CN112335581A - 一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法 - Google Patents
一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法，该方法包括亲鱼培育、强化促熟培育、亲鱼选择、雌性亲鱼的催产、精子溶液制备、卵子收集、人工授精，通过该方法制备的受精卵经显微注射后，孵化率超过80％。本发明还提供了促进斑点叉尾鮰雌性亲鱼排卵的催产剂及其剂量，注射催产剂后可促进雌性亲鱼产卵并可实现人工取卵。根据本发明制备的斑点叉尾鮰受精卵可以保证其同步的发育，满足基因敲除、过表达等研究需要。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类的催产及人工授精方法，特别是涉及一种用于斑点叉尾鮰基因敲除 和过表达研究的受精卵制备方法。
背景技术
显微注射是分子和细胞生物学研究的一种常用实验技术，其主要通过毛细玻璃管将 微量物质(如DNA、RNA、蛋白质和其他大分子)输送到细胞或胚胎中。显微注射技 术已经被研究人员用于基因敲除、过表达和修饰等研究中。在对各种生物进行基因敲除、 过表达研究时一般需要在受精卵1细胞阶段开展显微注射，因而获得同步的受精卵则十 分关键。
斑点叉尾鮰鱼卵为粘性卵，数以万计的鱼卵黏着成较厚的卵块，且受精后胚胎发育 也不同步，不利于开展显微注射实验。尽管国内外已有多篇文献关于斑点叉尾鮰人工催产技术研究，但这些文献中亲鱼催产后均用于提高自然产卵率，使用文献中的催产剂和 剂量注射后并不能实现人工挤卵和人工授精。本发明的目的在于提供一种用于斑点叉尾 鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，使用该方法可保证受精卵保持同步受精， 且单层排列。本发明同时还提供了促使斑点叉尾鮰雌性亲鱼排卵的催产剂和注射剂量， 根据本发明提供的催产剂组分、剂量及注射方法，可以实现人工挤卵，完成人工授精。 根据本发明制备的斑点叉尾鮰受精卵可以保证其处于相同的发育阶段，满足基因编辑、 过表达等研究。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰基因 敲除和过表达研究的受精卵及其制备方法。
技术方案：为实现上述目的，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研 究的受精卵制备方法，其包括，(1)亲鱼培育：由G2代家系苗种培育至4龄获得亲鱼； (2)强化促熟培育：4龄亲鱼繁殖前3个月开始强化促熟培育，饲喂时补充卵磷脂及复 合维生素；(3)亲鱼选择：选择健康且第二性征清晰可辨的雌、雄亲鱼，所选雌鱼置 于自制产卵袋内；(4)雌性亲鱼的催产：雌性亲鱼注射催产素，促进排卵；(5)制备 精子溶液：雄性亲鱼麻醉后解剖，采集精巢组织制备精子溶液；(6)收集卵子：雌性 亲鱼麻醉后在其泄殖孔及腹鳍周围涂上一层植物起酥油，轻轻挤压雌性亲鱼腹部，卵子 收集于事先涂布植物性起酥油的培养皿中；(7)人工授精：向卵子表面加入适量精子 溶液，使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌，加入更多的淡水浸没卵子，使已受精的卵子 保持坚挺10～15min，即为可用于斑点叉尾鮰基因敲除、过表达研究的受精卵。
优选的，步骤(1)中，所述G2代家系苗种是由德克萨斯群体、阿肯色群体、密西 西比群体、阿肯色群体、阿肯色群体中的一种或几种，通过逐代定向构建、培育而成。
优选的，步骤(4)中，所述催产素包括绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2、多潘立酮(中的一种或几种。
优选的，步骤(4)中，所述雌性亲鱼的催产，其为采用三针法，注射剂量以亲鱼 体重计，第一针：促黄体素释放激素A2 50ug/kg；第二针：促黄体素释放激素A2 6 ug/kg、多潘立酮3mg/kg、绒毛膜促性腺激素500IU/kg；第三针：促黄体素释放激素 A2 3ug/kg、多潘立酮1.5mg/kg、绒毛膜促性腺激素250IU/kg，注射时间间隔为12 h。
优选的，步骤(4)中，所述雌性亲鱼注射催产素，其完成后放回水池，在水温20～25℃条件下，效应时间为14～20h。
优选的，步骤(3)中，所述自制产卵袋的规格为100cm×30cm，网眼大小为3mm， 材料为软质尼龙网。
优选的，步骤(5)和步骤(6)中，所述麻醉，其使用的麻醉剂为0.1％的3-氨基 苯甲酸乙酯甲基磺酸盐。
优选的，步骤(7)中，经淡水浸没后获得的卵子能够同步受精和发育。
作为本发明的另一方面，本发明提供一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的 受精卵，其特征在于：所述受精卵经显微注射后，其孵化率超过80％。
优选的，所述显微注射必须在90min内完成。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：
(1)提供了用于雌性亲鱼催产的催产剂组分、剂量及注射方法，经催产处理后的雌性亲本可以采用人工挤卵的方式采集卵子，完成人工授精；
(2)通过人工授精方式制备的斑点叉尾鮰受精卵具有同步的胚胎发育过程，研究人员可以精确地掌握其胚胎发育时期；
(3)根据本发明说明书制备的斑点叉尾鮰受精卵可以用于基因编辑、过表达等研究，经显微注射后的受精卵具有较高的孵化率。
具体实施方式
下面对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，包括以下步骤：
(1)亲鱼培育
本实验所用斑点叉尾鮰亲鱼均来自于江苏省淡水水产研究所扬中试验基地。1997～ 2004年从美国引进德克萨斯(1997)群体、阿肯色(1999)群体、密西西比(2001)群 体、阿肯色(2003)群体和阿肯色(2004)群体405尾建立育种基础群体，利用基础群 体进行G0代家系构建。2013年6月利用G0代家系构建G1代家系，2017年利用G1代 家系亲本构建G2代家系。本实验所用亲本由G2代家系苗种培育而成，为了减小环境对 斑点叉尾鮰生长的影响，家系培育按照同一标准进行，即均一的换水速率(每10d换一 次水，换水量为水体的1/3)、投喂量(每日早晚各饲喂1次，投喂量为鱼体重的1％～ 3％，每10d调整一次投喂量)、养殖密度(20尾/m2)及充氧量(5mg/L～8mg/L)。 待到各家系平均日龄150d时，进行PIT电子标记注射以区分不同家系和身份。此后， 各家系混合养殖，养殖密度为1000尾/亩。用人工膨化颗粒饲料进行投喂，人工膨化颗 粒饲料粗蛋白质含量≥32％、粗脂肪≥6％、粗纤维≤4％、灰分≤14％，日投喂人工膨化 颗粒饲料2次，日投喂量为鱼体重的3％左右，实际投喂量根据天气、水温等条件做调 整，随着鱼苗长大，根据鱼体大小调整投喂饲料规格，包括粒径大小和各组分的含量； 同时加强苗种养殖的日常管理和水质调控，做好病害防治工作。亲鱼养殖至4龄时即可 进行催熟和繁殖。
(2)亲鱼的强化促熟培育
在4龄亲鱼繁殖前3个月开始进行强化促熟培育，每日投喂喷涂卵磷脂的饲料和冰鲜杂鱼饵料。冰鲜杂鱼饵料每日早上投喂1次，日投喂量为鱼体重的1％～3％，并根据 冰鲜饵料重量按2g/kg加入复合维生素。含卵磷脂的膨化饲料每日下午投喂一次，日投 喂量为鱼体重的1％～3％，饲料粗蛋白质含量≥40％、粗脂肪≥6％、粗纤维≤4％、灰分 ≤14％。实际投喂量根据天气、水温等条件进行适当调节，以免投喂过多饵料。投喂冰 鲜杂鱼饵料极易坏水，为了使亲鱼促熟强化培育环节具有良好的水质条件，需要定期换 水，换水量约为池塘总水量的1/3，同时喷洒相关改底生物制剂改良水质。
(3)亲鱼的选择
从各家系中选择健康斑点叉尾鮰亲鱼，并确保所选雌、雄亲鱼间无亲缘关系，雌、雄亲鱼应该具有清晰可辨的第二性征。亲鱼的选择按照以下标准进行：雄鱼体色暗黑、 头部比身体其它部位更为宽阔；雌鱼具有柔软和丰满的腹部，头部比身体其他部位狭窄。 雄鱼体重介于3～4kg，雌鱼体重介于2～3kg。挑选亲鱼时切勿动作过大，以免对其造 成应激，亲鱼挑选前停止喂食2～3d。
本实验挑选不同家系雄性亲鱼3尾，雌性亲鱼18尾。雌性亲鱼置于自制产卵袋(100cm×30cm，网眼大小为3mm，材料为软质尼龙网)中，把装有雌性亲鱼的产卵袋放入 盛满水的水池(3m×1m×0.5m)中，方便后续注射催产剂和排卵观察。产卵袋口固定 在水池边缘，保持水池处于微流水状态并具有充足的氧气。雄性亲鱼置于水池中即可， 无需放入产卵袋中。
(4)雌性亲鱼的催产
在雌性亲鱼催产前，称量并记录每尾鱼的重量。催产剂由催产素与质量分数为0.9％ 的NaCl溶液配制而成，催产素包括绒毛膜促性腺激素(HCG)、促黄体素释放激素A2(LHRH-A2)、多潘立酮(Dom)(宁波第二激素厂)。催产剂在注射前即按亲鱼的体 重配置好，每条鱼1管，现配现用。在胸鳍基部注射催产剂，注射的深度为0.5～0.6cm， 胸鳍基部在注射前使用0.9％的NaCl(上海国药集团化学试剂有限公司)溶液进行擦拭， 注射结束后使用75％的酒精溶液擦拭伤口。人工催产采用三针法，每针注射的时间间距 为12h，设置两个剂量组，各剂量组试验亲鱼均为9尾。第一个剂量组为：第一针， LHRH-A2 50ug/kg；第二针，LHRH-A2 6ug/kg、Dom 3mg/kg、HCG 500IU/kg；第三针， 各催产素剂量为第二针的一半(即LHRH-A2 3ug/kg、Dom 1.5mg/kg、HCG 250IU/kg)。 第二个剂量组为：第一针，LHRH-A2100ug/kg；第二针，LHRH-A2 12ug/kg、Dom 6 mg/kg、HCG 1000IU/kg；第三针，各催产素剂量为第二针的一半(即LHRH-A2 6ug/kg、 Dom 3mg/kg、HCG 500IU/kg)。第二针催产剂注射后6～8h可观察到雌性亲鱼的生殖 孔更为突出、红肿。注射催产剂后，将产卵袋放回水池，维持充足的氧气(约6mg/L 的溶解氧)和良好的水质以保证产出优质的卵子，在水温20～25℃条件下，效应时间为 14～20h，每尾雌性亲鱼注射量、效应时间及存活情况如表1所示。
(5)精子的采集
在雌鱼预产卵前即需准备好精子溶液。使用0.1％的3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐 (MS-222)对雄性亲鱼进行麻醉。雄性亲鱼麻醉后，解剖、采集精巢组织并称量计重， 量取50mL 0.9％NaCl溶液清洗表面粘附的血液，好的精巢组织呈须状且显乳白色。用 镊子将精巢组织转移至绢网(面积为100cm2，目数100)中，折叠绢网将精巢组织包 裹起来，在50mL离心管口不断挤压包裹的精巢组织以提取精子，同时用0.9％NaCl溶液冲洗绢网上粘附的精液至离心管中，NaCl溶液与精巢组织的最终体积质量比为10 mL/g。精子溶液4℃保存，24h内使用。
(6)卵子的采集
第三针催产剂注射后，每3h检查排卵情况，若发现产卵袋上附着的卵子超过10 颗即可开始进行人工挤卵。将雌鱼放入浓度为0.1％的MS-222(Merck公司，德国)进 行麻醉。挤卵前使用干净的毛巾擦拭雌性亲鱼，并在泄殖孔及腹鳍周围涂上一层植物起 酥油(Nutiva公司，美国)，以避免在挤卵时卵子黏附在泄殖孔或腹鳍上。轻轻挤压雌 性亲鱼腹部，卵子收集于事先涂布植物性起酥油的培养皿(150mm)中。好的卵子可 以自由滑动，颜色呈金黄色，无血凝块，卵粒直径为3～4mm，在受精前避免接触水， 因为水会刺激其卵膜孔关闭。本实验第一个剂量组共催产了9尾雌性亲鱼，其中有8尾 亲鱼在第三针注射后的12～20h内可以顺利挤出卵子，具体产卵时间如表1所示，说明 该组合为有效剂量；第二个剂量组中超过一半的亲鱼死亡，说明该组合的剂量不适合雌 性亲鱼催产。
表1雌性亲鱼催产剂注射及排卵情况记录表
注：+表示已排卵，-表示未排卵。
(7)人工授精
向卵子表面加入适量精子溶液，使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌，用量约为每100 颗卵子加1mL精子溶液。加入适量清水后，震荡30s，淡水环境会激发卵子和精子活 力。使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌使受精卵保持单层排列状态，加入适量的淡水浸 没卵子，使已受精的卵子保持坚挺10～15min。通过此方法获得的斑点叉尾鮰受精卵即 可用于显微注射实验。
(8)显微注射
在10cm无菌培养皿上涂上一层薄薄的植物起酥油，转移50-100个受精卵至培养皿中，使受精卵保持单层排列状态，吸取预先配置的Holtfreter溶液(100％)浸没受精 卵。将装有受精卵的培养皿放在显微镜下，一只手握住培养皿，另一只手轻轻控制显微 注射仪操作杆，使其以平滑的动作刺穿卵膜和卵黄。在输送注射液之前，毛细管针尖应 尽可能靠近胚盘。踩下踏板将注射液输送到靠近动物极的卵黄中。注射剂量因研究目的 的不同而有所不同，在基因编辑研究中，可注射30～50nL gRNA与Cas9混合液，且需 要为目的基因优化gRNA和Cas9蛋白注射量，以获得最佳的突变率。将完成显微注射 的受精卵放回Holtfreter溶液(100％)中，持续孵化6-7d。每天更换溶液，做好消毒 工作，消毒可使用100ppm的霉平溶液。
需要注意的是，显微注射实验必须在90min内完成，因为此时的受精卵正处于1 细胞阶段。未受精的卵子使用保鲜膜盖住以防止其干燥，人工授精可以错开进行，例如， 每15～30min可受精一批卵子，以确保具有充足的1细胞期受精卵用于显微注射实验。 使用本方案获得的斑点叉尾鮰受精卵经过显微注射实验后，孵化率均大于80％，说明本 方案制备的斑点叉尾鮰受精卵可以满足基因敲除和过表达等显微注射实验。
本发明采用定向家系构建技术制备斑点叉尾鮰家系育种群体，培育至4龄时开始进 行亲鱼的强化促熟培育，在进行人工授精前三个月饲喂喷涂卵磷脂的饲料和冰鲜鱼，进一步促进亲鱼性腺发育；选择体色暗黑、头部比身体其它部位更为宽阔的雄鱼；选择头 部比身体其他部位狭窄的雌鱼，并且具有丰满且柔软的腹部，生殖器红肿突出；将选择 的雌性亲鱼置于自制产卵袋，配置催产剂并注射，实现亲鱼的人工催产；选择的雄性亲 鱼麻醉后，解剖、采集精巢并称量计重，制备精子溶液，精子溶液4℃保存；经催产处 理后的雌性亲鱼麻醉后，采用人工挤卵的方式采集卵子；向采集的斑点叉尾鮰卵子表面 加入适量预制精子溶液，制备受精卵。
本发明使用的育种群体是由G1代斑点叉尾鮰育种群体通过定向家系构建技术繁育 而成。各家系苗种培育至平均日龄150d时，进行电子标记注射以区分不同家系和身份。携带电子标记的苗种在池塘中混合养殖，养殖密度为1000尾/亩。用人工膨化颗粒饲料 进行投喂，人工膨化颗粒饲料粗蛋白质含量≥32％、粗脂肪≥6％、粗纤维≤4％、灰分≤14％，日投喂人工膨化颗粒饲料2次，日投喂量为鱼体重的3％左右。
本发明中，所述强化培育的亲鱼为4龄鱼，强化促熟培育从三月份开始，持续时间为3个月，养殖过程投喂喷涂卵磷脂的饲料和冰鲜杂鱼饵料。冰鲜杂鱼饵料每日早上投 喂1次，日投喂量为鱼体重的8％～10％，并根据冰鲜饵料重量按2g/kg加入复合维生 素。含卵磷脂的膨化饲料每日下午投喂一次，日投喂量为鱼体重的10％～15％，饲料粗 蛋白质含量≥40％、粗脂肪≥6％、粗纤维≤4％、灰分≤14％。
本发明中，所述雌、雄亲鱼要求体格健壮、无伤病、肥满度好、活动力强，雄性亲 鱼体色暗黑、头部一般比身体其它部位更为宽阔；雌性亲鱼头部一般比身体狭窄，并且 具有柔软和丰满的腹部，生殖器红肿突出。所选亲鱼，雄性体重介于3～4kg，雌性亲 鱼体重介于2～3kg。
本发明人工催产采用三针法进行，注射时间间距为12h。第一针：LHRH-A2 50 ug/kg；第二针：LHRH-A2 6ug/kg、Dom 3mg/kg、HCG 500IU/kg；第三针各催产素剂 量为第二针的一半，以鱼体体重计。催产剂注射采用胸鳍基部注射方式进行，注射的深 度为0.5～0.6cm。胸鳍基部在注射前使用0.9％的NaCl溶液进行擦拭，注射结束后使用 75％的酒精溶液擦拭。注射催产剂后，保持池水溶氧充足、周围环境安静；在水温20～ 25℃条件下，效应时间为14～20h。
本发明中，所述雌、雄性亲鱼的麻醉策略为将鱼体浸没于含0.1％MS-222水中约30～60s。采集精巢组织后称量计重，用50mL 0.9％NaCl溶液清洗表面粘附的血液。 精子的采集主要通过挤压精巢组织来实现，主要过程为：将精巢组织置于大小为100cm2的100目绢网中，包裹后在50mL离心管口不断挤压。精子溶液由0.9％NaCl溶液稀释 而成，NaCl溶液与精巢组织最终体积质量比为10mL/g。
人工挤卵前，在泄殖孔和腹鳍周围涂上一层植物起酥油，防止卵子粘附。人工挤卵主要是通过轻轻挤压雌性亲鱼腹部，使其排出卵子，卵子收集于事先涂布植物性起酥油 的培养皿中。所述精子溶液用量约为每100颗卵子加1mL精子溶液。加入适量清水后， 震荡30s，并使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌使受精卵保持单层排列状态，加入更多 的淡水浸没受精卵，使已受精的卵子保持坚挺10～15min。所获得的斑点叉尾鮰受精卵 可以开展显微注射，用于基因编辑和过表达等研究。
本发明提供了一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，包括 以下步骤：亲鱼家系培育、亲鱼的强化促熟培育、亲鱼的选择、雌性亲鱼的催产、精子 的采集、卵子的采集、人工授精。本发明提供了促进斑点叉尾鮰雌性亲鱼排卵的催产剂 及其剂量，可以实现人工取卵。根据本发明制备的斑点叉尾鮰受精卵可以保证其处于相 同的发育阶段，满足基因编辑和过表达等实验需要。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：包括，
(1)亲鱼培育：由G2代家系苗种培育至4龄获得亲鱼；
(2)强化促熟培育：4龄亲鱼繁殖前3个月开始强化促熟培育，饲喂时补充卵磷脂及复合维生素；
(3)亲鱼选择：选择健康且第二性征清晰可辨的雌、雄亲鱼，所选雌鱼置于自制产卵袋内；
(4)雌性亲鱼的催产：雌性亲鱼注射催产素，促进排卵；
(5)制备精子溶液：雄性亲鱼麻醉后解剖，采集精巢组织制备精子溶液；
(6)收集卵子：雌性亲鱼麻醉后在其泄殖孔及腹鳍周围涂上一层植物起酥油，轻轻挤压雌性亲鱼腹部，卵子收集于事先涂布植物性起酥油的培养皿中；
(7)人工授精：向卵子表面加入适量精子溶液，使用涂布有起酥油的药匙轻轻搅拌，加入更多的淡水浸没卵子，使已受精的卵子保持坚挺10～15min，即为可用于斑点叉尾鮰基因敲除、过表达研究的受精卵。
2.如权利要求1所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述G2代家系苗种是由德克萨斯群体、阿肯色群体、密西西比群体、阿肯色群体、阿肯色群体中的一种或几种，通过逐代定向构建、培育而成。
3.如权利要求1所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述催产素包括绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2、多潘立酮(中的一种或几种。
4.如权利要求3所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述雌性亲鱼的催产，其为采用三针法，注射剂量以亲鱼体重计，第一针：促黄体素释放激素A2 50ug/kg；第二针：促黄体素释放激素A2 6ug/kg、多潘立酮3mg/kg、绒毛膜促性腺激素500IU/kg；第三针：促黄体素释放激素A2 3ug/kg、多潘立酮1.5mg/kg、绒毛膜促性腺激素250IU/kg，注射时间间隔为12h。
5.如权利要求4所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(4)中，所述雌性亲鱼注射催产素，其完成后放回水池，在水温20～25℃条件下，效应时间为14～20h。
6.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述自制产卵袋的规格为100cm×30cm，网眼大小为3mm，材料为软质尼龙网。
7.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(5)和步骤(6)中，所述麻醉，其使用的麻醉剂为0.1％的3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸盐。
8.如权利要求1～5任一项所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵制备方法，其特征在于：步骤(7)中，经淡水浸没后获得的卵子能够同步受精和发育。
9.一种用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵，其特征在于：所述受精卵经显微注射后，其孵化率超过80％。
10.如权利要求9所述的用于斑点叉尾鮰基因敲除和过表达研究的受精卵，其特征在于：所述显微注射必须在人工授精后90min内完成。
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