于任何这种描绘样品中的对象的任务。

样品中的对象通常是除一般样品基质之外的任何物质。在光信息的图像记录中全局或局部存在的样品基质表示通常被称为图像背景，因此对象是可以被识别为与图像中的背景不同的任何事物。对象通常是颗粒，并且在生物或生化分析领域中，对象通常是生物对象或颗粒，诸如细胞，例如动物、植物、真菌或细菌细胞。关于固体样品(例如组织样品)的描绘，对象可以是能够从一般样品基质分离的任何结构和/或特征，例如组织细胞或组织细胞的元素。生物对象可以是任何对象，或者生物对象可以仅表示生物对象。

样品室是一个有限的空间，其中容纳了被分析的样品。在一些情况下，样品室由单个表面限定，例如当样品是置于玻璃板上的液滴时，但在其它情况下，样品室由至少两个表面限定，通常其中两个表面是基本上平行的透明材料片，在它们之间形成样品片，例如液体样品。

在本公开内容全文中，描绘样品或样品中的对象或结构将被理解为生成样品的图像的过程，其中对象或结构之间的对比度是“可见的”；可见的意义是，为了可视化，由操作者，或者为了诸如变换的计算，由计算机应用程序使其看起来与背景不同。

在图像细胞计数法和显微镜法中，通常使用诸如数码相机的电子装置来采集图像。因此，术语“图像”是数据的任何形式的可视化或数字表示。图像中的数据通常可以是由数码相机记录的数据，但更通常的是由记录数据的数学变换产生的数据，包括来自多于一个记录的数据，这样的变换由计算机上的软件应用程序执行。

当记录图像时，通常有利的是，在记录的整个持续时间内，几乎所有条件都不变。记录条件可以根据光信息的性质和/或图像细胞仪或显微镜的条件而从一种情况变化到另一种情况，例如信号积分的可变时间、根据光信息的强度、或者例如当可以减少系统的噪声贡献时获取组合到图像记录的两个或更多个单个记录，以便产生更好统计质量的记录图像，例如更低水平的随机噪声。

根据本发明的描绘通常涉及光信息的记录图像的处理，当然包括现有技术中称为图像处理的任何这样的处理。处理(通常是数字处理)还包括诸如加法或乘法处理(例如，记录图像的加法或减法、滤波、卷积)之类的变换，仅举几个示例。此外，它包括确定从一个记录图像到另一个记录图像的光信息的位置和/或强度的变化。

在本公开内容全文中，当描绘样品中的对象是用于掩蔽的基础时，掩蔽应理解为分离或隔离图像的一个或多个区域和/或检测图像中的一个或多个区域的边缘或边界和/或区域之间的边界的过程，例如区域可以是细胞或细胞的一部分，例如细胞质、线粒体、高尔基体、溶酶体、脂质球、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶，或通常生物对象的任何元素或区域。掩蔽包括将对象的描绘图(即对象或对象的片段或部分的图像)与其背景分离和/或去除图像背景的描绘。

此外，它还可以包括分割图像或者选择或隔离图像的某些部分。这可能导致将图像划分或分割成两个或多个区域，或者它可能导致单个区域与原始图像隔离。可以为分离或隔离的区域分配特定值。例如，可以为隔离的背景赋予零值或选定的背景值。对于具有多个隔离区域的图像，可以为每个区域分配不同的值。掩蔽可进一步包括勾勒图像的一个或多个区域的轮廓以确定区域的边缘或边界。

图像细胞仪或显微镜的图像平面是图像捕获装置(例如数码相机)的位置。图像捕获装置的位置也可以称为传感器表面。

图像细胞仪或显微镜的主光轴是沿着样品室和图像细胞仪或显微镜的图像平面之间的方向的轴。

图像细胞仪或显微镜的焦平面是沿着主光轴的源自样品中的点的光线会聚到图像平面上的点的位置。

对象诸如生物对象的焦点或位置优选地是其相对于参考点(诸如图像细胞仪或显微镜的光学系统的焦平面)的位置的度量或者是相对于另一对象的位置的度量。优选地，当样品室相对于焦平面的位置已知时，这通常与样品室中沿着主光轴的位置(即，沿着样品室的z轴的位置)有关。

此外，术语“波段”和“波长带”在本公开内容全文中用于基本上位于两个给定限度之间的电磁波长或频率的范围。这些电磁波长包括可见光谱中的光以及紫外光和红外光。

术语“染色”用于描述显微镜法中用于增强显微图像中的对比度的技术。这种技术经常用于突出显示生物组织中的结构以便观察，以及突出显示生物对象或生物对象的部分。可以使用单一染料来执行染色以增强样品的对比度，或者可以使用两种或更多种染料来执行染色来增强对比度。

在本公开内容全文中，术语“边界”应被理解为区域或范围的边缘或周界。这包括对象、细胞、颗粒或元素的边界以及区域或范围之间的边界。生物对象的边界可以指外边缘或周界，如从给定视点拍摄的对象的图像中所示。边界也可用于描述对象或元素的子区域的边缘或外围。细胞的边界可以指细胞膜、细胞壁或细胞被膜。

术语元素或区域的“周长”应当被理解为在图像中表示的所述元素或区域周围的距离。在边界的周长的情况下，这对应于边界的长度。生物对象的周长则是从给定视点所示的沿着对象的外边缘或周界的距离。

具体实施方式

使用细胞计数法(例如图像细胞计数法)或使用显微镜法分析样品中的对象(例如生物对象)通常依赖于对象的描绘，例如出于对象的可视化的目的，或出于掩蔽的目的，其中掩蔽是确定(一个或多个)感兴趣区域的方法。对象的进一步描绘包括确定位置的方法，例如确定对象相对于图像细胞仪或显微镜的元件(诸如图像细胞仪或显微镜的样品室或焦平面的部分)的位置，或对象相对于彼此的位置，或相对于对象和/或对象的部分或截面确定对象的部分。

本发明的优选实施方式包括用于描绘生物对象和随后的掩蔽以便确定其边界的方法，以及用于掩蔽生物对象的元素或区域和/或确定生物对象的位置和/或焦点的方法，等等。能够执行这种描绘的现有技术的方法通常需要专门的光学部件和/或专门的光学部件布置，导致设计和操作的复杂化。而且，当考虑专门的布置时，例如，首先，分析(例如亮视场、暗视场、相位对比、反射、透射分析)通常是基于高光强度检测的方法，其次，例如依赖于非常低或甚至极低光强度检测的荧光的方法，由于在一种情况或另一种情况下使用次优部件，需要牺牲光学性能，或者由于需要替换关键光学部件，例如图像细胞仪或显微镜的收集物镜，而增加复杂性，通常需要额外的任务，例如对准和/或聚焦。

在本发明的一个实施例中，用于描绘悬浮液中或附着到样品室表面的样品中的至少一个生物颗粒或对象的方法还可以包括，

-将样品室放置在图像细胞仪中，

-用来自照射装置的光照射样品，

其中照射光与样品的颗粒或对象相互作用，

-从样品收集光信息，

-使所述收集光通过可移动的调制装置

-记录来自样品的光信息的一个或多个图像，

-及处理一个或多个图像中的光信息以确定或形成对象或颗粒和/或对象或颗粒的元素或区域的描绘图。

尽管本发明的一些实施例基于仅记录单个图像，但是其它同样优选的实施例基于记录两个图像，或者有时记录多于两个图像，例如三个或更多个记录的图像。当记录两个或多个图像时，与仅记录一个图像相比，图像细胞仪或显微镜的条件，优选地是调制装置的位置，是显著不同的。

本发明的方法包括调制装置，其中所述调制装置可以在记录的光信息中插入显著的差异。所述调制装置优选地沿着图像细胞仪或显微镜的主光轴放置，优选地放置在例如物镜的收集光学器件和例如数码相机的图像记录装置之间的位置。最优选地，调制装置放置在物镜和聚焦透镜之间，即在成像光平行的部分中。在本发明的实施例中，所述调制装置在从样品发射的光信息引入变化。这种变化优选是定量的，例如与光信息的强度或相位角有关，和/或定性的，例如与波长的变化有关。

本发明的优选实施例包括这样的方法，其中所述调制装置的预定位置产生记录的光信息的调制，该记录的光信息可以被处理以便产生对象的描绘图。本发明的另外几个优选实施例包括这样的方法，其中所述调制装置的两个或多个不同的预定位置在记录的光信息的调制中产生差异，该记录的光信息可以被处理以便产生对象的描绘图。优选地，所述调制装置位于光束中的预定位置，在该预定位置处，光的条件有些不同或者所述条件可能不同，从而反映了光信息图像记录中的所述差异。在本发明的调制装置所在处的光束是平行的实施例中，通常优选地在垂直于图像细胞仪或显微镜的主光轴的方向上移动或放置所述调制装置，而在光束或至少一部分光束不平行的其他实施例中，通常优选地在平行于图像细胞仪或显微镜的主光轴的方向上移动或放置所述调制装置。在所述光束的一部分光平行而另一部分光偏离平行的实施例中，通常优选地以这样的方式移动或放置调制，即，使得一个或多个记录的图像反映所述平行光或偏离平行的所述光的特性。

在本发明的实施例中，调制装置所在处的光束在至少一个光学特性方面是不均匀的，所述光学特性例如强度、相移、方向、波长、样品和/或对象中的原点位置，或者更一般地，优选的是，调制装置可以在光信息的记录图像中反映的至少一个特性中插入改变，优选地，所述反映的特性是成像特征的强度和/或空间位置。在调制装置在光特性中插入改变的条件下，例如通过将所述调制装置定位在预定位置，记录光信息的两个或多个图像，优选地可以确定所述两个或多个记录的图像中的差异，并且优选地使用所述差异来描绘样品中的对象。在许多优选实施例中，所述光学特性的差异以及它在记录的图像中如何表示基本上仅与距光束中心的距离有关，例如旋转对称，而在其它实施例中，所述差异还与光束中的角位置有关。

本发明的一个优选特征是，可以在保持图像细胞仪或显微镜的所有光学部件静止(优选地不包括所述调制装置)的同时，来执行光信息图像的记录，所述调制装置优选地可以在光信息图像的记录中在不同的预定位置之间移动。这是非常优选的，因为它允许针对不同的应用(例如散射和荧光确定)优化图像细胞仪或显微镜的配置，并且保持这样的优化配置。

本发明的优选实施例包括描绘对象的方法，所述对象诸如生物对象或生物对象的一部分，其中所述描绘可以用于创建和/或改进样品中的对象的图像表示。这种描绘优选地提供与诸如DIC这样的方法类似的图像表示的条件，但是同时包括对插入和/或移动调制装置的需求，优选地，其中图像细胞仪或显微镜的其它部件(包括收集物镜和聚焦透镜)是固定的，并且优选地，布置成对于图像细胞仪(诸如荧光图像细胞仪)或显微镜(诸如荧光显微镜)的其他方法基本上是最佳的。

本发明的几个实施例使用对诸如生物对象之类的对象的描绘来确定掩蔽。优选地，这种掩蔽包括确定对象边界，例如细胞边界，例如细胞膜的范围或位置。在其它同样优选的方法中，掩蔽对象的元素或片段的位置，例如生物对象的元素或片段在所述对象的边界内的位置。

本发明的几个实施例使用对诸如生物对象之类的对象的描绘来确定对象的焦点或位置。诸如生物对象的位置优选地相对于图像细胞仪或显微镜的焦平面、样品室或另一对象。单个对象相对于焦平面的位置通常是非常重要的，例如因为它可以用于确定聚焦的一般条件，例如用于确定图像细胞仪或显微镜是否“聚焦”，同时它还可以用于确定样品室相对于焦平面的布置，例如用于确定样品室的倾斜。在本发明的几个优选实施例中，涉及聚焦的信息包括幅度，即距焦平面的距离，还涉及取向，即其源自焦平面的哪一侧，并且本发明的实施例通常包括单独使用该信息来确定一个或多个光学部件，例如透镜、样品室或图像记录相机的布置的变化，以便使图像细胞仪或显微镜“聚焦”，或者至少优选地改进图像细胞仪或显微镜的聚焦条件。

用于确定对象的焦点和/或位置的对象的描绘优选地基于确定光信息在一个或多个记录的光信息图像中的移位，所述移位由调制装置产生，优选地由在记录光信息图像期间处于不同预定位置的可移动调制装置产生。此外，所述调制装置具有一个或多个基本不透明的区域，以及具有至少一个基本透明的区域，优选地，其中所述透明区域的尺寸，例如直径，小于由图像细胞仪或显微镜的收集物镜产生的光束的尺寸，从而形成孔径。已经发现，相对于所述光束的中心移动所述孔径将产生对象的图像在图像平面上的移动，并且通过处理所记录的光信息的图像，所述移动可以与聚焦或位置相关。

本发明的其他同样优选的实施例使用对象(诸如生物对象、生物对象的部分或片段)的描绘以确定所述对象的位置，通常相对于参考位置，诸如样品室的边界，或相对于其他对象或对象的部分。这种方法使得不仅可以在图像的窗格中，而且优选地还可以在垂直于图像平面的方向上，确定对象的元素的相对位置，从而便于确定颗粒或颗粒的对象之间的三维差异，例如，为了确定细胞的不同元素的位置。

用于描绘诸如生物对象(例如生物细胞)的对象的一个优选方法是描绘关于与所述对象相互作用的光的相移(例如相位角的改变)的程度的特性。相移的描绘可以优选地用于确定诸如生物对象的材料的物理厚度和/或光学厚度。

本发明的优选方法包括在基本上不同的条件下记录光信息的两个或更多个图像。优选地，所述条件差异由调制装置(即光调制装置)引起，优选地，其中调制装置是可移动的并且在记录两个或更多个所述图像期间位于不同位置。优选地，所述调制装置调制通过样品中的对象和/或与样品中的对象相互作用和/或从样品中的对象发射的光信息。这样的光调制优选地是以下一种或多种：相位角的偏移、光的衰减、光的衍射、光的折射。

尽管可以使用本发明的方法描绘几种不同类型的对象，但是几个优选实施例包括的对象是生物对象。

虽然本发明的实施例通常适用于任何波长的光信息，但是本发明的几个优选实施例，尤其是包括生物对象的描绘图的实施例，优选地包括其中照射装置是在200nm与1,000nm之间的范围内、优选地在250nm与800nm之间的范围内、更优选地在300nm与700nm之间的范围内发射的光源的光信息。在实施例中，例如在所述调制装置反映相位角的变化的实施例中，所述照射装置优选地是在250nm和400nm之间的范围内发射的光源。

在几个优选实施例中，照射装置位于连接图像细胞仪或显微镜的样品和检测器的主光轴上。在其它同样优选的实施例中，所述照射装置以相对于图像细胞仪或显微镜的主光轴倾斜的方式照射样品，优选地，其中，感兴趣的是通过减少可以进入收集光学器件(即收集物镜)的照射光的量，抑制光信息的记录中的同样多的照射光。

当考虑照射光和样品中的对象之间的相互作用的方法时，本发明的几个优选实施例使用以下中的一个或多个：透射、吸收、折射、衍射、米氏散射、瑞利散射、拉曼散射、光致发光。

根据本发明的用于描绘对象的几个优选方法中的调制装置是显著影响光的相位的调制装置，优选地其中所述可移动调制装置处于其中将来自样品的光的相移转换成图像中的亮度变化的布置中。产生所述相移的调制装置包括两个或多个区域或区段，在这些区域或区段中，厚度限定了相角偏移。当记录光信息的两个或更多个图像时，通常优选的是，所述记录的图像中的至少一个是相位对比显微镜图像，优选地其中将光的相移转换成亮度变化。此外，在几个优选方法中，所述调制装置包括不透明区域或区段，其可以基本上阻止光透射通过所述区域或区段，而另一区域或区段是基本上透明的。优选地，在记录光强度信息的两个或更多个图像期间，所述调制装置处于不同的位置，典型地，在记录所述图像之间，所述调制装置在垂直于主光轴的方向上移动，优选地，其中移动是预定的。

所述调制装置的许多优选配置是平行光学材料片，优选地是光学玻璃，进一步地，其中所述片在不同区域中具有不同的光学特性。

优选地，当所述调制装置包括具有不同光学特性的区域时，所述区域可以定位成与图像细胞仪或显微镜的主光轴近似中心对准，并且在许多实施例中，该区域是对称的，更优选地，该区域是圆形的。许多这样的优选实施例包括其中所述调制装置相对于主光轴的中心移动的方法。

调制装置的通常优选的特性是所述调制装置的区域具有不同的光透明度，例如不同的光衰减。优选地，所述调制装置具有不同衰减的区域，优选地，其中一些区域的衰减强，通常这些区域基本上不透明，和/或其中其它区域具有很小的衰减，通常这些区域是透明的。其它优选实施例包括透明区域，其中衰减在所述区域的范围上变化，例如当衰减沿所述区域的尺寸连续变化时，例如当区域的衰减消失时。

在本发明的几个实施例中，对诸如生物对象的对象的描绘基于将第一调制装置插入到光束中，而在其它实施例中，所述描绘基于将所述第一调制装置放置在光束中的预定位置。在本发明的其它实施例中，所述描绘基于插入第二调制装置，优选地，其中所述第二调制装置相对于所述第一调制装置在特性上不同。第一和第二调制装置之间的差异通常与光学活性区域或区段的空间布置有关，而其它实施例包括在所述第一和第二调制装置中呈现不同光学调制的区域或区段。

当执行根据本发明的方法时，包括诸如相位对比方法的方法，通常优选的是，照射装置在光进入样品时用基本准直的光照射样品。在其它方法，包括诸如散射、侧向散射和荧光的方法中，同样优选的是，照射装置用非准直的光照射样品，即基本上聚焦到样品上。在任一情况下，通常取决于应用。

本发明的优选方法包括处理记录的光信息图像的方法，例如图像的缩放、图像的相加、图像的相减、图像之间的比率、图像之间的互相关、图像的去卷积、通过求解强度方程的传输来得到光学相位和强度。其他方法，例如通过最大信号强度的定位和/或强度质心的定位来确定位置通常也是优选的，特别是当描绘涉及确定焦点和/或位置时。

本发明的几个实施例包括记录光信息的图像，其中光信息是荧光信息或侧向散射光信息。

本发明的几个优选方法涉及对附着到表面的对象的描绘，优选地，附着到样品室的表面。优选地，所述对象是在表面上生长的生物对象，例如细胞。

本发明的优选实施方式包括用于掩蔽生物对象的元素或区域的方法，其中生物对象的元素或区域是对象或细胞膜的边界。同样优选的是其中生物对象的元素或区域包含在对象的边界内的实施方式。图像细胞计数法或显微镜法的许多任务包括分析生物对象的细胞核，并且在这样的任务中，优选地包括本发明的实施，其中生物对象的元素或区域是包含其细胞核的对象的区域。图像细胞计数法或显微镜法的其它任务包括分析生物对象的其它部分，并且在本发明的这样的实施方式中，生物对象的元素或区域是细胞质、线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶或通常生物对象的任何元素或区域。

生物对象和/或生物对象样品的特性分析优选包括本发明的特征。这些分析中的一些涉及单个对象，例如细胞周期、细胞活力或细胞活性的状态分析，仅举几个示例。在这些情况下，感兴趣的是定位细胞的一个或多个元素或部分，例如其细胞核、线粒体或参与细胞代谢的其他部分。

包括基于本发明的实施方式的掩蔽的几个图像细胞计数法或显微镜法任务包括估计对象或对象的区域的大小，诸如观察到的对象或对象的区域的直径和/或周长。此外，这样的任务通常包括优选地实施用于估计生物对象的样品中的细胞浓度的掩蔽。

在图像细胞计数法或显微镜中，为了分析的目的，记录来自样品的视图的光信息，并且优选地记录来自相同样品的不同部分或体积的两个或更多个视图的信息，从而增加被分析的样品的面积和/或体积。根据本发明的几种掩蔽方法可以用于估计图像细胞仪或显微镜的视图中的对象的数量的任务，优选地，其中估计两个或更多个视图中存在的对象的数量。在图像细胞计数法或显微镜法的几个任务中，感兴趣的特性是确定来自对象和/或对象的元素或部分的光信息的强度，优选地荧光信息的强度，其中本发明的实施方式允许可靠地掩蔽这样的对象和/或这样的对象的元素或区域。

已经发现本发明的几个实施例适用于分析生物对象，例如植物、真菌或细菌细胞和动物细胞，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和昆虫细胞。取决于样品的性质和/或分析的目的，细胞的条件可以变化。已经发现本发明的实施方式对于分析附着于表面的生物对象是有用的，例如细胞在诸如样品室表面的基底上生长的样品。当所讨论的细胞具有在某种基质上形成集落的倾向时，这种分析通常是令人感兴趣的。为了调查这种生物对象，本发明的实施方式允许直接分析包含附着细胞的样品，而无需首先将这种细胞释放到溶液中，这优选地是通过使用本发明的优选实施例来掩蔽附着的生物对象和/或附着的生物对象的元素或区域从而允许在图像细胞仪或显微镜中观察包含生物对象附着的基底的样品。

在本发明的其它实施例中，对悬浮液中的细胞进行分析。在对悬浮细胞的这种分析中，尤其是当长时间研究样品的每个视图时，或者特别是当应该可以重新访问样品的给定视图时，优选的是，细胞在分析之前已经沉积，至少使得对象在分析之前紧密靠近样品室的表面。这种沉积过程的时间取决于被分析的样品的特性而变化，诸如粘度、对象尺寸和密度的特性是最重要的，但是也取决于所使用的样品室的特性。

本发明的许多非常优选的实施例用作光源发光二极管(LED)。在这些实施例的几个中，优选两个或多个发光二极管(LED)，这通常提供了诸如通过使用发射基本上相同波长带的光的两个或多个LED来增加照射光的强度的能力和/或通过使用发射基本上不同波长带的光的两个或多个LED来用两个或多个基本上不同波长带的光照射样品的能力的优点。

当在图像细胞计数法或显微镜中实施本发明的实施例时，通常优选具有高的光学放大率，即，因为这样的条件有利于小细节的大成像，而且允许使用光学系统的大数值孔径，从而促进大量光的收集。另一方面，高光学放大率固有地限制了图像细胞仪或显微镜的视场，因此限制了在单个视图中记录的样品的体积或面积。因此，本发明的几个优选实施例包括中等光学放大率的实施方式，例如低于x100的光学放大率，并且在一些情况下，通常当对涉及生物对象和/或生物对象的元素或部分的尺寸和/或形态的详细信息感兴趣时，包括低于x60的光学放大率。此外，在其它实施例中，感兴趣的是例如x20或更小的光学放大率的光学放大率。当被分析对象足够大以允许详细的图像表示时和/或当感兴趣的是对每个子样品图像中的样品的大部分进行成像时，例如当感兴趣的是限制样品的不同区段的子样品图像的数量同时仍然分析整个样品或至少相当大部分的样品时，这通常是感兴趣的。

由于在本发明的几个优选实施例中，低光学放大率降低了分辨生物对象图像中的小特征的能力，因此优选地，光学放大率在x100和x2之间的范围内，例如在x20和x4之间的范围内。在其他实施例中，通常在不太关注生物对象的小特征的情况下，优选地光学放大率为x10或更小，优选地光学放大率为x5或更小。特别地，当感兴趣的是在图像细胞仪或显微镜的视场中呈现大体积和/或大面积的样品时，本发明的几个实施例包括光学放大率为x4或更小的实施方式，在几个实施例中，非常低的光学放大率是优选的，诸如x2或更小的光学放大率。

附图说明

图1示出了根据本发明的图像细胞仪装置。

图2示出了根据本发明的配置中的调制装置。

图3示出了根据本发明的附着细胞的显像的图示。

图4示出了根据本发明的生物对象的焦点和位置的图示。

图5示出了根据本发明的在图像平面上描绘对象时沿着光轴的位置与移位之间的关系。

图6示出了根据本发明的在图像平面上描绘对象时的移位。

示例1

成像条件

图1A、1B、1C和1D示意性地示出了根据本发明的图像细胞仪，其通常适于检测光的相移。样品由在基本上平行于图1A中的主光轴的方向上发射光的光源(101)照射。然而，在图1B中，样品由相对于主光轴倾斜地发射光的光源(101)照射。照射光通过光学装置(102)，使得它形成光束(103)，该光束取决于图像细胞仪的布置的性质而基本上在样品室上准直或聚焦。

用于样品(104)的保持器支撑包含被分析的样品的样品室(105)。当照射光束进入样品时，通常大部分照射光束通过样品而不与样品或样品中的颗粒或对象发生任何相互作用，例如当照射光通过透明液体时。照射光的一部分与样品中的颗粒或对象相互作用，这可以引起发射光(106)，发射光或者通过光的方向的改变而形成，例如通过散射而形成，或者通过光致发光而形成。发射光的方向通常与照射光的方向大不相同，这意味着当离开样品的光(例如发射光或透射照射光和发射光的组合)进入图像细胞仪的物镜模块(107)时，它们被不同地处理。在几个优选实施例中，发射光作为平行光束离开物镜模块。

离开物镜模块的发射光在被透镜模块(109)聚焦到图像记录装置(110)上之前与调制装置(108)相互作用。

图1B中给出了根据本发明的几个实施例的图像细胞仪的示意图，其中照射光(103)相对于主光轴倾斜地进入样品。当进行光致发光分析或侧向散射分析时，图像细胞仪的这种配置通常是优选的。这些实施例的一些优选特性涉及大多数照射光被引导到物镜模块(107)的入口之外，因此基本上不朝向检测器引导。图1A中示意性示出的照射光基本上是准直的，然而显然本发明的几个优选实施例包括聚焦到样品区域上的照射光。

图1C是调制装置108的详细图示。在该图示中，调制装置具有可以适于相位对比确定的设计，包含具有与调制装置的其余部分不同的厚度的中心区域。厚度的不同导致通过调制装置的不同区域的光的相移差。显然，本发明的其它同样优选的实施例可以包括以不同方式调制光的调制装置。

图1D是图1C中的调制装置的图示，其中调制装置处于不同的位置，使得它已经在垂直于主光轴(108a)的方向上移动给定量(111)。该图示出了平行发射光(106)的不同部分进入调制装置的相移区域。该图还示出了调制装置已经在沿着主光轴(108b)的方向上移动了给定量(112)。调制装置的移动可以或者在垂直于光轴的方向上，或者在沿着主光轴的方向上，或者同时在两个方向上。

示例2

调制装置

图2示出了在本发明的实施例中通常优选的调制装置的示意图。由调制装置产生的调制的性质通常优选是例如光的相移或衰减。图2A、2B和2C的示意图示出了调制装置的横截面，但没有公开调制装置的详细机械设计。通常，在本发明的实施例中，圆形、正方形或矩形的调制装置是优选的。

图2A将调制装置图示为实心块(200)，假设光穿过该实心块，调制装置包括沿着其对角线的三个不同的调制区域(201)，这些调制区域呈现为沿着调制装置的一个边缘的不同阴影的条。

类似地，图2B示出了调制装置(210)，其包括沿其对角线的五个不同的调制区域(211)。此外，图2C示出了调制装置(220)，其包括沿其对角线的七个不同的调制区域(221)。

此外，图2D示出了调制装置230的俯视图，其具有与图2A中所示的调制装置相似的横截面。调制装置包括2个调制区域(231)，第一对称中心区域被第二区域包围。所呈现的调制装置的形状是圆形的，但是这与通过调制装置的光线的典型形状而不是其物理形状有关。当这种设计的调制装置插入光束的中心时，通常从对象以相对于图像细胞仪的主光轴的小角度发射的光在调制装置的中心区域中通过，而以更大角度发射的光通过包围区域。

类似地，图2E示出了调制装置240的俯视图，其具有与图2B中所示的调制装置相似的横截面。调制装置包括3个调制区域(241)，第一对称中心区域被另外2个区域包围。图2F示出了调制装置250的俯视图，其具有与图2C所示的调制装置相似的横截面。调制装置包括4个调制区域(251)，第一椭圆形中心区域和与中心区域线性对准的另外2个新月形区域以及最后包围前者的第四区域。中心区域的椭圆形状用于说明通常优选除圆形之外的形状，2个新月形区域也是如此。由于调制装置的区域不是旋转对称的，因此通常优选的是，在两个图像的记录之间的移动优选地沿着连接各个调制装置区域的轴线(252)。具有重复区域的设计增强了微分相位效应，从而增加了对比度。

图2G示出了包括3个调制区域的调制装置，两个区域与调制装置的横截面对准，第三区域包围前述区域。由于调制装置的区域不是旋转对称的，因此通常优选的是，在两个图像的记录之间的移动优选地沿着连接各个调制装置区域的轴线(262)。

图2H示出了与图2G中的那些相似的调制装置(270)，主要区别在于与调制装置的横截面对准的两个区域(271)中的一个具有不同的尺寸，例如使得它们中的一个是另一个的大约2倍。通常，通过使两个区域的特性不同，例如关于光衰减，可以获得类似的效果，优选地，净效果是通过两个区域透射的光强度基本上不同。由于调制装置的区域不是旋转对称的，因此通常优选的是，在两个图像的记录之间的移动优选地沿着连接各个调制装置区域的轴线(272)。

虽然在本示例中呈现了调制装置的几个一般设计，但是应当理解，这些设计并不表示有限数量的可能设计。事实上，尽管本发明的许多优选实施例的确包括与所呈现的调制装置类似的调制装置，但是其它同样优选的实施例包括基本上不同设计的调制装置。

示例3

可视化

构造根据本发明的图像细胞仪系统，其具有使用发射波长以约365nm为中心的光的发光二极管(LED)的光源，该光源与图像细胞仪的主光轴对准布置。使用透镜系统，基本上将照射样品室的光在空间强度方面准直和均匀化。样品室由两个透明玻璃壁部分组成，U2OS细胞在底表面上生长，形成附着细胞层。用甲醛固定细胞，用含有Triton X-100的溶液裂解。在分析之前，用DAPI溶液染色样品，由于细胞已经裂解，预期将细胞核染色。

使用Nikon 4x物镜(NA0.2)收集从样品发射的光，形成接近平行的光束。使用Nikon f-200mm透镜将光束聚焦到用于记录图像的Point Grey CCD数码相机上。

在由物镜形成的基本平行的光束中插入相位板作为调制装置。相位板是具有圆形相位部分的熔融石英板，直径5mm，深度约192nm。相位板安装在能够相对于图像细胞仪的其它部件横向移动它的装置上，从而形成可移动的调制装置。

图3A示出了通过本发明的优选方法生成的样品的差分相位对比图像。该图像显示了几个细胞，首先它显示了紧密结构的细胞核，而且附着细胞的边界也是清晰可见的。

取走调制装置，并且在其位置上插入适于选择反射来自DAP的荧光的波段的荧光发射滤光器。记录的荧光图像示于图3B中。可以将荧光信号提供给细胞核，这可以通过与图3A的细胞核部分比较位置形状和大小来验证。

分析结果表明，使用本发明的优选实施例，在单个细胞变得清晰可见的条件下，可以产生样品中哺乳动物细胞的描绘图，并且进一步，除了用荧光发射滤光器代替调制装置外不做任何改变，表明可以记录荧光图像，其中描绘图和荧光图像都是在基本上最佳的条件下捕获的。

示例4

焦点和位置

构造了根据本发明的图像细胞仪系统，其具有使用发射波长以约405nm为中心的光的发光二极管(LED)的光源，光以如下方式聚焦，使得图像细胞仪的视场近似用基本上均匀的光强度照射，该系统被配置用于记录荧光信息的图像。光源被布置成与图像细胞仪的主光轴倾斜对准，使得来自光源的大部分光不进入收集光学器件，以便减少杂散光。

使用Nikon 4x物镜(NA 0.2)收集从样品发射的荧光，形成接近平行的光束。使用Nikon f-200mm透镜将光束聚焦到用于记录图像的Point Grey CCD数码相机上。

在由物镜形成的平行光束中，插入调制装置。调制装置是包含直径约为7mm的圆孔的不透明盘。孔盘安装在可相对于图像细胞仪的其它部件横向移动的装置上，从而形成可移动的调制装置。

在第一个实验中，将Jurkat细胞的悬浮液装入由两个间距约100μm的透明玻璃壁部分组成的样品室中。用含有Triton X-100的溶液裂解细胞，并用DAPI溶液染色，由于细胞已经裂解，预期会染色细胞核。使样品静置足够的时间，以使基本上所有悬浮细胞沉淀在样品室的底表面上，从而确保在分析期间几乎所有细胞对象都处于静止状态。记录来自样品的荧光信息的两个图像，其中对于第一图像，孔的中心从光束中心移位大约5mm，并且对于第二图像，孔的中心从光束中心移位大约5mm，但是相对于用于第一图像的位置在光束中心的相对侧上。

在两个记录图像的每一个中，识别荧光对象，并且使用重心来相对于每个荧光对象的荧光强度的位置估计每个对象的位置，表示为像素的行和列。使用第一图像中的每个对象的位置作为参考，确定第二图像中的对应对象的行和列位置的差，从而估计两个记录的图像中的每个对象的位置的偏移。

图4A示出了对象的重心偏移相对于对象的图像列位置的曲线图。该图显示了两个基本上平行于列位置的x轴的不同细胞群，第一群集中在大约零像素的偏移处，平均偏移大约为-1像素，第二群集中在大约+11像素的偏移处。对系统的了解，例如像素尺寸和光学放大率，使得可以确定两个群之间的偏移差达到约100μm，并且对记录的图像的人工检查确认第二群中的对象确实是附着到样品室的顶表面的对象，而位于样品室的底表面处或附近的对象是第一群的成员。此外，第一群的平均偏移可以与执行分析的图像细胞仪的焦平面的位置相关，这表明焦平面位于图像细胞仪的底表面的稍上方。

在第二个实验中，样品室由两个透明玻璃壁部分组成，U2OS细胞生长在底表面上，形成附着细胞层。用甲醛固定细胞，用含有Triton X-100的溶液裂解。在分析之前，样品已用DAPI溶液染色，由于细胞已经裂解，预期会染色细胞核。记录来自样品的荧光信息的两个图像，其中对于第一图像，孔的中心从光束中心移位大约5mm，并且对于第二图像，孔的中心从光束中心移位大约5mm，但是相对于用于第一图像的位置在光束中心的相对侧上。

图4B示出了对象的重心偏移相对于对象的图像列位置的曲线图。使用本发明的实施例，发现重心偏移的幅度可以与距图像细胞仪的焦平面的距离相关。由此可见，不同对象之间的重心偏移的变化可以与所述对象之间的距离相关。由于已知被分析的细胞附着在样品室的底表面，因此可以得出结论，不同细胞之间的偏移变化可以与不同细胞的细胞核在样品室的z轴上的位置变化相关，因此与从所记录的图像中的对象的x和y位置导出的x和y轴位置相结合，可以在x-y和z坐标中描绘对象位置。对在分析中采用的系统的进一步分析表明，确定重心偏移的精度为0.05个像素的量级，表示为一个标准偏差，对应于大约0.5μm的精度，其明显小于细胞的尺寸，或者甚至小于细胞核，这表明可以从生物颗粒或对象的描绘图中推导出关于z轴位置的可靠且有价值的信息。

这些发现的结果表明，使用本发明的方法，有可能实现用于描绘诸如生物颗粒或对象这样的对象的方法，其允许确定生物颗粒或对象相对于图像细胞仪的焦平面和/或相对于其他生物颗粒或对象的焦点和/或位置。

示例5

图5A以说明性方式示出了本发明。图5A示出了由第一透镜506和第二透镜508在图像平面504上描绘的物体平面502。在物体平面中存在第一对象510、第二对象512和第三对象514，它们沿着从物体平面到图像平面的光学方向分离。此处使用光学方向的表述，因为如果例如将反射镜插入光路中，则光学方向的第一部分是从物体平面到反射镜的方向，而光学方向的第二部分是从反射镜到图像平面的方向。

物体平面的第二对象512精确地定位在第一透镜506的焦平面上，而第一对象510比第二对象512稍微远离第一透镜506，并且第三对象514比第二对象512稍靠近第一透镜506。

第二对象由两个透镜506、508描绘在图像平面上，所述图像平面精确地在第二透镜508的焦平面上(参见图5A中的实线)，而第一对象510描绘在图像平面504前面的点中(参见图5A中的虚线)。第三对象514被第二透镜508聚焦到图像平面后面的点(见图5A中的点划线)。

传感器表面，例如放置在图像平面中的数码相机的CCD芯片，将记录第二对象的清晰图像，而第一和第三对象的描绘图在传感器表面上将是稍微模糊的。

通过在一侧上的光路中插入例如像阻挡器的调制装置516，将非对称地影响从物体平面到图像平面上的光。第二对象的描绘图将仅受到损失一些光强度的影响，而第一和第三对象的描绘图将在图像平面中移动。通过从第一对象中去除物体平面和图像平面之间的射线的上部，第一对象的描绘图将在图像平面中和传感器表面上向上移动，因为采用从第一对象朝向图像平面的上部路径的虚线对第一对象的描绘图的下部有贡献。通过去除该光线，第一对象的描绘图的下部消失，并且描绘图向上移动。同样，但在相反的方向上，由于调制装置516的调制，第三对象的描绘图将在图像平面中向下移动。调制装置也可以是吸收一些但不是全部落在吸收器上的光的吸收器。

通过由传感器表面拍摄两幅图片，其中一幅图片利用调制装置，一幅图片不利用调制装置，并且将两幅图片彼此相减，所得到的减影图片将在对象的边缘处具有增加的对比度，其中两幅图片不同。(所得到的减影图片可以具有负强度，其可以通过例如将图片中的所有像素与具有负强度的像素的最高绝对值的像素的强度相加来固定。)增加的对比度将使得用户能够更清楚地看到对象的轮廓，如例如图3A所示。

对象距第一透镜506的焦平面越远，当插入调制装置时，对象的描绘图将在图像平面中移动得越多。因此，描绘图移动了多少取决于距第一透镜的焦平面的距离。该关系或多或少是线性的，如图5B所示。除了确定图像平面中的对象的x和y坐标之外，该方法还可以确定每个对象的z坐标。这也在上述的图4A中示出，其中大多数对象位于样品室的底表面附近，而一些对象附着到样品室的顶表面。如果在执行对象的统计或分析时，对象位于相同的高度是必要的，则可以从统计或分析所基于的对象中取消选择附着到样品室的顶表面的对象。这将给出具有更高精度的结果。

示例6

图6A-C显示了使用以488nm发射并以40°入射角照射7.3μm熔融二氧化硅珠样品的LED光源的图像细胞仪的三个图像。成像模式是具有7.0mm孔径的侧向散射，并且放大率是4x。图6A-C是样品的相同部分的图示，并且所有三幅图示出了相同的四个熔融硅珠的图示602、604、606、608。在所有三个图中，所有四个珠都位于距离透镜系统的焦平面75μm处。

在图6A中，将调制滤波器插入在从样品所收集的光的路径中的中心位置，而当捕获图6B和6C时收集光被调制滤波器非对称调制。在图6B中，调制滤波器向左偏移，而在图6C中，调制滤波器向右偏移。在图6C中调制滤波器向右偏移的程度与在图6B中调制滤波器向左偏移的程度相同。

将虚线610、612、614、616添加到图6A中，以示出未经任何非对称调制的珠的每个描绘图的位置。在图6B和6C中还添加了相同位置处的虚线。很明显，通过非对称调制来移动珠的描绘图。在图6B中，珠的描绘图都在图像中向左移动相同的距离，在图6C中，描绘图都移动相同的距离，并且与图6B中移动相同的距离，但是向右移动。

如果将其中一个珠定位成离焦平面比75μm远，但在样品中具有相同的横向位置，则该珠的描绘图位置在图6A中将是相同的，但在图6B中将进一步向左移动，而在图6C中将进一步向右移动。

如果调制滤光器比捕获图6B和6C的图像时更远地偏离光轴，则珠的描绘图将在图6B中进一步向左移动，并且在图6C中进一步向右移动。

项目

1.一种用于表征样品中的一个或多个对象的方法，所述方法包括步骤：

-任选地使用一个或多个透镜收集来自所述样品的透射、散射、衍射或发射光，包括荧光和/或冷光，从而形成收集光，

-通过所述收集光在传感器表面上形成

-对象的光的至少第五图像，其中，对于至少第五图像，收集光在与周围环境相比不同的至少两个位置处被调制，或者

-为了表征样品中的一个或多个对象而处理

-至少第一和第二图像，或者

-至少第五图像，或者

-至少第六和第七图像。

2.根据前述项目中任一项所述的方法，还包括以下步骤：用来自照射元件的入射光照射样品，或者使样品暴露于化学反应、电流和/或电压、或应力。

3.根据项目1或2所述的方法，其中，所述方法包括将所述样品置于图像细胞仪、成像流式细胞仪、不是流式细胞仪的图像细胞仪、或显微镜中的步骤。

4.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，处理至少所述第一图像和所述第二图像处理所述第六图像和所述第七图像包括

-从所述第二图像减去所述第一图像，或从所述第七图像减去所述第六图像，

-计算所述第一图像和所述第二图像的平均值，或所述第六图像和所述第七图像的平均值，

-计算所述第一图像和所述第二图像之间的比率，或所述第六图像和所述第七图像之间的比率，

-将所述第一图像和所述第二图像、所述第三图像和所述第四图像、或所述第六图像和所述第七图像互相关，或

-对所述第一图像和/或所述第二图像、所述第三图像和/或所述第四图像、所述第五图像、或所述第六图像和/或所述第七图像进行去卷积。

5.根据前述项目中任一项所述的方法，其中

-处理至少第一和第二图像包括将第一图像与第二图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像中的平移来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理至少第三和第四图像包括将第三图像与第四图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像之间的对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理至少第五图像包括基于至少一个对象来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，其中，在第五图像中确定一个或多个对象的描绘图的延长，或者

-处理至少第六和第七图像包括将第六图像与第七图像进行比较，并且基于一个或多个对象的描绘图在这两个图像中/之间的平移和/或对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点。

6.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，来自样品的光沿着一个或多个透镜的方向限定轴线，及其中

-处理至少所述第一图像和所述第二图像包括将所述第一图像与所述第二图像进行比较并且基于至少一个对象在至少所述第一图像和所述第二图像之间移动了多少来确定至少一个对象沿轴线的位置，

-处理至少所述第五图像包括基于至少一个对象的描绘图的延长来确定所述对象沿着轴线的位置，

-处理至少所述第六图像和所述第七图像包括将所述第六图像与所述第七图像进行比较，并且基于至少一个对象在至少所述第六图像和所述第七图像之间移动了多少来确定所述对象沿轴线的位置。

7.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，来自所述样品的光包括来自所述样品的至少第一波长和第二波长的发射光，并且其中，所述方法包括确定所述对象中的至少一个发射了具有所述第一波长还是所述第二波长的光的步骤。

8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定从所述样品发射的光的波长的步骤。

9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，非对称调制收集光意味着

-阻挡收集光中的一些，和/或

-相移收集光中的一些。

10.根据前述项目中任一项所述的方法，其中

-既非对称调制又对称非对称调制第一和第二图像，

-对称调制在与周围环境相比不同的至少两个位置调制的收集光，或者

-既非对称调制又对称非对称调制第六和第七图像。

11.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，通过在收集光中插入以下实现非对称调制收集光，或者在与周围环境相比不同的至少两个位置调制收集光

-具有至少一个或两个开口的板，

-至少一个或两个不透明区域，和/或

-至少一个或两个相移区域。

12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述照射元件是在200nm和1,000nm之间的范围内发射的光源，在第一优选实施例中，所述范围在250nm和800nm之间，更优选地在300nm和700nm之间的范围内，或者在第二优选实施例中，所述范围在250nm和400nm之间，优选地其中所述调制装置反映相位的变化。

13.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个对象在悬浮液或胶体中，其中，所述悬浮液或所述胶体的分散介质是固体、液体或气体。

14.根据前述项目中任一项所述的方法，其中

-处理至少第一和第二图像包括将第一图像与第二图像进行比较并确定样品中的对象的相位量化特性，

-处理至少第五图像包括确定样品中的对象的相位量化特性，或

-处理至少第六和第七图像包括将第六图像与第七图像进行比较并且确定样品中的对象的相位量化特性，

优选地其中相位量化特性包括相位的改变。

15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，处理所述一个或多个图像以表征所述样品中的一个或多个对象包括分割所述对象的步骤。

16.根据项目15所述的方法，其中，所述对象是细胞，并且其中，分割所述细胞包括识别细胞的部分，例如细胞质、线粒体、高尔基体、溶酶体、脂质球、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶或通常所述细胞的任何元素或区域。

17.一种用于描绘样品中的颗粒或对象的方法，所述方法包括以下步骤：

-将样品放置在图像细胞仪中，

-用来自照射装置的光照射样品，其中，照射光与样品的颗粒或对象相互作用，

-记录来自样品的光信息的一个或多个图像，及

-处理一个或多个图像中的光信息，以形成对象或颗粒和/或对象或颗粒的元素或区域的描绘图。

18.根据项目17所述的方法，其中，记录来自所述样品的光信息的两个或更多个图像。

19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，从所述样品发射的光信息在被记录之前穿过可移动调制装置，优选地，其中，在记录来自所述样品的光信息的所述两个或更多个图像期间，所述可移动装置处于不同的位置。

20.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，在记录来自样品的光信息的两个或更多个图像期间，图像细胞仪的除了所述可移动装置之外的所有光学部件相对于彼此静止，优选地其中，在记录来自样品的光信息的所有图像期间，图像细胞仪的除了所述可移动装置之外的所有光学部件相对于彼此静止。

21.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，收集光在所述传感器表面上形成所述对象的描绘图，其中，所述描绘图用于对所述样品中的所述对象和/或所述对象的元素或区域进行可视化。

22.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述描绘图用于掩蔽所述对象和/或所述对象的元素或区域。

23.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述描绘图用于确定所述对象的聚焦特性。

24.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述描绘图用于确定所述对象的位置特性。

25.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述描绘图用于确定所述对象的相位量化特性，优选地其中，相位量化特性包括相位角的变化，从而表示光密度的差异。

26.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，在不同条件下记录光信息的记录图像中的至少两个。

27.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述不同的条件由所述可移动光调制装置引起。

28.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述可移动光调制装置对已经穿过所述样品中的颗粒或对象和/或与所述样品中的颗粒或对象相互作用和/或从所述样品中的颗粒或对象发射的光进行调制。

29.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述颗粒或对象是生物颗粒或对象。

30.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置是在200nm和1,000nm之间的范围内、优选地在250nm和800nm之间的范围内、更优选地在300nm和700nm之间的范围内发射的光源。

31.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置是在250nm和400nm之间的范围内发射的光源，优选地其中，所述调制装置反映相位角的变化。

32.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置位于连接所述图像细胞仪的所述样品和所述检测器的主光轴上。

33.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置以相对于所述图像细胞仪的主光轴倾斜的方式照射所述样品。

34.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射/入射光和颗粒或对象的相互作用引起以下中的一个或多个：透射、吸收、折射、衍射、米氏散射、瑞利散射、拉曼散射、光致发光。

35.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述可移动光调制装置影响光的相位，优选地其中，所述可移动光调制装置在其中来自样品的光的相移被转换成图像中的亮度变化的布置中。

36.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，光信息的至少两个记录的图像中的至少一个是相位对比显微图像。

37.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，至少两个记录的图像是相位对比显微图像，其中，光的相移到亮度变化的转换是基本上不同的。

38.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，至少两个记录的图像中的相移或光到亮度变化的转换中的差异是由移动调制装置引起的。

39.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，至少两个记录的图像中的至少一个是其中来自所述样品的光信号的至少一部分被所述光路中的不透明构件的存在阻挡的图像。

40.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，在记录光强度信息的两个或更多个图像期间，所述可移动光调制装置或所述可移动光调制装置的至少一个元件处于不同的位置。

41.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述可移动光调制装置是平行光学材料片，优选地是光学玻璃。

42.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，平行光学材料在平行光学材料的不同区域中具有不同的光学特性。

43.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，平行光学材料具有不同光学特性的区域，所述区域能够被定位成与图像细胞仪的主光轴近似中心对准，优选地其中，所述区域是对称的，更优选地其中，所述区域是圆形的。

44.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，平行光学材料在不同区域中具有可变厚度，优选地其中，所述可变厚度引起穿过不同区域的光的基本上不同的相移。

45.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，平行光学材料具有不同衰减的区域，优选地其中，一些区域的衰减是基本上不透明的。

46.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，平行光学材料具有与图像细胞仪的主光轴中心对准的是基本上透明的不同光学特性的区域，优选地其中，平行光学材料的其他区域是基本上不透明的。

47.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置用基本上准直的光照射所述样品，优选地其中，所述光是平行的。

48.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述照射光基本上平行于所述主光轴，优选地其中，所述照射光平行于所述主光轴。

49.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，照射装置用基本上聚焦到所述样品的平面上的光照射所述样品，使得照射所述样品的光与所述主光轴成一角度。

50.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，处理光信息的方法是以下方法中的一种或多种，图像的加法、图像的减法、图像之间的比率、图像之间的互相关、光学相位和强度的去卷积。

51.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，处理是确定颗粒或对象的图像表示在光信息的记录图像中的空间位置，优选地其中，光信息的最大信号强度的信息确定颗粒或对象的图像表示在记录图像中的空间位置，更优选地其中，光信息的重心的信息确定颗粒或对象的图像表示在记录图像中的空间位置。

52.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，荧光是用于描绘生物颗粒或对象的光信息。

53.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，侧向散射光是用于描绘生物颗粒或对象的光信息

54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品中的生物颗粒或对象附着于表面，例如样品室的表面。

55.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，颗粒或对象的一个元素或区域是所述颗粒或对象的边界。

56.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，颗粒或对象的一个元素或区域是包含在所述颗粒或对象的边界内的所述颗粒或对象的区域。

57.根据前述项目中任一项的方法，其中，生物颗粒或对象的一个元素或区域包含颗粒或对象的核。

58.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，生物颗粒或对象的一个元素或区域是细胞质。

59.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，生物颗粒或对象的一个或多个元素或区域是以下中的一个或多个：线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶。

60.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述方法用于估计所述颗粒或对象的尺寸。

61.根据前述项目中任一项的方法，其中，所述生物颗粒或对象是细胞，并且该方法用于确定细胞周期的状态。

62.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述生物颗粒或对象是细胞，并且所述方法用于确定细胞的生存力。

63.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物颗粒或对象是细胞，并且所述方法用于确定细胞的活性。

64.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法用于估计在所述图像细胞仪的视图中存在的颗粒或对象的数量。

65.根据前述项目中任一项的方法，其中，生物颗粒或对象是细胞，例如动物细胞，或植物细胞，或真菌细胞或细菌细胞。

66.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述生物颗粒或对象附着于表面。

67.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述生物颗粒或对象处于悬浮液中。

68.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，当所述悬浮液的颗粒或对象已经沉降使得所述颗粒或对象紧密接近样品室的表面时，执行所述生物颗粒或对象的描绘。

69.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，用于照射所述样品的光由单个发光二极管产生。

根据前述项目中任一项所述的方法，其中，用于照射所述样品的光由两个或更多个发光二极管产生。

70.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x100或更小，优选地其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x60或更小。

71.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x60或更小，优选地其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x20或更小。

72.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x10或更小，优选地其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x4或更小。

73.根据前述项目中任一项所述的方法，其中，所述图像细胞仪的光学放大率为x2或更小。

74.一种用于表征样品中的一个或多个对象的系统，所述一个或多个对象如生物对象和/或生物对象的元素或区域，其中，所述系统被配置为执行根据前述项目中的任一项所述的方法步骤。

Claims

1.一种用于表征样品中的一个或多个对象的方法，所述方法包括以下步骤：

-任选地使用一个或多个透镜收集来自所述样品的透射、折射、散射、衍射和/或发射光，包括荧光和/或冷光，从而形成收集光，

-通过所述收集光在传感器表面上形成

-所述对象的至少第一图像和第二图像，其中，对于至少所述第一图像和所述第二图像，不同地非对称调制所述收集光，或者

-所述对象的至少第三图像和第四图像，其中，所述第三图像和所述第四图像的焦平面具有不同的位置，或者

-所述对象的光的至少第五图像，其中，对于至少所述第五图像，所述收集光在与周围环境相比不同的至少两个位置处被调制，或者

-所述对象的至少第六图像和第七图像，其中，对于至少所述第六图像和所述第七图像，不同地非对称调制所述收集光，并且所述第六图像和所述第七图像的焦平面具有不同的位置，及

-为了表征所述样品中的一个或多个对象而处理

-所述至少第一图像和第二图像，或者

-所述至少第三图像和第四图像，其中，处理至少是从所述第四图像减去所述第三图像，

-所述至少第五图像，或者

-所述至少第六图像和第七图像。

2.根据前述权利要求所述的方法，还包括以下步骤：用来自照射元件的入射光照射所述样品，或者使所述样品暴露于化学反应、电流和/或电压、或应力。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法包括将所述样品置于图像细胞仪、成像流式细胞仪、不是流式细胞仪的图像细胞仪、或显微镜中的步骤。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，处理至少所述第一图像和所述第二图像或处理所述第六图像和所述第七图像包括：

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

-处理所述至少第一图像和第二图像包括将所述第一图像与所述第二图像进行比较，并且基于所述一个或多个对象的描绘图在这两个图像中的平移来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理所述至少第三图像和第四图像包括将所述第三图像与所述第四图像进行比较，并且基于所述一个或多个对象的描绘图在这两个图像之间的对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，或者

-处理所述至少第五图像包括基于所述对象中的至少一个对象来确定图像细胞仪或显微镜的焦点，其中，在所述第五图像中确定所述一个或多个对象的描绘图的延长，或者

-处理所述至少第六图像和第七图像包括将所述第六图像与所述第七图像进行比较，并且基于所述一个或多个对象的描绘图在这两个图像中/之间的平移和/或对比度的变化来确定图像细胞仪或显微镜的焦点。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，来自样品的光沿着一个或多个透镜的方向限定轴线，及其中

-处理所述至少第一图像和第二图像包括将所述第一图像与所述第二图像进行比较并且基于至少一个对象在所述至少第一图像和第二图像之间移动了多少来确定所述至少一个对象沿轴线的位置，

-处理所述至少第五图像包括基于至少一个对象的描绘图的延长来确定所述对象沿着轴线的位置，

-处理所述至少第六图像和第七图像包括将所述第六图像与所述第七图像进行比较，并且基于至少一个对象在所述至少第六图像和第七图像之间移动了多少来确定所述至少一个对象沿轴线的位置。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，来自所述样品的光包括来自所述样品的至少第一波长和第二波长的发射光，并且其中，所述方法包括确定所述对象中的至少一个对象发射了具有所述第一波长还是所述第二波长的光的步骤。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法包括确定从所述样品发射的光的波长的步骤。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，非对称调制所述收集光意味着

-阻挡所述收集光中的一些，和/或

-相移所述收集光中的一些。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

-既非对称调制又对称非对称调制所述第一图像和所述第二图像，

-既非对称调制又对称非对称调制所述第六图像和所述第七图像。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过在收集光中插入以下实现非对称调制收集光，或者在与周围环境相比不同的至少两个位置调制收集光

-具有至少一个或两个开口的板，

-至少一个或两个不透明区域，和/或

-至少一个或两个相移区域。

12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中，所述照射元件是在200nm和1,000nm之间的范围内发射的光源，在第一优选实施例中，所述范围在250nm和800nm之间，更优选地在300nm和700nm之间的范围内，或者在第二优选实施例中，所述范围在250nm和400nm之间，优选地其中所述调制装置反映相位的变化。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个对象在悬浮液或胶体中，其中所述悬浮液或所述胶体的分散介质是固体、液体或气体。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中

-处理至少所述第一图像和所述第二图像包括将所述第一图像与所述第二图像进行比较并确定样品中的对象的相位量化特性，

-处理至少所述第五图像包括确定样品中的对象的相位量化特性，或者

-处理至少所述第六图像和所述第七图像包括将所述第六图像与所述第七图像进行比较并且确定样品中的对象的相位量化特性，

优选地其中相位量化特性包括相位的改变。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，处理所述一个或多个图像以表征所述样品中的一个或多个对象包括分割所述对象的步骤。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述对象是细胞，并且其中，分割所述细胞包括识别所述细胞的一个或多个部分，例如细胞质、线粒体、高尔基体、溶酶体、脂质球、内质网、液泡、叶绿体、鞭毛、核仁、应激颗粒、细胞骨架、中心体、细胞壁、细胞膜、核膜、包含生物分子的病灶或通常所述细胞的任何元素或区域。

17.一种用于表征样品中的一个或多个对象的系统，所述一个或多个对象如生物对象和/或生物对象的元素或区域，其中，所述系统被配置为执行根据前述权利要求中的任一项所述的方法步骤。