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CN112391417B - 一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法 - Google Patents

一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物氧化4‑甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法，包括(1)菌种活化及制备种子培养液；(2)发酵；(3)转化；(4)吸附与洗脱；(5)浓缩与结晶。本发明提供了一种以4‑甲基愈创木酚为原料制备天然香兰素的生物氧化方法，为天然香兰素的生产开拓了新的思路。使用本发明中的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK‑72发酵氧化4‑甲基愈创木酚为香兰素，产物在转化液中的浓度可达到16.2g/L，生产成本低，具有良好的工业应用前景。

Description

一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法。
背景技术
香兰素是从芸香科植物香荚兰豆中提取的一种重要香料，具有强烈而又独特的香荚兰豆香气，是香料中产量最大的品种之一，是调配巧克力、冰淇淋、口香糖、糕点及烟草香精的重要原料。
目前市场上的香兰素主要来源于化学合成，具体有木质素法、愈创木酚-乙醛酸法等多条途径。但随着社会的发展，人们更加追求健康环保的生活，天然香料的市场接受度越来越高，开发一个纯天然的生物过程实现香兰素的生产已经成为了研究开发的热点。现有技术中的天然香兰素的生产方法主要为阿魏酸路线与丁香酚路线。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于上述方法的巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium OMK-72。
本发明的技术方案如下：
一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法，包括如下步骤：
(1)将巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72依次经固体斜面培养基和种子培养基培养后，获得种子培养液；巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72于2020年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M2020457；
(2)将该种子培养液接种于发酵培养基中培养，至菌体生长至对数早期后加入1.8-2.2g/L的4-甲基愈创木酚诱导相关酶的表达，并培养至发酵结束；
(3)在步骤(2)所得的培养液中一次性或分批加入4-甲基愈创木酚，同时在通气条件下充分搅拌反应，该步骤中每次加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5g/L；
(4)将步骤(3)所得的物料经离心获得上清液，将该上清液经过陶瓷膜获得清液，将该清液过树脂柱吸附，再用乙醇洗脱，获得洗脱液；
(5)将上述洗脱液进行蒸发浓缩，再进行结晶，接着经干燥，即得天然香兰素。
在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：
(1)从低温保藏的甘油管中划线所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72于固体斜面培养基上，于28-30℃静置培养24-48h后得到活化菌种；将所得的活化菌种接种于种子培养基中，于28-30℃且200-250rpm条件下震荡培养至对数早期，即得种子培养液；
(2)将步骤(1)所得的种子培养液按5-10％的体积比接种于发酵培养基中，于pH6.5-8.0，28-30℃，搅拌转速100-600rpm，通气量1∶0.5的条件下培养3-6h，至菌体生长至对数早期加入1.8-2.2g/L的4-甲基愈创木酚，继续发酵36-48h，获得培养液；
(3)在步骤(2)所得的培养液中一次性或分批加入4-甲基愈创木酚，同时在搅拌转速300-600rpm，通气量1∶0.5的条件下转化反应，该步骤中每次加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5g/L；
(4)将步骤(3)所得的物料经离心获得上清液，将该上清液经过陶瓷膜获得清液，将该清液过树脂柱吸附，再用乙醇洗脱，获得洗脱液；
(5)将步骤(4)所得的洗脱液转移至蒸馏瓶中蒸去适量乙醇，适当浓缩，在合适的条件下结晶，干燥，即得所述香兰素。
在本发明的一个优选实施方案中，所述固体斜面培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨1-2％，酵母提取物0.5-1％，氯化钠0.5-1％，琼脂1.5-2％，溶剂为水。
进一步优选的，所述固体斜面培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，余量为水。
在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨1-2％，酵母提取物0.5-1％，氯化钠0.5-1％，溶剂为水。
进一步优选的，所述种子培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，余量为水。
在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方按质量百分比包括：葡萄糖2.0-5.0％，磷酸二氢铵0.5-1.0％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，硫酸镁0.05-0.2％，硫酸钙0.05-0.1％，酵母浸粉0.1-1.0％，微量元素溶液0.1-0.2％，溶剂为水；该微量元素溶液配方按质量百分比包括：EDTA0.8-1.2％，硫酸锌0.1-0.3％，氯化钙0.08-0.12％，硫酸亚铁0.45-0.55％，钼酸钠0.01-0.03％，硫酸铜0.01-0.03％，氯化钴0.03-0.05％，氯化锰0.08-0.12％，溶剂为水。
进一步优选的，所述发酵培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖2％，磷酸二氢铵1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.2％，硫酸钙0.1％，酵母浸粉0.5％，微量元素溶液0.1％，余量为水；该微量元素溶液配方按质量百分比包括：EDTA 1％，硫酸锌0.2％，氯化钙0.1％，硫酸亚铁0.5％，钼酸钠0.02％，硫酸铜0.02％，氯化钴0.04％，氯化锰0.1％，溶剂为水。
本发明的另一技术方案如下：
一种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72，于2020年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020457。
上述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72在生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种以4-甲基愈创木酚为原料制备天然香兰素的生物氧化方法，使得天然香兰素的制备不再完全依赖阿魏酸与丁香酚，为天然香兰素的生产开拓了新的思路。
2、使用本发明中的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72发酵氧化4-甲基愈创木酚为香兰素，产物在转化液中的浓度可达到16.2g/L，生产成本低，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例2中的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72发酵氧化4-甲基愈创木酚为香兰素的HPLC图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1天然香兰素的生产(三角摇瓶发酵)
(1)菌种获取
从海洋沉积物中分离出一株可以催化4-甲基愈创木酚氧化为香兰素的菌株，经16S r DNA测序鉴定为巨大芽孢杆菌，命名为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72。该菌株于2020年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020457。
(2)菌种活化：从-80℃甘油管中划Bacillus megaterium OMK-72涂布于固体斜面培养基上，于30℃静置培养24h后得到活化菌种。
固体斜面培养基的配方按质量百分比具体如下：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，琼脂2％，余量为水。
(3)制备种子培养液：将所得的活化菌种接种于装有30mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，于30℃，250rpm培养4-6h，即得种子培养液。
种子培养基的配方按质量百分比具体如下：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％，余量为水，初始pH 7.5，121℃灭菌20min。
(4)发酵及转化：将5mL种子培养液接种于装有50mL发酵培养基的500mL三角摇瓶中，于30℃，250rpm发酵培养4h。待菌体进入对数生长期后加入2g/L的4-甲基愈创木酚，于30℃，250rpm继续发酵36h。发酵完成后加入5g/L4-甲基愈创木酚，转化10h至转化完全。HPLC测定得知发酵液中香兰素浓度为5.4g/L，得率98％。
发酵培养基的配方按质量百分比具体如下：葡萄糖2％，磷酸二氢铵1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.2％，硫酸钙0.1％，酵母浸粉0.5％，微量元素溶液0.1％，余量为水，初始pH 7.5，115℃灭菌30min。其中，微量元素溶液配方按质量百分比包括：EDTA 1％，硫酸锌0.2％，氯化钙0.1％，硫酸亚铁0.5％，钼酸钠0.02％，硫酸铜0.02％，氯化钴0.04％，氯化锰0.1％，溶剂为水。
实施例2天然香兰素的生产(发酵罐发酵)
步骤(1)至(2)同实施例1；
(3)制备种子培养液：将所得的活化菌种接种于装有50mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，于30℃，250rpm培养6-8h，得到一级种子液；将一级种子液50mL全部接入装有6L种子培养基的10L种子罐中，于30℃，搅拌转速250rpm，通气量1∶0.5的条件下培养6-8h，得到二级种子液；
种子培养基的配方同实施例1。
(4)发酵及转化：30L发酵罐装15L发酵培养基，于115℃灭菌30min，按接种量10％将培养好的二级种子液接入30L发酵罐进行培养，培养条件：温度30℃，搅拌转速400rpm，通气比1∶0.5，发酵培养5h后加入2g/L 4-甲基愈创木酚继续发酵，并按20g/h的流速流加70％葡萄糖溶液至发酵结束，总发酵周期48h。发酵结束后加入5g/L 4-甲基愈创木酚，设定搅拌转速400rpm，通气比1∶0.5进行转化，后续分别于6h，15h各补加5g/L4-甲基愈创木酚一次，总转化周期26h，4-甲基愈创木酚转化率可达100％，转化液中香兰素浓度为16.2g/L，得率98％。(其HPLC图如图1所示，天然香兰素特征峰如箭头所指)。
发酵培养基的配方同实施例1。
(5)树脂柱吸附与洗脱：转化结束，升温至60℃灭活，将步骤(4)所得的转化液离心获得上清液，上清液过陶瓷膜除去不溶物得清液，该清液流经树脂柱吸附，再使用乙醇洗脱，得含有香兰素的乙醇溶液；
(6)浓缩与结晶：将步骤(5)所得的含有香兰素的乙醇溶液转移至蒸馏瓶中蒸去适量乙醇，适当浓缩，在合适的条件下结晶，干燥，得天然香兰素纯品253g，收率88％。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72依次经固体斜面培养基和种子培养基培养后，获得种子培养液；巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72于2020年 8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020457；
（2）将该种子培养液接种于发酵培养基中培养，至菌体生长进入对数生长期后加入1.8-2.2 g/L的4-甲基愈创木酚诱导相关酶的表达，并培养至发酵结束；
（3）在步骤（2）所得的培养液中一次性或分批加入4-甲基愈创木酚，同时在通气条件下充分搅拌反应，该步骤中，一次性加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5 g/L，分批加入4-甲基愈创木酚中每次加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5 g/L；
（4）将步骤（3）所得的物料经离心获得上清液，将该上清液经过陶瓷膜获得清液，将该清液过树脂柱吸附，再用乙醇洗脱，获得洗脱液；
（5）将上述洗脱液进行蒸发浓缩，再进行结晶，接着经干燥，即得天然香兰素。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）从低温保藏的甘油管中划线所述巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72于固体斜面培养基上，于28-30 ℃静置培养24-48 h后得到活化菌种；将所得的活化菌种接种于种子培养基中，于28-30 ℃且200-250 rpm条件下震荡培养进入对数生长期，即得种子培养液；
（2）将步骤（1）所得的种子培养液按5-10%的体积比接种于发酵培养基中，于pH 6.5-8.0，28-30 ℃，搅拌转速100-600 rpm，通气量1:0.5的条件下培养3-6 h，至菌体生长进入对数生长期加入1.8-2.2 g/L的4-甲基愈创木酚，继续发酵36-48 h，获得培养液；
（3）在步骤（2）所得的培养液中一次性或分批加入4-甲基愈创木酚，同时在搅拌转速300-600 rpm，通气量1:0.5的条件下转化反应，该步骤中，一次性加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5 g/L，分批加入4-甲基愈创木酚中每次加入4-甲基愈创木酚的浓度为4.5-5.5g/L；
（4）将步骤（3）所得的物料经离心获得上清液，将该上清液经过陶瓷膜获得清液，将该清液过树脂柱吸附，再用乙醇洗脱，获得洗脱液；
（5）将步骤（4）所得的洗脱液转移至蒸馏瓶中蒸去适量乙醇，适当浓缩，在合适的条件下结晶，干燥，即得所述香兰素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述固体斜面培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨1-2%，酵母提取物0.5-1%，氯化钠0.5-1%，琼脂1.5-2%，溶剂为水。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述固体斜面培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，琼脂2%，余量为水。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的配方按质量百分比包括：蛋白胨1-2%，酵母提取物0.5-1%，氯化钠0.5-1%，溶剂为水。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的配方按质量百分比为：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，余量为水。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方按质量百分比包括：葡萄糖2.0-5.0%，磷酸二氢铵0.5-1.0%，磷酸二氢钾0.1-0.5%，硫酸镁0.05-0.2%，硫酸钙0.05-0.1%，酵母浸粉0.1-1.0%，微量元素溶液0.1-0.2%，溶剂为水；该微量元素溶液配方按质量百分比包括：EDTA 0.8-1.2%，硫酸锌0.1-0.3%，氯化钙 0.08-0.12%，硫酸亚铁0.45-0.55%，钼酸钠 0.01-0.03%，硫酸铜 0.01-0.03%，氯化钴 0.03-0.05%，氯化锰 0.08-0.12%，溶剂为水。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方按质量百分比为：葡萄糖2%，磷酸二氢铵1%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.2%，硫酸钙0.1%，酵母浸粉0.5%，微量元素溶液0.1%，余量为水；该微量元素溶液配方按质量百分比包括：EDTA 1%，硫酸锌0.2%，氯化钙 0.1%，硫酸亚铁 0.5%，钼酸钠 0.02%，硫酸铜 0.02%，氯化钴 0.04%，氯化锰 0.1%，溶剂为水。
9.一种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72，其特征在于：于2020年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020457。
10.权利要求9所述的一种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium OMK-72在生物氧化4-甲基愈创木酚制备天然香兰素的应用。
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