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CN112362870B - 登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条、检测卡及试剂盒 - Google Patents

登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条、检测卡及试剂盒 Download PDF

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CN112362870B
CN112362870B CN202110045337.4A CN202110045337A CN112362870B CN 112362870 B CN112362870 B CN 112362870B CN 202110045337 A CN202110045337 A CN 202110045337A CN 112362870 B CN112362870 B CN 112362870B
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Abstract

本发明涉及一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括第一金标垫层和第一硝酸纤维素膜，第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体‑胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线，登革热IgG/IgM抗体试纸条包括第二金标垫层和第二硝酸纤维素膜，第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原‑胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2；本发明试纸条一次操作即可联合检测IgM/IgG抗体、NS1抗原，简化了操作过程，有效地诊断了机体免疫应答反应状态，达到真正的POCT检测的目的。

Description

登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条、检测卡及试 剂盒
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用免疫层析技术检测血清、血浆、全血中登革热病毒IgG/IgM抗体、NS1抗原的两联检测试纸条、检测卡及试剂盒。
背景技术
登革热是由登革热病毒引起，埃及伊蚊或白伊蚊传播的一种急性传染病。登革热病毒为小型黄病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，按流行病学分类属虫媒病毒B组，血清学上分为四个血清型。登革热病毒能够引起一系列的临床症状，临床上以突然高热、广泛出血、全身剧烈肌肉疼痛和关节痛，极度疲乏等为主要症状，多伴有皮疹、淋巴腺肿和白细胞减少等现象。
目前，该病毒广泛流行于全球热带和亚热带的非洲、美洲、东南亚和太平洋地区等多个国家及地区，是分布最广，发病最多，危害较大的一种虫媒病毒性疾病，为全球最严重的由蚊虫传播的病毒性疾病。随着全球气候变暖日趋严重，登革热地理分布上有蔓延的趋势，发病率和疫情的严重程度也有所增加。登革热已成为全球性的严重公共卫生问题。由此可见，尽早发现并尽早对登革热患者采取隔离措施并进行对症治疗，从源头上对登革热病毒的蔓延进行有效遏制，是防止登革热病毒传播的最佳途径和手段。
登革热病毒感染后，潜伏期为3～14天（通常4～7天），潜伏期内机体的免疫系统会产生一系列的免疫应答反应。初次感染后，机体产生抗体的速度较慢，且滴度也较低，IgM为最初应答的抗体，一般在发病的第五天，可检测到80%水平的IgM抗体，IgM抗体水平在发病后2周达高峰，然后逐步下降，可保持2～3个月。IgG一般在发病的第7天后才出现，滴度很低，上升速度也慢，病毒NS1抗原在发病后4～5天内，可在病人的血清、血浆、白细胞、脑脊液和尸检组织标本中分离到，病毒核酸及NS1抗原在这个时期的检出率高，且抗原在血液中存在的时间较长。
血清学检测是国内外公认的临床诊断较为可靠的指标之一，目前，常用的登革热抗原、抗体检测方法有：ELISA法和PCR法、胶体金法。ELISA法和PCR法，这些检测技术需要特殊的仪器设备，并且要求专业技术人员在专业的实验室进行检测，并且操作繁琐、技术难度大、耗时长、实验条件要求高、并存在严重的生物安全问题，不适宜于现场即时检测，适宜作为确证方法，但不能进行大范围初筛，在实际工作中进行推广应用。胶体金法有单独的IgG/IgM抗体、NS1抗原检测试剂，特异性IgM抗体，表明有近期感染的发生，但IgM的检测阴性并不能证明机体未受到感染，还需要检测半衰期较长，含量最高的特异性IgG抗体，以明确诊断。另外，机体感染后，最先出现的是NS1抗原，所以特异性IgM、IgG抗体以及NS1抗原的同时检测，可以有效诊断机体对特定病原体的免疫应答反应状态，登革热病毒潜伏期长，亟待有高灵敏度、高特异性的登革热IgM/IgG抗体、NS1抗原胶体金法联合检测试剂的出现。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对以上不足，提供一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条检测灵敏度高、特异性好，这种抗原抗体联合检测试纸条可以在登革热感染早期、初次感染及二次或多次感染登革热的病人进行快速早期诊断及筛查，缩短窗口期，提高检出率。
还提供一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测卡，这种检测卡操作方便、简单、加样量少、实效性强，其使用便捷、操作简单，检测卡设计独特，不仅可以实现NS1抗原、IgG/IgM抗体血清/血浆/全血两联检，还特别针对IgG/IgM抗体检测全血，不仅可以改变抗原抗体的反应顺序，增加检出率，还可以实现过滤红细胞的功能，达到既可检测血清、血浆，又可同时检测全血。
还提供一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试剂盒，携带方便，操作简单，便于现场即时检测，能进行大范围初筛。
为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括第一金标垫层和第一硝酸纤维素膜，第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线，登革热IgG/IgM抗体试纸条包括第二金标垫层和第二硝酸纤维素膜，第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2。
试纸条其中NS1抗原检测中其第一硝酸纤维素膜上包被四个血清型混合的单克隆抗体；第二金标垫层的标记为登革热抗体，其中第二金标垫层包括登革热四个血清型的重组抗原按照一定比例混合后涂布完成，这就涵盖了登革热所有的血清型，减少了不同血清型的漏检，实现了登革热感染早期、初次感染及二次或多次感染登革热的病人进行快速早期诊断及筛查，缩短窗口期，更有利于提高检出率。
第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线，较单一的血清型的登革热NS1单克隆抗体包被，四个血清型按照一定比例混合包被，此混合包被目的是防止不同血清型的漏检，加大了其检出率。
作为一种优化方案，登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入登革热NS1单克隆抗体，充分反应后，以5000~8000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应10~20min，制得登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物。
作为一种优化方案，第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单克隆抗体的检测线包被方法如下：
检测线以四个血清型的登革热NS1单克隆抗体，按照2：1：1：1的比例混合，以1.0~1.2mg/mL的浓度，质控线羊抗鼠IgG以1.0~ 1.5mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%~4%的蔗糖，包被于第一硝酸纤维素膜上，并干燥。
作为一种优化方案，登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，先将登革热四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的重组抗原按照5：1：1：1的比例混合，在金溶胶中按照15~20μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原，充分反应后，以7000~10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应20~30min，制得登革热重组抗原-胶体金复合物。
作为一种优化方案，第二金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物。
作为一种优化方案，鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物。
鸡IgY抗体的选择，与哺乳动物免疫球蛋白（如类风湿因子、自身抗体）之间不会发生血清学交叉反应，避免了假阳性的产生。
作为一种优化方案，第二硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线，第二硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2、羊抗鸡IgY抗体的质控线包被方法如下：
鼠抗人IgG抗体以1.0~1.5mg/mL浓度、鼠抗人IgM 抗体以2.0~2.2mg/mL浓度，质控线山羊抗鸡IgY抗体以2.0~ 2.2mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%~3%的蔗糖，包被于第二硝酸纤维素膜上，并干燥。
作为一种优化方案，登革热IgG/IgM抗体试纸条还包括样品垫层，第二硝酸纤维素膜和样品垫层之间设置有可粘贴的滤血垫层。
一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测卡，检测卡的一侧设置有NS1抗原检测卡槽，检测卡的另一侧设置有IgG/IgM抗体检测卡槽，NS1抗原检测卡槽内设置有登革热NS1抗原试纸条，IgG/IgM抗体检测卡槽内设置有登革热IgG/IgM抗体试纸条，检测卡下端对应NS1抗原检测卡槽位置处设置有第一加样孔，检测卡中部对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有第二加样孔，检测卡下端对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有样本稀释液加入孔。
一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试剂盒，试剂盒包上述的检测卡和样本稀释液。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：
1、登革热病毒检测目前无IgM/IgG抗体、NS1抗原联合检测的诊断试纸条及检测卡，本发明试纸条及检测卡一次操作即可联合检测IgM/IgG抗体、NS1抗原，简化了操作过程，有效地显示了机体免疫应答反应状态，达到真正的POCT检测的目的。
2、试纸条采用多抗原标记或多抗体包被的形式，通过“标记四个血清型的重组抗原”的方式制备第二金标垫层，以及“包被四个血清型的单克隆抗体”的方式包被于第一硝酸素纤维素膜上，相比单一的标记重组抗原及单一的单克隆抗体包被技术，最大限度的提高了试剂的灵敏度，增加了其检出率，减少了由于登革热病毒潜伏期长带来的隐形传播风险。联合检测不仅可以减少潜伏期带来的隐形传播风险，缩短窗口期，有效控制疫情的大规模传播；而且在板块设计及操作上，操作方便、简单，对于登革热IgM/IgG抗体检测的操作还可以改变待测物的结合反应顺序，更好的特异性识别、检测登革热IgM/IgG抗体。
3、样品垫与第二硝酸纤维素膜之间增加一种可粘贴的滤血垫层，本发明的检测卡设置有第二加样孔和样本稀释液加入孔，滤血垫层位于第二加样孔和样本稀释液加入孔之间，固定于硝酸纤维素膜上，在此滤血垫上方，也就是第二加样孔加样，样本往上层析；此滤血垫可以防止样本往下渗出，而先与金标记物反应，此检测卡设计目的不仅可以改变抗原抗体的反应顺序，增加抗体的检出率，还可以实现过滤红细胞的功能，达到既可检测血清、血浆，又可同时检测全血。
4、本发明试纸条采用“山羊抗鸡IgY抗体-鸡IgY抗体” 干扰最小的配对作为质控体系，将质控系统对检测体系的干扰降至最低，显著提高了试剂的特异性。
鸡IgY较常见的羊IgG或兔IgG，种系距离相差大，与哺乳动物免疫球蛋白（如类风湿因子、自身抗体）之间不会发生交叉血清学反应，避免了假阳性的产生。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第一金标垫层、第一硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第一金标垫层一端0.5~1mm，第一金标垫层另一端压住第一硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第一硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第一硝酸纤维素膜，在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的第一金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
登革热IgG/IgM抗体试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第二金标垫层、第二硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第二金标垫层一端0.5~1.0mm，第二金标垫层另一端压住第二硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第二硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第二硝酸纤维素膜，在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，第二硝酸纤维素膜和样品垫层之间设置有可粘贴的滤血垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
样品垫处理液处理样品垫，按照以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.06g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PEG2000、5gBSA、2mL吐温20、0.2mL曲拉通X-100、1g抗RBC单抗，HCL调节pH至8.5，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按10μg/mL比例缓慢加入登革热NS1单克隆抗体，充分反应后，以5000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应10min，制得登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物。
第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单克隆抗体的检测线包被方法如下：
检测线以四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的登革热NS1单克隆抗体，按照2：1：1：1的比例混合，以1.0mg/mL的浓度，质控线羊抗鼠IgG以1.0mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%的蔗糖，包被于第一硝酸纤维素膜上，并干燥。
第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2。
登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，先将登革热四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的重组抗原按照5：1：1：1的比例混合，在50mL金溶胶中按照15μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原，充分反应后，以10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应20min，制得登革热重组抗原-胶体金复合物。
第二金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物，鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
在10mL金溶胶中按10μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以9000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物。
使用上述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取47mL复溶后胶体金标记物（含5.64mL胶体金标记的登革热重组抗原-胶体金复合物和1.88mL胶体金标记的鸡IgY抗体-胶体金复合物）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥10小时，干燥保存备用。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物按20%浓度，登革热重组抗原-胶体金复合物按12%浓度，鸡IgY抗体-胶体金复合物按4%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
第二硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线，第二硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体、的检测线T2、山羊抗鸡IgY抗体的质控线包被方法如下：
登革热IgG/IgM抗体的硝酸纤维素膜包被有1.0mg/mL浓度鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被有2.0mg/mL浓度鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2，质控线包被有2.0mg/mL浓度的山羊抗鸡IgY抗体，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%的蔗糖；包被于第二硝酸纤维素膜上，37℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例2：一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第一金标垫层、第一硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第一金标垫层一端0.5~1.0mm，第一金标垫层另一端压住第一硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第一硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第一硝酸纤维素膜，在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的第一金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
登革热IgG/IgM抗体试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第二金标垫层、第二硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第二金标垫层一端0.5~1.0mm，第二金标垫层另一端压住第二硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第二硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第二硝酸纤维素膜，在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，第二硝酸纤维素膜和样品垫层之间设置有可粘贴的滤血垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
样品垫处理液处理样品垫，按照以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.06g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PEG2000、5gBSA、2mL吐温20、0.2mL曲拉通X-100、1g抗RBC单抗，HCL调节pH至8.5，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按13μg/mL比例缓慢加入登革热NS1单克隆抗体，充分反应后，以7000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应15min，制得登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物。
第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单克隆抗体的检测线包被方法如下：
检测线以四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的登革热NS1单克隆抗体，按照2：1：1：1的比例混合，以1.1mg/mL的浓度，质控线羊抗鼠IgG以1.3mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入3%的蔗糖，包被于第一硝酸纤维素膜上，并干燥。
第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2。
登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，先将登革热四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的重组抗原按照5：1：1：1的比例混合，在50mL金溶胶中按照18μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原，充分反应后，以7000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应25min，制得登革热重组抗原-胶体金复合物。
第二金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物，鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
在10mL金溶胶中按12μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以8000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物。
使用上述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取47mL复溶后胶体金标记物（含5.64mL胶体金标记的登革热重组抗原-胶体金复合物和1.88mL胶体金标记的鸡IgY抗体-胶体金复合物）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥10小时，干燥保存备用。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物按25%浓度，登革热重组抗原-胶体金复合物按15%浓度，鸡IgY抗体-胶体金复合物按5%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
第二硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线，第二硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2、山羊抗鸡IgY抗体的质控线包被方法如下：
登革热IgG/IgM抗体的硝酸纤维素膜包被有1.3mg/mL浓度鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被有2.1mg/mL浓度鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2，质控线包被有2.1mg/mL浓度的山羊抗鸡IgY抗体，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2.5%的蔗糖；包被于第二硝酸纤维素膜上，37℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例3：一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第一金标垫层、第一硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第一金标垫层一端0.5~1.0mm，第一金标垫层另一端压住第一硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第一硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第一硝酸纤维素膜，在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第一硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的第一金标垫层及样品垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
登革热IgG/IgM抗体试纸条包括底板，底板为PVC板，底板上粘贴有依次搭接的样品垫层、第二金标垫层、第二硝酸纤维素膜和吸水层，吸水层为吸水纸，样品垫层一端压住第二金标垫层一端0.5~1.0mm，第二金标垫层另一端压住第二硝酸纤维素膜一端0.5~1.0mm，吸水层的一端压住第二硝酸纤维素膜另一端0.5~1.0mm，在底板的中间位置粘贴制备的第二硝酸纤维素膜，在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的上方粘贴吸水层；在底板固定第二硝酸纤维素膜位置的下方粘贴制备的金标垫层及样品垫层，第二硝酸纤维素膜和样品垫层之间设置有可粘贴的滤血垫层，将上述步骤得到的产品压平整后，切成4.0mm宽的试纸条。
样品垫处理液处理样品垫，按照以下配方配制1L样品垫处理液：称取6.06g Tris，超纯水900mL溶解，依次加入5g大分子聚合物PEG2000、5gBSA、2mL吐温20、0.2mL曲拉通X-100、1g抗RBC单抗，HCL调节pH至8.5，超纯水定容至1L。
使用配置好的样品垫处理液处理样品垫：每张30cm×25cm的样品垫，用50mL处理液均匀涂布后置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥12小时，干燥保存备用。
第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按15μg/mL比例缓慢加入登革热NS1单克隆抗体，充分反应后，以8000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应20min，制得登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物。
第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单克隆抗体的检测线包被方法如下：
检测线以四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的登革热NS1单克隆抗体，按照2：1：1：1的比例混合，以1.2mg/mL的浓度，质控线羊抗鼠IgG以1.5mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入4%的蔗糖，包被于第一硝酸纤维素膜上，并干燥。
第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2。
登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，先将登革热四个血清型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）的重组抗原按照5：1：1：1的比例混合，在50mL金溶胶中按照20μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原，充分反应后，以9000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应30min，制得登革热重组抗原-胶体金复合物。
第二金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物，鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
在10mL金溶胶中按15μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物。
使用上述金标液处理金标垫：取玻璃纤维放入不锈钢盘，量取47mL复溶后胶体金标记物（含5.64mL胶体金标记的登革热重组抗原-胶体金复合物和1.88mL胶体金标记的鸡IgY抗体-胶体金复合物）倒入不锈钢盘，使金溶液完全均匀吸收，置于37℃电热鼓风干燥箱中干燥10小时，干燥保存备用。
登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物按22%浓度，登革热重组抗原-胶体金复合物按14%浓度，鸡IgY抗体-胶体金复合物按4.5%浓度，涂布于玻璃纤维素膜上，干燥。
第二硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线，第二硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2、山羊抗鸡IgY抗体的质控线包被方法如下：
登革热IgG/IgM抗体的硝酸纤维素膜包被有1.5mg/mL浓度鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、包被有2.2mg/mL浓度鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2，质控线包被有2.2mg/mL浓度的山羊抗鸡IgY抗体，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入3%的蔗糖；包被于第二硝酸纤维素膜上，37℃电热鼓风干燥箱中干燥2小时，干燥保存备用。
实施例4：一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测卡，检测卡的一侧设置有NS1抗原检测卡槽，检测卡的另一侧设置有IgG/IgM抗体检测卡槽，NS1抗原检测卡槽内设置有登革热NS1抗原试纸条，IgG/IgM抗体检测卡槽内设置有登革热IgG/IgM抗体试纸条，检测卡下端对应NS1抗原检测卡槽位置处设置有第一加样孔，检测卡中部对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有第二加样孔，检测卡下端对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有样本稀释液加入孔，第二加样孔为S孔，样本稀释液加入孔为D孔，在检测卡的中部S孔处加样，在检测卡下端D孔加样本稀释液，实现全血、血清、血浆的同时检测。
实施例5：登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测卡，检测卡包括登革热NS1抗原检测卡和登革热IgG/IgM抗体检测卡，两个检测卡均为独立的检测卡，并可组合到同一个卡槽中作为联检检测卡使用；登革热NS1抗原检测卡下端S孔为第一加样孔，直接加样，观察结果；登革热IgG/IgM抗体检测卡中在上端为S孔，为第二加样孔，下端为D孔为样本稀释液加入孔，在S孔与D孔之间、样品垫与硝酸纤维素膜之间增加一种可粘贴的滤血垫层，固定于硝酸纤维素膜上，在此滤血垫层上方，也就是S孔加样，样本往上层析；此滤血垫层可以防止样本往下渗出，而先与金标记物反应。
实施例6：登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试剂盒，试剂盒包括检测卡和样本稀释液，样本稀释液由牛血清白蛋白BSA、吐温20以及防腐剂配制而成。
实施例7：登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体的检测方法，检测方法如下：
（1）检测
1）检测样本为血清、血浆、全血；
2）登革热IgG/IgM抗体：取血清、血浆、全血25µL，加入到检测卡的第二加样孔，随即滴加2滴样本稀释液；
登革热NS1抗原：取血清、血浆80~100µL，全血80µL，加入到检测卡的第一加样孔，全血样本需滴加2滴样本稀释液，15min观察结果，20min后结果无效；
（2）结果判断
阴性：
1）仅质控线C处出现一条红色条带，在登革热IgG/IgM抗体试纸条的检测线T1、检测线T2处无红色条带出现，表明登革热IgG/IgM抗体均为阴性结果，样本中不含待测抗体；
2）在登革热NS1抗原试纸条的检测线T处无红色条带出现，表明登革热NS1抗原为阴性结果，样本中不含待测抗原；
3）两个试纸条在T线处均未出现红色条带，表明两个试纸条均为阴性结果，样本中不含待测抗原及待测抗体；
阳性：
1）登革热IgG/IgM抗体试纸条：三条红色条带出现，两条红色条带分别出现于检测线T1、检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中同时含有登革热 IgG、IgM抗体；
2）登革热IgG/IgM抗体试纸条：两条红色条带出现，一条红色条带出现于检测线T1处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有登革热 IgG抗体；
3）登革热IgG/IgM抗体试纸条：两条红色条带出现，一条红色条带出现于检测线T2处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有登革热 IgM抗体；
4）登革热NS1抗原试纸条：两条红色条带出现，一条红色条带出现于检测线T处，另一条红色条带出现于质控线C处，阳性结果表明：样本中含有登革热NS1抗原；
无效：
质控线C处未出现红色条带，表明操作失误或试剂失效。
本发明的检测方法，步骤简单，可操作性强，可以快速、便捷的实现登革热病毒IgM/IgG抗体、NS1抗原的联合检测。可以在登革热感染早期、初次感染及二次或多次感染登革热的病人进行快速早期诊断及筛查，缩短窗口期，该方法使用样本量少、可操作性强、耗时短，可在20min内得到检测结果。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：试纸条包括登革热NS1抗原试纸条和登革热IgG/IgM抗体试纸条，登革热NS1抗原试纸条包括第一金标垫层和第一硝酸纤维素膜，第一金标垫层固相化有登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物，第一硝酸纤维素膜包被有四个血清型的登革热NS1单克隆抗体的检测线，登革热IgG/IgM抗体试纸条包括第二金标垫层和第二硝酸纤维素膜，第二金标垫层固相化有四个血清型的登革热重组抗原-胶体金复合物，第二硝酸纤维素膜包被有鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2；
第一硝酸纤维素膜上的四个血清型登革热NS1单克隆抗体的检测线包被方法如下：
检测线以四个血清型的登革热NS1单克隆抗体，按照2：1：1：1的比例混合，以1.0~1.2mg/mL的浓度，质控线羊抗鼠IgG以1.0~ 1.5mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%~4%的蔗糖，包被于第一硝酸纤维素膜上，并干燥；
登革热重组抗原-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，先将登革热四个血清型的重组抗原按照5：1：1：1的比例混合，在金溶胶中按照15~20μg/mL比例缓慢加入混合后的登革热重组抗原，充分反应后，以7000~10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应20~30min，制得登革热重组抗原-胶体金复合物。
2.如权利要求1的登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入登革热NS1单克隆抗体，充分反应后，以5000~8000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，静置反应10~20min，制得登革热NS1单克隆抗体-胶体金复合物。
3.如权利要求1的登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：第二金标垫层还固相化有羊IgG抗体-胶体金复合物或兔IgG抗体-胶体金复合物或鸡IgY抗体-胶体金复合物。
4.如权利要求3的登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：鸡IgY抗体-胶体金复合物的制备方法如下：
在金溶胶中按10~15μg/mL比例缓慢加入鸡IgY抗体，充分反应后，以8000~10000rpm离心30min，弃上清，10倍浓缩，制得鸡IgY抗体-胶体金复合物。
5.如权利要求1的登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：第二硝酸纤维素膜还包被有兔抗羊IgG抗体或羊抗兔IgG抗体或山羊抗鸡IgY抗体的质控线，第二硝酸纤维素膜上的鼠抗人IgG单克隆抗体的检测线T1、鼠抗人IgM单克隆抗体的检测线T2、山羊抗鸡IgY抗体的质控线包被方法如下：
鼠抗人IgG抗体以1.0~1.5mg/mL浓度、鼠抗人IgM 抗体以2.0~2.2mg/mL浓度，质控线山羊抗鸡IgY抗体以2.0~ 2.2mg/mL浓度，均用10mmoL的PBS缓冲液进行稀释，并加入2%~3%的蔗糖，包被于第二硝酸纤维素膜上，并干燥。
6.如权利要求1的登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试纸条，其特征在于：登革热IgG/IgM抗体试纸条还包括样品垫层，第二硝酸纤维素膜和样品垫层之间设置有可粘贴的滤血垫层。
7.一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测卡，其特征在于：检测卡的一侧设置有NS1抗原检测卡槽，检测卡的另一侧设置有IgG/IgM抗体检测卡槽，NS1抗原检测卡槽内设置有如权利要求1-6任一项的登革热NS1抗原试纸条，IgG/IgM抗体检测卡槽内设置有如权利要求1-6任一项的登革热IgG/IgM抗体试纸条，检测卡下端对应NS1抗原检测卡槽位置处设置有第一加样孔，检测卡中部对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有第二加样孔，检测卡下端对应IgG/IgM抗体检测卡槽位置处设置有样本稀释液加入孔。
8.一种登革热NS1抗原、IgG/IgM抗体两联检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括如权利要求7的检测卡和样本稀释液。
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