CN112251481B - 一种低聚半乳糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低聚半乳糖的制备方法，包括：S1.向乳糖溶液中加入β‑半乳糖苷酶，搅拌反应；S2.当S1酶反应至葡萄糖占总糖量≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，继续反应36~72h，升温灭酶活，得到粗糖液一；S3.向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，搅拌，发酵24~48h，制得粗糖液二；S4.向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴‑阳离子树脂洗脱、浓缩，即得。本发明低聚半乳糖的制备工艺，通过采用β‑半乳糖苷酶‑葡萄糖氧化酶‑马克斯克鲁维酵母特定顺序的三级联用生物转化制备低聚半乳糖，制备得到的低聚半乳糖在保证低聚半乳糖的纯度≥90%的基础上，能够使得低聚半乳糖的产率可提高至60%以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种低聚半乳糖的制备方法。
背景技术
低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）具有低甜度、低热量、低致龋齿性、热酸稳定及食品安全性等特殊的性质，是人体肠道中双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌等有益菌极好的营养源和有效的增殖因子。它可以改善人体肠道的消化吸收功能，常作为一种新型的功能性食品添加剂，被称为食疗效果最好的“双歧因子”。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。
工业上一般采用米曲霉、脆壁克鲁维酵母等生产低聚半乳糖。GOS初始生成的纯度多为20-40%左右，仍有大量的副产物存在，为了更经济的获得GOS，需要对GOS反应进行优化，增加底物利用率、减少副产物、提高产物纯度。现有技术中，专利文献报道了不同菌种产的β-半乳糖苷酶催化合成GOS，江波等人利用费式志贺菌产的β-半乳糖苷酶制备低聚半乳糖，提高了GOS产率，可达44.5%。也有专利报道利用酵母等微生物发酵消耗副产物中的葡萄糖，提高了产物GOS的纯度。但是对于如何兼顾GOS的产率和纯度，更加经济的获得GOS还少见报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低聚半乳糖的制备方法，该工艺能够使得在保证低聚半乳糖纯度≥90%的基础上，能够使得低聚半乳糖的产率可提高至60%以上。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种低聚半乳糖的制备方法，包括如下步骤：
S1. 向质量百分比为30~40wt%的乳糖溶液中加入β-半乳糖苷酶，搅拌反应；
S2. 当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，继续反应36~72h，升温灭酶活，得到粗糖液一；
S3. 向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，搅拌，发酵24~48h，制得粗糖液二；
S4. 向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴-阳离子树脂洗脱、浓缩，得到低聚半乳糖。
其中，步骤S1中，β-半乳糖苷酶的添加量优选为50~1000U/g乳糖；所述搅拌反应的工艺条件为：pH 5.5~7，温度30~40℃，200~300rpm。
其中，步骤S2中，葡萄糖氧化酶的添加量优选为5~100U/L S1反应液。
其中，步骤S3中，马克斯克鲁维酵母与S2制得的粗糖液的添加比例为质量比1:200~ 1:1000；所述搅拌的工艺条件为：调节pH 5.5~7，温度25~35℃，200~300rpm。
其中，步骤S4中，所述低聚半乳糖的阴-阳离子树脂洗脱采用强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的串联组合。
其中，步骤S4中，所述低聚半乳糖的纯度≥90%；产率≥60%。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
（1）本发明低聚半乳糖的制备工艺，通过采用β-半乳糖苷酶-葡萄糖氧化酶-马克斯克鲁维酵母的特定顺序三级联用生物转化制备低聚半乳糖，与现有采用β-半乳糖苷酶-酿酒酵母-马克斯克鲁维酵母或其他常规制备方法相比，制备得到的低聚半乳糖在保证低聚半乳糖纯度≥90%的基础上，能够使得低聚半乳糖的产率可提高至60%以上，在兼顾产品纯度的同时提高了GOS产率，有效改善生产效率，可减低生产成本。
（2）本发明的制备工艺高效、高产、绿色、健康，准确可靠，重复性好，且易于实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图；
图2为本发明实施例2所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图；
图3为本发明实施例3所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图；
图4为本发明对比例1所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图；
图5为本发明对比例2所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图；
图6为本发明对比例3所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明的实施例及对比例采用的原料均市购即得。
测试低聚半乳糖的纯度的方法：
采用Agilent-1260 HPLC色谱仪配套Agilent-1260 Infinity蒸发光散射检测器(ELSD)一起使用，使用外标比较法。
色谱柱：Agilent Hi-Plex Ca (7.7*300mm)
洗脱液：超纯水
流速：0.6 mL/min
柱温：85℃
进样量：10 μL
ELSD条件：雾化温度50℃，蒸发温度40℃，气体流速1.2 SLM
在上述条件下，每种糖的保留时间分别为：乳糖9.96min，葡萄糖11.30min，半乳糖12.51min，GOS-3（三糖）8.89min，GOS-4（四糖）8.41min。
纯度的计算方法：采用面积归一化法，以低聚半乳糖产物（三糖及以上）的峰面积比上总的峰面积。
产率的计算方法：以低聚半乳糖的生成量比上初始乳糖的添加量即得。
实施例1：
一种低聚半乳糖的制备方法，包括如下步骤：
S1. 向质量百分比为30wt%的乳糖溶液中加入β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶的添加量为500U/g乳糖，在pH 7，温度30℃，300rpm条件下进行搅拌反应；
S2. 当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，其中，葡萄糖氧化酶的添加量为50 U/L S1反应液，继续反应36h，升温灭酶活，得到粗糖液一；
S3. 向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母与S2制得的粗糖液的添加比例为质量比1:600，调节pH 7，温度25℃，300rpm，搅拌，发酵48h，制得粗糖液二；
S4. 向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴-阳离子树脂洗脱、浓缩，得到低聚半乳糖。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图1所示。
实施例2：
一种低聚半乳糖的制备方法，包括如下步骤：
S1. 向质量百分比为35wt%的乳糖溶液中加入β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶的添加量为50 U/g乳糖，在pH6.5，温度35℃，250 rpm条件下进行搅拌反应；
S2. 当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，其中，葡萄糖氧化酶的添加量为5 U/L S1反应液，继续反应54h，升温灭酶活，得到粗糖液一；
S3. 向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母与S2制得的粗糖液的添加比例为质量比1:1000，调节pH6.5，温度30℃，250rpm，搅拌，发酵36h，制得粗糖液二；
S4. 向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴-阳离子树脂洗脱、浓缩，得到低聚半乳糖。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图2所示。
实施例3：
一种低聚半乳糖的制备方法，包括如下步骤：
S1. 向质量百分比为40wt%的乳糖溶液中加入β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶的添加量为1000 U/g乳糖，在pH 5.5，温度40℃，200rpm条件下进行搅拌反应；
S2. 当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，其中，葡萄糖氧化酶的添加量为100 U/L S1反应液，继续反应72h，升温灭酶活，得到粗糖液一；
S3. 向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母与S2制得的粗糖液的添加比例为质量比1:200，调节pH 5.5，温度35℃，200rpm，搅拌，发酵24h，制得粗糖液二；
S4. 向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴-阳离子树脂洗脱、浓缩，得到低聚半乳糖。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图3所示。
对比例1：
一种低聚半乳糖的制备方法，无步骤S3；其他步骤同实施例1。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图4所示。
对比例2：
一种低聚半乳糖的制备方法，无步骤S2，即当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，直接向S1反应液中添加马克斯克鲁维酵母，马克斯克鲁维酵母与S1反应液的添加比例为质量比1:600，调节pH 7，温度25℃，300rpm，搅拌，发酵48h，制得粗糖液二；其他步骤同实施例1。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图5所示。
对比例3：
一种低聚半乳糖的制备方法，将步骤S2中的葡萄糖氧化酶替换为酿酒酵母；酿酒酵母与S1反应液的添加比例为质量比1:500；其他步骤同实施例1。所得低聚半乳糖的纯度、产率等性能指标的结果如表1所示。所得低聚半乳糖产品的HPLC谱图如图6所示。
表1
Claims (2)
1.一种低聚半乳糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 向质量百分比为30~40wt%的乳糖溶液中加入β-半乳糖苷酶，搅拌反应；
S2. 当S1酶反应至葡萄糖占总糖量的质量百分比≥15%时，向S1反应液中添加葡萄糖氧化酶，继续反应36~72h，升温灭酶活，得到粗糖液一；
S3. 向S2制得的粗糖液一中添加马克斯克鲁维酵母，搅拌，发酵24~48h，制得粗糖液二；
S4. 向S3制得的粗糖液二中加入活性炭脱色，过滤后，经纳滤、阴-阳离子树脂洗脱、浓缩，得到低聚半乳糖；
步骤S4中，所述低聚半乳糖的纯度≥90%；产率≥60%；
步骤S1中，β-半乳糖苷酶的添加量为50~1000U/g乳糖；所述搅拌反应的工艺条件为：pH5.5~7，温度30~40℃，200~300rpm；
步骤S2中，葡萄糖氧化酶的添加量为5~100U/L S1反应液；
步骤S3中，马克斯克鲁维酵母与S2制得的粗糖液的添加比例为质量比1:200 ~ 1:1000；所述搅拌的工艺条件为：调节pH 5.5~7，温度25~35℃，200~300rpm。
2.根据权利要求1所述的低聚半乳糖的制备方法，其特征在于，步骤S4中，所述阴-阳离子树脂洗脱采用强酸性阳离子交换树脂和弱碱性阴离子交换树脂的串联组合。
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