[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN112458076B - 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法 - Google Patents

一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112458076B
CN112458076B CN202011382356.8A CN202011382356A CN112458076B CN 112458076 B CN112458076 B CN 112458076B CN 202011382356 A CN202011382356 A CN 202011382356A CN 112458076 B CN112458076 B CN 112458076B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cellulose
based magnetic
nano
solution
phospholipase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011382356.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112458076A (zh
Inventor
汤虎
黄凤洪
鲍雨萍
张�浩
栾倩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Original Assignee
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences filed Critical Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority to CN202011382356.8A priority Critical patent/CN112458076B/zh
Publication of CN112458076A publication Critical patent/CN112458076A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112458076B publication Critical patent/CN112458076B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01004—Phospholipase A2 (3.1.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01032—Phospholipase A1 (3.1.1.32)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04003—Phospholipase C (3.1.4.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶，以高羧基含量纳米纤维素为原料，添加磁性γFe2O3纳米粒子，所得纤维素基磁性微球为载体，磷脂酶通过交联剂共价交联在纤维素基磁性微球上。本发明所述纤维素基磁性微球固定化磷脂酶在不减少酶与反应液接触位点的同时，提高了酶的稳定性，且方便实现固定化酶回收再利用。

Description

一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，属催化材料与酶固定化技术领域。
背景技术
磷脂是构成机体细胞膜的主要成分，在生命体脂肪代谢、神经发育和体内抗氧化等方面发挥重要作用，动植物体重要组织中都含有较多磷脂。天然磷脂由于含有较多的不饱和脂肪酸，容易氧化，实际应用受到限制。通过改性得到的一些特殊磷脂，无刺激、无毒副作用、安全性能高、易生物降解、配伍性能好，具有很高的营养保健和药用价值，在食品、医药、农业等领域应用广泛。随着生物医学、药理学、营养健康学等学科的发展，具有特殊生理功效和营养价值的磷脂越发受到关注，磷脂的改性也变得尤为重要。
现阶段磷脂改性方法主要有物理法、化学法和酶法，而采用磷脂酶对磷脂进行催化，具有反应温和、效率高、专一性强等优点。磷脂酶本身价格高昂，在酸、碱、热和有机溶剂中不稳定，立体化学结构易改变，且难以回收利用，给产品分离纯化带来困难，这极大地限制了其在工业上的应用。磷脂酶的固定化可以有效地改进这些不足。固定化酶技术是将游离酶通过物理(吸附和包埋)或者化学作用(交联)等方法固定到各种固体材料上形成固定化酶。
CN 110923225 A将纤维素和纳米纤维素的混合溶液分散于含乳化剂的液体石蜡中，10～20℃下固化，所得微球直径在0.5～1mm之间，该种复合凝胶微球采用交联剂N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺将磷脂酶共价交联在纤维素和纳米纤维素复合凝胶微球上，该纤维素凝胶微球固定化磷脂酶粒径较大，分离相对耗时耗力，负载量也相对较低；而且对环境因素如温度、pH的稳定性不够。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，所制得的纤维素基磁性微球固定化磷脂酶稳定性好，且便于分离可重复利用。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，主要包括如下步骤：
1)采用TEMPO氧化体系对纤维素进行选择性氧化，制备具有不同羧基含量的纳米纤维素，表面羧基含量为1.0～1.5mmol/g；
2)步骤1)所得的纳米纤维素加入碱/尿素水溶液或碱/硫脲水溶液中，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并快速搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入一定质量的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；
4)在0～5℃低温环境中，往步骤3)所得混合溶液中加入一定量的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；
5)将异辛烷和乳化剂混合后搅拌均匀，然后缓慢加入步骤4)制得的含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液以一定转速进行搅拌，搅拌完成后加入稀HCl调节混合溶液的pH值至中性，洗涤、冷冻干燥后得到纤维素基磁性微球；
6)将步骤5)制得的纤维素基磁性微球加入含有N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，在25±2℃恒温摇床中振荡1～2h，得到活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球清洗后，分散于PBS缓冲液中，加入磷脂酶溶液，恒温振荡一段时间后，加入一定量戊二醛溶液，继续恒温振荡一段时间，之后在0～5℃环境中静置或轻微振荡12～15h；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球收集后用PBS缓冲液清洗，再经冷冻干燥后得到纤维素基磁性微球固定化酶。
按上述方案，所述步骤2)中，碱/尿素水溶液、碱/硫脲水溶液中，碱均为氢氧化钠或氢氧化锂等无机碱，其中碱的浓度为4～9wt％，尿素或硫脲的浓度为8～14wt％。
按上述方案，所述步骤2)中，纳米纤维素的表面羧基含量为1.0～1.5mmol/g，纳米纤维素溶液中纳米纤维素的质量浓度为8～13wt％。
按上述方案，所述步骤3)中，γFe2O3纳米粒子的添加量为纳米纤维素质量的5～20％，超声处理时应注意控制溶液温度在0～5℃。
按上述方案，所述步骤4)中，环氧氯丙烷的添加量为红棕色混合溶液质量的1％-5％。
按上述方案，所述步骤5)中，乳化剂选用司班80或司班85等中的一种或多种。
按上述方案，所述步骤5)中，乳化剂在异辛烷中的分散浓度1～4wt％；异辛烷和步骤4)中制得的混合溶液的体积比为10：(1～5)。
按上述方案，步骤5)中，体系的温度一直控制在15～25℃间某一温度保持恒定，搅拌速度为1000～1500rpm/min；HCl溶液的浓度10-20wt％；洗涤时，用水和乙醇反复清洗至水相澄清透明。
按上述方案，所述步骤5)中，纤维素基磁性微球直径在20～100μm之间。
按上述方案，所述步骤6)中，MES缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH为5.0～6.0；纤维素基磁性微球与MES缓冲液的比例为(0.2～0.8)g/100mL。
按上述方案，所述步骤6)中，纤维素基磁性微球与N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺质量比为(0.2～0.8)：1：5。
按上述方案，所述步骤5)和6)中，恒温摇床的振荡速度为140～200rpm。
按上述方案，步骤7)中，活化的纤维素基磁性微球与PBS缓冲液的比例为(0.2～0.8)g：100mL；活化的纤维素基磁性微球与磷脂酶溶液的比例为(0.1～0.4)g：1mL；磷脂酶溶液的浓度为2000-2500U/mL；戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.25％-0.75％。
按上述方案，所述步骤6)和7)中，PBS缓冲液的浓度为0.01M，pH为7.0-7.4。
按上述方案，所述步骤5)、步骤8)中，冷冻干燥一般温度为-20℃左右，压力为0.07mbar左右，时间为24h左右。
按上述方案，所述酶主要包括磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D等。
与现有技术相比，本发明的有益效果具体如下：
在本发明中，首先采用纯的较高羧基含量的纳米纤维素为原料，提高了纳米纤维素溶液的浓度，还使用了交联剂环氧氯丙烷增强微球强度，用异辛烷做油相，制备了尺寸更小的微球，在几十到一百微米之间，且具有三维互穿网络多孔结构，可用于固定化磷脂酶的功能位点多；再者，纳米纤维素溶液中成功加入磁性γFe2O3纳米粒子，使得制备的微球可在磁诱导下迅速分离，这有利于纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的回收再利用；最后，在使用交联剂N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺共价交联磷脂酶在纳米纤维素羧基上后，进一步使用交联剂戊二醛可以交联更多的磷脂酶，不仅使得单位纳米纤维素上负载的磷脂酶变多，也使得固定化磷脂酶对环境因素如温度、pH的稳定性提高，耐受范围变宽。
附图说明
图1中，a、b分别为实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶分散在水中照片及其被磁铁吸引的照片，所得纤维素基磁性微球(c)和纤维素基磁性微球固定化磷脂酶(d)的扫描电镜图；
图2为本发明实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶与游离磷脂酶(标记为对比例1)以及CN 110923225 A制备的固定化脂肪酶(标记为对比例2)在不同pH下的相对活性对比；
图3为本发明实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶与游离磷脂酶(标记为对比例1)以及CN 110923225 A制备的固定化脂肪酶(标记为对比例2)在不同温度下的相对活性对比；
图4为本发明实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的重复使用性能。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的所解决的技术问题、技术方案及技术效果，以下结合实施例和附图，对本发明的内容进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。
下述实施例中，纤维素均为棉短绒纤维素，它的粘均分子量为3万～37万道尔顿。下述实施例中，碱采用氢氧化锂。
实施例1
一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，具体步骤如下：
1)采用TEMPO氧化体系对纤维素进行选择性氧化，制得富含羧基的纳米纤维素，表面羧基含量为1.25mmol/g；
2)往100g碱/尿素/水(质量比4.5/15/80.5)溶液中加入步骤1)制得的纳米纤维素10g，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并快速搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入1.0g的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；
4)0℃下，往步骤3)所得混合溶液中加入3mL的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；
5)在500mL三口烧瓶加入200mL异辛烷，4g司盘80，于15℃下500rpm搅拌均匀；将步骤4)制得的混合溶液40mL用注射器缓慢均匀连续注入三口烧瓶中，15℃下1200rpm搅拌2.5h，然后加入40mL浓度10％的HCL溶液，继续搅拌10min，静置分层后，收集下层微球；水和乙醇反复清洗至最后水相澄清透明，冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球；
6)往100mL 0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液(pH 6.0)中，依次加入1g N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和5g N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后，加入步骤6)制得的纤维素基磁性微球0.4g，在25±2℃恒温摇床以160rpm振荡1h，制得活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球(大约0.4g)经PBS缓冲液反复清洗，然后分散于100mL PBS缓冲液，并加入1mL磷脂酶PLA1溶液(酶液浓度2260U/mL)，在25±2℃恒温摇床中以160rpm振荡2h后，加入一定量戊二醛溶液(戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.5％)，继续恒温振荡0.5h，最后在4℃环境中90rpm振荡12h；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球经去离子水清洗，再经冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球固定化磷脂酶。
实施例2
一种纤维素凝胶微球固定化磷脂酶的制备方法，具体步骤如下：
1)采用TEMPO氧化体系对纤维素进行选择性氧化，制得富含羧基的纳米纤维素，表面羧基含量为1.25mmol/g；
2)往100g碱/尿素/水(质量比4.5/15/80.5)溶液中加入步骤1)制得的纳米纤维素10g，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并快速搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入1.5g的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；
4)0℃下，往步骤3)所得混合溶液中加入3mL的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；
5)在500mL三口烧瓶加入200mL异辛烷，5g司盘80，于15℃下500rpm搅拌均匀；将步骤4)制得的混合溶液40mL用注射器缓慢均匀连续注入三口烧瓶中，15℃下1200rpm搅拌2.5h，然后加入40mL浓度10％的HCL溶液，继续搅拌10min，静置分层后，收集下层微球；水和乙醇反复清洗至最后水相澄清透明，冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球；
6)往100mL 0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液(pH 6.0)中，依次加入1g N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和5g N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后，加入步骤6)制得的纤维素基磁性微球0.3g，在25±2℃恒温摇床以160rpm振荡1h，制得活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球(大约0.3g)经PBS缓冲液反复清洗，然后分散于100mL PBS缓冲液，并加入1mL磷脂酶PLA1溶液(酶液浓度2260U/mL)，在25±2℃恒温摇床中以160rpm振荡2h后，加入一定量戊二醛溶液(戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.4％)，继续恒温振荡0.5h，最后在4℃环境静置12h；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球经去离子水清洗，再经冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球固定化磷脂酶。
实施例3
一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，具体步骤如下：
1)采用TEMPO氧化体系对纤维素进行选择性氧化，制得富含羧基的纳米纤维素，表面羧基含量为1.49mmol/g；
2)往100g碱/尿素/水(质量比4.5/15/80.5)溶液中加入步骤1)制得的纳米纤维素12g，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并快速搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入1.2g的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；
4)0℃下，往步骤3)所得混合溶液中加入4mL的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；
5)在500mL三口烧瓶加入200mL异辛烷，6g司盘80，于20℃下500rpm搅拌均匀；将步骤4)制得的混合溶液40mL用注射器缓慢均匀连续注入三口烧瓶中，20℃下1200rpm搅拌2.5h，然后加入40mL浓度10％的HCL溶液，继续搅拌10min，静置分层后，收集下层微球；水和乙醇反复清洗至最后水相澄清透明，冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球；
6)往100mL 0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液(pH 6.0)中，依次加入1g N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和5g N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后，加入步骤6)制得的纤维素基磁性微球0.4g，在25±2℃恒温摇床以160rpm振荡1h，制得活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球(大约0.4g)经PBS缓冲液反复清洗，然后分散于100mL PBS缓冲液，并加入1mL磷脂酶PLA1溶液(酶液浓度2260U/mL)，在25±2℃恒温摇床中以160rpm振荡2h后，加入一定量戊二醛溶液(戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.6％)，继续恒温振荡0.5h，最后在4℃环境中静置12h；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球经去离子水清洗，再经冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球固定化磷脂酶。
实施例4
一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，具体步骤如下：
1)采用TEMPO氧化体系对纤维素进行选择性氧化，制得富含羧基的纳米纤维素，表面羧基含量为1.49mmol/g；
2)往100g碱/尿素/水(质量比4.5/15/80.5)溶液中加入步骤1)制得的纳米纤维素12g，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并快速搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入1.8g的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；
4)0℃下，往步骤3)所得混合溶液中加入4mL的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；
5)在500mL三口烧瓶加入200mL异辛烷，6g司盘80，于20℃下500rpm搅拌均匀；将步骤4)制得的混合溶液60mL用注射器缓慢均匀连续注入三口烧瓶中，15℃下1400rpm搅拌2.5h，然后加入40mL浓度10％的HCL溶液，继续搅拌10min，静置分层后，收集下层微球；水和乙醇反复清洗至最后水相澄清透明，冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球；
6)往100mL 0.1M 2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液(pH 6.0)中，依次加入1g N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和5g N-羟基琥珀酰亚胺，充分溶解后，加入步骤6)制得的纤维素基磁性微球0.4g，在25±2℃恒温摇床以160rpm振荡1h，制得活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球(大约0.4g)经PBS缓冲液反复清洗，然后分散于100mL PBS缓冲液，并加入1mL磷脂酶PLA1溶液(酶液浓度2260U/mL)，在25±2℃恒温摇床中以160rpm振荡2h后，加入一定量戊二醛溶液(戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.6％)，继续恒温振荡0.5h，最后在4℃环境中静置12h；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球经去离子水清洗，再经冷冻干燥(-20℃，0.07mbar)24h后，得到纤维素基磁性微球固定化磷脂酶。
图1中，a、b分别为实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶分散在水中照片及其被磁铁吸引的照片。
对实施例3步骤5)所得纤维素基磁性微球、步骤8)所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶进行扫描电镜观察，如图1所示，纤维素基磁性微球(c)表现出大小均一的三维多孔网络结构，负载了磷脂酶的纤维素基磁性微球(d)。
为检测本发明实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶与游离磷脂酶、CN110923225 A所制备的固定化磷脂酶(CN 110923225 A具体采用实施例3制备)在不同温度下、不同PH的相对活性，具体测试过程如下：
1)配置不同pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液100mL，分别加入4g大豆卵磷脂后，于50℃摇床中以180rpm振荡1h后得到大豆卵磷脂乳液；
2)将游离酶或实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶加入步骤1)的大豆卵磷脂乳液中，以180rpm振荡15min后，加入60mL乙醇溶液终止反应，得到反应液试样；同时制备未加入酶的空白试样作参照；
3)采用0.05M NaOH(c)溶液滴定步骤2)中的反应液试样和空白液试样至pH7.5，记录滴定体积V(反应液试样消耗的NaOH)和V0(空白液试样消耗的NaOH)；
4)采用如下公式计算酶活：
Figure BDA0002808825630000081
其中：X是酶活力；n-酶样的稀释倍数；t-测定酶活时的反应时间；
5)分别计算游离酶，实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的酶活性后，通过计算与最高酶活性的比值得到相对酶活。
将本发明实施例3纤维素基磁性微球固定化磷脂酶与游离磷脂酶以及CN110923225 A所制备的固定化磷脂酶在不同pH下的相对活性进行对比，如图2所示，本发明实施例3纤维素基磁性微球固定化磷脂酶耐受pH范围变宽，对应活性也高于CN 110923225A。
本发明实施例3纤维素基磁性微球固定化磷脂酶与游离磷脂酶以及CN 110923225A所制备的固定化磷脂酶在不同温度下的相对活性进行对比，如图3所示，本发明实施例3纤维素基磁性微球固定化磷脂酶耐受温度范围变宽，对应活性也高于CN 110923225 A。图2和图3证明了较游离酶相比，纤维素基磁性微球固定化磷脂酶pH耐受性和温度热稳定性增强，且优于CN 110923225 A固定化磷脂酶。
由图4可知，本发明实施例3所得纤维素基磁性微球固定化磷脂酶在进行了5次重复使用后，仍然保留了86％的相对活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于主要包括如下步骤：
1)选取表面羧基含量为1.0～1.5mmol/g的纳米纤维素；
2)步骤1)所述纳米纤维素加入碱/尿素水溶液或碱/硫脲水溶液中，于-20℃以下冷冻，室温下解冻，并搅拌溶解得到透明的纳米纤维素溶液，纳米纤维素的质量浓度为8～13wt％；
3)往步骤2)得到的纳米纤维素溶液中加入一定量的γFe2O3纳米粒子，超声处理得到含磁性纳米颗粒的红棕色混合溶液；其中，γFe2O3纳米粒子的添加量为纳米纤维素质量的5～20％；
4)低温下0-5℃下，往步骤3)所得红棕色混合溶液中加入一定量的环氧氯丙烷，搅拌分散均匀、脱泡，得到含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液；其中，环氧氯丙烷的添加量为红棕色混合溶液质量的1％-5％；
5)将异辛烷和乳化剂混合均匀，然后搅拌加入步骤4)制得的含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液，搅拌完成后加入稀酸调节pH至中性，洗涤、冷冻干燥后得到纤维素基磁性微球；
6)将步骤5)制得的纤维素基磁性微球加入含有N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液中，恒温振荡一段时间后，得到活化的纤维素基磁性微球；
7)将步骤6)活化的纤维素基磁性微球清洗后，分散于PBS缓冲液中，加入磷脂酶溶液，恒温振荡一段时间后，加入一定量戊二醛溶液，继续恒温振荡，之后在0～5℃环境中静置或轻微振荡12～15h；其中，戊二醛的添加量为缓冲溶液质量的0.25％-0.75％；
8)将步骤7)的纤维素基磁性微球收集后清洗，再经冷冻干燥后得到纤维素基磁性微球固定化酶。
2.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤2)中，碱/尿素水溶液、碱/硫脲水溶液中，其中碱的浓度为4～9wt％，尿素或硫脲的浓度为8～14wt％；步骤5)中，乳化剂选用司班80或司班85中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤3)中，超声处理的温度在0～5℃。
4.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤5)中，乳化剂在异辛烷中的分散浓度1～4wt％；异辛烷和步骤4)中所制得含磁性纳米颗粒的纳米纤维素预凝胶溶液的体积比为10：(1～5)；搅拌的速度为1000～1500rpm/min，环境温度为15-25℃。
5.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤6)中，2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L，pH为5.0～6.0；纤维素基磁性微球与2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液的比例为(0.2～0.8)g/100mL；纤维素基磁性微球与N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺质量比为(0.2～0.8)：1：5。
6.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于步骤7)中，活化的纤维素基磁性微球与PBS缓冲液的比例为(0.2～0.8)g：100mL；活化的纤维素基磁性微球与磷脂酶溶液的比例为(0.1～0.4)g：1mL；磷脂酶溶液的浓度为2000-2500U/mL。
7.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤6)和7)中，恒温摇床温度为20～30℃，振荡速度为140～200rpm，振荡时间1～2h。
8.根据权利要求1所述的一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法，其特征在于所述步骤5)、步骤8)中，冷冻干燥的温度为-15～-25℃，压力为0.06～0.08mbar，时间为24～36h。
9.权利要求1所述的纤维素基磁性微球固定化磷脂酶用于磷脂催化方面的应用。
CN202011382356.8A 2020-11-30 2020-11-30 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法 Active CN112458076B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011382356.8A CN112458076B (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011382356.8A CN112458076B (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112458076A CN112458076A (zh) 2021-03-09
CN112458076B true CN112458076B (zh) 2022-09-23

Family

ID=74805115

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011382356.8A Active CN112458076B (zh) 2020-11-30 2020-11-30 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112458076B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115029331B (zh) * 2022-07-29 2024-01-30 中国海洋大学 用于制备磷脂酰丝氨酸的固定化酶皮克林乳液反应体系

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1994469A (zh) * 2006-09-13 2007-07-11 上海师范大学 生物降解磁性纳米颗粒及其制法和应用
CN101274985B (zh) * 2008-05-12 2011-04-20 武汉大学 一种磁性纤维素微球及其制备方法和用途
CN102533717B (zh) * 2012-03-02 2013-06-12 江南大学 一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法
CN103710333A (zh) * 2013-12-21 2014-04-09 华中科技大学 一种固定化载体及其制备方法和固定化β-葡萄糖苷酶
CN107746842B (zh) * 2017-12-05 2022-02-11 天津科技大学 一种磁性纤维素微球固定化酶的制备方法
CN110923225B (zh) * 2019-12-05 2021-12-07 中国农业科学院油料作物研究所 用于磷脂催化的纤维素凝胶微球固定化磷脂酶及其制备方法
CN111909427A (zh) * 2020-06-18 2020-11-10 华南理工大学 壳聚糖-纤维素硫酸酯磁性多孔复合微球及其制备与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112458076A (zh) 2021-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Thangaraj et al. Immobilization of lipases–a review. Part II: carrier materials
CN110923225B (zh) 用于磷脂催化的纤维素凝胶微球固定化磷脂酶及其制备方法
CN102260662B (zh) 用于固定化酶的载体及其用途和固定有酶的载体
Seenuvasan et al. Magnetic nanoparticles: a versatile carrier for enzymes in bio‐processing sectors
Ulu et al. The carboxylated multi-walled carbon nanotubes/l-asparaginase doped calcium-alginate beads: Structural and biocatalytic characterization
Gracida et al. Improved thermal and reusability properties of xylanase by genipin cross-linking to magnetic chitosan particles
CN112458076B (zh) 一种纤维素基磁性微球固定化磷脂酶的制备方法
Ke et al. Synthesis and characterization of a novel magnetic chitosan microsphere for lactase immobilization
CN108410003A (zh) 一种聚丙烯腈改性膜的制备及其应用于固定酶的方法
CN102703411B (zh) 固定生物酶的顺磁性的环氧基介孔分子筛及其制备方法
Ayhan et al. Highly biocompatible enzyme aggregates crosslinked by L-lysine
Chen et al. Immobilization of Aspergillus niger xylanase on chitosan using dialdehyde starch as a coupling agent
Ein Ali Afjeh et al. Characteristics of glucose oxidase immobilized on Magnetic Chitosan Nanoparticles
Luan et al. Microporous regenerated cellulose-based macrogels for covalent immobilization of enzymes
CN106011206A (zh) 用复合载体磁性纳米颗粒固定化双酶制备活性肽的方法
EP1709169B1 (en) Stabilization of enzymes
CN112301025A (zh) 固定化酶载体的修饰方法及应用
Soares et al. Intensification of lipase performance for long-term operation by immobilization on controlled pore silica in presence of polyethylene glycol
CN113174384B (zh) 一种固定化酶及其制备方法与在opo制备中的应用
Zhou et al. Preparation and property of urease immobilization with cationic poly (4-vinylpyridine) functionalized colloidal particles
CN106281966B (zh) 一种高效生产κ-卡拉胶低聚糖的生物反应器及其应用
CN108690842A (zh) 海洋微生物脂肪酶ys2071的固定化方法
Zeng et al. Alcalase microarray base on metal ion modified hollow mesoporous silica spheres as a sustainable and efficient catalysis platform for proteolysis
CN106591274B (zh) 一种固定化核酸酶p1及其制备方法与其应用
CN114875015A (zh) 一种脂肪酶-聚合物偶联物的制备方法及其在结构脂质转酯化上的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant