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CN112313331A - 用于测量aadc病毒载体效力的方法 - Google Patents

用于测量aadc病毒载体效力的方法 Download PDF

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CN112313331A
CN112313331A CN201980040265.5A CN201980040265A CN112313331A CN 112313331 A CN112313331 A CN 112313331A CN 201980040265 A CN201980040265 A CN 201980040265A CN 112313331 A CN112313331 A CN 112313331A
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L.M.德鲁因
P.斯塔雷曼斯
E.D.霍罗维茨
C.西亚托
J.莫姆贝卢尔
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Voyager Therapeutics Inc
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Abstract

本公开提出了与AADC病毒载体有关的改进的分析工具、系统和方法，包括用于测量和分析与AADC载体，例如腺相关病毒(AAV)AADC载体有关的AADC表达效力(即酶活性)的AADC效力测定。

Description

用于测量AADC病毒载体效力的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月27日提交的题为METHODS FOR MEASURING THE POTENCYOF AADC VIRAL VECTORS的美国临时专利申请No.62/663,958，以及2018年7月26日提交的题为METHODS FOR MEASURING THE POTENCY OF AADC VIRAL VECTORS的美国临时专利申请No.62/703,590，以及于2018年10月4日提交的题为METHODS FOR MEASURING THE POTENCYOF AADC VIRAL VECTORS的US 62/741,463的权益，其内容均通过引用整体并入本文。
参考序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。提供了名称为20571058PCT.txt的序列表文件，该文件创建于2019年4月26日，其大小为16,195字节。序列表的电子格式信息通过引用完整并入本文。
发明领域
本公开提出了与AADC病毒载体有关的改进的分析工具、系统和方法，包括用于测量和分析与AADC载体，例如腺相关病毒(AAV)AADC载体有关的AADC表达和生物效力(即酶活性)的AADC效力测定。
发明背景
帕金森氏病
芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)是负责多巴胺和血清素合成的同二聚体吡哆醛磷酸依赖性酶。编码的蛋白质催化L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA或左旋多巴)脱羧成多巴胺；L-5-羟色氨酸脱羧成血清素；以及L-色氨酸脱羧成色胺。此基因中的缺陷是芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症(AADCD)的原因，所述芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症是神经递质代谢中的先天性错误，导致组合的血清素和儿茶酚胺缺乏症，其导致严重的运动和自主神经功能障碍。
帕金森氏病(PD)是产生感觉和运动症状的中枢神经系统(CNS)的进行性神经变性性疾病。多巴胺替代(即左旋多巴)已成为PD中运动损伤的标准药物疗法。然而，多巴胺疗法的益处随着时间的流逝变得越来越不明显，部分原因是多巴胺生成细胞的逐步死亡和相应的AADC活性丧失。此外，高剂量多巴胺的系统性施用由于源自中脑边缘系统的多巴胺能刺激的副作用，如运动性能的波动、运动障碍和幻觉而变得复杂。恢复多巴胺能功能并使副作用最小化的一种策略是使用基因疗法将AADC直接递送至CNS的靶定的区域。
腺相关病毒(AAV)由于其长期的基因表达、在没有辅助病毒的情况下无法自主复制、转导分裂细胞和非分裂细胞的能力以及缺乏来自野生型感染的病原性而成为一种有吸引力的基因疗法载体(参见例如Hadaczek等人Mol.Ther.18(8),1458-1461,Aug.2010)。AAV是一种依赖于辅助物的DNA细小病毒，其属于依赖病毒属(Dependovirus)。
腺相关病毒(AAV)
AAV已经成为将基因转移到哺乳动物细胞中最广泛研究和利用的病毒载体之一。参见，例如，Tratschin等，Mol.Cell Biol.,5(11):3251-3260(1985)和Grimm等，Hum.GeneTher.,10(15):2445-2450(1999)，其内容通过引用整体并入本文。
腺相关病毒(AAV)载体是治疗性基因递送的有希望的候选者，并且在临床试验中已被证明是安全有效的。为此目的，改进的AAV颗粒的设计和生产是一个活跃的研究领域。
细小病毒科由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)和感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒和细小病毒科的其他成员通常在Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication,”第69章于FIELDS VIROLOGY(第3版1996)中进行描述，其内容通过引用整体并入。
依赖病毒包括能够在脊椎动物宿主中复制的腺相关病毒(AAV)的病毒科，所述宿主包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和绵羊物种。
AAV基因组是长度为约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA(ssDNA)分子。反向末端重复(ITR)位于非结构蛋白(由Rep基因编码)和结构蛋白(由壳体壳体基因或Cap基因编码)的编码核苷酸序列的侧翼。AAV基因组包括特征性的T形发夹结构，该结构由ssDNA的5'和3'端的自互补末端145nt定义，该自互补末端145nt形成能量稳定的双链区。双链发夹结构包括多种功能，包括但不限于通过作为宿主病毒生产细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物发挥功能来充当DNA复制的起点。
Rep基因编码调节功能的非结构蛋白，例如AAV基因组的复制。Rep78和Rep68通常从p5启动子转录，而Rep52和Rep40通常从p19启动子转录。
Cap基因编码组装形成病毒壳体壳体的结构蛋白VP1、VP2和/或VP3。通常从p40启动子转录Cap基因。AAV的壳体壳体蛋白通常使用从一个或更多个开放阅读框(ORF)表达的3种蛋白(VP1、VP2和VP3)组装成四面体形式。
发明概述
确定包括AADC在内的蛋白质表达的当前方法(例如AADC ELISA试剂盒)测量蛋白质浓度，其不是生物活性的直接指标。此外，这些方法可导致样品重复之间的变化性。因此，一直需要用于AADC病毒载体的改进的分析工具，包括用于测量AADC病毒载体效力的改进方法，该方法在各种样品重复中提供一致性。
本公开提供了与AADC病毒载体有关的改进的分析工具、系统和方法，包括用于测量和分析与AADC载体，例如腺相关病毒(AAV)AADC载体有关的AADC表达和生物效力(即酶活性)的AADC效力测定。
本公开提出了与AADC病毒载体有关的改进的分析工具、系统和方法，以及分析工具、系统和方法的改进的组合。在某些实施方案中，分析工具，系统和方法是AADC效力测定和用于测量AADC效力的方法。在某些实施方案中，AADC效力测定法测量AADC载体，例如病毒载体，例如腺相关病毒(AAV)载体的效力。在某些实施方案中，AADC效力测定法基于AADC酶促活性来测量AADC载体，例如病毒载体，例如AAV载体的效力。
在某些实施方案中，本文提供了一种用于测量AADC病毒载体效力的方法，该方法包括将L-DOPA添加至由用包含编码AADC的多核苷酸的病毒载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，并测量添加L-DOPA后细胞裂解物中产生的多巴胺的量。在另一个实施方案中，本文提供了一种用于测量AADC AAV载体效力的方法，该方法包括将L-DOPA添加至由用包含编码AADC的多核苷酸的AAV载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，并测量添加L-DOPA后细胞裂解物中产生的多巴胺的量。在某些实施方案中，AADC是人AADC。在某些实施方案中，AAV是AAV2。
本文还提供了一种用于测定AADC病毒载体效力的方法，所述方法包括将L-DOPA添加到由用包含编码AADC的多核苷酸的第一病毒载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，测量在添加L-DOPA之后所述细胞裂解物中产生的多巴胺的量，并将产生的多巴胺的量与利用病毒载体参考标准品时产生的多巴胺的量进行比较，从而确定第一病毒载体的相对效力。在某些实施方案中，本文提供了一种用于测定AADC AAV载体效力的方法，所述方法包括将L-DOPA添加到由用包含编码AADC的多核苷酸的第一AAV载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，测量在添加L-DOPA之后所述细胞裂解物中产生的多巴胺的量，并将产生的多巴胺的量与利用AAV载体参考标准品时产生的多巴胺的量进行比较，从而确定第一病毒载体的相对效力。在某些实施方案中，AADC是人AADC。在某些实施方案中，AAV是AAV2。
在一些实施方案中，通过将L-DOPA添加到由用包含编码AADC的多核苷酸的病毒(例如AAV)载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，并测量在添加L-DOPA之后所述细胞裂解物中产生的多巴胺的量，来确定由病毒(例如AAV)载体参考标准品产生的多巴胺的量。在某些实施方案中，AADC是人AADC。在某些实施方案中，AAV是AAV2。
在一些实施方案中，本文提出的测定法和方法中利用的细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞是人细胞。在具体的实施方案中，细胞是肉瘤细胞。在其他实施方案中，细胞是纤维肉瘤细胞。在某些实施方案中，细胞是原代细胞或原代细胞培养物。在某些实施方案中，细胞是细胞系。在具体的实施方案中，细胞是HT1080细胞。
在一些实施方案中，将细胞以1×102个细胞/孔至1×106个细胞/孔的密度铺板。在具体的实施方案中，将细胞以1×103个细胞/孔至1×106个细胞/孔的密度铺板。在具体的实施方案中，将细胞以1×103个细胞/孔至1×105个细胞/孔的密度铺板。在具体的实施方案中，将细胞以1-9×104个细胞/孔的密度铺板。在具体的实施方案中，将细胞以1-5×104个细胞/孔的密度铺板。在具体的实施方案中，将细胞以1×104个细胞/孔的密度铺板。
在某些实施方案中，例如，当使用多种平板形式时，可以在每cm2的基础上调节铺板细胞的密度。在某些实施方案中，将细胞以约3×102个细胞/cm2至约3×108个细胞/cm2，例如约3×102个细胞/cm2至约3×105个细胞/cm2或约3×103个细胞/cm2至约3×106个细胞/cm2的密度铺板。
在某些实施方案中，将AADC病毒载体以约1vg/细胞至约1×108vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×105vg/细胞的浓度转导到细胞中。
在一些实施方案中，转导后44-52小时后收获细胞。在一些实施方案中，将AADC病毒载体以1×106vg/μL-1×1011vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC病毒载体以5×106vg/μL-5×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC病毒载体以1×107vg/μL-1×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC病毒载体以2×107vg/μL-2×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC AAV载体以1×106vg/μL-1×1011vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC AAV载体以5×106vg/μL-5×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC AAV载体以1×107vg/μL-1×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，将AADC AAV载体以2×107vg/μL-2×1010vg/μL的浓度转导到细胞中。
在一些实施方案中，在转导后18-72小时后收获制备细胞裂解物的细胞。在一些实施方案中，转导后24小时后收获细胞。在一些实施方案中，转导后36小时后收获细胞。在一些实施方案中，转导后48小时后收获细胞。
在一些实施方案中，细胞裂解物由使用化学和/或机械裂解法裂解的细胞形成。在一些实施方案中，化学裂解包括使用裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含蛋白酶抑制剂、缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)和表面活性剂(例如非离子表面活性剂(例如Triton X100))。在一些实施方案中，裂解过程涉及细胞离心以清除裂解物并除去碎片，例如，在室温下以3750RPM(每分钟转数)离心10分钟。
在一些实施方案中，将AADC反应缓冲液与L-DOPA一起添加至细胞裂解物中。在某些实施方案中，AADC反应缓冲液包含缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，例如磷酸钠缓冲液，例如50mM磷酸钠缓冲液。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含50mM磷酸钠缓冲液、抗坏血酸、吡哆醛-5'-磷酸DL-二硫苏糖醇、EDTA和巴吉林(Pargyline)。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、0.1mM抗坏血酸，0.1mM吡哆醛-5'-磷酸盐、1mMDL-二硫苏糖醇、0.1mM EDTA和0.1mM巴吉林。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含辛磺酸钠盐、磷酸二氢钠和乙腈。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含3.0mM、3.2mM或3.5mM的辛磺酸钠盐，pH 3.0、72.5mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)和10％％乙腈。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含3.0-4.0mM、3.0-3.7mM、3.0-3.5mM、3.0-3.2mM、3.0mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM或4.0mM。
在一些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.1mM至100mM。在某些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.1mM至50mM。在某些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.1mM至1mM。在某些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为5mM至30mM。在一些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.3mM。在一些实施方案中，添加至细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为20mM。
在一些实施方案中，与L-DOPA的AADC反应在37℃下进行。在一些实施方案中，与L-DOPA的AADC反应进行约10-120分钟。在一些实施方案中，与L-DOPA的AADC反应进行约10-90分钟。在一些实施方案中，与L-DOPA的AADC反应进行约20-60分钟。在一些实施方案中，与L-DOPA的AADC反应进行约30±1-3分钟。在具体的实施方案中，与L-DOPA的AADC反应在37℃下进行约30±1-3分钟。
在一些实施方案中，例如通过加入冰冷的高氯酸，用高氯酸淬灭与L-DOPA的AADC反应。在一些实施方案中，高氯酸，例如冰冷的高氯酸，以0.1M至1M的浓度添加。在一些实施方案中，高氯酸，例如冰冷的高氯酸，以0.5M的浓度添加。
在一些实施方案中，使用色谱法，例如液相色谱法(例如高效液相色谱法)测量产生的多巴胺的量。在某些实施方案中，使用具有电化学检测器的超高效液相色谱法(“UHPLC-ECD”)测量产生的多巴胺的量。在一些实施方案中，使用UHPLC-ECD通过将多巴胺的量与多巴胺标准曲线进行比较来测量产生的多巴胺的量。在某些实施方案中，使用具有紫外检测器的超高效液相色谱法(“UHPLC-UV”)测量产生的多巴胺的量。在一些实施方案中，使用UHPLC-UV通过将多巴胺的量与多巴胺标准曲线比较来测量产生的多巴胺的量。
附图简述
图1显示了对用AAV2.AADC载体转导HT1080细胞的体外剂量响应曲线。
图2显示了使用96孔板对转导HT1080细胞的体外剂量响应曲线。
图3显示了参考标准AAV2.AADC的分析的测定法间(inter-assay)变化性。
图4A-4C表明：(4A)在三个不同温度下多巴胺产生的动力学(插图是室温下相比于2-8℃的相对多巴胺生成)，(4B)AAV2.AADC的酶测定法，显示最高基线的变化性较小，和(4C)酶测定法用于显示HEK293/三重转染的哺乳动物细胞中产生的AADC病毒AAV载体和Sf9/杆状病毒昆虫细胞中产生的AADC病毒AAV载体中AADC活性的可比性。
图5A-5B显示了多巴胺标准曲线的标准曲线和色谱图。
图6显示了相隔三个月解冻并保存在2-8℃的两小瓶AAV2.AADC参考标准品的酶活性的比较。
图7显示了热处理样品、UV处理样品和未处理样品之间的酶活性的比较。
发明详述
本申请提供了测量病毒载体效力的方法。在一些实施方案中，病毒载体包含编码感兴趣的分子的多核苷酸。在一些实施方案中，本申请提供了测量病毒载体效力的方法，其中所述病毒载体包含编码感兴趣的分子的多核苷酸，其基于感兴趣的分子活性。
在所述方法的一些实施方案中，基于感兴趣的蛋白质的酶促活性，病毒载体包含编码感兴趣的蛋白质的多核苷酸。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质是AADC。在一些实施方案中，本申请提供了基于AADC酶活性来测量AADC病毒载体效力的方法。
I.组合物
腺相关病毒(AAV)和AAV颗粒
细小病毒科的病毒是特征在于单链DNA基因组的小的非包膜的二十面体壳体病毒。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。由于其相对简单的结构，易于使用标准分子生物学进行操作技术，此病毒科可用作生物学工具。可以修饰病毒的基因组以含有用于组装功能重组病毒或病毒颗粒的最少成分，所述功能性重组病毒或病毒颗粒装有有效负载或经过工程化以表达或递送期望的有效负载，该有效负载可以递送至靶细胞、组织、器官或生物体。
细小病毒和细小病毒科的其他成员通常在Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:TheViruses and Their Replication,”第69章于FIELDS VIROLOGY(第3版1996)中进行描述，其内容通过引用完整并入。
细小病毒科包含依赖病毒属，其包括能够在脊椎动物宿主中复制的腺相关病毒(AAV)，所述宿主包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和绵羊物种。
载体基因组是长度为约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA(ssDNA)分子。AAV病毒基因组可包含有效负载区和至少一个反向末端重复(ITR)或ITR区。传统上，ITR位于非结构蛋白(由Rep基因编码)和结构蛋白(由壳体基因或Cap基因编码)的编码核苷酸序列的侧翼。尽管不希望受到理论的束缚，但AAV病毒基因组通常包含两个ITR序列。载体基因组包含由ssDNA的5’和3’端的自身互补末端145nt限定的特征性的T形发夹结构，该结构形成能量稳定的双链区。双链发夹结构包含多种功能，包括但不限于通过作为宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合物的引物发挥功能来充当DNA复制起点。
除编码的异源有效负载外，AAV颗粒可以包含任何天然存在的和/或重组的AAV血清型核苷酸序列或变体的全部或部分病毒基因组。AAV变体可以在核酸(基因组或壳体)和氨基酸水平(壳体)上具有显著同源性的序列，以产生构建体，该构建体通常为物理和功能等同物，通过相似的机制复制，并通过相似的机制组装。Chiarini等人,J.Vir.71:6823-33(1997)；Srivastava等人,J.Vir.45:555-64(1983)；Chiarini等人,J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge等人,J.Vir.72:309-319(1998)；和Wu等人,J.Vir.74:8635-47(2000)，每篇的内容通过引用完整并入本文。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒是重组AAV颗粒，其是复制缺陷的，在其病毒基因组中缺乏编码功能性Rep和Cap蛋白的序列。这些缺陷性AAV颗粒可以缺乏大多数或全部亲本编码序列，并且基本上仅携带一个或两个AAV ITR序列以及用于递送至细胞、组织、器官或生物体的感兴趣的核酸。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种控制元件，该控制元件提供了其中编码的编码序列的复制、转录和翻译。并非所有控制元件需要始终存在，只要编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和/或翻译。表达控制元件的非限制性实例包括用于转录起始和/或终止的序列、启动子和/或增强子序列、有效的RNA处理信号(例如剪接和聚腺苷酸化信号)、稳定细胞质mRNA的序列、增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)、增强蛋白质稳定性的序列和/或增强蛋白质加工和/或分泌的序列。
根据本公开，用于治疗学和/或诊断学的AAV颗粒包含已经蒸馏或减少至转导感兴趣的核酸有效负载或货物必需的最小组分的病毒。以此种方式，AAV颗粒经工程化改造为用于特异性递送，而缺乏在野生型病毒中发现的有害复制和/或整合特征的载体。
本公开的AAV颗粒可以重组产生，并且可以基于腺相关病毒(AAV)亲本或参考序列。如本文所用，“载体”是转运、转导异源分子，如本文所述的核酸或以其他方式充当异源分子，如本文所述的核酸的载体的任何分子或部分。
除单链AAV颗粒(例如ssAAV)外，本公开还提供了自身互补AAV(scAAV)颗粒。scAAV颗粒含有DNA链，它们退火在一起以形成双链DNA。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒是scAAV。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒是ssAAV。
用于生产和/或修饰AAV颗粒的方法是本领域中公开的，如假型化AAV颗粒(PCT专利公开文本No.WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO 2005005610和WO2005072364，每篇的内容通过引用完整并入本文。
可以修饰AAV颗粒以增强递送效率。此类经修饰的AAV颗粒可以进行有效包装，并用于以高频率和最小的毒性成功地感染靶细胞。在一些实施方案中，根据美国公开号US20130195801(其内容通过引用完整并入本文)中描述的方法工程化改造AAV颗粒的壳体。
在一个实施方案中，可以将包含编码本公开多肽的有效负载区的AAV颗粒导入哺乳动物细胞中。
病毒基因组组分：反向末端重复(ITR)
本公开的AAV颗粒包含具有至少一个ITR区和有效负载区的病毒基因组。在一个实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR位于5’和3’端的有效负载区的侧翼。ITR发挥包含复制识别位点的复制起点功能。ITR包含可以互补和对称排列的序列区。掺入本公开的病毒基因组中的ITR可以由天然存在的多核苷酸序列或重组衍生的多核苷酸序列组成。
ITR可以源自与壳体相同的血清型。ITR可以具有与壳体不同的血清型。在一个实施方案中，AAV颗粒具有超过一个ITR。在非限制性实例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在一个实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一个实施方案中，ITR具有不同的血清型。非限制性实例包括具有与壳体相同血清型的ITR中的0、1或2个。在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR均为AAV2 ITR。
独立地，每个ITR的长度可以是约100至约150个核苷酸。ITR的长度可以是100-105个核苷酸、长度为106-110个核苷酸、长度为111-115个核苷酸、长度为116-120个核苷酸、长度为121-125个核苷酸、长度为126-130个核苷酸，131-135个核苷酸核苷酸、长度为136-140个核苷酸、长度为141-145个核苷酸或长度为146-150个核苷酸。在一个实施方案中，ITR的长度为140-142个核苷酸。ITR长度的非限制性实例是长度为102、140、141、142、145个核苷酸，以及与它们具有至少95％同一性的核苷酸。
病毒基因组成分：启动子
在一个实施方案中，病毒基因组的有效负载区包含至少一种增强转基因靶物特异性和表达的元件(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements toEnhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用完整并入本文)。增强转基因靶物特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性miRNA、转录后调控元件(PRE)、聚腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。
本领域技术人员可以认识到，靶细胞中本公开的多肽的表达可以需要特异性启动子，包括但不限于物种特异性、诱导型、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(Parr等人,Nat.Med.3:1145-9(1997)；其内容通过引用完整并入本文)。
在一个实施方案中，当启动子驱动在AAV颗粒的病毒基因组的有效负载区中编码的多肽的表达时，认为该启动子是有效的。作为非限制性实例，该多肽是AADC。
在一个实施方案中，当启动子驱动靶向的细胞中的表达时该启动子是认为有效的启动子。
在一个实施方案中，启动子是对靶向的细胞具有向性的启动子。
在一个实施方案中，启动子驱动有效负载在靶向的组织中表达一段时间。由启动子驱动的表达可以持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年。表达可以持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。作为非限制性实例，启动子是用于在神经组织中持续表达有效负载的弱启动子。
在一个实施方案中，启动子驱动本公开的多肽表达至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年、或超过65年。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。
在大多数组织中驱动或促进表达的启动子包括但不限于人延伸因子1α亚基(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)立即早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)及其衍生物CAG、β葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)或泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于将表达限制于某些细胞类型，例如但不限于肌肉特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或神经系统启动子，其可用于将表达限于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。
肌肉特异性启动子的非限制性实例包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子和哺乳动物骨骼α-肌动蛋白(ASKA)启动子(例如，美国专利公开US20110212529，其内容通过引用完整并入本文)。
神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、血小板衍生的生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn)、甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、促代谢性谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻(NFL)或重(NFH)、β-珠蛋白小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运蛋白2(EAAT2)启动子。星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓磷脂碱性蛋白(MBP)启动子。
在一个实施方案中，启动子可以小于1kb。启动子的长度可以为200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800多个核苷酸。启动子的长度可以在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。
在一个实施方案中，启动子可以是相同或不同的起始或亲本启动子的两种或更多种组分的组合，例如但不限于CMV和CBA。每个组分的长度可以为200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800。每个组分的长度可以在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。在一个实施方案中，启动子是382个核苷酸的CMV-增强子序列和260个核苷酸的CBA-启动子序列的组合。
在一个实施方案中，病毒基因组包含遍在启动子。遍在启动子的非限制性实例包括CMV、CBA(包括衍生物CAG，CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)和UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011,7:63；其内容通过引用完整并入本文)使用慢病毒载体评估大鼠DRG细胞和原代DRG细胞中在CAG、EFIα、PGK和UBC启动子下eGFP的表达并发现UBC的表达显示比其他3个启动子弱的表达，并且对于所有启动子看到仅10-12％胶质细胞表达。Soderblom等人(E.Neuro2015；其内容通过引用完整并入本文)评估了在运动皮层中注射后在具有CMV和UBC启动子的AAV8中和在具有CMV启动子的AAV2中的eGFP表达。鼻内施用含有UBC或EFIα启动子的质粒显示大于CMV启动子的表达的持续气道表达(参见例如Gill等人,Gene Therapy 2001,Vol.8,1539-1546；其内容通过引用完整并入本文)。Husain等人(Gene Therapy 2009；其内容通过引用完整并入本文)评估了具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并且发现HβH构建体在小鼠脑中显示出比NSE弱的表达。Passini和Wolfe(J.Virol.2001,12382-12392，其内容通过引用完整并入本文)评估了新生小鼠中脑室内注射后的HβH载体的长期作用，并发现表达持续至少1年。Xu等人(GeneTherapy 2001,8,1323-1332；其内容通过引用完整并入本文)发现当与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE(0.3kb)、NSE(1.8kb)和NSE(1.8kb+wpre)相比使用NFL和NFH启动子时在所有脑区域中的低表达。Xu等人发现启动子活性的降序是NSE(1.8kb)、EF、NSE(0.3kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL是650个核苷酸的启动子，并且NFH是920个核苷酸的启动子，两者在肝脏中都不存在，但NFH在感觉本体感受神经元、脑和脊髓中是丰富的，并且NFH存在于心脏中。SCN8A是470个核苷酸的启动子，其在整个DRG、脊髓和脑中表达，在海马神经元和小脑浦肯野细胞、皮质、丘脑和下丘脑中看到特别高的表达(参见例如Drews et al.Identification of evolutionary conserved,functionalnoncoding elements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A,Mamm Genome(2007)18:723-731；和Raymond et al.Expression of AlternativelySpliced Sodium Channelα-subunit genes,Journal of Biological Chemistry(2004)279(44)46234-46241；每篇的内容通过引用完整并入本文)。
由前述的Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond教导的任何启动子都可以用于本公开。
在一个实施方案中，启动子不是细胞特异性的。
在一个实施方案中，启动子是泛素c(UBC)启动子。UBC启动子可以具有300-350个核苷酸的大小。作为非限制性实例，UBC启动子是332个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)启动子。GUSB启动子可以具有350-400个核苷酸的大小。作为非限制性实例，GUSB启动子是378个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是神经丝轻(NFL)启动子。NFL启动子可以具有600-700个核苷酸的大小。作为非限制性实例，NFL启动子是650个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是神经丝重(NFH)启动子。NFH启动子可以具有900-950个核苷酸的大小。作为非限制性实例，NFH启动子是920个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是SCN8A启动子。SCN8A启动子可以具有450-500个核苷酸的大小。作为非限制性实例，SCN8A启动子是470个核苷酸。
在一个实施方案中，启动子是共济蛋白(FXN)启动子。FXN启动子也可以称为FRDA启动子。
在一个实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一个实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
在一个实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一个实施方案中，启动子是H1启动子。
在一个实施方案中，启动子是工程化启动子。
在一个实施方案中，启动子是肝脏或骨骼肌启动子。肝启动子的非限制性实例包括人α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和甲状腺素结合球蛋白(TBG)。骨骼肌启动子的非限制性实例包括结蛋白、MCK或合成的C5-12。
在一个实施方案中，启动子是RNA pol III启动子。作为非限制性实例，RNA polIII启动子是U6。作为非限制性实例，RNA pol III启动子是H1。
在一个实施方案中，病毒基因组包含两个启动子。作为非限制性实例，启动子是EF1α启动子和CMV启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含增强子元件、启动子和/或5’UTR内含子。增强子元件(在本文中也称为“增强子”)可以是但不限于CMV增强子，启动子可以是但不限于CMV、CBA、UBC、GUSB、NSE、Synapsin、MeCP2和GFAP启动子，并且5’UTR/内含子可以是但不限于SV40和CBA-MVM。作为非限制性实例，组合使用的增强子、启动子和/或内含子可以是：(1)CMV增强子、CMV启动子、SV40 5’UTR内含子；(2)CMV增强子、CBA启动子、SV 40 5’UTR内含子；(3)CMV增强子、CBA启动子、CBA-MVM 5’UTR内含子；(4)UBC启动子；(5)GUSB启动子；(6)NSE启动子；(7)突触蛋白启动子；(8)MeCP2启动子和(9)GFAP启动子。
在一个实施方案中，病毒基因组包含工程化启动子。
在另一个实施方案中，病毒基因组包含来自天然表达的蛋白质的启动子。
在一个实施方案中，区域位于有效负载的第一外显子上游大致约5kb，以允许用启动子表达有效负载。(参见例如Puspasari et al.Long Range Regulation of Human FXNGene Expression,PLOS ONE,2011；其内容通过引用完整并入本文；17bp区域位于共济蛋白基因的第一外显子上游的大致约4.9kb以允许用FRDA启动子表达)。
在一个实施方案中，载体基因组可包含启动子，例如但不限于CMV或U6。作为非限制性实例，用于包含本公开的有效负载的AAV颗粒的启动子是CMV启动子。作为另一个非限制性实例，用于包含本公开的有效负载的AAV颗粒的启动子是U6启动子。
在一个实施方案中，载体基因组可包含CMV和U6启动子。
在一个实施方案中，载体基因组可包含CBA启动子。
病毒基因组组分：非翻译区(UTR)
根据定义，基因的野生型非翻译区(UTR)被转录但不翻译。通常，5’UTR在转录起始位点开始并在起始密码子处终止，而3’UTR在终止密码子后立即开始并一直持续到转录终止信号为止。
通常在特定靶器官的大量表达的基因中发现的特征可以被工程化改造为UTR以增强稳定性和蛋白质产生。作为非限制性实例，来自肝脏中正常表达的mRNA(例如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5’UTR可用于本公开的AAV颗粒的病毒基因组以增强在肝细胞系或肝脏中的表达。
尽管不希望受到理论的束缚，野生型5’非翻译区(UTR)包括在翻译起始中起作用的特征。通常已知参与核糖体启动许多基因翻译的过程的Kozak序列通常包含在5’UTR中。Kozak序列具有共有CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个“G”。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5’UTR包括Kozak序列。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5’UTR不包含Kozak序列。
尽管不希望受到理论的束缚，但是已知野生型3’UTR具有在其中嵌入的腺苷和尿苷区段。这些富含AU的标签在具有高周转率的基因中特别普遍。基于其序列特征和功能特性，可将富含AU的元件(ARE)分为三类(Chen等人，1995，其内容通过引用完整并入本文)：I类ARE，例如但不限于c-Myc和MyoD，在富含U的区域内包含数个AUUUA基序的分散拷贝。II类ARE，例如但不限于GM-CSF和TNF-a，拥有两个或多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARES的定义不太明确，例如但不限于c-Jun和肌形成蛋白。这些富含U的区域不含AUUUA基序。已知大多数与ARE结合的蛋白质都会使信使脱稳定化，而ELAV家族的成员(最特别是HuR)已被证明增加mRNA的稳定性。HuR结合到所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化改造到核酸分子的3’UTR中将导致HuR结合，从而使体内信息稳定化。
引入、除去或修饰3’UTR的富含AU的元件(ARE)可用于调节多核苷酸的稳定性。当工程化改造特定的多核苷酸，例如病毒基因组的有效负载区时，可以引入一个或多个拷贝的ARE，以使多核苷酸的稳定性降低，从而消除翻译并降低所得蛋白质的产量。类似地，可以鉴定并除去或突变ARE，以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产量。
在一个实施方案中，病毒基因组的3’UTR可以包括寡聚(dT)序列，用于模板化添加多聚-A尾。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包括至少一个miRNA种子、结合位点或全序列。微小RNA(或miRNA或miR)是19-25个核苷酸的非编码RNA，其结合核酸靶物的位点并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。微小RNA序列包含“种子”区域，即成熟微小RNA的2-8位区域中的序列，该序列与核酸的miRNA靶序列具有完美的Watson-Crick互补性。
在一个实施方案中，可以对病毒基因组进行工程化改造以包括、改变或去除至少一个miRNA结合位点、序列或种子区。
可以将来自本领域已知的任何基因的任何UTR掺入AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以以与选择它们的基因中相同的方向放置，或者可以改变方向或位置。在一个实施方案中，可以将AAV颗粒的病毒基因组中使用的UTR倒置、缩短、延长，用本领域已知的一种或多种其他5’UTR或3’UTR制备。如本文所用，术语“改变的”在它涉及UTR时表示相对于参考序列已经以某种方式改变UTR。例如，3’或5’UTR可以通过如上所教导的方向或位置的改变相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过包含额外的核苷酸、核苷酸的缺失、交换或转座来改变。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一种人工UTR，其不是野生型UTR的变体。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含UTR，其已经从转录物家族选择，所述转录物的蛋白质共享共同的功能、结构、特征或特性。
病毒基因组组分：聚腺苷酸化序列
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个聚腺苷酸化序列。AAV颗粒的病毒基因组可以在有效负载编码序列的3’端与3’ITR的5’端之间包含聚腺苷酸化序列。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列或“多聚A序列”的长度范围可以从不存在到约500个核苷酸。聚腺苷酸化序列的长度可以是但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、和500个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是50-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为50-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为60-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是70-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为70-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是80-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为80-200个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度是90-100个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-150个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-160个核苷酸。
在一个实施方案中，聚腺苷酸化序列的长度为90-200个核苷酸。
病毒基因组组分：内含子
在一个实施方案中，有效负载区包括至少一种增强表达的元件，例如一个或多个内含子或其部分。内含子的非限制性实例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短的内含子1(300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂合腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在一个实施方案中，内含子或内含子部分的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可以在80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500。
在一个实施方案中，载体基因组包含至少一种增强转基因靶物特异性和表达的元件(参见例如Powell et al.Viral Expression Cassette Elements to EnhanceTransgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其通过引用完整并入本文)，例如内含子。内含子的非限制性实例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短的内含子1(300bp)、β-球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在一个实施方案中，内含子的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以为80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500。内含子的长度可以在80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500、或400-500之间。
病毒基因组成分：填充序列
在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组包含一个或多个填充序列以使病毒基因组的长度为包装的最佳大小。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。
在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，其具有约0.1kb-3.8kb之间，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、或3.8kb的长度。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为3.1kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为2.7kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在一个实施方案中，病毒基因组是一种自身互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列，其具有0.1kb-1.5kb之间，例如但不限于0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb、1.1kb、1.2kb、1.3kb、1.4kb或1.5kb的长度。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中的全长填充序列为0.4kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.8kb。作为非限制性实例，载体基因组中每个填充序列的长度为0.4kb。
在一个实施方案中，病毒基因组包含填充序列的任何部分。病毒基因组可包含填充序列的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
在一个实施方案中，病毒基因组是单链(ss)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列以使病毒基因组的长度为约4.6kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且填充序列位于5’ITR序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3’ITR序列的5’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5’，而第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充序列位于5’ITR序列的5’。
在一个实施方案中，病毒基因组是自身互补(sc)病毒基因组，并包含一个或多个填充序列以使病毒基因组的长度为约2.3kb。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于5’ITR序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于启动子序列的5’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于3’ITR序列的5’。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于两个内含子序列之间。作为非限制性实例，病毒基因组包含至少一个填充序列，并且该填充序列位于内含子序列内。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，第一填充序列位于5’ITR序列的3’处，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于启动子序列的5’，并且第二填充序列位于聚腺苷酸化信号序列的3’。作为非限制性实例，病毒基因组包含两个填充序列，并且第一填充序列位于5’ITR序列的3’，并且第二填充序列位于5’ITR序列的5’。
在一个实施方案中，病毒基因组可以在病毒基因组的多个区域之一之间包含一个或多个填充序列。在一个实施方案中，填充区可以位于诸如但不限于有效负载区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区等区域之前。在一个实施方案中，填充区可以位于诸如但不限于有效负载区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区等区域之后。在一个实施方案中，填充区可以位于诸如但不限于有效负载区、反向末端重复(ITR)、启动子区、内含子区、增强子区、聚腺苷酸化信号序列区、多克隆位点(MCS)区和/或外显子区等区域之前和之后。
在一个实施方案中，病毒基因组可包含一个或多个将病毒基因组的至少一个区域分叉的填充序列。病毒基因组的分叉区域可包含填充序列区5’的区域的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的10％位于填充序列的5’并且该区域的90％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的20％位于填充序列的5’并且该区域的80％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的30％位于填充序列的5’并且该区域的70％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的40％位于填充序列的5’并且该区域的60％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的50％位于填充序列的5’并且该区域的50％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的60％位于填充序列的5’并且该区域的40％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的70％位于填充序列的5’并且该区域的30％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的80％位于填充序列的5’并且该区域的20％位于填充序列的3’。作为非限制性实例，填充序列可以分叉至少一个区域，使得该区域的90％位于填充序列的5’并且该区域的10％位于填充序列的3’。
在一个实施方案中，病毒基因组在5’ITR之后包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效负载区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在MCS区域之后包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区之后包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在启动子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在有效负载区之前包含一个填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在内含子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在增强子区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在聚腺苷酸化信号序列区之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在MCS区域之前包含填充序列。在一个实施方案中，病毒基因组在外显子区之前包含填充序列。
在一个实施方案中，病毒基因组在3’ITR之前包含填充序列。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和启动子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和有效负载区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和MCS区域。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于5’ITR和外显子区。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和有效负载区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和MCS区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于启动子区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和内含子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和MCS区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和外显子区。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于有效负载区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和增强子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和MCS区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于内含子区和3’ITR。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和MCS区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于增强子区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区域。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于MCS区域和外显子区。在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于MCS区域和3’ITR。
在一个实施方案中，填充序列可以位于两个区域之间，例如但不限于外显子区和3’ITR。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和有效负载区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和启动子区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和有效负载区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于启动子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和内含子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于有效负载区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和增强子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3'ITR之间在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于5’ITR和有效负载区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
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在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于内含子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和聚腺苷酸化信号序列区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于增强子区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和MCS区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和外显子区之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于MCS区和3’ITR之间。在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于聚腺苷酸化信号序列区和3’ITR之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
在一个实施方案中，病毒基因组可以包含两个填充序列，第一填充序列可以位于MCS区和外显子区之间，并且第二填充序列可以位于外显子区和3’ITR之间。
基因组大小
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的AAV颗粒可以是单链或双链载体基因组。载体基因组的大小可以是小、中、大或最大大小。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是小的单链载体基因组。小的单链载体基因组的大小可以为2.7至3.5kb，例如约2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。作为非限制性实例，小的单链载体基因组的大小可以是3.2kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是小的双链载体基因组。小的双链载体基因组的大小可以是1.3至1.7kb，例如大小为1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。作为非限制性实例，小的双链载体基因组的大小可以为1.6kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是中等单链载体基因组。中等单链载体基因组的大小可以为3.6至4.3kb，例如约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。作为非限制性实例，中等单链载体基因组的大小可以为4.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是中等双链载体基因组。中等双链载体基因组的大小可以为1.8至2.1kb，例如约1.8、1.9、2.0和2.1kb。作为非限制性实例，中等双链载体基因组的大小可以为2.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是大的单链载体基因组。大的单链载体基因组的大小可以为4.4至6.0kb，例如约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。作为非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是4.7kb。作为另一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是4.8kb。作为又一个非限制性实例，大单链载体基因组的大小可以是6.0kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
在一个实施方案中，包含本文描述的有效负载的载体基因组可以是大的双链载体基因组。大的双链载体基因组的大小可以为2.2至3.0kb，例如约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。作为非限制性实例，大的双链载体基因组的大小可以是2.4kb。另外，载体基因组可包含启动子和聚A尾。
有效负载
本公开内容的AAV颗粒包括至少一个有效负载区。如本文所用，“有效负载”或“有效负载区”是指由病毒基因组或病毒基因组内编码的一个或多个多核苷酸或多核苷酸区，例如转基因、编码多肽或多-多肽的多核苷酸或调控性核酸或调节性核酸。本公开的有效负载通常编码多肽或其片段或变体。
有效负载区可以以反映类似于或反映mRNA的自然构造的区域的方式构建。
有效负载区可以包含编码和非编码核酸序列的组合。
在一些实施方案中，AAV有效负载区可以编码编码或非编码RNA。
在一个实施方案中，AAV颗粒包含具有有效负载区的病毒基因组，该有效负载区包含编码超过一种感兴趣的多肽的核酸序列。在此类实施方案中，可以复制编码超过一种多肽的病毒基因组，并将其包装到病毒颗粒中。用包含超过一种多肽的病毒颗粒转导的靶细胞可以在单个细胞中表达每种多肽。
在一个实施方案中，有效负载区可含以下成分：位于病毒基因组内的有效负载区；和在有效负载区的5'和/或3'端的至少一个反向末端重复(ITR)；和有效负载区内的启动子区、内含子区和编码区。
在AAV颗粒有效负载区编码多肽的情况下，多肽可以是肽或蛋白质。编码本文所述的多肽的病毒基因组可用于人类疾病、病毒、兽医感染应用和多种体内和体外背景的领域。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于医学领域中以治疗、预防、减轻或改善神经学疾病和/或病症。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于医学领域中以治疗、预防、减轻或改善帕金森氏病。
在一些实施方案中，AAV颗粒可用于医学领域中以治疗、预防、减轻或改善中枢神经学疾病。
多肽和变体的性质
由本发明的病毒基因组的有效负载区编码的氨基酸序列可以翻译为完整的多肽、多个多肽或多肽片段，其可以独立地由一个或多个核酸、核酸片段或上述任何形式的变体编码。如本文所用，“多肽”是指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，该术语是指任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在某些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，然后将该多肽称为肽。如果多肽是肽，则其长度将至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其他等同物、变体和类似物。多肽可以是单分子或者可以是多分子复合物，例如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可以包含单链或多链多肽，并且可以缔合或连接。术语多肽还可以应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“多肽变体”是指其氨基酸序列不同于天然序列或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与天然或参考序列具有至少约50％的同一性(同源性)，优选地，它们与天然或参考序列具有至少约80％，更优选至少约90％的同一性(同源)。
在一些实施方案中，提供“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是含有一个或多个模拟激活序列的氨基酸的变体。例如，谷氨酸可以充当磷酸苏氨酸和/或磷酸丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可导致失活或含有该模拟物的失活产物，例如苯丙氨酸可作为酪氨酸的失活替代物；或丙氨酸可作为丝氨酸的失活替代物。
术语“氨基酸序列变体”是指与天然或起始序列相比其氨基酸序列具有一些差异的分子。氨基酸序列变体可以在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。“天然”或“起始”序列不应与野生型序列混淆。如本文所用，天然或起始序列是相对术语，是指可以与之进行比较的原始分子。“天然”或“起始”序列或分子可以代表野生型(在自然界中发现的序列)，但不必是野生型序列。
通常，变体与天然序列具有至少约70％的同源性，优选地，它们与天然序列具有至少约80％，更优选至少约90％的同源性。“同源性”在其应用于氨基酸序列时定义为当比对序列并在必要时引入缺口达到最大的同源性百分比时候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基相同的残基所占的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是公知的。应当理解，同源性取决于同一性百分比的计算，但是由于计算中引入的缺口和罚分，其值可能不同。
“同源物”在它应用于氨基酸序列时是指与第二物种的第二序列具有实质同一性的其他物种的相应序列。
“类似物”是指包括相差一个或多个氨基酸改变(例如，氨基酸残基的取代、添加或缺失)，且仍保持亲本多肽的性质的多肽变体。
可以将序列标签或氨基酸(例如一种或多种赖氨酸)添加至本公开的肽序列(例如，在N端或C端)。序列标签可用于肽纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解度或进行生物素化。或者，可以任选地缺失位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基端区域的氨基酸残基，以提供截短的序列。或者，取决于序列的用途，可以缺失某些氨基酸(例如，C端或N端残基)，例如将该序列表达为可溶的或连接至固体支持物的较大序列的一部分。
当涉及蛋白质时，“取代变体”是指那些在天然或起始序列中至少一个氨基酸残基被除去并且其在相同位置处的空间插入不同氨基酸的蛋白质。取代可以是单个的，其中分子中仅一个氨基酸被取代，或者它们可以是多个，其中两个或多个氨基酸已在同一分子中取代。
如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指序列中通常存在的氨基酸被具有相似大小、电荷或极性的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括将非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸取代为另一个非极性残基。同样，保守取代的例子包括一个极性(亲水)残基被另一个取代，例如在精氨酸和赖氨酸之间，在谷氨酰胺和天冬酰胺之间以及在甘氨酸和丝氨酸之间。另外，保守取代的另外实例是用碱性残基例如赖氨酸，精氨酸或组氨酸取代另一种，或用一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸取代另一种酸性残基。非保守取代的实例包括用非极性(疏水)氨基酸残基例如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸，丙氨酸，甲硫氨酸取代极性(亲水)残基例如半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸或赖氨酸和/或用极性残基取代非极性残基。
当涉及蛋白质时，“插入变体”是具有紧邻天然或起始序列中的特定位置处的氨基酸插入的一个或多个氨基酸的蛋白质。“紧邻”氨基酸是指连接至氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。
当涉及蛋白质时，“缺失变体”是在天然或起始氨基酸序列中去除了一个或多个氨基酸的那些。通常，缺失变体将在分子的特定区域中缺失一个或多个氨基酸。
如本文所用，术语“衍生物”与术语“变体”同义使用，并且是指相对于参考分子或起始分子以任何方式被修饰或改变的分子。在一些实施方案中，衍生物包括已被有机蛋白质或非蛋白质衍生剂，以及翻译后修饰进行修饰的天然或起始蛋白质。传统上，共价修饰是通过使蛋白质的目标氨基酸残基与能够与选定的侧链或末端残基反应的有机衍生剂反应，或通过利用在选定的重组宿主细胞中起作用的翻译后修饰机制来引入的。所得的共价衍生物可用于针对鉴定对生物学活性，免疫测定或制备用于重组糖蛋白的免疫亲和纯化的抗蛋白抗体重要的残基的程序。此类修饰在本领域普通技术人员范围内，并且无需过多的实验即可进行。
某些翻译后修饰是重组宿主细胞对表达的多肽的作用的结果。谷氨酰胺基和天冬酰胺基残基经常被翻译后脱酰胺基化为相应的谷氨酰基和天冬氨酰残基。或者，这些残基在弱酸性条件下脱酰胺。这些残基的任何一种形式都可以存在于根据本公开使用的蛋白质中。
其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的磷酸化，赖氨酸，精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化，糖基化/糖化，和二硫键的引入(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)(T.E.Creighton,Proteins:Structure and MolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,pp.79-86(1983))。
当提及蛋白质时，“特征”定义为分子的不同的基于氨基酸序列的组分。本公开的蛋白质的特征包括表面表现、局部构象形状、折叠、环、半环、域、半域、位点，末端或其任何组合。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“表面表现”是指出现在最外表面上的蛋白质的基于多肽的成分。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“局部构象形状”是指位于蛋白质的可定义空间内的蛋白质的基于多肽的结构表现。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“折叠”是指在能量最小化时所得的氨基酸序列的构象。折叠可发生在折叠过程的二级或三级水平。二级折叠的例子包括β折叠和α螺旋。三级折叠的例子包括由于能量力的聚集或分离而形成的域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水袋和亲水袋等。
如本文所用，术语“转角”当它涉及蛋白质构象时是指改变肽或多肽的主链方向并可涉及一个，两个，三个或更多个氨基酸残基的弯曲。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“环”是指肽或多肽的结构特征，其反转肽或多肽的主链的方向并包含四个或更多个氨基酸残基。Oliva等人已经鉴定出至少5类蛋白质环(J.Mol Biol 266(4):814-830；1997)。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“半环”是指已鉴定的环的一部分，其具有氨基酸残基数目的至少一半作为其来源的环。应当理解，环可以并不总是函数偶数个氨基酸残基。因此，在环含有或被鉴定为包含奇数个氨基酸的那些情况下，奇数编号环的半环将包含该环的整数部分或下一个整数部分(环的氨基酸数目/2+/-0.5个氨基酸)。例如，鉴定为7个氨基酸的环的环可以产生3个氨基酸或4个氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5为3或4)。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“结构域”是指具有一个或多个可鉴定的结构或功能特征或性质(例如，结合能力，用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的多肽的基序。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“半域”是指所鉴定的域的一部分，其具有氨基酸残基数目的至少一半作为其来源的域。应当理解，域可以并不总是包含偶数个氨基酸残基。因此，在域含有或被鉴定为包含奇数个氨基酸的那些情况下，奇数编号域的半域将包含域的整数部分或下一个整数部分(域的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，鉴定为7个氨基酸的域的域可产生3个氨基酸或4个氨基酸的半域(7/2＝3.5+/-0.5为3或4)。还应理解，可以在域或半域内鉴定亚域，这些亚域具有小于在其衍生自的域或半域中鉴定的所有结构或功能性质。还应理解，包含本文任何域类型的氨基酸不必沿着多肽的主链是连续的(即，不相邻的氨基酸可以在结构上折叠以产生域，半域或亚域)。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“位点”当它与基于氨基酸的实施方案有关时与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。位点代表可以在本公开的基于多肽的分子内被修饰，操作，改变，衍生化或变化的肽或多肽内的位置。
如本文所用，当提及蛋白质时，术语“端”是指肽或多肽的末端。此类末端不仅限于肽或多肽的第一个或最后一个位点，还可以在末端区域包括其他氨基酸。本公开的基于多肽的分子可以被表征为具有N端(被具有游离氨基(NH2)的氨基酸终止)和C端(被具有游离羧基(COOH)的氨基酸所终止)。在某些情况下，本公开的蛋白质由通过二硫键或通过非共价力结合在一起的多条多肽链组成(多聚体，寡聚体)。这些蛋白质将具有多个N和C端。或者，可以修饰多肽的末端，以使得它们可以视情况以基于非多肽的部分例如有机缀合物开始或终止。
一旦任何特征已经被鉴定或定义为本公开分子的成分，则可以通过移动，交换，倒置，删除，随机化或复制来进行这些特征的几种操作和/或修饰中的任何一种。此外，应理解，特征的操作可导致与对本公开分子的修饰相同的结果。例如，涉及删除域的操作将导致分子长度的改变，就像修饰核酸以编码小于全长分子那样。
修饰和操作可以通过本领域已知的方法例如定点诱变来完成。然后可以使用体外或体内测定法，例如本文所述的测定法或本领域已知的任何其他合适的筛选测定法，测试所得修饰分子的活性。
有效负载：AADC多核苷酸构建体
根据本公开，提供了芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC；也称为多巴脱羧酶和DDC)多核苷酸，其单独起作用或与另外的核酸序列组合起作用以编码AADC蛋白。如本文所用，“AADC多核苷酸”是编码AADC蛋白并且当存在于载体，质粒或可翻译的构建体中时在细胞，组织，器官或生物体中表达此类AADC蛋白的任何核酸聚合物。
AADC多核苷酸包括在细胞内部加工的前体分子。可以在质粒，载体，基因组或其他核酸表达载体中编码AADC多核苷酸或其加工形式以递送至细胞。
在一些实施方案中，将AADC多核苷酸设计为AAV病毒基因组的组分，并包装在AAV颗粒中，所述AAV颗粒在细胞内加工以产生野生型AADC蛋白。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸可以是AAV颗粒的有效负载。
如本文所用，野生型AADC蛋白可以是来自DDC基因的任何天然存在的同种型或变体。已经鉴定出编码AADC的不同同种型的多个可变剪接的转录变体。具体来说，DDC基因产生七个转录物变体，其编码六个不同的同等型。DDC转录物变体1和2均编码AADC同等型1。在一些实施方案中，AADC多核苷酸编码DDC转录物变体2，从而编码天然AADC同等型1(NCBI参考序列：NP_000781.1)。在此给出此序列：
Figure BDA0002836722570000701
本公开的AADC多核苷酸可以被工程化改造为包含组装以创建AADC多核苷酸构建体的模块元件和/或序列基序。
根据本公开，提供了AADC多核苷酸。此类多核苷酸包含核酸聚合物，其包含编码AADC蛋白的一种或多种同等型或变体的连接的核苷区域。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸包含编码AADC蛋白的密码子优化的转录物。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸包含编码AADC蛋白的一种或多种野生型同等型或变体的序列区。此类多核苷酸还可以包含编码以下任何一个或多个的序列区：5’ITR，巨细胞病毒(CMV)增强子，CMV启动子，ie1外显子1，ie1内含子1，hbB珠蛋白内含子2，hB珠蛋白外显子3、5'UTR，3'UTR，hGH聚(A)信号和/或3'ITR。此类序列区在本文中教导或可以是本领域已知的任何序列区。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸包含SEQ ID NO：2或其片段或变体。表1中显示了包含SEQ ID NO：2的AADC多核苷酸的组成区域。
表1.AADC多核苷酸的组成区域
Figure BDA0002836722570000702
Figure BDA0002836722570000711
在一个实施方案中，AADC多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有百分比同一性的序列。AADC多核苷酸可与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的同一性。AADC多核苷酸可与SEQ IDNO:2或其片段或变体具有1-10％，10-20％，30-40％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-99％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-99％、60-100％、70-80％、70-90％、70-99％、70-100％、80-85％、80-90％、80-95％、80-99％、80-100％、90-95％、90-99％、或90-100％。作为非限制性实例，AADC多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有80％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，AADC多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有85％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，AADC多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有90％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，AADC多核苷酸包含与SEQID NO:979或其片段或变体具有95％同一性的序列。作为另一个非限制性实例，AADC多核苷酸包含与SEQ ID NO:2或其片段或变体具有99％同一性的序列。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸的编码区的长度为1440个核苷酸。可以在全部或部分多核苷酸上对此类AADC多核苷酸进行密码子优化。
在一些实施方案中，AADC多核苷酸包含SEQ ID NO:2或其片段或变体中的任何一个，但缺少5'和/或3'ITR。可以将此类多核苷酸掺入质粒或载体中并用于表达编码的AADC蛋白。
在一个实施方案中，可以在昆虫细胞(例如，Sf9细胞)中产生AADC多核苷酸。
在一个实施方案中，可以使用三重转染产生AADC多核苷酸。
在一个实施方案中，AADC多核苷酸可包含AADC mRNA的密码子优化的可读框，至少一个5'ITR和至少一个3'UTR，其中一个或多个5'ITR可位于启动子区域的5'末端，一个或多个3'ITR可位于聚(A)信号的3'末端。AADC mRNA可以包含启动子区域，5'非翻译区(UTR)，3'UTR和聚(A)信号。启动子区域可以包括但不限于增强子元件，启动子元件，第一外显子区域，第一内含子区域，第二内含子区域和第二外显子区域。作为非限制性实例，增强子元件和启动子元件源自CMV。作为另一个非限制性实例，第一外显子区域是ie1外显子1或其片段，第一内含子区域是ie1内含子1或其片段，第二内含子区域是hbB珠蛋白内含子2或其片段，第二外显子区域是hbB珠蛋白3外显子或其片段。作为另一个非限制性实例，聚(A)信号源自人生长激素。
在一个实施方案中，至少一种元件可以与本文所述的AADC多核苷酸一起使用以增强转基因靶的特异性和表达(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elementsto Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用整体并入本文)。增强转基因靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子，内源性miRNA，转录后调控元件(PRE)，聚腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)，CMV增强子和内含子。
在一个实施方案中，至少一种元件可以与本文所述的AADC多核苷酸一起使用以增强转基因靶的特异性和表达(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elementsto Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；其内容通过引用整体并入本文，例如启动子。
在一个实施方案中，AADC多核苷酸在质粒或载体中编码，该质粒或载体可以源自腺相关病毒(AAV)。AAV可包含壳体血清型例如但不限于PHP.B、PHP.A、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAAV、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-pre-miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV Shuffle 100-1、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAVShuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAVSM100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAVCBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAVCBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAVCHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAVCKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAVCLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAVCLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAVCLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAVCLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAVCLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAVCSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAVCSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、PHP.B(AAV-PHP.B)、PHP.A(AAV.PHP.A)、G2B-26、G2B-13、TH1.1-32、TH1.1-35、AAVPHP.B2、AAVPHP.B3、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3、AAVG2B4、和/或AAVG2B5及其变体。
II.产生和分析
在某些实施方案中，携带人芳香族L-氨基酸脱羧酶(hAADC)基因的互补脱氧核糖核酸(cDNA)的重组腺相关病毒血清型2(AAV2)受到巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子的控制。
载体的产生涉及用两个BV感染的昆虫细胞(BIIC)感染Sf9细胞，以产生重组腺相关病毒(rAAV2)-hAADC载体。在某些实施方案中，BIIC选自BIIC-rep2/cap2、BIIC-hAADC，或BIIC:BIIC:VCD。
载体由四个分子种类组成：形成载体壳体的三种病毒蛋白(VP1、VP2和VP3)和包装入壳体中的治疗性脱氧核糖核酸(DNA)，其由侧翼有AAV2反向末端重复元件(IRT)的转基因表达盒组成。或者，使用HEK293/三重转染的(TTx)系统产生载体。
或者，用AAV2转导HT1080细胞以产生AADC。假设AAV2通过硫酸肝素介导的结合进入，这被认为在神经元细胞系和HT1080细胞系之间是相似的(Plochmann等人，JVI 2012)。此外，HT1080细胞具有类似于突触后神经元的检测不到水平的内源性AADC，这导致具有转基因表达的hAADC的较大且准确的测定窗口。在某些实施方案中，TT/HEK293系统用于产生AADC。
在一些实施方案中，用编码感兴趣的蛋白质的病毒载体转导细胞。在一些实施方案中，病毒载体是细小病毒载体。在一些实施方案中，细小病毒载体是AAV载体。在一些实施方案中，感兴趣的蛋白质是AADC，例如人AADC。AADC的氨基酸序列例如人AADC是公知的。例如，UniProtKB/Swiss-Prot P20711.2的氨基酸序列是人AADC的代表性氨基酸序列。在一些实施方案中，病毒载体是AAV2 AADC载体或AAV2.AADC载体。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约1vg/细胞至约1×108vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×105vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约1vg/细胞至约1×107vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约11vg/细胞至约1×106vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约1vg/细胞至约1×105vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约100vg/细胞至约1×106vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约100vg/细胞至约1×105vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×104vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×103vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×102vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约100vg/细胞至约1×104vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约100vg/细胞至约1×103vg/细胞的浓度转导到细胞中。在一些实施方案中，AADC病毒载体以约1vg/细胞、约10vg/细胞、约100vg/细胞、约1×103vg/细胞、约1×104vg/细胞、约1×105vg/细胞、约1×106vg/细胞、约1×107vg/细胞、约1×108vg/细胞的浓度转导到细胞中。
在一些实施方案中，HT1080细胞以约3×102个细胞/cm2至约3×108个细胞/cm2、约3×102个细胞/cm2至约3×107个细胞/cm2、约3×102个细胞/cm2至约3×106个细胞/cm2、约3×102个细胞/cm2至约3×105个细胞/cm2、约3×102个细胞/cm2至约3×104个细胞/cm2、约3×102个细胞/cm2至约3×103个细胞/cm2、约3×103个细胞/cm2至约3×104个细胞/cm2、约3×103个细胞/cm2至约3×105个细胞/cm2、约3×103个细胞/cm2至约3×106个细胞/cm2、约3×104个细胞/cm2至约3×106个细胞/cm2、约3×105个细胞/cm2至约3×107个细胞/cm2的密度铺板。在一些实施方案中，HT1080细胞以约3×104个细胞/cm2的密度铺板。
在一些实施方案中，细胞以约1×102个细胞/孔至约1×108个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×107个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×105个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×104个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×103个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×104个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×105个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×104个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×105个细胞/孔至约1×107个细胞/孔的密度铺板。在一些实施方案中，HT1080细胞以约1×104个细胞/孔的密度铺板。
在一些实施方案中，HT1080细胞以约1×102个细胞/孔至约1×108个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×107个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×105个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×104个细胞/孔、约1×102个细胞/孔至约1×103个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×104个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×105个细胞/孔、约1×103个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×104个细胞/孔至约1×106个细胞/孔、约1×105个细胞/孔至约1×107个细胞/孔的密度铺板。在一些实施方案中，HT1080细胞以约1×104个细胞/孔的密度铺板。在一些实施方案中，HT1080细胞以约5×103个细胞/孔的密度铺板。在一些实施方案中，将细胞在37±2℃下温育24+2小时。
在一些实施方案中，用编码感兴趣的蛋白质的病毒载体(例如AAV载体)转导细胞，裂解，并收集细胞裂解物。在一些实施方案中，用编码感兴趣的蛋白质的病毒载体(例如AAV载体)转导细胞，并在转导后约18至约72小时后收获。在一些实施方案中，转导后24小时后收获细胞。在一些实施方案中，转导后约24至约44小时后收获细胞。在一些实施方案中，转导后约44至约52小时后收获细胞。在一些实施方案中，转导后约52至约72小时后收获细胞。
在一些实施方案中，使用化学和/或机械裂解来裂解细胞。在一些实施方案中，化学裂解包含裂解缓冲液，其包含蛋白酶抑制剂，磷酸盐缓冲盐水和Triton X100。在一些实施方案中，可以在添加裂解缓冲液后在-80℃将细胞冷冻约30分钟至约72小时。或者，细胞裂解物可以在2至8℃的范围内或在室温下存储。在一些实施方案中，将细胞离心并收集细胞裂解物。在一些实施方案中，这通过在室温下以3,750RPM在离心机中旋转细胞10分钟来进行。
在一些实施方案中，本申请提供了一种用于测量AADC效力的方法，其包括将L-DOPA添加到由用包含编码AADC的多核苷酸的病毒载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，并在AADC与L-DOPA反应后，测量细胞裂解物中产生的多巴胺的量。
在一些实施方案中，细胞裂解物包含由用AAV2.AADC载体转导的细胞产生的AADC。在一些实施方案中，将L-DOPA和/或AADC反应缓冲液添加至细胞裂解物中。在一些实施方案中，通过AADC与L-DOPA的反应将L-DOPA转化为多巴胺。
在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含磷酸盐缓冲液，例如磷酸钠缓冲液，例如50mM磷酸钠缓冲液。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含50mM磷酸钠缓冲液、抗坏血酸、吡哆醛-5'-磷酸DL-二硫苏糖醇、EDTA和巴吉林。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含50mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、0.1mM抗坏血酸，0.1mM吡哆醛-5'-磷酸盐、1mM DL-二硫苏糖醇、0.1mM EDTA和0.1mM巴吉林。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含辛磺酸钠盐、磷酸二氢钠和乙腈。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含3.0mM的辛磺酸钠盐pH 3.0、72.5mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)和10％乙腈。在一些实施方案中，AADC反应缓冲液包含3.2mM的辛磺酸钠盐pH 3.0、72.5mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)和10％乙腈。在一些实施方案中，将L-DOPA以约0.01mM至约1mM的浓度添加至细胞裂解物中。在一些实施方案中，将L-DOPA以约0.03mM的浓度添加至细胞裂解物中。
在一些实施方案中，AADC与L-DOPA的反应在37℃下进行。在一些实施方案中，AADC与L-DOPA的反应进行10-120分钟。在一些实施方案中，AADC与L-DOPA的反应进行30分钟。在一些实施方案中，AADC与L-DOPA的反应进行30分钟，并将细胞裂解物转移至2-8℃，以降低转化率并使样品之间的变化最小化。在一些实施方案中，AADC与L-DOPA的反应在室温下进行。
在一些实施方案中，通过加入冰冷的高氯酸淬灭AADC与L-DOPA的反应。在一些实施方案中，以0.1M至1M的浓度加入冰冷的高氯酸。在一些实施方案中，以0.5M的浓度加入冰冷的高氯酸。
在一些实施方案中，使用具有电化学检测器的超高效液相色谱法(“UHPLC-ECD”)测量产生的多巴胺的量。在一些实施方案中，使用UHPLC-ECD通过将多巴胺的量与多巴胺标准曲线进行比较来测量产生的多巴胺的量。
本申请还提供了一种用于测量AADC病毒载体效力的方法，该方法包括将L-DOPA添加到由用包含编码AADC的多核苷酸的第一病毒载体转导的细胞产生的细胞裂解物中，测量在AADC与L-DOPA反应后在细胞裂解物中产生的多巴胺的量，并将产生的多巴胺的量与利用病毒载体参考标准品时产生的多巴胺的量进行比较，从而测量第一病毒载体的效力。
在一些实施方案中，病毒载体参考标准品为上述病毒载体的效力方法提供了适当的范围。在一些实施方案中，用每个细胞或vg/μl的载体基因组范围转导细胞，如上所述裂解细胞，并确定感兴趣的分子的活性。在一些实施方案中，绘制剂量响应(多巴胺对每个细胞或vg/μl载体基因组)。在一些实施方案中，每个细胞的载体基因组的范围是每个细胞约10至约10,000个载体基因组。在一些实施方案中，每个细胞的载体基因组的范围包含通过进行最高剂量的2倍连续稀释而均匀间隔的剂量。
在一些实施方案中，本公开涉及选择具有期望效力的病毒载体的方法。在一些实施方案中，在AADC与L-DOPA的反应之后在细胞裂解物中产生的多巴胺的量高于当利用病毒参考标准品时产生的多巴胺的量，指示第一病毒载体比病毒载体参考品更有力。在一些实施方案中，在AADC与L-DOPA反应之后在细胞裂解物中产生的多巴胺的量低于当利用病毒参考标准品时产生的多巴胺的量，指示第一病毒载体的效力小于病毒载体参考品。在一些实施方案中，在AADC与L-DOPA反应之后在细胞裂解物中产生的多巴胺的量约等同于当利用病毒参考标准品时产生的多巴胺的量，指示第一病毒载体与病毒载体参考品大致相等有效力。
在某些实施方案中，本文所述的方法可进一步包括使用阳性对照，所述阳性对照包括针对定义的可接受范围内的值进行监测的病毒载体批次。如果测定运行导致在可接受范围外的来自阳性对照的值，则测定运行可以宣布是无效的。此类阳性对照可以提供作为有效性或接受标准的益处。
可以通过利用任何宽范围的细胞测定形式进行本文所述的方法，包括但不限于细胞板，例如24孔板、48孔板、96孔板或384孔板、单个细胞培养板或烧瓶，例如T瓶或摇瓶。
在一些实施方案中，根据以下公式，使用四参数逻辑回归分析来分析数据：
Figure BDA0002836722570000801
其中A是上渐近线(“顶部”)；B是动态范围的斜率(“坡斜率(Hillslope)”)；C为EC50；并且D是下部渐近线(“底部”)。在一些实施方案中，剂量响应曲线拟合到四参数曲线分析。在一些实施方案中，根据四参数曲线分析，不同样品的相对效力可以表示为半最大有效浓度(EC50)的值或偏离)。该方法的线性允许准确比较批次之间的效力，确保一致性。
在一些实施方案中，分析数据的相对效力，其可以表示为与参考标准品的EC50的偏离。AADC相对效力可以使用以下公式表示为参考标准品与测试样品的EC50值之比：
Figure BDA0002836722570000802
在一些实施方案中，AADC载体具有1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、100-105％、105-110％、110-115％、115-120％、120-125％、125-130％、130-135％、135-140％、140-145％、145-150％、150-155％、155-160％、160-165％、165-170％、170-175％、175-180％、180-185％、185-190％、190-195％、195-200％的AADC相对效力。
在一些实施方案中，将AADC载体的AADC相对效力与阈值AADC相对效力值进行比较。在一些实施方案中，如果AADC载体落入阈值AADC相对效力值之下，则将其丢弃或弃用。在一些实施方案中，AAV制剂中包括AADC病毒载体，并且如果AADC病毒载体的AADC相对效力落到阈值AADC相对效力值之下，则不将AAV制剂等分取样到制剂容器中。在某些实施方案中，阈值AADC相对效力值为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或200％。
在一些实施方案中，本公开的测定法可用于测量和/或比较通过不同方法产生的AADC载体的酶活性。在一些实施方案中，本公开的测定法可用于测量和/或比较以不同体积产生的AADC载体的酶活性。在一些实施方案中，本公开的测定法可用于测量以约10L至约5000L之间、约50L至约4000L之间、约100L至约3000L之间、或约20L至约2000L规模之间的规模产生的AADC载体的酶活性。在一些实施方案中，本公开的测定法可用于测量以约10L、约25L、约50L、约75L、约100L、约150L、约200L、约250L、约500L、约750L、约1000L、约1500L、约2000L、约3000L、约4000L和约5000L的规模产生的AADC载体的酶活性。
尽管不希望受到理论的束缚，但本文所述的效力测定法提供了一种方法，通过该方法可以在生物学相关的背景下评估转基因(例如，AADC)的表达。
该测定法被设想为利用以一定剂量范围的表达AADC的载体体外转导永生化细胞系(HT1080细胞)。然后将裂解物用于将L-DOPA酶促转化为多巴胺。可以通过UHPLC(或HPLC)监测多巴胺的产生，然后通过电化学检测(“UHPLC-ECD”)检测L-DOPA和多巴胺中二羟基芳香族环(dihydroxyaromatic ring)的氧化。或者，可以通过剂量范围监测多巴胺的产生，然后拟合到非线性曲线。使用拟合参数，相对于参考品测试样品。或者，UHPLC-UV用于测量多巴胺的产生。在某些实施方案中，剂量范围为32μM至320μM。
先前已在文献(Ciesielska等人,2015)中证明了使用AADC将L-DOPA转化为多巴胺。收获的表达AADC的组织裂解物用于将L-DOPA转化为多巴胺，包括转化所需要的试剂/辅因子和反应条件。使用HPLC-ECD测量此转化。
本文所述的效力测定法的准确性可以受病毒载体滴度的初始测量影响。准确性、精确性和可重复的滴度确保更准确、精确和可重复的效力读数，并可进一步用于确保对实验或临床给药的置信度。当结合时滴度和效力数据可用于进一步对本领域技术人员告知病毒载体特性和适当的给药参数，以增强功效和安全性。多次测量滴度和效力可以进一步提高批次间比较和长期稳定性研究中的准确性和精确性。
制备AAV颗粒的方法是本领域中公知的，并且记载于例如美国专利No.US6204059,US5756283,US6258595,US6261551,US6270996,US6281010,US6365394,US6475769,US6482634,US6485966,US6943019,US6953690,US7022519,US7238526,US7291498andUS7491508,US5064764,US6194191,US6566118,US8137948；或国际公开No.WO1996039530,WO1998010088,WO1999014354,WO1999015685,WO1999047691,WO2000055342,WO2000075353和WO2001023597；Methods In Molecular Biology,Richard,Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,A Laboratory Manual,OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.,219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)；每篇的内容通过引用完整并入本文。在一个实施方案中，使用WO2015191508(其内容通过引用完整并入本文)中所述的方法制备AAV颗粒。
通常用于生产重组AAV颗粒的病毒复制细胞包括但不限于293细胞，COS细胞，HeLa细胞，KB细胞和其他哺乳动物细胞系，如美国专利4US6156303，US5387484，US5741683，US5691176和US5688676号；美国专利公开号2002/0081721和国际专利公开号No.WO 00/47757，WO 00/24916和WO 96/17947，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施方案中，本公开提供了利用以一定MOI剂量范围的AAV2-AADC体外转导永生化细胞系(HT-1080；人纤维肉瘤细胞)的测定法。然后将裂解物用于将L-DOPA酶促转化为多巴胺。多巴胺的产生可以通过UHPLC(或HPLC)进行监测，然后紫外线(UV)检测或电化学检测(ECD)L-DOPA和多巴胺中存在的芳香族环。MOI剂量及其相应的多巴胺值的范围可拟合到非线性四参数曲线。可以使用四参数拟合数据相对于载体参考品评估测试样品，以确定相对效力。
在一些实施方案中，本公开提供了产生具有增强的(增加的，改善的)转导效率的AAV颗粒的方法，该方法包括以下步骤：1)用杆状病毒载体和病毒构建体载体和/或AAV有效负载构建体载体共转染感受态细菌细胞，2)分离所得的病毒构建体表达载体和AAV有效负载构建表达载体并分别转染病毒复制细胞，3)分离并纯化所得的有效负载和包含病毒构建体表达载体或AAV有效负载构建体表达载体的病毒构建体颗粒，4)用AAV有效负载和包含病毒构建体表达载体或AAV有效负载构建体表达载体的病毒构建体颗粒两者共感染病毒复制细胞，以及5)收获和纯化包含病毒基因组的AAV颗粒。
在一些实施方案中，本公开提供了用于生产AAV颗粒的方法，其包括以下步骤：1)用有效负载区、表达rep和cap基因的构建体以及辅助构建体同时共转染哺乳动物细胞(例如但不限于HEK293细胞)，2)收获并纯化包含病毒基因组的AAV颗粒。
在一些实施方案中，本公开包括生产基因疗法产品的方法，其可以包括以下步骤：(a)提供包含AAV载体的AAV制剂，(b)使用本公开的方法或系统测量AAV制剂的病毒载体效力；和(c)在已经测量了病毒载体效力之后，将AAV制剂适当地等分取样到制剂容器中。在一些实施方案中，AAV病毒载体包括病毒基因组。在一些实施方案中，AAV载体包括编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸。在一些实施方案中，被测量的AAV制剂的病毒载体效力是AADC病毒载体效力。
在一些实施方案中，本公开包括生产基因疗法产品的方法，其可以包括以下步骤：(a)将AAV制剂适当地等分取样到制剂容器中，其中所述AAV制剂包含AAV载体，并且其中在将AAV制剂等分取样到制剂容器中之前，已经使用本公开的方法或系统测量了制剂的病毒载体效力。在一些实施方案中，AAV载体包括病毒基因组。在一些实施方案中，AAV载体包括编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸。在一些实施方案中，被测量的AAV制剂的病毒载体效力是AADC病毒载体效力。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒的病毒基因组任选地编码选择标志物。选择标志物可以包括细胞表面标志物，例如在细胞表面上表达的任何蛋白质，包括但不限于受体CD标志物、凝集素、整联蛋白或其截短形式。
在一些实施方案中，选择标志物如记载于国际申请号WO 96/23810；Heim等人,Current Biology 2:178-182(1996)；Heim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等人,Science 373:663-664(1995)；WO 96/30540，每篇的内容通过引用整体并入本文。
III.制剂和组合物
药物组合物
根据本公开，可以将AAV颗粒制备为药物组合物。将理解的是，此类组合物一定包含一种或多种活性成分，并且最通常地是药学上可接受的赋形剂。
根据本公开内容的药物组合物中的活性成分(例如，AAV颗粒)，药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可以变化，这取决于身份，大小和/或接受治疗的受试者的状况，并且进一步取决于组合物的施用途径。例如，组合物可包含0.0001％至99％(w/w)的活性成分。举例来说，该组合物可包含0.0001％至100％，例如0.5至50％、1-30％、5-80％、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒药物组合物可包含至少一种有效负载。作为非限制性实例，药物组合物可包含具有1、2、3、4或5个有效负载的AAV颗粒。
尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人施用的药物组合物，但是熟练技术人员应理解，此类组合物通常适合于对任何其他动物，例如对非人动物，例如非人类哺乳动物施用。为了使组合物适合于向各种动物施用，适合于对人施用的药物组合物的修饰是公知的，并且普通技术的兽医药理师可以仅通过普通的(若有的话)实验来设计和/或进行此类修饰。预期接受药物组合物施用的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊，猫、狗、小鼠、大鼠、鸟类，包括与商业有关的鸟类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
在一些实施方案中，将组合物施用于人、人类患者或受试者。
制剂
本公开的制剂可以包括但不限于盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白质、用AAV颗粒转染的细胞(例如，用于转移或移植入受试者)及其组合。
本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。如本文所用，术语“药物组合物”是指包含至少一种活性成分和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合物。
通常，此类制备方法包括将活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分相关联的步骤。如本文所用，短语“活性成分”通常是指带有编码本公开的多肽的有效负载区的AAV颗粒，或指由本文所述的AAV颗粒的病毒基因组编码的终产物。
本文所述的AAV颗粒和药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要和/或期望的话，将产品分成，成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单位。
根据本公开的药物组合物可以作为单个单位剂量和/或作为多个单个单位剂量散装制备，包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是指包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用于受试者的活性成分的剂量和/或该剂量的方便分数，例如该剂量的一半或三分之一。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以与环氧乙烷/环氧丙烷共聚物(也称为普鲁尼克(pluronic)或泊洛沙姆(poloxamer))组合配制在PBS中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于pH为约7.0的具有0.001％的普朗尼克酸(pluronic acid)(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于pH为约7.3的具有0.001％的普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于pH为约7.4的具有0.001％的普朗尼克酸(F-68)(泊洛沙姆188)的PBS中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于包含氯化钠、磷酸钠和环氧乙烷/环氧丙烷共聚物的溶液中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于包含氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钠和泊洛沙姆188/普朗尼克酸(F-68)的溶液中。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于包含约180mM的氯化钠、约10mM的磷酸钠和约0.001％的泊洛沙姆188的溶液(约7.3的pH)中。最终溶液中氯化钠的浓度可以为150mM-200mM。作为非限制性实例，最终溶液中氯化钠的浓度可以是150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。最终溶液中磷酸钠的浓度可以为1mM-50mM。作为非限制性实例，最终溶液中磷酸钠的浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM。泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可以为0.0001％-1％。作为非限制性实例，泊洛沙姆188(普鲁尼克酸(F-68))的浓度可以为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％。最终溶液的pH可以为6.8-7.7。最终溶液的pH的非限制性实例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
在一个实施方案中，本公开的AAV颗粒可以配制于包含约1.05％的氯化钠、约0.212％的磷酸氢二钠七水合物、约0.025％的磷酸二氢钠一水合物和0.001％的泊洛沙姆188的溶液(约7.4的pH)中。作为非限制性实例，该配制溶液中AAV颗粒的浓度可以为约0.001％。最终溶液中氯化钠的浓度可以为0.1-2.0％，非限制性实例为0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、0.95％、0.96％、0.97％、0.98％、0.99％、1.00％、1.01％、1.02％、1.03％、1.04％、1.05％、1.06％、1.07％、1.08％、1.09％、1.10％、1.25％、1.5％、1.75％或2％。最终溶液中磷酸氢二钠的浓度可以为0.100-0.300％，非限制性实例包括0.100％、0.125％、0.150％、0.175％、0.200％、0.210％、0.211％、0.212％、0.213％、0.214％、0.215％、0.225％、0.250％、0.275％、0.300％。最终溶液中磷酸二氢钠的浓度可以为0.010-0.050％，非限制性实例为0.010％、0.015％、0.020％、0.021％、0.022％、0.023％、0.024％、0.025％、0.026％、0.027％、0.028％、0.029％、0.030％、0.035％、0.040％、0.045％、或0.050％。泊洛沙姆188(普朗尼克酸(F-68))的浓度可以为0.0001％-1％。作为非限制性实例，泊洛沙姆188(普鲁尼克酸(F-68))的浓度可以为0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％。最终溶液的pH可以为6.8-7.7。最终溶液的pH的非限制性实例包括6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。
在一个实施方案中，该制剂包含具有以下CAS(化学文摘社)注册号的组分：7647-14-15(氯化钠)、7782-85-6(磷酸氢二钠，七水合物)、10049-21-5(磷酸二氢钠，一水合物)、9003-11-6(泊洛沙姆188)和2226647-27-2(重组腺相关病毒2载体VY-AADC02人芳香族氨基酸脱羧酶指定)。
在一些实施方案中，本文所述的AAV制剂可包含足够的AAV颗粒，用于表达至少一种表达的功能性有效负载。作为非限制性实例，AAV颗粒可包含编码1、2、3、4或5个功能性有效负载的病毒基因组。
根据本公开，可以配制AAV颗粒用于CNS递送。可以使用穿过脑血屏障的药物。例如，可以将可将分子靶向到脑血屏障内皮的分子的一些细胞穿透肽用于配制(例如Mathupala,Expert Opin Ther Pat.,2009,19,137-140；其内容通过引用完整并入本文)。
在一些实施方案中，本公开的制剂可以在水性介质中或以冻干形式包装。制剂的容器通常将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其他容器装置，其中可以放置制剂，并且优选适当等分取样。在存在有超过一种试剂盒组分(标记试剂和标签可以包装在一起)的情况下，试剂盒通常还可以含有可以分开放置另外的组分的第二、第三或其他另外的容器。在一些实施方案中，试剂盒还可包含第二容器装置，用于容纳无菌的药学上可接受的缓冲液和/或其他稀释剂。在一些实施方案中，组分的各种组合可以包含在一个或多个小瓶中。本公开的试剂盒通常还可以包含用于容纳本公开的化合物和/或组合物，例如蛋白质，核酸的装置和紧密封闭的任何其他试剂容器，以用于商业销售。此类容器可以包括保留有期望的小瓶的注射或吹塑塑料容器。
赋形剂和稀释剂
可以使用一种或多种赋形剂或稀释剂配制本公开的AAV颗粒，以(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)允许持续或延迟释放有效负载；(4)改变生物分布(例如，将病毒颗粒靶向特定的组织或细胞类型)；(5)增加编码蛋白的翻译；(6)改变编码蛋白的释放概况和/或(7)允许可调节性表达本公开的有效负载。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂可以由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂可以是药物级的。在一些实施方案中，赋形剂可以满足美国药典(USP)，欧洲药典(EP)，英国药典和/或国际药典的标准。
如本文所用的赋形剂包括但不限于任何和所有溶剂，分散介质，稀释剂或其他液体载体，分散或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂等等，以适合所需的特定剂型。用于配制药物组合物的各种赋形剂和制备该组合物的技术是本领域已知的(参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006；其通过引用完整并入本文)。可以考虑在本公开内容的范围内使用常规的赋形剂介质，除非任何常规的赋形剂介质可与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物学作用或在其它情况下以有害的方式与药物组合物的任何其他成分相互作用。
示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等，和/或其组合。
在一个实施方案中，可以在施用前将AAV颗粒配制在水凝胶中。水凝胶由于其大量的水含量而具有与天然组织相似的柔韧性。
在另一个实施方案中，可在施用AAV颗粒制剂之前将水凝胶施用于受试者。作为非限制性实例，水凝胶的施用部位可以在3英寸之内(例如，在AAV颗粒制剂施用部位的2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2.、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或小于0.1英寸内)。
非活性成分
在一些实施方案中，AAV颗粒制剂可包含至少一种非活性成分。如本文所用，术语“非活性成分”是指不有助于制剂中包括的药物组合物的活性成分的活性的一种或多种试剂。在一些实施方案中，可用于本公开制剂中的所有非活性成分、无一非活性成分或一些非活性成分可通过美国食品和药物管理局(FDA)批准。
在一个实施方案中，AAV颗粒药物组合物包含至少一种非活性成分，例如但不限于1,2,6-己三醇；1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-S-(1-甘油))；1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二油酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1,2-二棕榈酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1,2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-(磷酸-Rac-(1-甘油))；1,2-二硬脂酰基-Sn-甘油-3-磷酸胆碱；1-O-甲苯基双胍；2-乙基-1,6-己二醇；乙酸；冰醋酸；乙酸酐；丙酮；丙酮亚硫酸氢钠；乙酰化羊毛脂醇；乙酰化甘油单酸酯；乙酰半胱氨酸；乙酰色氨酸，DL-；丙烯酸酯共聚物；丙烯酸-丙烯酸异辛酯共聚物；丙烯酸粘合剂788；活性炭；Adcote72A103；粘合带；己二酸；Aerotex树脂3730；丙氨酸；白蛋白聚集；白蛋白胶体；人白蛋白；醇；脱水醇；变性醇；稀释醇；Alfadex；海藻酸；烷基铵磺酸甜菜碱；烷基芳基磺酸钠；尿囊素；烯丙基α-紫罗兰酮(Allyl.Alpha.-Ionone)；杏仁油；α-松油醇(Terpineol)；α-生育酚；乙酸α-生育酚，Dl-；α-生育酚，Dl-；乙酸铝；氯羟基尿囊素铝(AluminumChlorhydroxy Allantoinate)；氢氧化铝；氢氧化铝-蔗糖，水合；氢氧化铝胶；氢氧化铝凝胶F 500；氢氧化铝胶F 5000；单硬脂酸铝；氧化铝；铝聚酯；硅酸铝；淀粉辛烯基琥珀酸铝；硬脂酸铝；亚乙酸铝；无水硫酸铝；Amerchol C；Amerchol-Cab；氨基甲基丙醇；氨；氨溶液；氨溶液，浓；乙酸铵；氢氧化铵；月桂基硫酸铵；Nonoxynol-4硫酸铵；C-12-C-15线性伯醇乙氧基化物的铵盐；硫酸铵；Ammonyx；Amphoteric-2；Amphoteric-9；茴香烯；无水柠檬酸；无水葡萄糖；无水乳糖；无水柠檬酸三钠；茴香油；抗氧化剂Sbn；消泡剂；安替比林；阿帕氟烷；杏桃仁油Peg-6酯；Aquaphor；精氨酸；Arlacel；抗坏血酸；棕榈酸抗坏血酸酯；天冬氨酸；秘鲁香脂(Balsam Peru)；硫酸钡；蜂蜡；蜂蜡，合成的；Beheneth-10；膨润土；苯扎氯铵；苯磺酸；苄索氯铵；苯扎溴铵；苯甲酸；苯甲醇；苯甲酸苄酯；氯化苄；Betadex；二聚阿帕西肽(Bibapcitide)；没食子酸铋(Bismuth Subgallate)；硼酸；Brocrinat；丁烷；丁基醇；乙烯基甲基醚的丁基酯/马来酸酐共聚物(125000Mw)；硬脂酸丁酯；丁基羟基茴香醚；丁羟甲苯；丁二醇；对羟基苯甲酸丁酯；丁酸；C20-40Pareth-24；咖啡因；钙；碳酸钙；氯化钙；葡庚糖酸钙；氢氧化钙；乳酸钙；考布曲钙(Calcobutrol)；卡地胺钠；钙塞酸三钠；卡特利多钙；加拿大香胶(Canada Balsam)；辛酸/癸酸甘油三酯；辛酸/癸酸/硬脂酸甘油三酯；卡普坦；Captisol；Caramel；卡波姆1342；卡波姆1382；卡波姆934；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆941；卡波姆980；卡波姆981；B型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联)；C型卡波姆均聚物(烯丙基季戊四醇交联)；二氧化碳；羧基乙烯基共聚物；羧甲基纤维素；羧甲基纤维素钠；羧基聚亚甲基；角叉菜胶；角叉菜胶盐；蓖麻油；雪松叶油；纤维素；纤维素，微晶的；Cerasynt-Se；地蜡(Ceresin)；Ceteareth-12；Ceteareth-15；Ceteareth-30；鲸蜡硬脂醇(CetearylAlcohol)/Ceteareth-20；鲸蜡硬脂基辛酸酯(Cetearyl Ethylhexanoate)；Ceteth-10；Ceteth-2；Ceteth-20；Ceteth-23；鲸蜡硬脂醇；西曲氯铵；鲸蜡醇；十六烷基酯蜡(CetylEsters Wax)；棕榈酸十六烷基酯；氯化十六烷基吡啶；氯丁醇；氯丁醇半水合物；无水氯丁醇；氯甲酚；氯二甲酚；胆固醇；Choleth；Choleth-24；柠檬酸盐；柠檬酸；一水柠檬酸；含水柠檬酸；椰酰胺醚硫酸盐(Cocamide Ether Sulfate)；椰油胺氧化物(Cocamine Oxide)；可可甜菜碱；可可二乙醇酰胺；可可单乙醇酰胺；可可脂；可可甘油酯；椰子油；氢化椰子油；氢化椰子油/棕榈仁油甘油酯；椰油酰基辛酸癸酸酯(Cocoyl Caprylocaprate)；光亮可乐果(Cola Nitida)种子提取物；胶原；着色悬浮液；玉米油；棉籽油；膏基(Cream Base)；肌酸；肌酸酐；甲酚；交联羧甲基纤维素钠；交聚维酮；硫酸铜；无水硫酸铜；环甲硅油(Cyclomethicone)；环甲硅油/二甲硅油共聚多元醇(Copolyol)；半胱氨酸；盐酸半胱氨酸；无水半胱氨酸盐酸盐；半胱氨酸Dl-；D&C Red No.28；D&C Red No.33；D&C Red No.36；D&CRed No.39；D&C Yellow No.10；达伐吡啶(Dalfampridine)；Daubert1-5Pestr(Matte)164z；癸基甲基亚砜；Dehydag Wax Sx；脱氢乙酸；Dehymuls E；苯甲地那铵；脱氧胆酸；葡聚糖；葡聚糖40；糊精；右旋糖；一水右旋糖；右旋糖溶液；泛影酸(Diatrizoic Acid)；双咪唑烷基脲(Diazolidinyl Urea)；二氯苄醇；二氯二氟甲烷；二氯四氟乙烷；二乙醇胺；焦碳酸二乙酯；癸二酸二乙酯；二乙二醇单乙基醚；邻苯二甲酸二乙基己酯；氨基乙酸二羟基铝；二异丙醇胺；己二酸二异丙酯；二亚油酸二异丙酯；二甲硅油350；二甲硅油共聚醇；二甲硅油Mdx4-4210；二甲硅油药液360；二甲基异山梨醇；二甲基亚砜；甲基丙烯酸二甲氨基乙酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；二甲基双十八烷基铵膨润土；二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷共聚物；Dinoseb铵盐；二棕榈酰磷脂酰甘油，D1-；二丙二醇；椰油酰两性基二乙酸二钠(Cocoamphodiacetate)；月桂基磺基琥珀酸二钠；月桂基磺基琥珀酸二钠；磺基水杨酸二钠；地索苯宁；二乙烯基苯苯乙烯共聚物；Dmdm Hydantoin；二十二醇(Docosanol)；多库酯钠；Duro-Tak 280-2516；Duro-Tak 387-2516；Duro-Tak 80-1196；Duro-Tak 87-2070年；Duro-Tak 87-2194；Duro-Tak 87-2287；Duro-Tak 87-2296；Duro-Tak 87-2888；Duro-Tak 87-2979；依地酸钙二钠(Edetate Calcium Disodium)；依地酸二钠；无水依地酸二钠；依地酸钠；依地酸；卵磷脂；Entsufon；Entsufon钠；表乳糖；盐酸表四环素；EssenceBouquet 9200；乙醇胺盐酸盐；乙酸乙酯；油酸乙酯；乙基纤维素；乙二醇；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；乙二胺；乙二胺二盐酸盐；乙烯-丙烯共聚物；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(28％乙酸乙烯酯)；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(9％乙酸乙烯酯)；羟基硬脂酸乙基己酯；对羟基苯甲酸乙酯；桉叶脑(Eucalyptol)；依沙美肟；可食用脂肪；硬脂肪；脂肪酸酯；脂肪酸季戊四醇酯；脂肪酸；脂肪醇柠檬酸盐；脂肪醇；Fd&C Blue No.1；Fd&C Green No.3；Fd&C Red No.4；Fd&CRed No.40；Fd&C Yellow No.10(退市)；Fd&C Yellow No.5；Fd&C Yellow No.6；氯化铁；氧化铁；Flavor 89-186；Flavor 89-259；Flavor Df-119；Flavor Df-1530；风味增强剂(Flavor Enhancer)；Flavor Fig 827118；Flavor Raspberry Pfc-8407；Flavor RhodiaPharmaceutical No.Rf 451；氟氯烃；甲醛；甲醛溶液分馏椰子油；Fragrance 3949-5；Fragrance 520a；Fragrance 6.007；Fragrance91-122；Fragrance 9128-Y；Fragrance93498g；Fragrance Balsam Pine No.5124；Fragrance Bouquet 10328；FragranceChemoderm 6401-B；Fragrance Chemoderm 6411；Fragrance Cream No.73457；FragranceCs-28197；Fragrance Felton 066m；Fragrance Firmenich 47373；Fragrance GivaudanEss 9090/1c；Fragrance H-6540；Fragrance Herbal 10396；Fragrance Nj-1085；Fragrance P O Fl-147；Fragrance Pa 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II；乳酸盐；乳酸；乳酸，Dl-；乳酸L-；乳糖酸；乳糖；一水乳糖；含水乳糖；Laneth；羊毛脂；羊毛脂醇-矿物油；羊毛脂醇；无水羊毛脂；羊毛脂胆固醇；羊毛脂非离子衍生物；羊毛脂，乙氧基化；氢化羊毛脂；劳拉氯铵；月桂基胺氧化物；Laurdimonium水解动物胶原；Laureth硫酸酯；Laureth-2；Laureth-23；Laureth-4；月桂酸二乙醇酰胺；月桂酸肉豆蔻二乙醇酰胺；月桂酰肌氨酸；乳酸月桂酯；十二烷基硫酸盐；Lavandula AngustifoliaFlowering Top；卵磷脂；卵磷脂未漂白；卵磷脂，蛋；氢化卵磷脂；卵磷脂，氢化大豆；卵磷脂，大豆；柠檬油；亮氨酸；乙酰丙酸；利多芬宁；轻质矿物油；轻质矿物油(85Ssu)；柠檬烯，(+/-)-；Lipocol Sc-15；赖氨酸；乙酸赖氨酸；一水赖氨酸；硅酸铝镁；硅酸铝镁水合物；氯化镁；硝酸镁；硬脂酸镁；马来酸；甘露醇；Maprofix；甲溴菲宁；医用粘合剂改性S-15；医用Antiform A-F乳液；甲磺酸二钠；亚甲磷酸；葡甲胺；薄荷脑；间甲酚；偏磷酸；甲磺酸；甲硫氨酸；甲醇；甲基Gluceth-10；甲基Gluceth-20；甲基Gluceth-20半硬脂酸酯(Sesquistearate)；甲基葡萄糖半硬脂酸酯；月桂酸甲酯；甲基吡咯烷酮；水杨酸甲酯；硬脂酸甲酯；甲基硼酸；甲基纤维素(4000Mpa.S)；甲基纤维素；甲基氯异噻唑啉酮；亚甲蓝；甲基异噻唑啉酮；对羟基苯甲酸甲酯；微晶蜡；矿物油；甘油单和二酯；柠檬酸单硬脂酯；一硫代甘油；多固醇提取物；肉豆蔻醇；乳酸肉豆蔻酯；肉豆蔻基-γ-氯化吡啶鎓(Myristyl-.Gamma.-Picolinium Chloride)；N-(氨基甲酰基-甲氧基Peg-40)-1,2-二硬脂酰基-脑磷脂钠；N,N-二甲基乙酰胺；烟酰胺；Nioxime；硝酸；氮；壬醇碘；壬苯醇醚(Nonoxynol)-15；壬苯醇醚-9；诺氟烷(Norflurane)；Oatmeal；十八碳烯-1/马来酸共聚物；辛酸；水杨酸辛酯；辛苯昔醇-1；辛苯昔醇-40；辛苯昔醇-9；辛基十二烷醇；辛基酚聚亚甲基；油酸；Oleth-10/Oleth-5；Oleth-2；Oleth-20；油醇；油酸油酯；橄榄油；羟亚甲基二膦酸二钠(OxidronateDisodium)；羟喹；棕榈仁油；Palmitamine Oxide；对羟基苯甲酸酯；石蜡；石蜡，白色柔和；Parfum Creme 45/3；花生油；精制花生油；果胶；Peg 6-32硬脂酸酯/乙二醇硬脂酸酯；Peg植物油；Peg-100硬脂酸酯；Peg-12月桂酸甘油酯；PEG-120硬脂酸甘油酯；Peg-120甲基葡萄糖二油酸酯；Peg-15 Cocamine；Peg-150二硬脂酸酯；Peg-2硬脂酸酯；Peg-20去水山梨糖醇异硬脂酸酯；Peg-22甲醚/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-25丙二醇硬脂酸酯；Peg-4二月桂酸酯；Peg-4月桂酸酯；Peg-40蓖麻油；Peg-40去水山梨聚糖二异硬脂酸酯；Peg-45/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-5油酸酯；Peg-50硬脂酸酯；Peg-54氢化蓖麻油；Peg-6异硬脂酸酯；Peg-60蓖麻油；Peg-60氢化蓖麻油；PEG-7甲醚；Peg-75羊毛脂；Peg-8月桂酸酯；Peg-8硬脂酸酯；Pegoxol 7硬脂酸酯；十五内酯；可可酸季戊四醇酯；戊酸五钠；三胺五乙酸钙三钠(Pentetate Calcium Trisodium)；戊酸；薄荷素油；Perflutren；Perfume 25677；PerfumeBouquet；Perfume E-1991；Perfume Gd 5604；Perfume Tana 90/42Scba；Perfume W-1952-1；矿脂；矿脂，白色；石油馏分；酚；酚，液化；Phenonip；苯氧乙醇；苯丙氨酸；苯乙醇；乙酸苯汞；硝酸苯汞；磷脂酰甘油，蛋；磷脂；磷脂，鸡蛋；Phospholipon 90g；磷酸；松针油(PinusSylvestris)；六水合哌嗪；Plastibase-50w；Polacrilin；泊利氯铵；Poloxamer 124；Poloxamer 181；Poloxamer 182；Poloxamer 188；Poloxamer 237；Poloxamer 407；聚(双(P-羧苯氧基)丙烷酐)：癸二酸；聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)二甲基乙烯基或二甲基羟基或三甲基封端；聚(Dl-乳酸-乙醇酸共聚物)，(50:50；聚(Dl-乳酸-乙醇酸共聚物)，乙基酯终止，(50:50；聚丙烯酸(250000Mw)；聚丁烯(1400Mw)；聚卡波非；聚酯；聚酯多胺共聚物；聚酯Rayon；聚乙二醇1000；聚乙二醇1450；聚乙二醇1500；聚乙二醇1540；聚乙二醇200；聚乙二醇300；聚乙二醇300-1600；聚乙二醇3350；聚乙二醇400；聚乙二醇4000；聚乙二醇540；聚乙二醇600；聚乙二醇6000；聚乙二醇8000；聚乙二醇900；聚乙烯高密度含氧化铁黑(<1％)；聚乙烯低密度含硫酸钡(20-24％)；聚乙烯T；聚对苯二甲酸乙酯；Polyglactin；聚甘油3油酸酯；聚甘油4油酸酯；聚甲基丙烯酸羟乙酯；聚异丁烯；聚异丁烯(1100000Mw)；聚异丁烯(35000Mw)；聚异丁烯178-236；聚异丁烯24 1-294；聚异丁烯35-39；聚异丁烯低分子量；聚异丁烯中等分子量；聚异丁烯/聚丁烯粘合剂；聚丙交酯；多元醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯1800；聚氧乙烯醇；聚氧乙烯脂肪酸酯；聚氧乙烯丙烯；Polyoxyl 20十八硬脂基醚；Polyoxyl 35蓖麻油；Polyoxyl 40氢化蓖麻油；Polyoxyl 40硬脂酸酯；Polyoxyl400硬脂酸酯；Polyoxyl 6和Polyoxyl 32硬脂酸棕榈酸酯；Polyoxyl聚二硬脂酸酯；Polyoxyl甘油硬脂酸酯；Polyoxyl羊毛脂；Polyoxyl棕榈酸酯；Polyoxyl硬脂酸酯；聚丙烯；丙二醇；聚季铵盐(Polyquaternium)-10；聚季铵盐-7(70/30丙烯酰胺/Dadmac；聚硅氧烷；Polysorbate 20；Polysorbate 40；Polysorbate 60；Polysorbate 65；Polysorbate 80；聚氨酯(Polyurethane)；聚乙酸乙烯酯；聚乙烯醇；聚氯乙烯；聚氯乙烯-聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯吡啶；罂粟籽油；钾碱；乙酸钾；钾明矾；碳酸氢钾；亚硫酸氢钾；氯化钾；柠檬酸钾；氢氧化钾；焦亚硫酸钾；磷酸氢二钾；磷酸二氢钾；钾皂；山梨酸钾；聚维酮丙烯酸酯共聚物；聚维酮水凝胶；聚维酮K17；聚维酮K25；聚维酮K29/32；聚维酮K30；聚维酮K90；聚维酮K90f；聚维酮/Eicosene共聚物；聚维酮；Ppg-12/Smdi共聚物；Ppg-15硬脂基醚；Ppg-20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯；Ppg-26油酸盐；Product Wat；脯氨酸；Promulgen D；Promulgen G；丙烷；推进剂(Propellant)A-46；没食子酸丙酯；碳酸丙烯酯；丙二醇；丙二醇二乙酸酯；丙二醇二辛酸酯；丙二醇单月桂酸酯；丙二醇单棕榈硬脂酸酯；丙二醇棕榈硬脂酸酯；丙二醇蓖麻油酸酯；丙二醇/尿素醛/对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯；对羟基苯甲酸丙酯；硫酸鱼精蛋白；蛋白质水解物；Pvm/Ma共聚物；Quaternium-15；Quaternium-15顺式；Quaternium-52；Ra-2397；Ra-3011；糖精；糖精钠；糖精无水钠；红花油；Sd醇3a；Sd醇40；Sd醇40-2；Sd醇40b；Sepineo P 600；丝氨酸；芝麻油；Shea Butter；Silastic牌医用级管；Silastic医用粘合剂，A型硅胶；二氧化硅，牙科；硅；二氧化硅；二氧化硅，胶体；硅酮；硅酮粘合剂4102；硅酮粘合剂4502；硅酮粘合剂Bio-Psa Q7-4201；硅酮粘合剂Bio-Psa Q7-4301；硅乳液；硅酮/聚酯薄膜带；西甲硅油；西甲硅油乳液；Sipon Ls 20np；苏打粉；乙酸钠；无水乙酸钠；烷基硫酸钠；抗坏血酸钠；苯甲酸钠；碳酸氢钠；硫酸氢钠；亚硫酸氢钠；硼酸钠；十水合硼酸钠；碳酸钠；十水合碳酸钠；一水碳酸钠；鲸蜡硬脂基硫酸钠；氯酸钠；氯化钠；氯化钠注射液；氯化钠注射液，抑菌；胆固醇硫酸钠；柠檬酸钠；椰油酰肌氨酸钠；脱氧胆酸钠；连二亚硫酸钠；十二烷基苯磺酸钠；甲醛次硫酸钠；葡萄糖酸钠；氢氧化钠；次氯酸钠；碘化钠；乳酸钠；乳酸钠，L-；Laureth-2硫酸钠；Laureth-2硫酸钠；Laureth-2硫酸钠；月桂酰肌氨酸钠；月桂基硫酸钠；月桂基磺基乙酸钠；焦亚硫酸钠；硝酸钠；磷酸钠；二水合磷酸钠；磷酸氢二钠；磷酸氢二钠无水；磷酸氢二钠，二水合物；磷酸氢二钠，十二水合物；磷酸氢二钠，七水合物；磷酸二氢钠，无水磷酸二氢钠；磷酸二氢钠，二水合物；磷酸二氢钠，一水合物；聚丙烯酸钠(2500000Mw)；焦磷酸钠；吡咯烷酮羧酸钠；羟甲基淀粉钠(Sodium StarchGlycolate)；六水合琥珀酸钠；硫酸钠；无水硫酸钠；无水亚硫酸钠；十水合硫酸钠；亚硫酸钠；磺基琥珀酸化十一烯单烷醇酰胺钠(Sodium Sulfosuccinated UndecyclenicMonoalkylolamide)；酒石酸钠；硫代乙醇酸钠；硫代马来酸钠；硫代硫酸钠；无水硫代硫酸钠；三偏磷酸钠；二甲苯磺酸钠；Somay 44；山梨酸；脱水山梨聚糖；脱水山梨糖醇异硬脂酸酯；脱水山梨酸单月桂酸酯；脱水山梨醇单油酸酯；脱水山梨糖单棕榈酸酯；脱水山梨糖醇单硬脂酸酯；山梨醇倍半油酸酯；脱水山梨酸三油酸酯；山梨酸三硬脂酸酯；山梨醇；山梨醇溶液；大豆粉；豆油；荷兰薄荷油(Spearmint Oil)；鲸蜡；角鲨烷；稳定的氧氯配合物(Oxychloro Complex)；2-乙基己酸亚锡；氯化亚锡；无水氯化亚锡；氟化亚锡；酒石酸亚锡；淀粉；淀粉1500，已预胶化；玉米淀粉；司拉氯铵(Stearalkonium Chloride)；司拉氯铵水辉石/碳酸丙烯酯；硬脂酰胺基乙基二乙胺；Steareth-10；Steareth-100；Steareth-2；Steareth-20；Steareth-21；Steareth-40；硬脂酸；硬脂酸二乙醇酰胺；硬脂氧基三甲基硅烷；硬脂基三甲基铵(Steartrimonium)水解动物胶原；硬脂醇；吸入无菌水；苯乙烯/异戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物；琥巯酸；琥珀酸；三氯蔗糖；蔗糖；蔗糖二硬脂酸酯；蔗糖聚酯；磺胺醋酰钠；磺丁基醚β-环糊精；二氧化硫；硫酸；亚硫酸；Surfactol Qs；塔格糖，D-；滑石；Tall油；牛油甘油酯；酒石酸；酒石酸，Dl-；Tenox；Tenox-2；叔丁基醇；叔丁基过氧化氢；叔丁基氢醌；四(2-甲氧基异丁基异氰化物)铜(I)四氟硼酸酯；四丙基原硅酸盐；Tetrofosmin；茶碱；硫柳汞；苏氨酸；百里酚；锡；二氧化钛；生育酚；托可索仑；全胃肠外营养，脂乳剂；三醋汀；甘油三辛酸酯；三氯一氟甲烷；Trideceth-10；三乙醇胺硫酸月桂酯；三氟乙酸；甘油三酯，中链；三羟基硬脂；Trilaneth-4磷酸盐；Trilaureth-4磷酸盐；柠檬酸三钠二水合物；Hedta三钠；Triton 720；Triton X-200；三乙醇胺；曲金刚胺；氨丁三醇(TRIS)；色氨酸；泰洛沙泊；酪氨酸；十一烯酸；Union 76Amsco-Res 6038；尿素；缬氨酸；植物油；氢化植物油甘油酯；氢化植物油；Versetamide；Viscarin；粘胶/棉；维生素E；蜡，乳化；Wecobee Fs；白地蜡(White Ceresin Wax)；白蜡；黄原胶；锌；乙酸锌；碳酸锌；氯化锌；和氧化锌。
本文公开的AAV颗粒的药物组合物制剂可包含阳离子或阴离子。在一个实施方案中，制剂包含金属阳离子，例如但不限于Zn2+、Ca2+、Cu2+、Mn2+、Mg+及其组合。作为非限制性实例，制剂可包括具有金属阳离子的聚合物和络合物(参见例如美国专利号6,265,389和6,555,525，其各自通过引用完整并入本文)。
本公开的制剂还可以包括一种或多种药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开化合物的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化为其盐形式(例如，通过使游离碱基团与合适的有机酸反应)来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基的碱金属或有机盐，例如羧酸；等等。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、乙酸、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚糖酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸酯、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒的盐。
本公开的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，可以通过在水中或在有机溶剂中，或在两者的混合物中使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计算量的合适的碱或酸反应来制备这些盐；通常，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。合适的盐的列表参见Remington’sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1985,第1418页,Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl andC.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008和Berge et al.,Journal of PharmaceuticalScience,66,1-19(1977)；其每一个的内容通过引用完整并入本文。
如本文所用，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指本公开的化合物，其中合适的溶剂的分子被掺入晶格中。合适的溶剂在所施用的剂量下是生理上可耐受的。溶剂化物可通过从包含有机溶剂，水或其混合物的溶液中结晶，重结晶或沉淀来制备。合适溶剂的例子是乙醇、水(例如一水，二水和三水合物)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲亚砜(DMSO)、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N'-二甲基乙酰胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯烷酮、苯甲酸苄酯等。当水为溶剂时，溶剂化物称为“水合物”。
IV.定义
如本文所用，术语“近似地”或“约”，如应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于所述的参考值的值。在某些实施方案中，术语“近似地”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的数值范围，除非另有说明或从上下文中明显(除非在此类数字将超过可能值的100％的情况下)。
如本文所用，术语“与...缔合”、“缀合”，“联系”、“附着”和“栓系”当就两个或多个部分而言使用时，是指该部分直接或经由充当连接剂的一个或多个另外的部分在物理上彼此缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得部分在使用结构的条件，例如生理条件下保持物理缔合。“缔合”不必严格地通过直接共价化学键键合来实现。也可以暗示离子或氢键键合或基于杂交的连接性足够稳定，以使“缔合”实体保持物理缔合。
如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一个或多个：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5’帽形成和/或3’末端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；(4)折叠多肽或蛋白质；和(5)多肽或蛋白质的翻译后修饰。
如本文所用，“病毒颗粒”是由至少两种组分组成的病毒，蛋白壳体和壳体内封闭的多核苷酸序列。
术语“基因表达”是指核酸序列经历成功转录并且在大多数情况下翻译以产生蛋白质或肽的过程。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，这应理解为意指测量可以是转录的核酸产物，例如RNA或mRNA，或翻译的氨基酸产物，例如多肽或肽。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法是本领域公知的。
如本文所用，“制剂”包括至少一种本公开内容的多核苷酸和/或化合物和/或组合物(例如，载体、AAV颗粒等)和递送剂。
如本文所用，“片段”是指整体的连续部分。例如，蛋白质的片段可以包含通过消化从培养的细胞分离的全长蛋白质而获得的多肽。在一些实施方案中，蛋白质的片段包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250或更多个氨基酸。在一些实施方案中，抗体的片段包括进行进行酶消化或原样合成的抗体的部分。
如本文所用，“有效负载”是指由病毒基因组编码或在病毒基因组内编码的一种或多种多核苷酸或多核苷酸区域或者此类多核苷酸或多核苷酸区域的表达产物，例如转基因、编码多肽或多-多肽的多核苷酸或调控核酸或调节核酸。
如本文所用，“有效负载构建体”是编码或包含在一侧或两侧侧翼有反向末端重复(ITR)序列的有效负载的一个或多个多核苷酸区域。有效负载构建体是在病毒生产细胞中复制以产生病毒基因组的模板。
如本文所用，“有效负载构建体载体”是编码或包含有效负载构建体以及用于在细菌细胞中复制和表达的调节区的载体。
如本文所用，“有效负载构建体表达载体”是编码或包含有效负载构建体，并且还包含一个或多个编码或包含用于病毒复制细胞中病毒表达的组分的多核苷酸区域的载体。
如本文所用，“肽”小于或等于50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
如本文所用，“病毒基因组”是编码至少一个反向末端重复(ITR)、至少一个调控序列和至少一个有效负载的多核苷酸。通过从有效负载构建体表达载体复制有效负载构建体来衍生病毒基因组。病毒基因组编码有效负载构建体的至少一个拷贝。
如本文所用，术语“转染”是指将外源核酸引入细胞的方法。转染的方法包括但不限于化学方法、物理处理和阳离子脂质或混合物。
如本文所用，术语“测定法”是指与报告的结果相关的活动顺序，其可以包括但不限于：细胞接种、测试材料的制备、感染、裂解、分析和结果计算。
如本文所用，术语“感兴趣的分子”是指本文提供的蛋白质及其片段、突变体、变体和改变。
如本文所用，术语“AADC反应”是指L-DOPA与AADC反应以形成多巴胺。
如本文所用，术语“效力”是指生物学活性的量度，例如蛋白质，例如酶，例如AADC的生物学活性的量度。在某些实施方案中，可以通过测量一段时间内L-DOPA向多巴胺的转化，以绝对量测量AADC的生物学活性。在某些实施方案中，可以通过将蛋白质的生物学活性与参考标准品的生物学活性进行比较来评估效力。可以通过测量由病毒载体(例如AAV载体)产生的蛋白质的生物学活性来评估效力。可以通过比较病毒载体(例如AAV载体)产生的蛋白质的生物学活性与参考病毒载体(例如参照AAV载体)产生的蛋白质的生物学活性来评估效力。例如，可以通过将AADC的生物学活性与参考AADC标准品的生物学活性进行比较来评估效力。可以通过测量由病毒载体(例如AAV载体)产生的AADC的生物学活性来评估效力。可以通过比较由病毒载体(例如AAV载体)产生的AADC的生物学活性与由参考AADC病毒载体(例如参照AADC AAV载体)产生的AADC的生物学活性来评估效力。
如本文所用，术语“载体”是指转运、转导或以其他方式充当异源分子(例如多核苷酸)的载体的任何分子或部分。“病毒载体”是包含一个或多个编码或包含感兴趣的分子的多核苷酸区域的载体。在本公开的上下文中，病毒载体和载体颗粒可以重组产生并且可以基于腺相关病毒(AAV)的亲本或参考序列。AAV已经成为用于基因转移到哺乳动物细胞的最广泛研究和利用的病毒载体之一，并且生产病毒载体的方法是本领域公知的。参见，例如，Tratschin等人,Mol.Cell Biol.,1985,5(11):3251-3260；Grimm等人,Hum.Gene Ther.,1999,10(15):2445-2450；Chiorini等人,J.Vir.1997,71:6823-33；Srivastava等人,J.Vir.1983,45:555-564；Chiorini等人,J.Vir.1999,73:1309-1319；Rutledge等人,J.Vir.1998,72:309-319；和Wu等人,J.Vir.2000,74:8635-47，其每一个的内容通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“感染复数”或“MOI”是试剂例如噬菌体或更一般地病毒与感染靶标例如细胞的比率，即感染每个细胞的病毒颗粒的平均数目。例如，当提及一组接种了病毒颗粒的细胞时，感染复数或MOI是病毒颗粒的数量与定义空间中存在的靶标细胞数量的比率。如本文所用，在病毒例如细小病毒的上下文中的“颗粒”是包括至少两个组分，蛋白质壳体组分和多核苷酸序列(例如在壳体组分内封闭的基因组)的病毒。
本文使用的术语“细胞”或“细胞系”是指允许病毒，例如细小病毒或依赖细小病毒(dependoparvovirus)，例如腺病毒或AAV(例如AAV2)复制，并且可以根据本公开和标准技术维持培养和用病毒载体感染的任何细胞。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在具体的实施方案中，细胞是肉瘤细胞，例如纤维肉瘤细胞。可以利用原代细胞或原代细胞培养物，也可以利用细胞系。细胞系的非限制性实例包括HT1080(例如，
Figure BDA0002836722570001001
CCL-121TM)人纤维肉瘤细胞系、CHO、HeLa、Vero、HEK293或HEK293K细胞系，或此类细胞系的变体。
如本文所用，“细胞裂解”是指细胞壁的破裂以释放细胞内容物。可以基于要裂解的细胞的细胞培养形式来选择细胞裂解方法。在一些实施方案中，化学裂解可用于裂解细胞。
如本文所用，术语“裂解剂”是指可以帮助破坏细胞的任何试剂。在某些情况下，将裂解剂引入溶液中，称为裂解溶液或裂解缓冲液。
如本文所用，术语“裂解溶液”是指包括一种或更多种裂解剂的溶液(通常是水溶液)。除裂解剂外，裂解溶液可包括一种或更多种缓冲剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂、冷冻保护剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。裂解缓冲液是包括一种或多种缓冲剂的裂解溶液。裂解溶液的其他组分可包括一种或更多种增溶剂。
如本文所用，术语“增溶剂”是指增强溶液的一种或多种组分的溶解度和/或接受溶液施加的一种或多种实体的溶解度的化合物。在某些情况下，增溶剂增强蛋白质的溶解度。在某些情况下，基于增溶剂在保持蛋白质构象和/或活性的情况下增强蛋白质溶解度的能力来选择增溶剂。在某些情况下，裂解剂可以选自裂解盐、两性剂、阳离子剂、离子型去污剂和非离子型去污剂。裂解盐可包括但不限于氯化钠(NaCl)和氯化钾(KCl)。
在一些实施方案中，进行机械细胞裂解。机械细胞裂解方法可包括使用一种或多种裂解条件和/或一种或多种裂解力。如本文所用，术语裂解条件是指促进细胞破坏的状态或环境，例如某些温度、压力、渗透纯度、盐度等。根据此类实施方案进行的细胞裂解可以包括冷冻-解冻裂解。如本文所用，术语冷冻-解冻裂解是指其中细胞溶液经历一个或多个冷冻-解冻循环的细胞裂解。根据冷冻-解冻裂解方法，将溶液中的细胞冷冻以诱导由冰晶的形成和膨胀引起的细胞膜的机械破坏。根据冷冻-解冻裂解方法使用的细胞溶液可以进一步包括一种或多种裂解剂、增溶剂、缓冲剂、冷冻保护剂、表面活性剂、防腐剂、酶、酶抑制剂和/或螯合剂。在一些实施方案中，可以根据美国专利号7,704,721中描述的任何方法进行冷冻-解冻裂解，该专利的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，机械细胞裂解可以包括用于破坏细胞的物理活动(“裂解力”)。裂解力可包括但不限于机械力、声力、重力、光学力、电动力(electrical force)等。根据裂解力可以使用的机械力可包括高剪切流体力和/或通过刮擦对细胞的物理破坏。
化学裂解的非限制性实例包括使用去污剂溶液或盐溶液。细胞的物理/机械裂解的非限制性实例包括超声处理、冷冻/解冻、混合或研磨。
如本文所用，术语“细小病毒”是指含有线性、单链DNA基因组的DNA动物病毒并涵盖细小病毒科，包括自主性复制的细小病毒和依赖细小病毒。自主性细小病毒包括细小病毒属、红病毒属(Erythrovirus)、浓核病毒、重复病毒属(Iteravirus)和Contravirus的成员。示例性自主性细小病毒包括但不限于小鼠细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒和B19病毒。其他自主性细小病毒是本领域技术人员已知的。
如本文所用，术语“芳香族L-氨基酸脱羧酶”或“AADC”是指参与L-DOPA的脱羧以产生多巴胺的酶。
如本文所用，术语“HT-1080细胞”是指源自纤维肉瘤的人永生化细胞系；该细胞系源自
Figure BDA0002836722570001011
(CCL-121)。当用本文所述的AAV2.AADC载体转导时，这些细胞对于AAV2是允许的并表达AADC酶。
如本文所用，术语“UHPLC-ECD”是指具有电化学检测器的超高效液相色谱。
如本文所用，术语“UHPLC-UV”是指具有紫外检测器的超高效液相色谱。
如本文所用，术语“样品”是指用于分析的单个测试物品。
V.等同方案和范围
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定根据本文所述本公开的特定实施方案的许多等同方案。本公开的范围不旨在限于以上描述，而是如所附权利要求书中所述。
在权利要求书中，诸如“一”、“一个/种”和“该”的冠词可以表示一个或超过多个，除非相反指出或从上下文中另外明显看出。若在给定的产品或过程中存在或采用一个或超过一个或所有组成员或者在其它情况下一个或超过一个或所有组成员与给定的产品或过程相关，则在组的一个或多个成员之间包含“或”的要求或描述将认为得到满意，除非相反指出或从上下文中另外明显看出。本公开包括如下的实施方案，其中给定的产品或过程中存在或采用刚好一个组成员或者在其它情况下刚好一个组成员与给定的产品或过程相关。本公开包括如下的实施方案，其中给定的产品或过程中存在或采用超过一个或所有组成员或者在其它情况下超过一个或所有组成员与给定的产品或过程相关。
还应注意，术语“包括”旨在是开放的并且允许但不要求包括附加的元件或步骤。当在本文中使用术语“包括”时，因此也包含和公开了术语“由...组成”。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常的理解相同的含义。本文描述了用于本公开内容的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适方法和材料。
在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解，除非另外指出或从上下文和本领域普通技术人员的理解中另外明显看出，否则在本公开的不同实施方案中，表示为范围的值可以假定所述范围内的任何特定值或子范围，至范围的下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。
另外，应当理解，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于此类实施方案视为本领域普通技术人员已知的，因此即使本文未明确提出排除，也可以将它们排除。出于何种原因(无论是否与现有技术的存在相关)，本公开的组合物的任何特定实施方案(例如，任何核酸或由其编码的蛋白质；任何生产方法；任何使用方法；等等)都可以从任何一项或多项权利要求中排除。
所有引用的来源(例如本文引用的参考文献、出版物、数据库、数据库条目和技术)通过引用并入本申请，即使在引用中没有明确说明。在引用的来源与本申请的声明存在冲突，则以本申请中的声明为准。
节和表的标题不是限制性的。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，章节标题、材料、方法和示例仅是说明性的，并不意图是限制性的。
尽管已经关于几个所描述的实施方案以某种长度和某些特殊性描述了本公开，但是并不意图将本公开限于任何此类细节或实施方案或任何特定的实施方案，而应参考所附权利要求书来解释，以便鉴于现有技术提供对这些权利要求的最广泛的可能的解释，因此，以有效地涵盖本公开的预期范围。
实施例
实施例1.UHPLC-UV的量化
在此实施例中描述了通过反相UHPLC和280nm紫外检测定量经AAV2.AADC转导的HT1080细胞裂解物中的多巴胺的方法。发现所有评估的参数(例如特异性、精确性、准确性和线性)均在预期的限度内。
将多巴胺标准品和由经AAV2.AADC转导的HT1080细胞产生的多巴胺的峰面积进行积分，并用于计算校准曲线和评估量化参数。将HT-1080细胞在烧瓶中培养，并接种在具有DMEMc培养基(DMEM+GLUTAMAX中10％FBS)的平板中。也将AAV2.AADC在DMEMc培养基中稀释以转导HT-1080细胞。转导温育后，将细胞用裂解缓冲液(1XPBS+Triton X-100)裂解。然后，将细胞裂解物在实施例3中教导的反应缓冲液中与L-DOPA反应，导致L-多巴被AADC酶脱羧成多巴胺。
阶段1
根据两种不同的方案，制备了用于定量的校准曲线，跨越从320到0.3μM的三个浓度对数。一种方案通过简单的两倍稀释覆盖整个范围，并且另一种方案提供了均匀间隔的浓度范围，以避免校准曲线的系统偏差。将第二个低浓度范围添加到后一个方案中，以更好地鉴定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。
根据以下时间表注射样品：校准标准品组1，一式三份的转染的裂解物，校准标准品组2，一式三份的加标(spiked)的转染的裂解物，校准标准品组3；总共64次注射。在每个标准品组和转染的裂解物组之间利用50％乙腈进行柱清洁方案。将64次注射重复连续五次。显示了首次进行64次注射的结果，并观察到其他四次的数据是等同的。
观察到的色谱图显示了多巴胺校准标准品整个范围的覆盖图。拟合的线性回归模型显示R2为0.999。这些结果显示可接受水平的数据线性度。
特异性的标准是：1)加标的细胞裂解物必须产生单个峰；2)加标的和未加标的细胞裂解物的洗脱时间与仅多巴胺标准品的洗脱时间之差必须为±0.1分钟；和3)没有来自空白对照的干扰峰。在本实施例中，观察到转染的细胞裂解物中的峰与观察到的多巴胺标准品的峰共洗脱。色谱图显示了20μM多巴胺标准品的叠加图，并且以MOI 1563转导的细胞裂解物掺有与16μM对应的多巴胺。与多巴胺标准品共洗脱，在加标的转导的裂解物中观察到单个峰。最低的多巴胺浓度(0.3μM)覆盖在模拟转导的全细胞裂解物上，并且在模拟转导的裂解物中未观察到干扰峰。
表2举例说明了对单一组64次注射的一式三份进行的计算。当比较标准品，转导的裂解物和加标的转导裂解物的平均时间时计算的底部三排中所报告的洗脱时间迁移为±0.1分钟。满足方案中规定的所有标准。
表2.特异性
Figure BDA0002836722570001041
准确性的接受标准设定为±20％的回收率，重复之间的回收率标准偏差(RSD)小于或等于10％。表2中的所有样品均符合这些标准。
精确性定义为RSD小于或等于10％的一式三份的积分峰面积。表2显示了对于所有转导的和加标的细胞裂解物样品以及校准标准品是真实的。除了最高(300μM)和最低(0.3μM)多巴胺浓度外，均符合标准。
通过重复一组64次注射5次，然后比较各次重复间的结果来评估可重复性。在5个连续重复中对相同的计算取平均值。统计数据显示，第一次运行得出的结论在五次测量的完整组中保持真实的。
检测限(LOD)定义为3.3σ/斜率，并且定量限(LOQ)定义为10σ/斜率。“σ”是5个最低稀释时响应的标准偏差，计算为校准线的y截距的标准偏差，并且“斜率”是校准曲线的斜率。平均LOQ为0.233μM，并且平均LOD为0.070μM。
阶段2
在阶段2，根据以下时间表注射样品：校准标准品组1，一式三份转染的裂解物，校准标准品组2，一式三份加标的转染的裂解物，和校准标准品组3总共72次注射。在每个标准品组和转染的裂解物组之间利用50％乙腈进行柱清洁方案。将72次注射重复连续五次。
表3显示了具有320至32μM范围中均匀间隔的稀释和从2.88至0.32μM的低浓度范围的校准曲线。使用0.32至2.88的低范围计算LOD和LOQ。在低范围内，R2为0.9996。
表3.来自校准曲线的值
Figure BDA0002836722570001051
Figure BDA0002836722570001061
所有支持特异性的色谱图均与实验1中的色谱图相当。观察到平均LOQ为0.723μM，并且观察到平均LOD为0.217μM。
阶段3
在阶段3(在具有不同柱的不同仪器上进行)，根据以下时间表注射样品：校准标准品组1，一式三份转染的裂解物，校准标准品组2，一式三份加标的转染的裂解物，校准标准品组3；总共72次注射。在每个标准品组和转染的裂解物组之间利用50％乙腈进行柱清洁方案。将72次注射重复连续五次。使用已经用于实验2的相同样品。
对于每个重复，校准曲线的线性拟合的R2为0.999。代表性色谱图与本文所述的先前实验中的色谱图是相当的。对于实验3，满足本文所述的特异性、准确性和精确性标准。平均定量限和检测限分别为0.625μM和0.188μM。
通过比较加标样品和未加标样品中转导细胞裂解物计算的多巴胺浓度，评估中等精确性。满足来自量化方案的接受标准(％RSD必须≤20％)。尽管在最低MOI的情况下，％RSD接近20。一个可能的原因是，对于MOI 24，平均浓度(0.9μM)非常接近定量限，其被确定为0.625至0.723μM之间。
为了评估流动相制剂响应其组分的随机变化的稳健性，制备了磷酸钠和辛磺酸的三种储备液，并通过它们的组合制备了九种流动相。可使用反应缓冲液中的多巴胺评估和比较用九种流动相的分析物迁移率。对九张色谱图进行了叠加，显示了通过将三种不同的磷酸钠储备液与三种辛磺酸钠储备液混合而制备的九种单独流动相的性能。洗脱时间显示于表4。
表4.不同流动相组合的洗脱时间
Figure BDA0002836722570001062
Figure BDA0002836722570001071
观察到多巴胺迁移率受流动相组成的影响。变化为等于1.75的％CV，并且未观察到可辨别的趋势。在整个实验过程中，观察到多巴胺与最接近的组分(DTT)的有效基线分离。
基于实验2和实验3的结果，确定校正标准品中多巴胺峰(水平S8，96μM)以及以MOI1563用细胞裂解物参考标准品转导的细胞裂解物的理论板计数和峰拖尾因子的接受标准。峰不对称性有助于评估色谱柱质量，且理论板计数是柱分离能力的度量。统计量报告于下表5中。
表5.理论板计数
Figure BDA0002836722570001072
根据此量化方案的可接受值对于参考标准品和校准标准品的不对称性为小于或等于1.23，并且对于参考标准品或校准标准品的板分别为≥5396或≥5385。考虑到相对较少的测量数量和有限数量的测试柱，将来可以审核这些数量。
本实施例中详述的活性证明通过反相UHPLC和280nm UV检测在经AAV2.AADC转导的HT1080细胞裂解物中的多巴胺定量达到特异性、线性、精确性的可接受的水平。建立了参考和校准标准品的检测限(LOD)和定量限(LOQ)以及峰形状的接受标准，并证明了用于色谱分离的流动相制备的稳健性。
实施例2.用杆状病毒产生AAV载体
AAV2.AADC是在Sf9/杆状病毒系统中产生的。解冻细胞库以在EFS AFTM昆虫细胞培养基(Expression Systems，LLC)中启动Sf9细胞培养物的扩充。使用摇瓶和WAVE生物反应器(GE Life Sciences)扩充活Sf9细胞的数量，以实现滚动接种到200L一次性生物反应器中。在一次性生物反应器中，将Sf9细胞在26-27℃下进一步扩充。然后，通过在26℃下用杆状病毒(BIIC)感染Sf9细胞来产生AAV载体颗粒，所述杆状病毒包括BIIC-rep2/cap2和BIIC-hAADC。Sf9细胞的化学裂解是在18-25℃下进行的，以从细胞核中释放AAV载体颗粒。通过使用免疫亲和层析和阴离子交换层析去除细胞碎片来澄清该物质。使用超滤(UF)和渗滤(DF)将AAV载体颗粒以目标浓度配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，然后在最终填充之前立即通过纳滤和0.2μM过滤澄清所得制剂。加入0.001％的普朗尼克酸(F-68)进行最终填充，得到药物产品。
实施例3.AADC效力/表达测定法：UHPLC-UV
试剂的制备
完全培养基(DMEMc)-将50mL胎牛血清等分试样在4℃融化过夜，然后将其移液至新瓶的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)+GLUTAMAXTM(在生物安全柜内)。将FBS加入DMEM后，将所得培养基用0.22μM瓶顶过滤器过滤消毒到干净的500mL无菌储存瓶中，标记为DMEMc，并注明制备日期和自制备日期起1个月的有效期。
1X PBS+0.2％Triton X-100-在缓冲瓶中将495mL的1X PBS与5mL的Triton X-100(20％储备液)合并，并涡旋混合溶液。将所得混合物通过500mL0.2μm瓶顶过滤器过滤到500mL储存瓶中，并在室温下储存。
抗坏血酸-10mM抗坏血酸溶液是使用HPLC水制备的，并等分取样到1.5mL微量离心管(每个450μL)中并在-20℃下储存。
巴吉林(10mM)-用HPLC水制备10mM巴吉林溶液，并等分取样到1.5mL微量离心管(每个450μL)中，并在-20℃下储存。
二硫苏糖醇(100mM)-用HPLC水制备100mM二硫苏糖醇溶液，并等分取样到1.5mL微量离心管(每个450μL)中，并在-20℃下储存。
吡哆醛-5'-磷酸(2mM)-使用HPLC水制备2mM吡哆醛-5'-磷酸溶液，并等分取样到4mL琥珀玻璃小瓶(每个2.25mL)中，并在-20℃下储存。
0.1M盐酸(HCl)-在通风橱中，将49.5mL HPLC水添加到50mL锥形管(Eppendorf)中。将500μL的10N HCl缓慢加入50mL锥形管(Eppendorf)中的水中。将管加盖并通过涡旋混合。将该溶液在室温下储存在酸储存柜中。
L-DOPA(20mM)-使用HPLC水和0.1M HCl制备20mM L-DOPA溶液。使用固定在箔纸包裹的150mL储存瓶上的150mL瓶顶过滤器(Corning，Inc.；目录号431161)对所得溶液进行无菌过滤，然后等分取样到1.5mL微量离心管(每个1.25mL)中，并在-20℃下储存。使用NANODROPTM测量L-DOPA储备液浓度，280nm处的UV-V(基座，1mm光程长)吸光度一式三份测量并求平均值。使用水作为仪器的空白。使用以下公式计算L-DOPA浓度：[[L-DOPA溶液浓度(mM)＝((吸光度(280nm))/((2.63cm-1mM-1)×0.1cm))×10]]。L-DOPA溶液的所得浓度为20±5mM。
多巴胺(4mM)-用HPLC水制备4mM多巴胺溶液。使用固定在箔纸包裹的50mL锥形管上的50mL管顶过滤器对所得溶液进行无菌过滤，然后等分取样入1.5mL微量离心管(每个500μL)中，并在-20℃下储存。使用NANODROPTM测量多巴胺浓度，并使用UV-V(基座，1mm光程长)测量(一式三份)在280nm处的平均吸光度。使用水作为仪器的空白。使用以下公式计算多巴胺浓度：[[多巴胺储备液浓度(mM)＝((吸光度(280nm))/((2.07cm-1mM-1×0.1cm)×10)]]。多巴胺溶液的所得浓度为4±0.1mM。
0.5M高氯酸(PCA)-在通风橱中，将5.4mL的60％高氯酸(9.2M)缓慢添加到瓶中的94.6mL HPLC水中，将瓶盖上盖子，轻轻搅拌使其混合。将该溶液在室温下储存。
0.724M的磷酸二氢钠溶液(10X储备液)，pH 3.0-使用分析天平，测得86.9g的NaH2PO4。将86.9g NaH2PO4在烧杯中溶于900mL HPLC水中，在磁力搅拌板上搅拌。使用pH探针检查溶液的pH。通过逐滴添加磷酸将溶液的pH调节至3.0。将该溶液转移至1L的量筒中(移开磁力搅拌棒)，并用HPLC水将体积补足至1000mL。溶液通过连接到1L储存瓶的500mL瓶顶过滤器过滤，并在室温下储存。
100mM辛磺酸-使用分析天平，测得10.8g辛磺酸钠。将10.8g辛磺酸在量筒中溶于400mL HPLC水，在磁力搅拌板上搅拌。移除磁力搅拌棒，并用HPLC水将体积补足至500mL。溶液通过连接到500mL储存瓶的500mL瓶顶过滤器过滤。将该溶液在室温下储存。
AADC流动相(缓冲液A)-将HPLC水(700mL)、100mL乙腈、100mL 0.724M NaH2PO4(10X储备液)和32mL 100mM辛磺酸合并在1000mL量筒中，用HPLC水将体积补足至1000mL。将该溶液转移至1L玻璃瓶中并充分混合。使用pH探针检查溶液的pH。如果必要的话，使用磷酸将溶液的pH调节至3.0。通过超声处理将缓冲液脱气10分钟。
50％乙腈(缓冲液B)-将HPLC水(500mL)和500mL乙腈合并在1000mL量筒中。将该溶液转移至1L玻璃瓶中并充分混合。通过超声处理将缓冲液脱气10分钟。
接种HT-1080细胞
本文所述的基因疗法载体能够转导壳(putamen)中的细胞以在突触后神经元中表达AADC酶。本文描述了AADC效力/表达测定法，其基于生物活性的EC50评价来评估载体递送的AADC基因疗法的效力。这是相对于测量转导后蛋白质浓度的可用AADC ELISA试剂盒的一项进步，所述浓度并非生物活性的直接测量。该实施例中的效力测定法分析已经用AADC编码基因疗法载体转导的细胞，自细胞产生的裂解物中AADC介导的L-DOPA向多巴胺的转化以及所产生的多巴胺的测量。
具体而言，使用P300多通道移液器(以避免剪切)以5x103个细胞/孔的密度将HT1080细胞(
Figure BDA0002836722570001101
CCL-121)接种在DMEM+10％FBS中，在Corning cellbind 96孔板中，并且以37±2℃的温度温育24±2小时。一块96孔板用于测试两个AADC载体样品(其中每个MOI一式三份进行测试)。AAV2.AADC载体参考标准品和阳性对照使用一块额外的板。用多孔粘合膜密封板，以减少蒸发并维持整个板区域内气体交换的均匀性。将盖置于每个板的顶部。
或者，将100μL HT-1080细胞以1 x 104个细胞/孔的密度接种在96孔板中的完全培养基(DMEMc)中，并在37±2℃下温育21±3小时。一个板用于AAV2.AADC参考标准品和阳性对照。
载体计算和稀释
在生物安全柜中，将10mL DMEM+10％FBS(每板的细胞)在50mL锥形管(Eppendorf)中于37℃水浴中温热约5至30分钟。对于每种载体、阳性对照和参考标准品，计算添加到HT1080细胞中的载体和DMEM+10％FBS的体积。一式三份进行载体稀释，并在细胞的相邻孔中进行测试。为了减少错误，添加到DMEM+10％FBS的载体数量大于20μL但小于200μL。如果计算出的载体体积在此范围外，则将载体用1X PBS稀释(例如1:5、1:10、1:20)。使用载体的ddPCR滴度计算出达到MOI 200,000所需的载体量。如果需要稀释载体储备液，则稀释因子应包括在以下计算中；如果稀释载体储备液是必需的，则稀释因子应为1。
Figure BDA0002836722570001111
从200μL的总体积中减去所需载体的体积，以确定所需的DMEM+10％FBS的量。
DMEM体积+10％FBS(μL)＝200μL-载体体积(μL)
载体稀释液是在1.5mL Safe-Lock微量离心管(Eppendorf，目录号022363212或等同物)中的1XPBS中制备的。在单独的板中，将100μL DMEMc添加到除顶排以外的所有孔中。然后将AAV2.AADC载体(在1X PBS中稀释至2x108 vg/μL的起始浓度)在DMEMc中以1：8稀释，然后将200μL加入板的顶排。然后将顶排中的溶液沿板向下连续稀释。使用多通道移液器向每个连续的孔中添加100μL，进行两倍连续稀释。将每种稀释液混合，然后移至下一个稀释液，并在两次稀释液之间更换移液器吸头。表6显示了载体稀释方案的一个实例。
表6.载体稀释方案
Figure BDA0002836722570001112
Figure BDA0002836722570001121
细胞转导
从培养箱中移出96孔细胞培养板，并使用倒置相差显微镜证实细胞似乎健康且大约60-80％汇合。将板放置在生物安全柜(BSC)中。
使用P20多通道移液器，为了避免破坏细胞单层，将载体稀释液(20μL)添加到细胞中，一次一排添加到孔侧面的液面上。用多孔粘合膜密封板以减少蒸发并维持整个板区域间气体交换的均匀性，并在板顶部放置盖子。然后，将细胞以8字形的方式轻轻摇动5-10次，以均匀分布载体，然后放回到37±2℃的培养箱中48±4小时(通常为44-52小时)。
转导后，使用固定到真空线中的血清学移液器的未过滤的P200移液器吸头，一次一孔吸出培养基。然后，用P200多通道移液器将100μL 1X PBS应用于每个孔的侧面，以洗涤细胞。移液器吸头放置在孔侧面的液体表面，以避免细胞破裂。通过使用P200多通道移液器将100μL 1X PBS加入孔的侧面来洗涤细胞，注意避免干扰细胞。将板侧面对侧面轻轻摇动。使用固定到真空线中的血清学移液器的未过滤的P200移液器吸头从孔中吸出1XPBS。
细胞裂解
对于两个96孔板，通过向9.9mL的1X PBS+0.2％Triton X-100中添加100μL的100XHalt Protease Inhibitor Cocktail来制备10mL裂解缓冲液溶液。根据运行的板数，以5mL的倍数制备溶液。在使用当天制备裂解缓冲液，并丢弃未用于细胞裂解的任何溶液。
转导后48±4小时收获细胞。使用P50多通道移液器，在每个孔中用50μL裂解缓冲液(50μL 1x Halt Protease Inhibitor Cocktail+1x PBS+0.2％Triton X100)裂解细胞。用石蜡膜将板围绕边缘密封。将板在-80℃下冷冻30分钟或长达72小时，在室温下解冻直至所有冰融化。使用P50多通道移液器，每排细胞裂解物通过上下吸移裂解液几次进行混合。将裂解物转移到96孔PCR板中并用密封膜覆盖。将96孔PCR板在3500-4000RPM，例如3750RPM下离心10分钟以沉淀细胞碎片。在进行AADC反应之前，使用P50多通道移液器将上清液(“澄清的细胞裂解物”)转移到新板中(裂解物也可以在-80℃下储存长达72小时)，注意避免破坏孔底部的细胞沉淀。用密封膜覆盖该板。
多巴胺标准曲线
通过在1.5mL Safe-Lock微量离心管(Eppendorf，目录号022363212或等同物)中的1X PBS+0.2％Triton X-100中稀释4mM多巴胺储备液，制备11点多巴胺标准曲线。稀释示于表7。如果多巴胺储备液不刚好为4mM，则调整标准品S1、S2和S3的计算。
表7.多巴胺标准曲线稀释液
Figure BDA0002836722570001131
在96孔PCR板中，使用P200多通道移液器在11个连续的孔(例如A1-A11)中，将AADC反应缓冲液(180μL)与20μL相应的多巴胺标准品组合。添加20μL相应的多巴胺标准品到11个孔中的每个中，以模拟将AADC细胞裂解物添加到AADC反应中。在每个孔中添加10μL HPLC水作为“模拟L-DOPA添加”。用P200多通道移液器向每个孔中加入40μL冷的0.5M高氯酸以“模拟淬灭”反应。移液每个孔进行混合。使用Bio-Rad PX1TMPCR板密封器将板用热封膜密封，然后将板放入UHPLC自动取样器或保持在4℃直至准备使用。
AADC反应
通过以下方案制备AADC反应。如果冷冻，将细胞裂解物(储存在96孔板中)在工作台(benchtop)上解冻。将一管阳性对照细胞裂解物也在工作台上解冻，并且解冻后置于冰上或4℃。
在工作台解冻实验所需的20mM L-DOPA管。解冻后，将它们放在冰上或4℃，当天使用或丢弃。向每个孔中加入L-DOPA(10μL，20mM)，并将板在37℃下温育30分钟。然后，将板转移至冰浴(2-8℃)中。加入预冷的0.5M高氯酸(PCA)(40μL)淬灭反应。
使用P200多通道移液器或重复移液器，将180μL AADC反应缓冲液添加到每个孔中，以在96孔PCR板中使用。另外，将180μL AADC反应缓冲液作为AADC反应阳性对照添加到不同的孔中。加入20μL AADC细胞裂解物阳性对照，并且移液混合。
使用P20多通道移液器向剩余的含反应缓冲液的孔中加入20μL AADC细胞裂解液，并用移液器混合。
将该板用密封膜覆盖，并在96孔板离心机中旋转15秒以在孔底部收集内容物。将板置于37℃培养箱中5±1分钟。
从培养箱中移出板，并丢弃密封膜。将L-DOPA管的内容物转移到试剂容器中。使用P20多通道移液器向每个孔中加入10μL 20mM L-DOPA溶液，然后通过移液进行混合。一旦将L-DOPA加入板，反应将迅速进行；因此，这些步骤是高度时间敏感的。
将该板用密封膜覆盖，并置于设定在37℃的培养箱中30±1分钟。给大冰盘装满冰。将含有12mL 0.5M高氯酸的15mL锥形管(Eppendorf)以及96孔塑料板支架(holder)放于冰上，使其冷却。温育30±1分钟后，将板转移至冰浴中5±1分钟以冷却至2-8℃。5±1分钟后，立即将板转移到冷却的板支架上，并除去密封膜。
将预冷的(2-8℃)0.5M高氯酸(PCA)转移到试剂容器中。使用P200电子多通道移液器添加40μL预冷的0.5M PCA淬灭反应。使用Bio-Rad PX1TMPlate Sealer用热封膜密封板。
UHPLC-UV分析
UHPLC-UV用于检测样品中的多巴胺。使用以下方案进行UHPLC-UV。将多巴胺标准品和样品放入设置为4℃的预冷UHPLC自动取样器中。将新的保护盒(cartridge)插入保护柱(BDS Hypersil保护柱，3 x 10mm，3μm，目录号28105-013001(ThermoScientific))，并固定在50mm C18柱上。冲洗缓冲液A1和缓冲液B1的线，并且将10mL的50％乙腈(缓冲液B)和分别地10mL的AADC流动相(缓冲液A)运行通过柱。在运行多巴胺标准品或样品之前，进行一系列十次测试注射以确保柱和UHPLC系统正常运行。通常十次多巴胺标准品S1注射是足够的。样品在50mm C18柱上在280nm下运行3分钟，具有以下UHPLC运行参数：1)泵：0.5mL/minAADC流动相(缓冲液A)；2)注射：5μL样品；和3)柱温：35℃。
大约每12个样品后，进行UV清洁步骤以清洁柱并平衡UV检测器。0.5mL/min的50％乙腈(缓冲液B)处理3分钟，然后以0.5mL/min的AADC流动相(缓冲液A)处理7分钟。在UV清洁步骤之后，使用多巴胺标准品SNEG注射平衡柱。储存前，用10mL 50％乙腈(缓冲液B)冲洗该柱以对其进行清洁。使用CHROMELEONTM色谱数据系统软件(Thermo Scientific)中的自动积分功能对多巴胺峰进行积分。
使用CHROMELEONTM色谱数据系统软件(Thermo Scientific)将多巴胺峰面积与多巴胺标准曲线相关联(多巴胺标准点：300、250、200、150、100、50、25、10、5、0.5μM)。在GraphPad软件(Prism)或等效的数据分析包中绘制来自每个MOI的所有重复的多巴胺浓度。将数据拟合到四参数逻辑曲线([激动剂]对响应变量的斜率(四个参数))：
Figure BDA0002836722570001151
其中A＝上渐近线(“顶部”)；B＝动态范围的斜率(“坡斜率”)；C＝EC50(EC50)；和D＝下渐近线(“底部”)。
相对效力表示为EC50与参考标准品的偏离。AADC相对效力使用以下公式表示为参考标准品与测试样品的EC50值之比：
Figure BDA0002836722570001152
L-DOPA浓度的优化
在以下L-DOPA浓度下制备了8种不同的L-DOPA储备液浓度：0.3mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM、20mM、50mM、97mM。在一系列的三个实验中，如实施例3所述，使用先前制备的AADC细胞裂解物和各种浓度的L-DOPA储备液进行AADC反应。所得多巴胺剂量响应曲线表明，用20mM L-DOPA产生峰值多巴胺产量。
AADC反应温育时间的稳健性
在剂量响应曲线的上渐近线中观察到的潜在变化性来源涉及AADC反应的时机。如果过早停止酶促反应或让其进行额外的时间，则可能会对产生的多巴胺产物的量具有影响。研究了反应的三个部分的稳健性：(1)反应缓冲液和细胞裂解物在37℃下温育5分钟，(2)添加L-DOPA以引发AADC反应，其在37℃进行30分钟，和(3)在冰上保持5分钟以减缓反应，然后用高氯酸(PCA)淬灭。
用先前制备的AADC细胞裂解物和反应缓冲液(如实施例3)建立AADC反应，并在添加L-DOPA之前于37℃温育2、5或10分钟，并且其余反应正常进行。在另一个测试中，在将板移至冰上之前，AADC反应时间在28、30或32分钟变化。最后，允许前面的温育步骤和AADC反应步骤正常进行，但是在冰上的最终步骤在淬灭前的3、5或7分钟变化。所得的结果表明，基于步骤1、步骤2和步骤3的温育时间变化，多巴胺产生略有不同，有利的条件如下：步骤1：37℃达5±2分钟，步骤2：37℃达30±2分钟，第3步：在冰上达5±2分钟。
测定法内和测定法间变化性
由一名操作员进行单一实验，含有阳性对照和参考标准品两者的四个板用于运行AADC活性测定法。将每个板运行的每个MOI的一式三份数据点取平均值，并将四个板中每个板的结果拟合到四参数曲线。为了获得更有意义的比较，在进行四参数拟合之前，将底部渐近线(D)值都强制为零，因为该值似乎在四个参数内贡献较大的变化性，对曲线拟合的总体影响较小。在四参数拟合之后，在四个变量中观察到的最大变化性源于这两个数据集的EC50值。在包含四个板的单次测定运行中，阳性对照的平均EC50值为12,779.75，CV为10.95％，而对于参考标准品，它为8964.75，CV为17.87％。尽管对于标准测定法，％CV值略高，但对于基于细胞的效力测定法，这些数目被认为处于可接受的范围内，对于所述测定法，通常对测定法和样品接受标准设置10-30％CV。
实施例4.AADC效力/表达测定法：UHPLC-ECD
试剂的制备
完全培养基(DMEMc)-将55mL胎牛血清等分试样添加到一瓶新的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)+GLUTAMAXTM(在生物安全柜中)。将5.5mL青霉素/链霉素添加到瓶中，然后将其涡旋以混合溶液。将得到的混合物过滤并在2-8℃的室温下储存。
1X PBS+0.2％Triton X-100-将990mL的1X PBS与5mL的Triton X-100(20％储备溶液)在缓冲瓶中组合，并涡旋以混合溶液。将所得混合物过滤并在室温下储存。
抗坏血酸(10mM)-10mM抗坏血酸溶液是使用10mL HPLC水和0.0176g抗坏血酸制备的，调节至目标浓度。将混合物等分取样到试管中并在2-8℃下储存。
巴吉林(10mM)-用10mL HPLC水和0.0196g巴吉林制备10mM巴吉林溶液，调节至目标浓度。将混合物等分取样到试管中并在2-8℃储存。
二硫苏糖醇(100mM)-用10mL HPLC水和0.1543g二硫苏糖醇制备100mM二硫苏糖醇溶液，调节至目标浓度。将混合物等分取样到试管中并在2-8℃下储存。
吡哆醛-5'-磷酸(2mM)-使用35mL HPLC水和0.0173g吡哆醛-5'-磷酸制备2mM吡哆醛-5'-磷酸溶液，调节至目标浓度。将混合物等分取样到试管中并在2-8℃下储存。
0.1M盐酸(HCl)-在通风橱中，将49.5mL HPLC水添加到50mL锥形管中。将500μL10N HCl缓慢加入到50mL锥形管中的水中。将管加盖并涡旋混合。将该溶液在室温下储存在酸储存柜中。
L-DOPA(0.3mM)-使用10mL HPLC水和0.00986g-DOPA制备0.3mM L-DOPA溶液，调节至目标浓度。将混合物过滤到箔纸包裹的150mL储存瓶中，然后等分取样入1.5mL微量离心管(每个1.25mL)中，并在-20℃下储存。使用NANODROPTM测量L-DOPA储备液浓度，并使用UV-V(基座，1mm光程长)(一式三份)测量280nm处的平均吸光度。使用水作为仪器的空白。使用以下公式计算L-DOPA浓度：[[L-DOPA溶液浓度(mM)＝((吸光度(280nm))/((2.63cm-1mM-1)×0.1cm))×10]]。所得L-DOPA溶液的浓度为0.3mM。
多巴胺(1mM)-使用10mL 0.1M HCl和0.00948g多巴胺在不暴露于光的情况下制备1mM多巴胺溶液，调节至目标浓度。将混合物过滤到箔纸包裹的50mL储存管中，然后等分取样入1.5mL微量离心管(每个0.5mL)中，并在-20℃下储存。使用NANODROPTM测量多巴胺浓度，使用UV-V(基座，1mm光程长)(一式三份)测量280nm处的平均吸光度。使用水作为仪器的空白。使用以下公式计算多巴胺浓度[[多巴胺储备液浓度(mM)＝((吸光度(280nm))/((2.07cm-1mM-1×0.1cm)×10)]。所得多巴胺溶液的浓度为1mM。
0.5M高氯酸(PCA)-在通风橱中，将5.4mL的60％高氯酸(9.2M)缓慢添加到瓶中的94.6mL HPLC水中，将瓶盖上盖子，轻轻涡旋使其混合。将该溶液在室温下保存。
反应缓冲液-将300mL无核酸酶的水加入1L铝箔包裹瓶中。向瓶中添加以下物质：50mL pH 7.2的磷酸钠(500mM)；5mL抗坏血酸(10mM)；5mL的巴吉林(10mM)；5ml二硫苏糖醇(100mM)；25mL吡哆醛-5'-磷酸(2mM)；100μL EDTA(500mM)。将溶液混合并储存在-20℃。
接种HT-1080细胞，稀释液和转导
将HT1080细胞(
Figure BDA0002836722570001181
CCL-121)以1x104个细胞/孔的密度接种在24或96孔板中的完全培养基(DMEMc)中，并在37±2℃下温育18-24小时。在单独的板中，将100μL DMEMc添加到除顶排以外的所有孔中。然后将AAV2.AADC载体(在1x PBS中稀释至2x108 vg/μL的起始浓度)在DMEMc中以1：8稀释，然后添加(200μL)到板的顶排。然后将顶排中的溶液沿着板向下连续稀释，如表8所示。将载体稀释液(20μL)加入细胞中，然后将细胞放回到培养箱中，持续期望的转导时间(通常为44-52小时)。
表8.载体稀释方案
稀释编号 MOI 温热的DMEMc 载体
稀释D1 25,000 - 200μL
稀释D2 12,500 100μL 100μL D1
稀释D3 6,250 100μL 100μL D2
稀释D4 3,125 100μL 100μL D3
稀释D5 1,563 100μL 100μL D4
稀释D6 781 100μL 100μL D5
稀释D7 391 100μL 100μL D6
稀释D8 195 100μL 100μL D7
稀释D9 98 100μL 100μL D8
稀释D10 49 100μL 100μL D9
NEG 0 100μL -
细胞裂解与AADC反应
转导后，吸出培养基，然后在PBS中洗涤细胞，并用50μL裂解缓冲液(50μL 1x HaltProtease Inhibitor Cocktail+1x PBS+0.2％Triton X100)裂解。将板在-80℃下冷冻30分钟直至72小时，解冻，然后离心(3750RPM 10分钟)。在进行AADC反应之前，将上清液(“细胞裂解物”)转移至新板中(裂解物也可以在-80℃下储存长达72小时)。
将反应缓冲液(180μL)与20μL细胞裂解物组合，并在37℃的培养箱中温育5分钟。向每个孔中加入L-DOPA(10μL，0.3mM)，将板在37℃下温育30分钟，然后转移到冰浴(2-8℃)中。加入预冷的0.5M高氯酸(PCA)(40μL)淬灭反应。然后使用耦合到电化学检测器(UHPLC-ECD)的超高压液相色谱法分析样品。
UHPLC-ECD分析
UHPLC-ECD用于检测样品中的多巴胺。在50mm C18柱(BDS Hypersil C18反相柱，3x 50mm，5μm，目录号28105-053030(ThermoScientific))上，使用与电化学检测器耦合的超高效液相色谱法(UHPLC-ECD)分析样品，具有以下运行参数：泵：0.5ml/min ThermoFisher#70-3829的测试流动相(乙腈、磷酸盐缓冲液和离子剥离(paring)剂的有机混合物)；注射：5μL样品；运行时间：2.5分钟；ECDRS1：250mV，ECDRS2：400mV；数据采集速率：10Hz；柱温：35℃。使用Chromeleon软件分析多巴胺峰。
UHPLC-ECD对多巴胺的电化学响应以电流(μA)进行测量。为了将该测量值转换为产生的多巴胺量，利用了多巴胺标准曲线。用0.1M HCl溶解多巴胺，并使用280nm处的吸光度(消光系数＝2.07cm·1mM·1)确定浓度。消光系数根据经验确定。将多巴胺在水中稀释至1mM，等分取样并在-20℃冷冻。冷冻储备液在280nm处的吸光度是在将其融化以确保质量时进行测量的。然后将1mM储备液在AADC反应缓冲液中稀释至顶部标准点(最终浓度80μM)。然后将该标准品在反应缓冲液中进行连续稀释(2倍稀释)以生成标准曲线。当一式三份地分析每个样品时，色谱图中的差异很小，如图5B所示。
在绘制原始多巴胺面积时，在两个最集中的点存在一些非线性。从标准曲线中去除这两个点使最佳拟合线更紧密地代表较低的浓度(图5A)。作为参考，对测得的AAV2.AADC最低MOI(49vg/细胞)具有多巴胺面积约为1x10-3μA/min。为了量化较低MOI的多巴胺水平，所选最佳拟合线的Y轴截距尽可能接近零。标准曲线中所有点的Y截距为3.9x10-3μA/min。通过去除标准曲线中顶部两个点，Y轴截距降低到4.0x10-4μA/min，其低于最低的MOI。除去标准曲线中的顶部四个点将Y截距降低到7.3x10-5μA/min。尽管除去顶部四个点改善在低浓度多巴胺时的灵敏度，但它也减小较高浓度多巴胺的范围。对于所测试的剂量响应范围内的最高的MOI，多巴胺的面积范围为3x10-2至6x10-2μA/min。如果去除标准曲线的超过顶部两个点，则无法准确确定较高MOI的多巴胺浓度。
确定参考标准品的稳定性
对实施例4中使用的AAV2.AADC载体参考标准品在2-8℃的短期稳定性(滴度为1.5x109 vg/μL，每瓶250μL装瓶；剂量响应范围内的最高剂量为约2x108 vg每孔)进行了分析。平行测试两个小瓶。将一个小瓶新鲜融化，并且将另一个在3个月前解冻并在2-8℃储存。两个样品之间的数据是相当的(图6，表9)。这些数据表明参考标准品可以在2-8℃保持至少多达3个月。
表9.图6中曲线的四参数曲线拟合数据。
样品 底部 斜率 顶部 EC<sub>50</sub>
AAV2.AADC(新鲜) 7.65E-05 1.276 0.01954 1087
AAV2.AADC(3个月) -1.49E-04 1.201 0.02186 1061
裂解物样品稳定性分析
对来自实施例4的细胞裂解物进行了短期稳定性研究。
将裂解物样品保持在2-8℃冷冻器、-20℃冷冻器和-80℃冷冻器中。在-80℃的第一天后观察到裂解物具有一些活性损失，然后在30天后活性略有下降。相反，保持在-20℃和2-8℃的细胞裂解物在前4天内具有迅速的活性丧失。
另外，将裂解物冷冻/解冻数次以确定在多次冷冻/解冻后是否存在AADC活性的损失。在-80℃反复进行冷冻/解冻循环后，观察到代表性的裂解物在第一次和第二次冷冻/解冻之间的多巴胺生成减少(约40％)，但在最初下降后稳定下来。
还测试了裂解物样品以分析暴露于热和UV的效应。示于图7和表10的结果显示了暴露于热和UV对裂解物样品的显著影响。
表10.图7中曲线的四参数曲线拟合数据。
载体样品 底部 斜率 顶部 EC<sub>50</sub> 参考的％
新鲜的，未处理的 -0.1349 1.122 13.48 1983 100
加热处理的 -0.02323 1.275 2.062 11266 17.60
UV处理的 0 * * * *
效力测定法的适当剂量范围(MOI)的确定
本领域中的AADC ELISA测定法通常在转导中使用有限的剂量范围(每个细胞63、125、250、500和1000个载体基因组)。为了准确测量相对于参考标准品的效力，需要一个完整的剂量响应范围，包括在对数标度(scale)上绘制MOI(感染复数)时的上和下渐近线两者。
为了确定该效力测定法的合适范围，使用实施例4中描述的方法，以每个细胞10至10,000个载体基因组(VG)的量，用AAV2.AADC载体转导HT1080细胞。裂解细胞，并确定酶活性，其在图1中显示。绘制剂量响应(多巴胺对MOI)，并将数据拟合到4参数逻辑(logistic)曲线。对于此分析，将拟合参数用作读数。使用10到10,000vg/细胞的剂量范围，每个细胞10-25个载体基因组之间观察到较低的渐近线。每个细胞的MOI大于2500个载体基因组时，观察到了上渐近线。
提高AADC效力测定法的通量
使用24孔板进行实施例4F中所述的测定法。使用96孔板进行相似的测定法，以测试更高的测定通量的96孔板的可行性。
首先，基于温育时间测试96孔板的变化性。用AAV2.AADC载体在96孔板中转导HT1080细胞达24或48小时，之后使用实施例4中所述的裂解缓冲液裂解细胞。96孔板中24小时和48小时剂量响应曲线显示转导时间依赖性，在48小时转导时间样品中观察到更大的AADC活性(图2)。分析了9种不同的MOI，从50-10,000。每个剂量一式三份进行测试。每个生物学重复中活性的测量值是一致的(方差系数<10％)。
接下来，测试96孔板的测定法间变化性和可重复性。将AAV2.AADC载体用作参考标准品，并在实施例4的AADC效力测定法的五次独立运行中分析八次。将载体新鲜制备(标记为“新鲜的”)或在-80℃下储存1或3个月。检查了这些运行的一致性和变化性。确定每个样品的活性(图3)，并且将数据的变化性总结在下表11中。
表11.图3中曲线的四参数曲线拟合数据。
Figure BDA0002836722570001211
Figure BDA0002836722570001221
如表11所示，在比较拟合参数变化性时，顶部和底部基线值是最可变的。从AADC反应产生的多巴胺的量存在变化。
检测与淬灭有关的AADC效力测定法变化性
可变性的潜在来源是酶促反应淬灭左右的时机。实施例4中的反应在37℃发生30分钟，并用冰冷的高氯酸(PCA)淬灭。如果反应在室温下继续进行，则板底部的孔可以比板顶部的孔具有更多的多巴胺生成(考虑到从顶部到底部的淬灭模式)。
在三个不同的温度(37℃、室温和2-8℃)下检测多巴胺的生成速率。如图4A所示的数据，与37℃或室温相比，当反应保持在2-8℃时，L-DOPA向多巴胺的酶促转化减慢。在室温下产生的多巴胺的量比在2-8℃下产生的多巴胺的量大大约2-2.5倍(图4A)。这些数据表明，温育30分钟后将板转移至2-8℃会显著降低转化率，从而在将PCA添加到孔中时使样品之间的变化最小化。通过使用多通道移液器(或96孔板移液器)可进一步使变化最小化，以加快样品淬灭并减少温育时间的变化。调准孔淬灭(反应停止)的方法与L-DOPA的添加(反应的开始)减少整个板上排与排的温育时间的变化。
为了确定这些修饰是否导致样品之间的变化性降低，将细胞以10个MOI重复转导，在37℃下温育30分钟，然后使用Bio-Rad冷却块冷却至2-8℃(上侧向下在-20±5℃冷冻器中储存)以减慢反应速度，然后淬灭。将含有细胞的板置于冰上，然后使用电子多通道移液器用冰冷的PCA淬灭以控制时机并加快淬灭。这些改进的应用极大地减小顶部斜率的变化性(图4B和表12)：
表12.图4B中曲线的四参数曲线拟合数据。
Figure BDA0002836722570001222
Figure BDA0002836722570001231
另外，通过进行最高剂量的2倍连续稀释，使剂量间隔更均匀。该板从B排到G排序贯淬火。在最高MOI时呈上升趋势，这有助于顶部基线的变化。每排代表一个单独稀释的样品，而不是对每排使用相同的连续稀释液。这里呈现的结果显示出样品之间的变化性比图3中小得多。
实施例5.AADC效力/表达测定法–ELISA–A
根据实施例3中呈现的规程对HT-1080细胞进行培养、接种、稀释、转导和裂解。
试剂的制备
洗涤/稀释缓冲液(1xTBS-T)-在500mL量筒中，将纯净水(950mL)与50mL的20xTBS-T(tris缓冲盐水+tween，pH 7.4)组合。重复该过程，直到制备6L用于洗涤和稀释。
封闭溶液(具有2％BSA的TBS-T)-用量筒测量1xTBS-T(100mL)，并转移至具有磁力搅拌棒的烧杯。在搅拌时将2g牛血清白蛋白(BSA)缓慢添加到溶液中。所得溶液在4℃下避光储存(最多2周)。
样品稀释缓冲液(具有0.1％BSA的TBS-T)-将75mL的1xTBS-T与25mL封闭溶液(具有2％BSA的TBS-T)组合。所得溶液在4℃下避光储存(最多2周)。
制备具有捕获抗体的AADC ELISA板
通过将10mL的50mM碳酸盐缓冲液(每100mL高压灭菌水的1个碳酸盐胶囊)与0.01mL的储备捕获抗体组合来制备捕获抗体溶液(2μg/mL工作浓度)。可以根据需要使用相同的混合物浓度生产其他捕获抗体溶液(每个ELISA板10mL的捕获抗体溶液，其中每两个测试品样品需要一个ELISA测定板)。
将100μL的稀释捕获抗体添加到ELISA板(Nunc Maxisorp白色平底板)的每个孔中。将板密封并于2-8℃储存过夜(12-18h)。
用300μL TBS-T洗涤ELISA测定板3次。使用多通道移液器将300μL的封闭缓冲液添加到测定板的每个孔中。将板密封并于室温在台式温育至少1小时。通过添加以下配置的样品稀释缓冲液制备稀释板96孔PCR板(表13)
表13.稀释板设置-稀释缓冲液的体积，以μL显示
Figure BDA0002836722570001241
将15μL的澄清的裂解物添加至96孔PCR样品稀释缓冲液板中，并根据表14进行连续稀释。
表14.样品板的连续稀释
Figure BDA0002836722570001242
Figure BDA0002836722570001251
将板密封并在室温下以400rpm摇动2小时。使用多通道移液器将100μL的检测抗体溶液添加到每个孔中。将板密封并在室温下以400rpm摇动1小时，然后使用铝箔避光。
化学发光
对于每个测定板，通过使用SuperSignal West Dura Extended DurationSubstrate试剂盒在15mL锥形管中将5mL的鲁米诺(Luminol)/增强剂与5mL的过氧化物溶液混合，为每个样品板制备10mL的发光溶液。
使用多通道移液器(左至右)将100μL的发光溶液添加到每个孔(一次一个板)中。将板密封，用铝箔保护，并以400rpm摇动1分钟。使用SpectraMax M5或类似的酶标仪用发光设置捕获化学发光。
数据分析
如下使用SpectraMax M5软件或类似软件分析原始数据(参考表14中的板布局)：(i)将H1和H2孔取平均值以获得阴性ELISA对照；(ii)从板中的所有孔中减去ELISA阴性对照；(iii)拟合的标准曲线用于对来自化学发光信号的数据相对于AADC(ng/mL)进行标准化；(iv)通过适当的稀释因子(1:20、1:40、1:80或1:160)调整每个测试孔；(v)将来自每个转导的细胞培养孔的稀释液取平均值；(vi)将来自每个样品MOI的三个重复取平均值，并确定标准偏差；(vii)排除未落在标准曲线范围内的任何值，并通过调整模板中用于平均值和标准偏差的范围来对剩余的值取平均值(或如果三个值中只有一个有效则报告为单个值)。
数据分析将提供以下:(i)AADC标准曲线的四参数拟合数据；(ii)标准曲线的相关系数；(iii)每个MOI的平均AADC浓度；(iii)平均相对AADC浓度的标准偏差；和(iv)根据以下公式与参考标准品的MOI相比的每个MOI的平均相对AADC浓度：
Figure BDA0002836722570001261
实施例6.AADC效力/表达测定法–ELISA–B
试剂的制备
胰蛋白酶-EDTA-将100mL瓶的胰蛋白酶-EDTA在2-8℃解冻过夜。一旦瓶子完全解冻，将10mL的溶液转移至多个15mL聚丙烯无菌离心管。将等分试样在-15至-30℃下储存。使用前将等分试样解冻并平衡至环境温度。一旦解冻，将等分试样储存在2-8℃，并指定两周的有效期。
青霉素-链霉素(Pen-Strep)溶液-将100mL瓶的青霉素-链霉素在2-8℃解冻过夜。将6mL的解冻溶液转移至多个聚丙烯无菌离心管，然后储存在-15至-30℃。
细胞培养基(CCM)(EMEM，10％FBS，1％Pen-Strep)-将5.6mL的Pen-Strep溶液添加到500mL瓶的Eagle最小必需培养基(EMEM)中。然后将5.6mL的胎牛血清(FBS)添加到EMEM+Pen-Strep的瓶中。将所得的CCM溶液通过0.22μm的无菌一次性过滤器进入无菌的接收瓶中，并储存在2-8℃(避光)。
不含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液(0.1M磷酸钠，0.2％Triton X-100，pH 7.8)-将纯净水(400mL)添加至500mL量筒中，将水转移至具有磁力搅拌棒的1L烧杯。在搅拌板上开始搅拌。将磷酸二氢钠(0.25g)和磷酸氢二钠(3.24g)与水混合直至溶解。将1g的Triton X-100倒入搅拌溶液中。将该溶液在室温搅拌30分钟。测试pH值，且如果溶液的pH值不在7.7-7.9，则根据需要用0.1N HCl或0.1N NaOH调节pH。将烧杯中的内容物转移至量筒中，并用Milli-
Figure BDA0002836722570001262
水填充至500mL的体积。将溶液通过0.22μm无菌一次性过滤器进入无菌接收瓶。瓶子用铝箔包裹以避免光照，并在室温下储存。
AADC ELISA包被缓冲液(碳酸盐缓冲溶液)-以明胶胶囊提供碳酸盐缓冲液。将两个胶囊的内容物倒入干净无菌烧杯中的200mL的纯净水中，并加入磁力搅拌棒。内容物完全溶解。将溶液通过0.22μm无菌一次性过滤器进入无菌接收瓶。对该瓶标记制备日期的1个月的有效期，并在室温下储存。
ELISA洗涤缓冲液(1xTBS-T)-在2L量筒中测量纯净水(1800mL)，并在500mL量筒中测量200mL的10x TBS-T(tris缓冲盐水+tween，pH 7.4)溶液。将10x TBS-T加入水中，并用石蜡膜覆盖量筒。将量筒倒转2-3次以混合。将溶液通过0.22μm无菌一次性过滤器进入无菌接收瓶，并在室温下储存。
ELISA封闭缓冲液(具有2％BSA的TBS-T)-用量筒测量1xTBS-T(80mL)，并转移至具有磁力搅拌棒的烧杯。在搅拌时于室温将2g牛血清白蛋白(BSA)缓慢添加到缓冲液中，少于30分钟。用1xTBS-T将烧杯调节至最终100mL体积。将该溶液转移到干净的无菌瓶中并在2-8℃下储存。
检测抗体稀释缓冲液(具有0.5％BSA的TBS-T)-用量筒测量1x ELISA洗涤缓冲液(100mL)。将缓冲液转移至具有磁力搅拌棒的烧杯。在搅拌时于室温将0.5g的BSA加入到缓冲液中，最多30分钟。将该溶液转移到干净的无菌瓶中并在2-8℃下储存。
ELISA样品稀释缓冲液(具有0.1％BSA的TBS-T)-用量筒测量ELISA洗涤缓冲液(100mL)。将缓冲液转移至具有磁力搅拌棒的烧杯。在搅拌时于室温将0.1g的BSA缓慢添加到缓冲液中，最多30分钟。将该溶液转移到干净的无菌瓶中并在2-8℃下储存。
AADC ELISA标准品-将冻干的固体用1mL的ELISA稀释缓冲液(具有0.5％BSA的TBS-T)溶解并涡旋5至10秒以混合。允许液体排到小瓶底部1-2分钟。将AADC标准品在0.5mL体积的微量离心管中等分取样至80μL体积，并储存在小于-70℃下。
HT-1080细胞的细胞悬浮液的制备
以7.5x104个细胞/孔的接种密度制备细胞悬浮液。或者，将100μL的HT-1080在96孔板中以5 x 103个细胞/孔的密度铺板于DMEM+10％FBS中。P300多通道移液器用于此步骤，以避免剪切HT-1080细胞。用多孔粘附膜密封板以减少蒸发并在整个板区域上保持气体交换的均匀性，并且将盖置于板的顶部。将细胞在37±2℃下温育24±2小时。一个汇合的HT-1080细胞的T75烧瓶将大约有2x106个细胞，即对4至5个24孔板足够的细胞。将完全培养基(CCM)、1X HBSS和胰蛋白酶-EDTA在37℃水浴中温热至少10分钟。将培养基从汇合的HT1080单层吸到1:2漂白溶液中。通过使用血清学移液器向烧瓶加入10mL的1x HBSS来洗涤细胞。来回摇动烧瓶以冲洗细胞。将HBSS吸入1:2漂白溶液中。使用无菌的5mL血清学移液器，向烧瓶中加入4mL胰蛋白酶-EDTA。轻轻摇动烧瓶以允许胰蛋白酶覆盖烧瓶的整个底部。将烧瓶在37±2℃及4-6％CO2培养箱中温育4-5分钟。
在显微镜下检查烧瓶以确认细胞从烧瓶分离。烧瓶底部看起来清澈，其中细胞在CCM中自由漂浮。未强迫细胞分离。但是一旦细胞分离，去除胰蛋白酶。一旦细胞从烧瓶底部分离，使用10mL血清学移液器，添加8mL的CCM(温热至室温)以阻断胰蛋白酶活性。来回摇动烧瓶以取出剩余贴壁细胞。将细胞悬浮液转移至无菌的50mL锥形离心管，并将该管在环境温度下以400 x g离心5分钟。细胞在50mL无菌离心管底部形成沉淀。在生物安全柜中工作，在不干扰沉淀的情况下吸取尽可能多的CCM以使细胞悬浮液去除胰蛋白酶-EDTA。将新鲜的，预热的CCM(12mL)添加到管中，并将CCM上下吸移以破碎细胞沉淀。最终的悬浮液具有均匀的密度并且没有细胞团块。对细胞悬浮液计数。
通过向管中添加100μL的细胞悬浮液和100μL台盼蓝染色剂，将HT-1080细胞在管中以1:2稀释，它们通过涡旋轻轻混合在一起。血细胞计数器的表面用70％酒精溶液清洁，并用KIMWIPESTM(Kimberly-Clark)干燥。将盖玻片放置在血细胞计数器的凹槽上方。使用20μL单通道移液器将10μL的台盼蓝染色的细胞悬浮液加载到血细胞计数器的每个计数室中。倒置相差显微镜用于计数血细胞计数器的两个网格上的五个正方形(共10个正方形)的每一个中的细胞数。如果每个正方形中计数的细胞超过100个，则在台盼蓝中增加细胞悬浮液的稀释度，并重复计数。每个正方形中应有大于30个细胞。为了使用血细胞计数器计数悬浮液中的细胞数，根据以下等式计算细胞浓度(细胞/mL)：
细胞/mL＝(总细胞÷10)x台盼蓝的稀释因子x 10,000
“10,000”是血细胞计数器的体积校正因子
为每个测试的样品制备一个24孔板，并为测定对照制备单独的板。使用以下等式将细胞用CCM稀释至7.5x104个细胞/mL。
稀释因子＝(测得的细胞/mL)/(7.5 x 104个细胞/mL)
细胞悬浮液的所需体积(mL)＝测定孔的数目×1mL/孔/稀释因子
CCM稀释液的所需体积(mL)＝测定孔的数目-细胞悬浮液的所需体积
稀释后，将细胞悬浮液分配。对24孔板的所有孔接种1mL的细胞悬浮液。通过保持板与培养箱架接触并使其左右移动3-4次，然后前后移动3-4次，使细胞分散。将细胞在37±2℃和5±1％CO2下温育18-24小时。
HT1080细胞的转导
在制备细胞悬浮液的温育期结束时，将CCM，1x HBSS和胰蛋白酶-EDTA在37℃水浴中温热至少10分钟。从每个测定板上的一个“计数”孔中吸出培养基，并用HBSS洗涤。将胰蛋白酶(100μL)添加到每个洗涤的孔中，并在37±2℃下温育以使细胞与表面分离。通过向孔中添加100μL的CCM来停止胰蛋白酶的活性。
使用血细胞计数器确定胰蛋白酶处理的孔的细胞密度，以确保每个正方形含有至少10个细胞。如果细胞在1x105个和3x105个细胞/孔之间，则继续感染方案。
对于每个待分析的样品，病毒基因组(vg)滴度均大于1x1011 vg/mL。AAV2.AADC参考标准品(LN-2014-088-56；10mM磷酸钠，350mM NaCl，0.001％普朗尼克)的浓度为3.90x1012 vg/ml。使用以下公式计算导致1,000vg/细胞的感染复数(MOI)的AAV2.AADC参考标准品(LN-2014-088-56)和测试样品病毒的初始稀释度的目标浓度(vg/mL)：
目标浓度(vg/mL)＝细胞计数/孔×2×104
除了1,000MOI外，2x104值还包括样品稀释度的校正因子和递送至孔的体积量。
或者，将AAV2.AADC参考标准品(LN-2014-088-56)和测试样品的等分试样完全解冻，或使用储存在2-8℃下未过期的等分试样。如果参考标准品或测试样品滴度大于或等于1x1011 vg/mL，则在1x PBS中进行测试材料的初始稀释。
使用以下公式计算制备1mL的1,000vg/细胞目标浓度所需的测试样品和参考标准品的体积：
测试样品或参考标准品的体积＝(目标浓度×总体积)/(测试样品或参考对照滴度)
在无菌的2mL深孔96孔板中制备表15中所述的载体稀释液。每种稀释液一式三份制备。使用相同的吸头进行连续稀释，但重复之间使用不同的吸头。最后丢弃最终的50μL，以确保每个孔中的最终体积为100μL。
表15.载体稀释液
Figure BDA0002836722570001301
将每种载体稀释液添加至600μL的细胞培养基(CCM)中并涡旋2-3秒以混合。将该混合物在室温下储存。这些稀释液在制备的两个小时内使用。制备三个额外的100μL的1xPBS和600μL的CCM样品作为阴性对照。一次一个板从孔中吸出培养基，并用350μL的CCM稀释的参考标准品和测试样品代替孔中的培养基。覆盖板，并返回到37±2℃和5±1％CO2培养箱中22-26小时。温育期结束时，将一瓶的CCM在37±2℃水浴中温热至少10分钟。吸出感染培养基，并每孔用1mL的预热的CCM代替。覆盖板并返回到37±2℃和5±1％CO2培养箱中46-50小时。
制备细胞裂解缓冲液以收获细胞。对于每个板，将58μL的100X HALT蛋白酶抑制剂添加到5.7mL的细胞裂解缓冲液中。一次处理一个板，吸出所有孔中的培养基，并用1mL的1xHBSS洗涤。吸出HBSS，并向每个孔中加入300μL的细胞裂解缓冲液。用手轻轻摇动板10-15秒以混合，然后覆盖板并在小于或等于-60℃下冷冻大于或等于1小时。
制备样品以使用ELISA检测AADC的表达
用AAV2-AADC感染HT-1080细胞。3天后，裂解细胞，并使用人DDC匹配的ELISA抗体对组(Sino Biological；目录号：SEK10560)定量AADC蛋白的量。
每个24孔感染板需要一个96孔ELISA板进行测定。每96孔板制备10mL的稀释的捕获抗体溶液。将捕获抗体在AADC ELISA包被缓冲液中稀释至2μg/mL的终浓度。使用多通道移液器，将100μL的稀释的捕获抗体添加到固体白色不透明MAXISORPTM 96孔板(ThermoFisher)的每个孔中。将该板用密封膜覆盖，并在2-8℃下储存过夜(12至18小时)，其中一个空板在包被的板上方且一个空板在下方。
为了封闭多巴脱羧酶(DDC)ELISA板，使用自动洗板机用具有300μL TBS-T的ELISA洗涤缓冲液将板洗涤3次。使用多通道移液器，将300μL的ELISA封闭缓冲液添加到ELISA板的所有孔中。用板密封物覆盖板并在室温下储存75±15分钟(至少1小时)。
通过在环境温度下解冻24孔板来制备细胞裂解物稀释液。一次一个，将板漂浮在室温超声水浴中并超声30秒。将板倾斜一定角度，以便在孔的底部边缘收集裂解物。使用P1000移液器将细胞裂解物转移至一组标记的微量离心管。用单个吸头转移复制的孔，但是当从以不同MOI感染的细胞中吸取样品时更换吸头。通过在室温下以10,000RPM离心5分钟来沉淀细胞碎片。将澄清的裂解物转移至第二组标记的微量离心管。
通过解冻AADC标准品储备液的等分试样来制备ELISA模板。用样品稀释缓冲液将AADC标准品储备液稀释至50ng/mL。每个板需要400μL的50ng/mL AADC标准品。使用低结合的96孔板制备模板板。模板含有每个澄清的裂解物样品的三种稀释液和使用ELISA样品稀释液制备的AADC标准品。裂解物样品稀释度为1:20、1:40和1:80。
实施ELISA以检测AADC的表达
使用人ADDC匹配的ELISA抗体对组(Sino Biological；目录号：SEK10560)进行ELISA，以确认AADC在本文所述的AADC效力测定法中所用的同一裂解物中的表达。使用自动洗板机，用TBS-T将96孔ELISA板洗涤3次。将板倒置并轻拍到一叠纸巾上以排出残留的液体。
使用装有12个吸头的多通道移液器吸取100μL的样品和标准品，以分配到96孔ELISA板的相应行中。每行均更换移液器吸头。将板用密封膜覆盖，并在定轨摇床上在环境温度下以200rpm搅拌2小时±15分钟。对于每个板，制备10mL的稀释的检测抗体溶液，终浓度为0.2μg/mL。
使用自动洗板机，用TBS-T将96孔ELISA板洗涤3次。将板倒置并轻拍到一叠纸巾上以排出残留的液体。将100μL的稀释的检测抗体溶液添加至每个孔。用密封膜覆盖板，并在定轨摇床上在环境温度下以200rpm搅拌1小时±10分钟。
对于每个测定板，通过将5mL的鲁米诺/增强剂与5mL的辣根过氧化物溶液组合，制备10mL的SUPERSIGNALTM ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher)。使用自动洗板机，用TBS-T将96孔ELISA板洗涤3次。将板倒置并轻拍到一叠纸巾上以排出残留的液体。在检测之前，立即用多通道移液器(左至右)将100μL的SUPERSIGNALTM ELISA Pico化学发光底物(Thermo Fisher)添加到板的每个孔中。由于温育时间短，因此一次将溶液添加到一个板中。将板在定轨摇床上在环境温度下以200rpm搅拌2±1分钟。
在添加底物之后的2和10分钟之间，使用AMQ-021 VERSAMAXTM微板读取器(Molecular Devices LLC)读取板。板读取器读取ELISA板的发光并计算平均空白。从所有孔中减去空白，并将标准品拟合至四参数曲线。从标准曲线内插测试样品浓度以确定AADC浓度。
将曲线的可读范围内的浓度乘以稀释因子，并且对来自可读范围中的MOI的稀释校正结果取平均值以获得可报告的结果。可以根据测试数据适当地进行其他计算。测试中使用的计算将记录在最终报告中。
来自VERSAMAXTM微板读取器(Molecular Devices LLC)上的
Figure BDA0002836722570001321
Pro软件(Molecular Devices LLC)的分析模板对空白发光值取平均值，并从所有孔中减去平均空白发光。针对AADC标准品对标准品浓度绘制背景校正强度值。在标准点上进行四参数逻辑回归。回归方程和背景校正强度值用于计算板的所有孔中AADC的浓度。
通过将孔结果乘以稀释因子来计算在标准曲线的可读范围内的所有孔的稀释校正浓度。排除具有标准曲线范围(0.39-25ng/mL)外的计算的AADC浓度的孔。对来自生物重复的经稀释校正的AADC浓度取平均值。确定标准偏差和％CV。从分析中排除％CV大于100的稀释液。
对来自MOI的所有有效结果取平均值以获得MOI结果。在每个MOI对标准曲线的可读范围内的所有样品的稀释校正结果取平均值，并通过将测试样品平均值除以每个MOI的参考对照平均值来确定相对效力。将测试样品的MOI结果除以每个MOI的参考标准品的MOI结果以计算相对MOI效力。计算相对MOI效力的平均值以确定可报告的相对效力。
MOI的定量的上限为4000ng/mL。MOI的定量的下限为7ng/mL。AADC ELISA标准回归线的R2相关系数必须大于或等于0.98。ELISA空白的平均发光小于或等于10,000以用于计算中。单一稀释度下一式三份的感染孔之间的发光的CV百分比小于或等于100以用于在该稀释度下有效的结果的计算中。对于参考标准品，每个MOI至少需要1个有效的稀释结果。重复无效的测定法。在有效的测定法中未检测到0MOI样品的1:20稀释下未感染的裂解物(0MOI)的报告的AADC浓度。
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Met Asn Ala Ser Glu Phe Arg Arg Arg Gly Lys Glu Met Val Asp Tyr
1 5 10 15
Val Ala Asn Tyr Met Glu Gly Ile Glu Gly Arg Gln Val Tyr Pro Asp
20 25 30
Val Glu Pro Gly Tyr Leu Arg Pro Leu Ile Pro Ala Ala Ala Pro Gln
35 40 45
Glu Pro Asp Thr Phe Glu Asp Ile Ile Asn Asp Val Glu Lys Ile Ile
50 55 60
Met Pro Gly Val Thr His Trp His Ser Pro Tyr Phe Phe Ala Tyr Phe
65 70 75 80
Pro Thr Ala Ser Ser Tyr Pro Ala Met Leu Ala Asp Met Leu Cys Gly
85 90 95
Ala Ile Gly Cys Ile Gly Phe Ser Trp Ala Ala Ser Pro Ala Cys Thr
100 105 110
Glu Leu Glu Thr Val Met Met Asp Trp Leu Gly Lys Met Leu Glu Leu
115 120 125
Pro Lys Ala Phe Leu Asn Glu Lys Ala Gly Glu Gly Gly Gly Val Ile
130 135 140
Gln Gly Ser Ala Ser Glu Ala Thr Leu Val Ala Leu Leu Ala Ala Arg
145 150 155 160
Thr Lys Val Ile His Arg Leu Gln Ala Ala Ser Pro Glu Leu Thr Gln
165 170 175
Ala Ala Ile Met Glu Lys Leu Val Ala Tyr Ser Ser Asp Gln Ala His
180 185 190
Ser Ser Val Glu Arg Ala Gly Leu Ile Gly Gly Val Lys Leu Lys Ala
195 200 205
Ile Pro Ser Asp Gly Asn Phe Ala Met Arg Ala Ser Ala Leu Gln Glu
210 215 220
Ala Leu Glu Arg Asp Lys Ala Ala Gly Leu Ile Pro Phe Phe Met Val
225 230 235 240
Ala Thr Leu Gly Thr Thr Thr Cys Cys Ser Phe Asp Asn Leu Leu Glu
245 250 255
Val Gly Pro Ile Cys Asn Lys Glu Asp Ile Trp Leu His Val Asp Ala
260 265 270
Ala Tyr Ala Gly Ser Ala Phe Ile Cys Pro Glu Phe Arg His Leu Leu
275 280 285
Asn Gly Val Glu Phe Ala Asp Ser Phe Asn Phe Asn Pro His Lys Trp
290 295 300
Leu Leu Val Asn Phe Asp Cys Ser Ala Met Trp Val Lys Lys Arg Thr
305 310 315 320
Asp Leu Thr Gly Ala Phe Arg Leu Asp Pro Thr Tyr Leu Lys His Ser
325 330 335
His Gln Asp Ser Gly Leu Ile Thr Asp Tyr Arg His Trp Gln Ile Pro
340 345 350
Leu Gly Arg Arg Phe Arg Ser Leu Lys Met Trp Phe Val Phe Arg Met
355 360 365
Tyr Gly Val Lys Gly Leu Gln Ala Tyr Ile Arg Lys His Val Gln Leu
370 375 380
Ser His Glu Phe Glu Ser Leu Val Arg Gln Asp Pro Arg Phe Glu Ile
385 390 395 400
Cys Val Glu Val Ile Leu Gly Leu Val Cys Phe Arg Leu Lys Gly Ser
405 410 415
Asn Lys Val Asn Glu Ala Leu Leu Gln Arg Ile Asn Ser Ala Lys Lys
420 425 430
Ile His Leu Val Pro Cys His Leu Arg Asp Lys Phe Val Leu Arg Phe
435 440 445
Ala Ile Cys Ser Arg Thr Val Glu Ser Ala His Val Gln Arg Ala Trp
450 455 460
Glu His Ile Lys Glu Leu Ala Ala Asp Val Leu Arg Ala Glu Arg Glu
465 470 475 480
<210> 2
<211> 3526
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 2
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt 180
agccatgcgt cgacataacg cgtatatcta gacgttacat aacttacggt aaatggcccg 240
cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata 300
gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc 360
cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac 420
ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg 480
cagtacatct agtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 540
atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 600
atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 660
ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 720
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 780
gacaccggga ccgatccagc ctccgcggat tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga 840
acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct atagagtcta taggcccaca 900
aaaaatgctt tcttctttta atatactttt ttgtttatct tatttctaat actttcccta 960
atctctttct ttcagggcaa taatgataca atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa 1020
gaataacagt gataatttct gggttaaggc aatagcaata tttctgcata taaatatttc 1080
tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt ttcatattgc taatagcagc tacaatccag 1140
ctaccattct gcttttattt tatggttggg ataaggctgg attattctga gtccaagcta 1200
ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt 1260
gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg caaagaattg ggattcgaac atcgattgaa 1320
ttccccgggg atccaccatg aacgcaagtg aattccgaag gagagggaag gagatggtgg 1380
attacgtggc caactacatg gaaggcattg agggacgcca ggtctaccct gacgtggagc 1440
ccgggtacct gcggccgctg atccctgccg ctgcccctca ggagccagac acgtttgagg 1500
acatcatcaa cgacgttgag aagataatca tgcctggggt gacgcactgg cacagcccct 1560
acttcttcgc ctacttcccc actgccagct cgtacccggc catgcttgcg gacatgctgt 1620
gcggggccat tggctgcatc ggcttctcct gggcggcaag cccagcatgc acagagctgg 1680
agactgtgat gatggactgg ctcgggaaga tgctggaact accaaaggca tttttgaatg 1740
agaaagctgg agaaggggga ggagtgatcc agggaagtgc cagtgaagcc accctggtgg 1800
ccctgctggc cgctcggacc aaagtgatcc atcggctgca ggcagcgtcc ccagagctca 1860
cacaggccgc tatcatggag aagctggtgg cttactcatc cgatcaggca cactcctcag 1920
tggaaagagc tgggttaatt ggtggagtga aattaaaagc catcccctca gatggcaact 1980
tcgccatgcg tgcgtctgcc ctgcaggaag ccctggagag agacaaagcg gctggcctga 2040
ttcctttctt tatggttgcc accctgggga ccacaacatg ctgctccttt gacaatctct 2100
tagaagtcgg tcctatctgc aacaaggaag acatatggct gcacgttgat gcagcctacg 2160
caggcagtgc attcatctgc cctgagttcc ggcaccttct gaatggagtg gagtttgcag 2220
attcattcaa ctttaatccc cacaaatggc tattggtgaa ttttgactgt tctgccatgt 2280
gggtgaaaaa gagaacagac ttaacgggag cctttagact ggaccccact tacctgaagc 2340
acagccatca ggattcaggg cttatcactg actaccggca ttggcagata ccactgggca 2400
gaagatttcg ctctttgaaa atgtggtttg tatttaggat gtatggagtc aaaggactgc 2460
aggcttatat ccgcaagcat gtccagctgt cccatgagtt tgagtcactg gtgcgccagg 2520
atccccgctt tgaaatctgt gtggaagtca ttctggggct tgtctgcttt cggctaaagg 2580
gttccaacaa agtgaatgaa gctcttctgc aaagaataaa cagtgccaaa aaaatccact 2640
tggttccatg tcacctcagg gacaagtttg tcctgcgctt tgccatctgt tctcgcacgg 2700
tggaatctgc ccatgtgcag cgggcctggg aacacatcaa agagctggcg gccgacgtgc 2760
tgcgagcaga gagggagtag gagtgaagcc aggacctgca gaagcttgcc tcgagcagcg 2820
ctgctcgaga gatctacggg tggcatccct gtgacccctc cccagtgcct ctcctggccc 2880
tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat aaaattaagt tgcatcattt 2940
tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag gggggtggta tggagcaagg 3000
ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta ttgggaacca agctggagtg 3060
cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg ggttcaagcg attctcctgc 3120
ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac caggctcagc taatttttgt 3180
ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct ggtctccaac tcctaatctc 3240
aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt acaggcgtga accactgctc 3300
ccttccctgt ccttactaga tttaaatatg tcgtgcatcg atgctacgta gataagtagc 3360
atggcgggtt aatcattaac tacagaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct 3420
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt 3480
gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc tgcagg 3526
<210> 3
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 4
gtcgacataa cgcgtata 18
<210> 5
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 5
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctag tattagtcat cgctattacc 300
atg 303
<210> 6
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 6
gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt 60
ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac 120
tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg 180
tgggaggtct atataagcag agct 204
<210> 7
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 7
tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc catagaagac accgggaccg 60
atccagcctc cgcggattcg aatcccggcc gggaacggtg cattggaacg cggattcccc 120
gtgccaagag tgac 134
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 8
gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc ac 32
<210> 9
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 9
aaaaaatgct ttcttctttt aatatacttt tttgtttatc ttatttctaa tactttccct 60
aatctctttc tttcagggca ataatgatac aatgtatcat gcctctttgc accattctaa 120
agaataacag tgataatttc tgggttaagg caatagcaat atttctgcat ataaatattt 180
ctgcatataa attgtaactg atgtaagagg tttcatattg ctaatagcag ctacaatcca 240
gctaccattc tgcttttatt ttatggttgg gataaggctg gattattctg agtccaagct 300
aggccctttt gctaatcatg ttcatacctc ttatcttcct cccacag 347
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 10
ctcctgggca acgtgctggt ctgtgtgctg gcccatcact ttggcaaaga att 53
<210> 11
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 11
atgaacgcaa gtgaattccg aaggagaggg aaggagatgg tggattacgt ggccaactac 60
atggaaggca ttgagggacg ccaggtctac cctgacgtgg agcccgggta cctgcggccg 120
ctgatccctg ccgctgcccc tcaggagcca gacacgtttg aggacatcat caacgacgtt 180
gagaagataa tcatgcctgg ggtgacgcac tggcacagcc cctacttctt cgcctacttc 240
cccactgcca gctcgtaccc ggccatgctt gcggacatgc tgtgcggggc cattggctgc 300
atcggcttct cctgggcggc aagcccagca tgcacagagc tggagactgt gatgatggac 360
tggctcggga agatgctgga actaccaaag gcatttttga atgagaaagc tggagaaggg 420
ggaggagtga tccagggaag tgccagtgaa gccaccctgg tggccctgct ggccgctcgg 480
accaaagtga tccatcggct gcaggcagcg tccccagagc tcacacaggc cgctatcatg 540
gagaagctgg tggcttactc atccgatcag gcacactcct cagtggaaag agctgggtta 600
attggtggag tgaaattaaa agccatcccc tcagatggca acttcgccat gcgtgcgtct 660
gccctgcagg aagccctgga gagagacaaa gcggctggcc tgattccttt ctttatggtt 720
gccaccctgg ggaccacaac atgctgctcc tttgacaatc tcttagaagt cggtcctatc 780
tgcaacaagg aagacatatg gctgcacgtt gatgcagcct acgcaggcag tgcattcatc 840
tgccctgagt tccggcacct tctgaatgga gtggagtttg cagattcatt caactttaat 900
ccccacaaat ggctattggt gaattttgac tgttctgcca tgtgggtgaa aaagagaaca 960
gacttaacgg gagcctttag actggacccc acttacctga agcacagcca tcaggattca 1020
gggcttatca ctgactaccg gcattggcag ataccactgg gcagaagatt tcgctctttg 1080
aaaatgtggt ttgtatttag gatgtatgga gtcaaaggac tgcaggctta tatccgcaag 1140
catgtccagc tgtcccatga gtttgagtca ctggtgcgcc aggatccccg ctttgaaatc 1200
tgtgtggaag tcattctggg gcttgtctgc tttcggctaa agggttccaa caaagtgaat 1260
gaagctcttc tgcaaagaat aaacagtgcc aaaaaaatcc acttggttcc atgtcacctc 1320
agggacaagt ttgtcctgcg ctttgccatc tgttctcgca cggtggaatc tgcccatgtg 1380
cagcgggcct gggaacacat caaagagctg gcggccgacg tgctgcgagc agagagggag 1440
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
寡核苷酸"
<400> 12
gctgctcgag agatctac 18
<210> 13
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 13
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca 60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc 120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca 180
acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg 240
ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg 300
ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg 360
ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct 420
tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtcctt 477
<210> 14
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /记录="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 14
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141

Claims (43)

1.用于测量AADC病毒载体效力的方法，包括：
(a)提供包含AADC病毒载体的AAV制剂，其中所述AADC病毒载体是包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸的AAV载体；
(b)在产生从所述AADC多核苷酸产生AADC多肽的细胞的条件下使所述AAV制剂与所述细胞接触；
(c)裂解所述细胞以形成包含所述AADC多肽的至少部分的细胞裂解物；
(d)如下确定所述AADC病毒载体的效力：
(i)在允许所述细胞裂解物中的所述AADC多肽的至少部分与L-3,4二羟基苯丙氨酸(“L-DOPA”)的至少部分起反应以产生多巴胺的条件下，向所述细胞裂解物中添加所述L-DOPA；
(ii)在所述AADC多肽和所述L-DOPA之间的反应后测量所述细胞裂解物中的多巴胺的量；和
(iii)提供用于多巴胺产生的AADC病毒载体效力参考标准品；
(iv)与所述AADC病毒载体效力参考标准品比较使用所述AADC病毒载体产生的多巴胺的量，从而测量所述AADC病毒载体的效力。
2.权利要求1所述的方法，其中如下确定由所述AADC病毒载体参考标准品产生的多巴胺的量：
(a)将L-DOPA添加到包含AADC的细胞裂解物中，其中所述细胞裂解物中的所述AADC由用包含编码AADC的多核苷酸的AADC病毒载体参考标准品转导的细胞产生；和
(b)测量所述AADC和所述L-DOPA之间反应后所述细胞裂解物中产生的多巴胺的量。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述细胞为HT1080细胞。
4.权利要求3所述的方法，其中所述HT1080细胞以7x103至4x104个细胞/孔之间的密度铺板。
5.权利要求3所述的方法，其中所述HT1080细胞以9x103至2x104个细胞/孔之间的密度铺板。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在转导后18-30小时后收获所述细胞。
7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在转导后22-26小时后收获所述细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述AADC病毒载体以约1个载体基因组(vg)/细胞至约1×108vg/细胞的浓度转导至所述细胞中。
9.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中将所述AADC病毒载体以约10vg/细胞至约1×105vg/细胞的浓度转导至所述细胞中。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中使用化学裂解、机械裂解或其组合裂解所述细胞。
11.权利要求10所述的方法，其中使用化学裂解来裂解所述细胞，并且其中所述化学裂解包含裂解缓冲液，所述裂解缓冲液包含蛋白酶抑制剂、磷酸盐缓冲液盐水和TritonX100。
12.权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述裂解过程包括在室温下以3650-3800RPM在离心机中旋转所述细胞5-20分钟。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中将AADC反应缓冲液与所述L-DOPA一起添加至所述细胞裂解物中，并且其中所述AADC反应缓冲液包含辛磺酸钠盐、磷酸二氢钠和乙腈。
14.权利要求13所述的方法，其中所述AADC反应缓冲液包含3.0-3.5mM的辛磺酸钠盐，pH 3.0、72.5mM的磷酸二氢钠(NaH2PO4)和10％的乙腈。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中添加至所述细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.01mM至1mM。
16.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中添加至所述细胞裂解物中的L-DOPA的浓度为0.03mM。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中AADC和L-DOPA之间的反应在37℃进行。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中AADC和L-DOPA之间的反应进行10-120分钟。
19.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中AADC和L-DOPA之间的反应进行30分钟。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在所述AADC与L-DOPA反应后，将所述细胞裂解物暴露于2-8℃的温度。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中通过添加冰冷的高氯酸来淬灭AADC和L-DOPA之间的反应。
22.权利要求21所述的方法，其中以0.1M至1M的浓度添加所述冰冷的高氯酸。
23.权利要求21所述的方法，其中以0.5M的浓度添加所述冰冷的高氯酸。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用具有电化学检测器的超高效液相色谱法(UHPLC-ECD)测量所述样品中多巴胺的量。
25.权利要求24所述的方法，其中通过将多巴胺的量与多巴胺标准曲线进行比较，使用UHPLC-ECD测量所述样品中的多巴胺的量。
26.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中使用具有紫外检测器的超高效液相色谱法(UHPLC-UV)测量所述样品中多巴胺的量。
27.权利要求24所述的方法，其中通过将多巴胺的量与多巴胺标准曲线进行比较，使用UHPLC-UV测量所述样品中的多巴胺的量。
28.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与SEQ ID NO.2具有至少85％同一性的多核苷酸。
29.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与SEQ ID NO.2具有至少90％同一性的多核苷酸。
30.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包含与SEQ ID NO.2具有至少95％同一性的多核苷酸。
31.权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述AAV载体包括包含SEQ ID NO.2的多核苷酸。
32.权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述AAV载体是AAV2。
33.产生基因疗法产品的方法，包括：
(a)提供包含AAV载体的AAV制剂，其中所述AAV载体包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸；
(b)使用权利要求1-32中任一项所述的方法测量所述AAV制剂的AADC病毒载体效力；和
(c)在已经测量了所述AADC病毒载体效力之后，将所述AAV制剂适当地等分取样到制剂容器中。
34.产生基因疗法产品的方法，其包括将AAV制剂适当地等分取样到制剂容器中，其中所述AAV制剂包含AAV载体，其中所述AAV载体包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸，且其中所述制剂的所述AADC病毒载体效力已使用权利要求1-32中任一项所述的方法测量。
35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述AADC病毒载体具有1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、75-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-100％、100-105％、105-110％、110-115％、115-120％、120-125％、125-130％、130-135％、135-140％、140-145％、145-150％、150-155％、155-160％、160-165％、165-170％、170-175％、175-180％、180-185％、185-190％、190-195％、195-200％的AADC相对效力。
36.权利要求35所述的方法，其中将所述AADC病毒载体的所述AADC相对效力与AADC相对效力值阈值进行比较。
37.权利要求36所述的方法，其中如果所述AADC相对效力落到所述AADC相对效力值阈值以下，则丢弃或放弃所述AADC病毒载体。
38.权利要求33或权利要求34所述的方法，其中所述AADC病毒载体具有与AADC相对效力值阈值相比较的AADC相对效力，并且其中如果所述AADC病毒载体的所述AADC相对效力落到所述AADC相对效力值阈值以下，则不将所述AADC病毒载体等分取样到所述制剂容器中。
39.权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述AADC相对效力值阈值为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或200％。
40.AADC病毒载体，其包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸，其中所述AADC病毒载体具有根据权利要求1-32中任一项所述的方法测量的AADC相对效力。
41.AADC病毒载体，其包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸，其中所述AADC病毒载体是使用包括根据权利要求1-32中任一项所述的测量AADC病毒载体效力的方法的过程制备。
42.AAV制剂，其包含权利要求40或权利要求41所述的AADC病毒载体。
43.包含AADC病毒载体的AAV制剂，所述AADC病毒载体包含编码芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)的AADC多核苷酸，其中所述AAV制剂使用包括权利要求33-39中任一项所述的方法的过程制备。
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