CN112410287A - 一种青海湖裸鲤胚胎培养液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种青海湖裸鲤胚胎培养液及其制备方法，属于渔业养殖技术领域。所述培养液包含以下组分：NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaHCO3、亚甲基蓝、庆大霉素。本发明的培养液模拟了青海湖裸鲤胚胎在自然条件下孵化、生长的水体组成，并加入其他电解质离子和抗菌成分，制备青海湖裸鲤胚胎培养液，能够显著提高青海湖裸鲤胚胎的成活率，并且成本低廉，可应用于青海湖裸鲤的生物学实验和规模化人工养殖。
Description
技术领域
本发明属于渔业养殖技术领域，具体地，涉及一种青海湖裸鲤胚胎培养液及其制备方法。
背景技术
青海湖裸鲤，系鲤科，裂腹鱼亚科，裸鲤属鱼类，俗称青海湖“湟鱼”，仅分布于青海湖流域，是我国特有珍惜鱼类。上世纪70年代以来，由于青海湖湖区水位持续下降、湖区沼泽面积逐渐减小、过度捕捞和偷捕滥捞等自然和人为因素，造成青海湖裸鲤自然资源急剧下降，成为濒危灭绝物种。
裸鲤资源的衰退将严重影响脆弱的青海湖生态系统，破坏青海湖以鱼为基础的“鱼鸟共生”生态平衡。青海湖裸鲤的保护受到社会、科研院所、政府相关部门乃至国家层面的高度重视。
科研人员通过不断探索青海湖裸鲤的人工孵化和苗种培育技术，经过十余年的工作，已取得显著成效，然而胚胎成活率低仍是青海湖裸鲤人工繁育的技术难点。
目前人工孵化方式主要是利用原生地自然流水孵化，其缺点是水质不可控，水体硬度大、有害微生物多，如真菌、细菌、寄生虫等，导致胚胎成活率低。为提高人工繁育青海湖裸鲤胚胎的成活率，人工配置适合青海湖裸鲤胚胎发育的培养液来替代自然水体是最经济、有效的策略。关于青海湖裸鲤胚胎培养液研发的成果尚无报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种青海湖裸鲤胚胎孵化用培养液，所述培养液包含以下组分：NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaHCO3、亚甲基蓝、庆大霉素。
进一步地，1000mL所述培养液中各组分含量如下：
NaCl 7.0~10.0g
KCl 0.30~0.50g
CaCl2 0.70~0.74g
MgSO4•7H2O 1.20~1.25g
Na2HPO4 0.35~0.36g
KH2PO4 0.50~0.70g
NaHCO3 0.30~0.40g
亚甲基蓝 0.40~0.60mg
硫酸庆大霉素 40000~80000U
去离子水 补充至1000mL。
更进一步地，1000mL所述培养液中各组分含量如下：
NaCl 8.5g
KCl 0.40g
CaCl2 0.72g
MgSO4•7H2O 1.23g
Na2HPO4 0.35g
KH2PO4 0.6g
NaHCO3 0.35g
亚甲基蓝 0.5mg
硫酸庆大霉素 40000U
去离子水 补充至1000mL。
本发明第二方面提供一种青海湖裸鲤胚胎孵化用培养液的制备方法，包括以下步骤：
S1，将7.0~10.0g NaCl和0.30~0.50g KCl用去离子水定容到100mL制备成母液一；
S2，将0.70~0.74g CaCl2用去离子水定容到50mL制备成母液二；
S3，将1.20~1.25g MgSO4•7H2O用去离子水定容到50mL制备成母液三；
S4，将0.35~0.36g Na2HPO4和0.50~0.70g KH2PO4用去离子水定容到100mL制备成母液四；
S5，将10mL 母液一、10mL 母液二、10mL 母液三、1mL 母液四、0.30~0.40g NaHCO3、0.40~0.60mg亚甲基蓝和40000~80000U硫酸庆大霉素用去离子水定容至1000mL配制成所述培养液。
进一步地，所述步骤S1中：将8.5g NaCl和0.40g KCl用去离子水定容至100mL，制备成母液一，121℃高温灭菌15min。
进一步地，所述步骤S2中：将0.72g CaCl2用去离子水定容至50mL，制备成母液二，121℃高温灭菌15min。
进一步地，所述步骤S3中：将1.23g MgSO4•7H2O用去离子水定容至50mL，制备成母液三。
进一步地，所述步骤S4中：将0.35g Na2HPO4和0.60g KH2PO4用去离子水定容至100mL，制备成母液四。
更进一步地，所述步骤S5中，将10mL 母液一、10mL 母液二、10mL 母液三、1mL 母液四、0.35g NaHCO3、0.5mg亚甲基蓝和4000U硫酸庆大霉素用去离子水定容至1000mL配制成所述培养液。
本发明的第三方面提供一种青海湖裸鲤胚胎的孵化方法，包括利用本发明第一方面所述的培养液进行培养的步骤。
在本发明一些实施方案中，将新鲜的青海湖裸鲤受精卵至于所述培养液中，在温度17℃条件下恒温培养。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明的培养液适用于青海湖裸鲤胚胎的培养和孵化，提高了青海湖裸鲤人工繁育工作中胚胎孵化率低的难题。
本发明的培养液模拟了青海湖裸鲤胚胎在自然条件下孵化、生长的水体组成，并加入其他电解质离子和抗菌成分，制备青海湖裸鲤胚胎培养液，能够显著提高青海湖裸鲤胚胎的成活率，并且成本低廉，可应用于青海湖裸鲤的生物学实验和规模化人工养殖。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1 青海湖裸鲤胚胎培养、孵化的培养液的制备
| 成分 | 含量 | 母液各物质组分含量 |
| 母液一 | 10 mL | NaCl 0.8 g、KCl 0.04 g |
| 母液二 | 10 mL | CaCl<sub>2 </sub>0.144 g |
| 母液三 | 10 mL | MgSO<sub>4</sub>·7H2O 0.246 g |
| 母液四 | 1 mL | Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 0.0035 g、KH<sub>2</sub>PO<sub>4 </sub>0.006 g |
| NaHCO<sub>3</sub> | 0.35 g | / |
| 亚甲基蓝 | 0.5 mg | / |
| 硫酸庆大霉素 | 40000 U | / |
| 去离子水 | 定容至1000 mL | / |
母液在4 °C保存，可保存一个月。使用时按规定量混合成工作液，方可使用。
母液一配置方法：
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 8.5 g |
| KCl | 0.40 g |
| 去离子水 | 定容至100 mL |
固体完全溶解后，121℃高温灭菌15 min，4℃保存。
母液二配置方法：
| 成分 | 含量 |
| CaCl<sub>2</sub> | 0.72 g |
| 去离子水 | 定容至50 mL |
固体完全溶解后，121 °C 高温灭菌15 min，4 °C保存。
母液三配置：
| 成分 | 含量 |
| MgSO<sub>4</sub>·7H2O | 1.23 g |
| 去离子水 | 定容至50 mL |
母液四配置：
| 成分 | 含量 |
| Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 0.35 g |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 0.6 g |
| 去离子水 | 定容至100 mL |
实施例2 青海湖裸鲤胚胎培养
采集原生地新鲜河水（沙柳河中段取水），运输至实验室备用。
对比培养液工作液的配制方法：（对比培养液的配制方法与实施例1相同，其差异在于溶液的成分和含量不同）
| 母液 | 对比培养液一 | 对比培养液二 | 对比培养液三 | 对比培养液四 | 对比培养液五 |
| 母液一 | — | 10 mL | 10 mL | 10 mL | 10 mL |
| 母液二 | 10 mL | — | 10 mL | 10 mL | 10 mL |
| 母液三 | 10 mL | 10 mL | — | 10 mL | 10 mL |
| 母液四 | 1 mL | 1 mL | 1 mL | — | 1 mL |
| NaHCO<sub>3</sub> | 0.35 g | 0.35 g | 0.35 g | 0.35 g | — |
| 亚甲基蓝 | 0.5 mg | 0.5 mg | 0.5 mg | 0.5 mg | — |
| 硫酸庆大霉素 | 40000 U | 40000 U | 40000 U | 40000 U | — |
| 去离子水 | 定容至1000mL | 定容至1000mL | 定容至1000mL | 定容至1000mL | 定容至1000mL |
其中，母液一、母液二、母液三和母液四同实施例1。
将新鲜的青海湖裸鲤受精卵至于上述不同培养液中（100粒受精卵/组，共6组，其中1组是实施例1的培养液，4组为不同对比培养液，1组为原产地自然河水），在温度17℃条件下恒温培养，每组实验处理设置3个生物学重复组。在处理24h、48h和72h时观察、记录胚胎成活情况，结果如下；
结果可知，本发明培养液能够有效提高青海湖裸鲤胚胎的成活率。对比培养液1-5分别缺少了培养液1中的不同组分，钠离子、镁离子、钙离子对青海湖裸鲤受精卵的早期发育（24h）具有重要的作用，直接影胚胎的早期发育；碳酸氢根和磷酸氢根是维持水体稳态的重要功能基团，尤其在水体小、代谢快的实验室特殊条件下，能够调节实体pH值，在胚胎发育48h后的作用更显著。对比培养液5和实施例2中的原生地自然水因为缺乏抗菌成分，使得青海湖裸鲤胚胎易感染各种真菌、水霉和细菌，少数的受精卵发育停滞、死亡后，迅速腐败，结果造成全组胚胎的病变和死亡，并不适用于静置小水体的实验室条件。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种青海湖裸鲤胚胎孵化用培养液，其特征在于，所述培养液包含以下组分：NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、Na2HPO4、KH2PO4、NaHCO3、亚甲基蓝、庆大霉素。
2.根据权利要求1所述的培养液，其特征在于，1000mL所述培养液中各组分含量如下：
NaCl 7.0~10.0g
KCl 0.30~0.50g
CaCl2 0.70~0.74g
MgSO4•7H2O 1.20~1.25g
Na2HPO4 0.35~0.36g
KH2PO4 0.50~0.70g
NaHCO3 0.30~0.40g
亚甲基蓝 0.40~0.60mg
硫酸庆大霉素 40000~80000U
去离子水 补充至1000mL。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，1000mL所述培养液中各组分含量如下：
NaCl 8.5g
KCl 0.40g
CaCl2 0.72g
MgSO4•7H2O 1.23g
Na2HPO4 0.35g
KH2PO4 0.6g
NaHCO3 0.35g
亚甲基蓝 0.5mg
硫酸庆大霉素 40000U
去离子水 补充至1000mL。
4.权利要求1所述的培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，将7.0~10.0g NaCl和0.30~0.50g KCl用去离子水定容到100mL制备成母液一；
S2，将0.70~0.74g CaCl2用去离子水定容到50mL制备成母液二；
S3，将1.20~1.25g MgSO4•7H2O用去离子水定容到50mL制备成母液三；
S4，将0.35~0.36g Na2HPO4和0.50~0.70g KH2PO4用去离子水定容到100mL制备成母液四；
S5，将10mL 母液一、10mL 母液二、10mL 母液三、1mL 母液四、0.30~0.40g NaHCO3、0.40~0.60mg亚甲基蓝和40000~80000U硫酸庆大霉素用去离子水定容至1000mL配制成所述培养液。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中：将8.5g NaCl和0.40gKCl用去离子水定容至100mL，制备成母液一，121℃高温灭菌15min。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中：将0.72g CaCl2用去离子水定容至50mL，制备成母液二，121℃高温灭菌15min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中：将1.23g MgSO4•7H2O用去离子水定容至50mL，制备成母液三。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中：将0.35g Na2HPO4和0.60g KH2PO4用去离子水定容至100mL，制备成母液四。
9.根据权利要求5-6任一所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中，将10mL 母液一、10mL 母液二、10mL 母液三、1mL 母液四、0.35g NaHCO3、0.5mg亚甲基蓝和4000U硫酸庆大霉素用去离子水定容至1000mL配制成所述培养液。
10.一种青海湖裸鲤胚胎的孵化方法，其特征在于，包括利用权利要求1~3任意所述的培养液进行培养的步骤。
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| CN112410287B (zh) | 2023-05-26 |
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