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CN112174851A - 一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用 - Google Patents

一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用 Download PDF

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CN112174851A CN202011240526.9A CN202011240526A CN112174851A CN 112174851 A CN112174851 A CN 112174851A CN 202011240526 A CN202011240526 A CN 202011240526A CN 112174851 A CN112174851 A CN 112174851A
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袁强
王平
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Guangzhou Wondfo Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用，所述氟胺酮半抗原的结构如式(Ⅰ)所示。所述氟胺酮半抗原的制备方法包括：以氟胺酮和式(Ⅱ)所示的化合物为原料，进行反应，在氟胺酮的羰基上引入具有羧基的活性手臂，得到所述氟胺酮半抗原。进一步地，将氟胺酮半抗原进行活化后，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述氟胺酮抗原。本发明首创了一种新型的氟胺酮人工半抗原和氟胺酮人工抗原，将其应用在免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何大型仪器设备等优点，可用于氟胺酮大规模的初筛。

Description

一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用。
背景技术
氟胺酮(F-Ketamine)为苯丙胺类兴奋剂，化学名称为：dl-2-邻氟苯基-2-甲胺基环己酮。氟胺酮是苯环己哌啶(phencyclidine)的衍生物，具有一定的精神依赖性潜力。氟胺酮可以产生一种分离麻醉状态，其临床特征与氯胺酮(K粉)相似，僵直状、浅镇静、遗忘与显著镇痛，并能进入梦境、出现幻觉，成为了狂野派对及其他类似活动里常用的迷幻物。目前，多国已将氟胺酮列管，英国列管氟胺酮于CLASS B，瑞典和拉脱维亚定义氟胺酮为非法成分。北京大学王世玉教授等人报道了氟胺酮的合成途径，并通过动物实验证实了氟胺酮具有与氯胺酮类似的麻醉效果。部分体外实验结果显示，氟胺酮的半衰期(T1/2，invitro)为69.1±13.1min，而氯胺酮的半衰期(T1/2，invitro)为23±3min，清除率上，氯胺酮也高于氟胺酮。氟胺酮的药效强度约为氯胺酮的1.5倍，药效持续时间约为氯胺酮的2-3倍。
在现阶段，中国未被列入国家管制类药物目录，对该化合物没有明确的规定和说明，而社会中存在大量使用氟胺酮替代K粉的滥用人群，对氟胺酮的检测仅限于高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、气-质联用法(GC-MS)、液-质联用法(LC-MS)等，但这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，对检材的要求也比较高，需要进一步的提纯处理才能进行，这已经不能达到现代检测对快速、方便、准确的要求。
而使用氯胺酮快速检测试剂并不能达到检测氟胺酮的标准。为了对此药物的监管力度和保障人民的身体健康，有必要展开关于氟胺酮免疫分析方法的研究，有必要提供一种有效的氟胺酮人工抗原的制备方法和快速检测试剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用。具体包括氟胺酮半抗原及其制备方法，氟胺酮抗原及其制备方法，氟胺酮半抗原或氟胺酮抗原在对样本中的氟胺酮进行免疫检测中的应用，以及一种检测样本中氟胺酮的免疫层析试剂盒。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种氟胺酮半抗原，所述氟胺酮半抗原的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002768270680000021
其中，x为1-6的任一整数，例如x＝1、2、3、4、5或6；y为x的2倍。
本发明提供了一种新型的氟胺酮人工半抗原及人工抗原，可适用于对氟胺酮的免疫分析，制备出氟胺酮快速检测试剂盒，现阶段为国内唯一的产品。本发明制备的检测试剂盒降低了交叉物干扰，并能应用于毛发检材的试剂盒，提高检测灵敏度至1ng/mg，为同类产品中灵敏度最高的。
第二方面，本发明提供一种如上所述的氟胺酮半抗原的制备方法，所述氟胺酮半抗原的制备方法包括：以氟胺酮和式(Ⅱ)所示的化合物为原料，进行反应，在氟胺酮的羰基上引入具有羧基的活性手臂，得到所述氟胺酮半抗原；
Figure BDA0002768270680000031
其中，x为1-6的任一整数，例如x＝1、2、3、4、5或6；y为x的2倍。
本发明所涉及的氟胺酮半抗原的合成方法涉及的关键因素是在氟胺酮分子结构的羰基上引入具有羧基的活性手臂，本发明经多种合成方案筛选后，选用氟胺酮和式(Ⅱ)所示的化合物为反应原料，工艺条件温和，无需高温高压，操作简单，合成步骤短。
优选地，所述反应在碱性条件下进行。
优选地，所述碱性介质包括碳酸钾。
优选地，所述氟胺酮与式(Ⅱ)所示化合物的摩尔比为1:(1-3)，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应的介质包括甲醇水溶液。
优选地，所述甲醇与水的体积比为(3-4):(1-2)，例如6:2、6:3、6:4、7:2、7:3、7:4、8:2、8:3或8:4等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。进一步优选7:3。
优选地，所述反应的温度为15-65℃，例如15℃、25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃或65℃等，时间为18-36h，例如18h、20h、22h、25h、30h或36h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种氟胺酮抗原，所述氟胺酮抗原是由如上所述的氟胺酮半抗原制备得到的。
本发明所涉及的氟胺酮半抗原通过与载体蛋白的偶联而活化，带有载体蛋白的修饰性抗原具有更强的免疫活性，因为单独的小分子本身通常不具有免疫活性或免疫活性很低。
第四方面，本发明提供一种如上所述的氟胺酮抗原的制备方法，所述制备方法包括：将氟胺酮半抗原进行活化后，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述氟胺酮抗原。
优选地，所述氟胺酮半抗原的活化方式为：将氟胺酮半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺混合反应，得到活化的氟胺酮半抗原。
优选地，所述氟胺酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺的摩尔比为1:(1-1.5):(1-1.5)，例如1:1:1、1:1:1.5、1:1.5:1、1:1.5:1.5、1:1.2:1、1:1:1.2或1:1.2:1.2等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应的反应介质包括N,N-二甲基甲酰胺。
优选地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血红蛋白、牛甲状腺蛋白、人免疫球蛋白IgG或人免疫球蛋白IgA。
优选地，所述偶联反应的体系pH值维持在6.8-7.2，例如pH＝6.8、pH＝6.9、pH＝7.0、pH＝7.1或pH＝7.2等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述偶联反应的温度为2-8℃，例如2℃、4℃、6℃或8℃等，时间为10-24h，例如10h、15h、18h、20h或24h等，上述范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述偶联反应结束后，将反应混合物进行透析纯化，透析液为0.05M，pH7.0的PBS缓冲液。
当本发明所涉及的氟胺酮抗原的制备方法满足上述温度、时间、原料比例、体系pH环境、介质的要求时，反应的效率更高，氟胺酮抗原的收率更高。
第五方面，本发明提供一种如上所述的氟胺酮半抗原或如上所述的氟胺酮抗原在对样本中的氟胺酮进行免疫检测中的应用。
优选地，所述样本包括体液样本或组织样本。
本发明合成的氟胺酮半抗原或者氟胺酮抗原可以被用来制备利用免疫方法来检测样本中是否含有氟胺酮。这里的样本是指哺乳动物或者人的体液样本，例如唾液、尿液、汗液；或者，哺乳动物或者人的组织样本，例如毛发、肝脏、脾等组织。这里所谓的“免疫检测方法”是利用抗体与抗原的结合的原理进行的免疫分析或者检测方法，这种免疫方法包括酶联免疫法(ELISA)，也包括横向流动测试试纸法(Lateral Flow)，方法包括竞争方法。
横向流动测试试纸用吸水或者非吸水性材料制成，一个测试条可以用多种材料，用于液体的传递。测试条的一种材料可以叠加在另一种测试条材料上，例如滤纸叠加在硝化纤维上。或者，测试条中至少含有一种材料的一个区域位于另一种至少含有一种不同材料的区域之后。在这种情况下，各区域之间的液体是可以流通的，它们之间可以相互叠加或者不叠加。测试条上的材料可以固定在列入塑料衬片的支撑物上或者硬质表面，以加强测试条可持力。测试条各区域可按如下排列：加样区，至少一个试剂区，至少一个检测结果区，至少一个控制区，至少一个掺假检测区和液体吸收区。如果检测区包括一个控制区，优选控制区位于检测结果区的被分析物检测区之后。所有这些区或其组合可以含有一种材料的单一试纸上。另外，这些区由不同的材料制成，并按液体传递的方向连接在一起。例如，不同区域可以直接或者间接进行液体传递。
第六方面，本发明提供一种检测样本中氟胺酮的免疫层析试剂条，所述免疫层析试剂条包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水板和底板；所述硝酸纤维素膜包括被如上所述的氟胺酮抗原包被的检测线和被羊抗鼠抗体包被的质控线。
优选地，所述免疫层析试剂条中胶体金标记氟胺酮抗体的浓度为15-25μg/mL；所述氟胺酮抗原的包被浓度为0.1-0.8mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.8-1.0mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的用量为0.09-0.22μL/mm。
优选地，所述样品垫采用样品垫处理液进行处理，所述样品垫处理液包括pH为8-11的缓冲液、水性流变助剂和封闭剂；其中，相对于每100mL所述缓冲液，所述水性流变助剂的添加量为0.05-10g，所述封闭剂的添加量为0.05-10g。
优选地，所述样品垫处理液还包括0.01-1M的Na2CO3或K2CO3。
优选地，所述样品垫处理液还包括海藻糖；相对于每100mL所述缓冲液，所述海藻糖的添加量为0.01-1g。
优选地，所述水性流变助剂为HPMC、PAA或PEO中的至少一种。
优选地，所述封闭剂为兔血清。
优选地，所述检测线上氟胺酮抗原采用包被缓冲液进行包被，所述包被缓冲液包括pH为7-8、1-50mM的Tris-HCl缓冲液、S9和脲；其中，相对于每100mL Tris-HCl缓冲液，所述S9的添加量为0.01-1g，所述脲的添加量为2-10g。
其中，样品垫的制备方法为：将玻璃纤维浸泡在样品溶液中，烘干。
标记垫的制备方法为：(1)HAuCl4水溶液与柠檬酸三钠水溶液共沸制得胶体金溶液，颜色为红色。(2)胶体金与蛋白质(IgG)的结合，将氟胺酮抗体溶液加入pH 9.0的胶体金溶液中，加入稳定剂，经离心纯化后制得免疫胶体金标记物。(3)将调配好浓度的免疫胶体金标记物溶液包被到玻璃纤维上，烘干，制得标记垫。
硝酸纤维素膜的制备方法为：氟胺酮-蛋白偶联物(本发明所涉及的氟胺酮抗原)配制T线溶液，羊抗鼠抗体配制C线溶液，然后分别包被在硝酸纤维素膜上的T线(检测线)、C线(质控线)区域。
试剂条的制备方法为：从加样端开始依次是，样品垫、标记垫、包被了T线和C线的硝酸纤维素膜、吸水板四个部分。这四个部分均依次粘贴在底板上，然后切割成所要求的宽度，形成试剂条。
也可按模具(塑料壳)尺寸装入，形成试剂卡。
第七方面，本发明还提供一种液体试剂杯，所述液体试剂杯包括杯体、试纸卡板和覆盖膜，所述试纸卡板置于杯体内，其上设有试纸插槽，所述试纸插槽内放置包括有如上所述的检测样本中氟胺酮的试剂条和其他毒品检测试剂条。
所述试纸插槽内还包括选择放置的防掺假试剂条；所述覆盖膜由试纸插槽开口面覆盖于所述试纸条表面。
在其中一些实施例中，所述覆盖膜底端边缘距离试纸条底端边缘的长度的3-10mm。
在其中一些实施例中，所述覆盖膜为透明膜。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首创了一种新型的氟胺酮人工半抗原和氟胺酮人工抗原，其制备方法，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们对氟胺酮的研究提供了方便的途径，可以满足国内对其研究的需要。
另外，本发明还提供了检测或测定氟胺酮的免疫层析分析试剂条、试剂卡和试剂杯，所述试剂条、试剂卡和试剂杯包括前述的氟胺酮人工抗原。应用在免疫层析技术上，具有高灵敏度、高特异性、简单快捷、易于操作和无需任何大型仪器设备等优点。可用于氟胺酮大规模的初筛。
附图说明
图1是实施例1中制得的氟胺酮半抗原的ESI-MS分析谱图；
图2是实施例2中氟胺酮半抗原、牛血清蛋白及氟胺酮抗原的紫外扫描图；
图3是实施例3制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂条的结构示意图；
图4是实施例3制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂卡的外观图；
图5是实施例3制得的免疫层析诊断试剂盒在检测氟胺酮时的各项结果的示意图(a为阴性结果，b为阳性结果，c和d均为失败结果)。
图6是实施例6制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂杯的结构示意图；
图7是实施例12、16制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂杯的结构示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例制备一种氟胺酮半抗原，制备方法如下：
分别称取10mmol羧甲基盐酸羟胺和10mmol K2CO3于50mL圆底烧瓶中，加入21mL甲醇和9mL纯化水，充分搅拌20min后，加入0.1mmol 18-冠醚-6和10mmol氟胺酮，于65℃条件下回流反应24h；反应结束后减压蒸干，残余物加入50mL超纯水和50mL二氯甲烷，分出水相后用2M盐酸调pH为4，用10mL正丁醇分两次萃取，合并正丁醇层进行干燥减压蒸馏，得到2.3mmol半抗原备用；对制得的半抗原进行ESI-MS分析(295.1[M+1])，结果如图1所示，证明成功制得氟胺酮半抗原。
实施例2
本实施例制备一种氟胺酮抗原，制备方法如下：
(1)氟胺酮半抗原活性酯的制备：
在25mL干燥单口瓶中，加入1mmol实施例1制得的半抗原、1.2mmol N-羟基琥珀酰亚胺、1.2mmol环己基碳酰二亚胺和8mL N,N-二甲基甲酰胺，在氦气保护下25℃下搅拌18h。反应完成后，将反应混合物分装8个1.5mL离心管中，10000rpm离心30min，将上清液分装在8个2mL的玻璃密封瓶中氦气保护下储藏备用。
(2)氟胺酮抗原(氟胺酮-牛血清蛋白)的制备：
取100mg BSA于25mL单口瓶中，加入8mL pH7.0的0.1M磷酸盐缓冲液搅拌溶解，用冰水浴使反应混合液温度维持在4℃左右，将2.6mL活性酯溶液缓慢的滴加到BSA溶液中，用0.1M盐酸随时调整反应液的pH值，维持混合液的pH值在7.0左右。滴加完毕后，维持反应液温度4℃左右，搅拌反应18h。反应结束后，将反应混合物转入透析袋中，用0.05M pH7.0的PBS缓冲液透析多次，用紫外分光光度计进行监测，直至透析液在200-400nm吸光值与基线一致，然后将透析袋中液体冻干，得目标抗原：氟胺酮-牛血清蛋白。
对制得的氟胺酮抗原进行如下鉴定：
(1)偶联比测定：偶联物的结合比是偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比，偶联比可采用分光光度法测定。分光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理，分别测定被偶联的两种分子浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱迭加的性质。偶联物的结合比是偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比。
分别测定上述氟胺酮半抗原、牛血清蛋白、上述氟胺酮抗原在某一波长下的摩尔消光系数(ε)，依据光谱分析中吸光度的加和性原理，根据公式：ε＝(ε抗原-ε牛血清蛋白)/ε半抗原，算出每摩尔载体蛋白上所偶联的半抗原摩尔数。依据紫外光谱扫描结果，对照三者的紫外吸光光谱特征可以进行定性解析。
氟胺酮半抗原、牛血清蛋白及氟胺酮抗原的紫外扫描图如图2所示，BSA在279nm和252nm处有典型吸收，氟胺酮半抗原和氟胺酮-牛血清蛋白偶联物的吸收在279nm和252nm处有明显的和偏移，这说明该人工抗原偶联物与其前体物质有不同的紫外吸收特征，表明半抗原与载体蛋白偶联成功，依据上述公式计算出半抗原与载体蛋白的分子结合比为9.32。
(2)氟胺酮抗原(氟胺酮-牛血清蛋白)蛋白浓度测定：配制浓度为0，40，60，80，100，120，160，200μg/mL的牛血清蛋白溶液1.5mL，加入5mL考马斯亮蓝染色液，立即混匀，静置20min，每个浓度做平行样，在595nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比例稀释，在595nm处测定抗原溶液的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应的蛋白浓度。本发明计算得抗原溶液的蛋白浓度为8.26mg/mL。
实施例3
本实施例制备一种检测尿液样本中氟胺酮的免疫层析诊断试剂条和试剂卡，制备方法如下：
(1)样品垫制备：将玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，然后烘干，样品垫处理溶液为0.02M pH 8.4Tris的配方且含有如下质量分数的成分：0.8％Triton X-100，0.8％Tween-80，2％兔血清，1％HPMC，1％海藻糖，1％LowCross-Buffer，2％NaCl，1％Na2CO3，0.5‰Proclin 300。
(2)标记垫制备：取质量分数0.01％HAuCl4水溶液100mL，加入质量分数1％柠檬酸三钠水溶液0.75mL，加热煮沸30min，颜色变红。停止加热，冷却待用。将胶体金溶液用0.1MK2CO3调pH9.0，搅拌胶体金溶液，加入抗氟胺酮单抗(广州万孚生物技术股份有限公司提供)继续搅拌10min，离心纯化得到免疫胶体金标记物，包被到玻璃纤维上，烘干备用；其中胶体金标记氟胺酮抗体的浓度为20μg/mL。
(3)硝酸纤维素膜制备：用实施例2制得的氟胺酮抗原配置T线溶液，用羊抗鼠IgG抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的T线、C线区域。其中氟胺酮抗原的包被浓度为0.5mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为1.0mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的用量为0.22μL/mm。其中氟胺酮抗原采用包被缓冲液进行包被，所述包被缓冲液配方为：pH为8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液、0.1％的S9和5％的脲。
(4)贴板方式为：硝酸纤维素膜T线(检测线)方向连接标记垫，C线(质控线)方向连接吸水板。标记垫压硝酸纤维素膜2mm。样品垫与标记垫相连，压标记垫1/3处，下方与PVC底板下端齐平。吸水板压硝酸纤维素膜1mm，上端与PVC底板上端齐平。当检测样本滴加到样品垫处，样品利用毛细效应向上层析，样品沿样品垫-标记垫-硝酸纤维素膜-吸水板方向移动，完成反应过程。切割，形成试剂条，如图3所示(其中1：样品垫；2：标记垫；3：T线；4：C线；5：吸水纸；6：PVC底板；7：硝酸纤维素膜)。
装入模具，形成试剂卡，如图4所示。
(5)检测结果判断：
取待检测尿液样本60μL，滴加在上述试剂盒样品加样区，当样品滴加到样品垫上后，液体将因毛细层析效应作用向吸水板端层析，如果样本液中无氟胺酮，标记了抗氟胺酮抗体的胶体金颗粒将随同样本液运行至膜上T线(检测线)位置后，与T线包被好的氟胺酮抗原发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线未知的堆积使得在T线呈现出一条肉眼可见的红色线条，此为阴性结果，如图5中a所示。如果样本液中含有氟胺酮，它们将和T线位置包被的氟胺酮-牛血清蛋白蛋白偶联物竞争有限的抗体结合位点，当样本液中的氟胺酮浓度达到一定量时，将占据胶体金颗粒上标记的所有抗体结合位点，从而阻止了T线位置上包被的氟胺酮-牛血清蛋白偶联物与其抗体胶体金的结合，这样T线区域无红色线条，表示结果阳性，如图5中的b所示。无论氟胺酮是否存在于样本液中，C线(质控线)区都会出现红色线条，该红色线条是判定是否有足够待检品，层析过程是否符合正常的标准，同时也作为试剂盒的内控标准。
正常结果：阳性为试剂盒显示区C线(质控线)出现一条红色线条，如图5中的a所示；阴性为试剂盒显示区T线(检测线)和C线(质控线)各出现一条红色线条，如图5中的b所示；失败结果：在试剂盒显示区T线和C线均无红色线条，如图5中的d所示，或仅T线出现一条红色线条，如图5中的c所示。
实施例4
本实施例使用实施例3制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂卡进行样本检测，样本为来源于广东正孚法医毒物司法鉴定所的临床样本，操作方法如下：
1、样本配制
根据测试要求，在空白尿样中添加氟胺酮标准品，分别配制成含氟胺酮的样本，浓度为0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、300ng/mL、350ng/mL、400ng/mL、450ng/mL、500ng/mL、550ng/mL、600ng/mL、650ng/mL、700ng/mL、750ng/mL、800ng/mL、850ng/mL、900ng/mL、950ng/mL、1000ng/mL、1050ng/mL、1100ng/mL、1150ng/mL、1200ng/mL、1250ng/mL和1300ng/mL。
2、检测与结果
2.1、将上述系列浓度定量梯度测试，测试时将样品加至试剂卡上的加样区(如图3、4所示)，测试时试剂条上检测线和质控线均显色为阴性；检测线不显色，质控线显色为阳性；检测线显色、质控线不显色或者检测线和质控线均不显色，试验失败；本实施例灵敏度实验结果如表1。
表1胶体金免疫层析分析试纸的灵敏度试验结果
浓度(ng/mL) 0 50 100 150 200 250 300 350 400
试纸结果 - - - - - - - - -
浓度(ng/mL) 450 500 550 600 650 700 750 800 850
试纸结果 - + + + + + + + +
浓度(ng/mL) 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300
试纸结果 + + + + + + + + +
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
实验结果表明，该试纸最低检测量500ng/mL。
2.2、阴性样本
根据测试要求，对经过GC/MS分析测试后的阴性样本1024例，分别加样在氟胺酮检测用胶体金免疫层析分析试纸上，结果均为阴性。
实施例5
氟胺酮检测用胶体金免疫层析分析试剂卡的药物交叉实验
94种毒品和常用药物，分别用阴性尿液配制浓度100μl/mL的样本。显色情况按照广州万孚生物技术股份有限公司比色卡判读，阴性结果用“-”表示，阳性结果用“+”表示。
表2胶体金免疫层析分析试纸的药物交叉试验结果
Figure BDA0002768270680000141
Figure BDA0002768270680000151
Figure BDA0002768270680000161
本实施例的检测氟胺酮的胶体金免疫层析分析试剂条采用常规的制备方法制成，包括测试条和支撑测试条的支撑板；测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，其中，层析材料预包被胶体金标记或有色标记的氟胺酮单克隆抗体或多克隆抗体。硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；检测线为氟胺酮抗原，检测线所在的区域为检测区；质控线为羊抗鼠多克隆抗体，质控线所在的区域为质控区。
实施例6
本实施例提供一种应用在尿液检材中的氟胺酮胶体金免疫层析分析试剂杯。
参阅图6(其中1：杯盖；2：密封圈；3：试纸卡板；4：杯体)，本实施例的样本检测杯，包括杯体、试纸卡板、覆盖膜、杯盖以及设置于杯盖内的密封圈；所述试纸卡板置于杯体内，其上设有试剂条插槽，所述插槽内放置有实施例3的氟胺酮检测试剂条和其他毒品检测试剂条和选择放置的防掺假试剂条；所述覆盖膜由插槽开口面覆盖于所述试剂条表面，述覆盖膜底端边缘距离试纸条底端边缘的长度的3-10mm。
实施例7
本实施例使用实施例6的试剂杯进行样本检测，样本为来源于广东正孚法医毒物司法鉴定所的临床样本，操作方法如下：
1、样本配制
同实施例4方法制备。
2、检测与结果
2.1、将上述系列浓度定量梯度测试，测试时将90mL样品加至检测杯中，旋紧杯盖静置；测试时试纸条上检测线和质控线均显色为阴性；检测线不显色，质控线显色为阳性；检测线显色、质控线不显色或者检测线和质控线均不显色，试验失败；本实施例灵敏度实验结果与实施例4一致，此处不再罗列。
实验结果表明，该试剂杯最低检测量500ng/mL。
2.2、阴性样本
根据测试要求，对经过GC/MS分析测试后的阴性样本318例，分别加样在试剂杯中，检测氟胺酮结果均为阴性。
实施例8
试剂杯的药物交叉实验
94种毒品和常用药物，分别用阴性尿液配制浓度100μl/mL的样本。显色情况按照广州万孚生物技术股份有限公司比色卡判读，阴性结果用“-”表示，阳性结果用“+”表示。
本实施例药物交叉实验结果与实施例5一致，此处不再罗列。
实施例9
本实施例制备一种检测毛发样本中氟胺酮的免疫层析诊断试剂条和试剂卡，制备方法如下：
(1)样品垫制备：将玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，然后烘干，样品垫处理溶液的配方为在0.01M pH8.4 Tris中加入如下质量分数组分：1.2％PVP-10，5％兔血清，1％海藻糖，1％LowCross-Buffer，0.8％Tween-80，0.1％HPMC，0.1％Na2CO3。
(2)标记垫制备：取质量分数0.01％的HAuCl4水溶液100mL，加入质量分数1％的柠檬酸三钠水溶液0.75mL，加热煮沸30min，颜色变红。停止加热，冷却待用。将胶体金溶液用0.1M K2CO3调pH9.0，搅拌胶体金溶液，加入抗氟胺酮单抗(广州万孚生物技术股份有限公司提供)继续搅拌搅拌10min，离心纯化得到免疫胶体金标记物，包被到玻璃纤维上，烘干备用；其中胶体金标记氟胺酮抗体的浓度为20μg/mL。
(3)硝酸纤维素膜制备：用实施例2制得的氟胺酮抗原配置T线溶液，用羊抗鼠IgG抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的T线、C线区域。其中氟胺酮抗原的包被浓度为0.1mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.8mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的用量为0.09μL/mm。其中氟胺酮抗原采用包被缓冲液进行包被，所述包被缓冲液配方为：pH为8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液、0.1％的S9和5％的脲。
(4)贴板方式为：硝酸纤维素膜T线(检测线)方向连接标记垫，C线(质控线)方向连接吸水板。标记垫压硝酸纤维素膜2mm。样品垫与标记垫相连，压标记垫1/3处，下方与PVC底板下端齐平。吸水板压硝酸纤维素膜1mm，上端与PVC底板上端齐平。当检测样本滴加到样品垫处，样品利用毛细效应向上层析，样品沿样品垫-标记垫-硝酸纤维素膜-吸水板方向移动，完成反应过程。切割，形成试剂条，如图3所示(其中1：样品垫；2：标记垫；3：T线；4：C线；5：吸水纸；6：PVC底板；7：硝酸纤维素膜)。
装入模具，形成试剂卡，如图4所示。
(5)毛发裂解液制备：取0.02M pH9.6 CB溶液加入如下质量分数的成分：5％D-异抗坏血酸钠，1％角蛋白酶S-221，2％尿素，1％TCEP·HCl，1％硫代乙醇酸钠，0.2％月桂醇硫酸钠，0.5％Proclin 300。
(6)检测结果判断：
取待检测毛发样本30mg，加入毛发上述毛发裂解液1mL，破碎裂解2min后，取60μL滴加在上述试剂盒样品加样区，当样品滴加到样品垫上后，液体将因毛细层析效应作用向吸水板端层析，如果样本液中无氟胺酮，标记了抗氟胺酮抗体的胶体金颗粒将随同样本液运行至膜上T线(检测线)位置后，与T线包被好的氟胺酮抗原发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线未知的堆积使得在T线呈现出一条肉眼可见的红色线条，此为阴性结果，如图5中a所示。如果样本液中含有氟胺酮，它们将和T线位置包被的氟胺酮-牛血清蛋白蛋白偶联物竞争有限的抗体结合位点，当样本液中的氟胺酮浓度达到一定量时，将占据胶体金颗粒上标记的所有抗体结合位点，从而阻止了T线位置上包被的氟胺酮-牛血清蛋白偶联物与其抗体胶体金的结合，这样T线区域无红色线条，表示结果阳性，如图5中的b所示。无论氟胺酮是否存在于样本液中，C线(质控线)区都会出现红色线条，该红色线条是判定是否有足够待检品，层析过程是否符合正常的标准，同时也作为试剂盒的内控标准。
正常结果：阳性为试剂盒显示区C线(质控线)出现一条红色线条，如图5中的a所示；阴性为试剂盒显示区T线(检测线)和C线(质控线)各出现一条红色线条，如图5中的b所示；失败结果：在试剂盒显示区T线和C线均无红色线条，如图5中的d所示，或仅T线出现一条红色线条，如图5中的c所示。
实施例10
本实施例使用实施例9制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂卡进行样本检测，样本为来源于广东正孚法医毒物司法鉴定所的临床样本，操作方法如下：
1、样本配制
根据测试要求，在30mg空白毛发样中添加氟胺酮标准品，向其中加入1mL毛发裂解液，分别配制成含氟胺酮的样本，浓度为0ng/mg、0.25ng/mg、0.5ng/mg、0.75ng/mg、1ng/mg、1.25ng/mg、1.5ng/mg、1.75ng/mg、2ng/mg、2.25ng/mg、2.5ng/mg、2.75ng/mg、3ng/mg、3.25ng/mg、3.5ng/mg、3.75ng/mg、4ng/mg、4.25ng/mg、4.5ng/mg、4.75ng/mg和5ng/mg。
2、检测与结果
2.1、将上述系列浓度定量梯度测试，测试时将样品加至试剂卡的加样区(如图3、4所示)，测试时试剂条上检测线和质控线均显色为阴性；检测线不显色，质控线显色为阳性；检测线显色、质控线不显色或者检测线和质控线均不显色，试验失败；本实施例灵敏度实验结果如表3。
表3灵敏度试验结果
浓度(ng/mg) 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5
试纸结果 - - - - + + +
浓度(ng/mg) 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25
试纸结果 + + + + + + +
浓度(ng/mg) 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5
试纸结果 + + + + + + +
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
实验结果表明，该试纸最低检测量1ng/mg。
2.2、阴性样本
根据测试要求，对经过GC/MS分析测试后的阴性毛发样本3286例，分别加样在实施例9试剂卡上，检测氟胺酮结果均为阴性。
实施例11
检测毛发样本中氟胺酮的免疫层析诊断试剂盒的药物交叉实验
94种毒品和常用药物，分别用阴性毛发和毛发裂解液配制浓度100μl/mL的样本。显色情况按照广州万孚生物技术股份有限公司比色卡判读，阴性结果用“-”表示，阳性结果用“+”表示。
本实施例药物交叉实验结果与实施例5一致，此处不再罗列。
实施例12
本实施例提供一种应用在毛发检材中的氟胺酮胶体金免疫层析分析试剂杯。
参阅图7(其中1：试纸卡板；2：带密封圈的连盖杯体)，本实施例的样本检测杯，包括带密封圈的连盖杯体、试纸卡板以及覆盖膜；所述试纸卡板置于杯体内，其上设有试剂条插槽，所述插槽内放置有实施例9的氟胺酮检测试剂条和其他毒品检测试剂条和选择放置的防掺假试剂条；所述覆盖膜由插槽开口面覆盖于所述试剂条表面，述覆盖膜底端边缘距离试纸条底端边缘的长度的3-10mm。
实施例13
本实施例制备一种检测唾液样本中氟胺酮的免疫层析诊断试剂条和试剂卡，制备方法如下：
(1)样品垫制备：将玻璃纤维浸泡在样品垫处理液中，然后烘干，样品垫处理溶液的配方为0.02M pH8.4 Tris且加入如下质量分数的成分：2％兔血清，1.2％PVP-10，1％海藻糖，1％NaCl，1％Na2CO3，1％HPMC，0.8％Triton X-100，0.8％Tween-80，0.5‰Proclin300。
(2)标记垫制备：取0.01％HAuCl4水溶液100mL，加入1％柠檬酸三钠水溶液0.75mL，加热煮沸30min，颜色变红。停止加热，冷却待用。将胶体金溶液用0.1M K2CO3调pH9.0，搅拌胶体金溶液，加入抗氟胺酮单抗(广州万孚生物技术股份有限公司提供)继续搅拌搅拌10min，离心纯化得到免疫胶体金标记物，包被到玻璃纤维上，烘干备用。其中胶体金标记氟胺酮抗体的浓度为20μg/mL。
(3)硝酸纤维素膜制备：用实施例2制得的氟胺酮抗原配置T线溶液，用羊抗鼠IgG抗体配置C线溶液，然后把它们分别包被到硝酸纤维素膜上的T线、C线区域。其中氟胺酮抗原的包被浓度为0.2mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的包被浓度为0.8mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的用量为0.1μL/mm。其中氟胺酮抗原采用包被缓冲液进行包被，所述包被缓冲液配方为：pH为8.0、50mM的Tris-HCl缓冲液、0.1％的S9和5％的脲。
(4)贴板方式为：硝酸纤维素膜T线(检测线)方向连接标记垫，C线(质控线)方向连接吸水板。标记垫压硝酸纤维素膜2mm。样品垫与标记垫相连，压标记垫1/3处，下方与PVC底板下端齐平。吸水板压硝酸纤维素膜1mm，上端与PVC底板上端齐平。当检测样本滴加到样品垫处，样品利用毛细效应向上层析，样品沿样品垫-标记垫-硝酸纤维素膜-吸水板方向移动，完成反应过程。切割，形成试剂条，如图3所示(其中1：样品垫；2：标记垫；3：T线；4：C线；5：吸水纸；6：PVC底板；7：硝酸纤维素膜)。
装入模具，形成试剂卡，如图4所示。
(5)检测结果判断：
取待检测唾液样本60μl，滴加在上述试剂盒样品加样区，当样品滴加到样品垫上后，液体将因毛细层析效应作用向吸水板端层析，如果样本液中无氟胺酮，标记了抗氟胺酮抗体的胶体金颗粒将随同样本液运行至膜上T线(检测线)位置后，与T线包被好的氟胺酮抗原发生免疫结合反应，胶体金颗粒在T线未知的堆积使得在T线呈现出一条肉眼可见的红色线条，此为阴性结果，如图5中a所示。如果样本液中含有氟胺酮，它们将和T线位置包被的氟胺酮-牛血清蛋白蛋白偶联物竞争有限的抗体结合位点，当样本液中的氟胺酮浓度达到一定量时，将占据胶体金颗粒上标记的所有抗体结合位点，从而阻止了T线位置上包被的氟胺酮-牛血清蛋白偶联物与其抗体胶体金的结合，这样T线区域无红色线条，表示结果阳性，如图5中的b所示。无论氟胺酮是否存在于样本液中，C线(质控线)区都会出现红色线条，该红色线条是判定是否有足够待检品，层析过程是否符合正常的标准，同时也作为试剂盒的内控标准。
正常结果：阳性为试剂盒显示区C线(质控线)出现一条红色线条，如图5中的a所示；阴性为试剂盒显示区T线(检测线)和C线(质控线)各出现一条红色线条，如图5中的b所示；失败结果：在试剂盒显示区T线和C线均无红色线条，如图5中的d所示，或仅T线出现一条红色线条，如图5中的c所示。
实施例14
本实施例使用实施例13制得的检测氟胺酮的免疫层析诊断试剂卡进行样本检测，样本为来源于广东正孚法医毒物司法鉴定所的临床样本，操作方法如下：
1、样本配制
根据测试要求，在空白唾液样中添加氟胺酮标准品，分别配制成含氟胺酮的样本，浓度为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL和200ng/mL。
2、检测与结果
2.1、将上述系列浓度定量梯度测试，测试时将样品加至试剂卡的加样区(如图3、4所示)，测试时试剂条上检测线和质控线均显色为阴性；检测线不显色，质控线显色为阳性；检测线显色、质控线不显色或者检测线和质控线均不显色，试验失败；本实施例灵敏度实验结果如表4。
表4灵敏度试验结果
浓度(ng/mL) 0 10 20 30 40 50 60
试纸结果 - - - - - + +
浓度(ng/mL) 70 80 90 100 110 120 130
试纸结果 + + + + + + +
浓度(ng/mL) 140 150 160 170 180 190 200
试纸结果 + + + + + + +
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
实验结果表明，该试纸最低检测量50ng/mL。
2.2、阴性样本
根据测试要求，对经过GC/MS分析测试后的阴性样本1024例，分别加样在实施例13的试剂盒上，结果均为阴性。
实施例15
检测唾液样本中氟胺酮的免疫层析诊断试剂卡的药物交叉实验。
94种毒品和常用药物，分别用阴性唾液配制浓度100μl/mL的样本。显色情况按照广州万孚生物技术股份有限公司比色卡判读，阴性结果用“-”表示，阳性结果用“+”表示。
本实施例药物交叉实验结果与实施例8一致，此处不再罗列。
实施例16
本实施例提供一种应用在唾液检材中的氟胺酮胶体金免疫层析分析试剂杯。
参阅图7(其中1：试纸卡板；2：带密封圈的连盖杯体)，本实施例的样本检测杯，包括带密封圈的连盖杯体、试纸卡板以及覆盖膜；所述试纸卡板置于杯体内，其上设有试剂条插槽，所述插槽内放置有实施例13的氟胺酮检测试剂条和其他毒品检测试剂条和选择放置的防掺假试剂条；所述覆盖膜由插槽开口面覆盖于所述试剂条表面，述覆盖膜底端边缘距离试纸条底端边缘的长度的3-10mm。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种氟胺酮半抗原、氟胺酮抗原及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种氟胺酮半抗原，其特征在于，所述氟胺酮半抗原的结构如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002768270670000011
其中，x为1-6的任一整数；y为x的2倍。
2.如权利要求1所述的氟胺酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述氟胺酮半抗原的制备方法包括：以氟胺酮和式(Ⅱ)所示的化合物为原料，进行反应，在氟胺酮的羰基上引入具有羧基的活性手臂，得到所述氟胺酮半抗原；
Figure FDA0002768270670000012
其中，x为1-6的任一整数；y为x的2倍。
3.如权利要求2所述的氟胺酮半抗原的制备方法，其特征在于，所述反应在碱性条件下进行；
优选地，所述碱性介质包括碳酸钾；
优选地，所述氟胺酮与式(Ⅱ)所示化合物的摩尔比为1:(1-3)；
优选地，所述反应的介质包括甲醇水溶液；
优选地，所述甲醇与水的体积比为(3-4):(1-2)，进一步优选7:3；
优选地，所述反应的温度为15-65℃，时间为18-36h。
4.一种氟胺酮抗原，其特征在于，所述氟胺酮抗原是由权利要求1所述的氟胺酮半抗原制备得到的。
5.如权利要求4所述的氟胺酮抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将氟胺酮半抗原进行活化后，与载体蛋白进行偶联反应，得到所述氟胺酮抗原。
6.如权利要求5所述的氟胺酮抗原的制备方法，其特征在于，所述氟胺酮半抗原的活化方式为：将氟胺酮半抗原与N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺混合反应，得到活化的氟胺酮半抗原。
7.如权利要求6所述的氟胺酮抗原的制备方法，其特征在于，所述氟胺酮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺和环己基碳酰二亚胺的摩尔比为1:(1-1.5):(1-1.5)；
优选地，所述反应的反应介质包括N,N-二甲基甲酰胺；
优选地，所述载体蛋白包括牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、牛血红蛋白、牛甲状腺蛋白、人免疫球蛋白IgG或人免疫球蛋白IgA；
优选地，所述偶联反应的体系pH值维持在6.8-7.2；
优选地，所述偶联反应的温度为2-8℃，时间为10-24h；
优选地，所述偶联反应结束后，将反应混合物进行透析纯化，透析液为0.05M，pH7.0的PBS缓冲液。
8.如权利要求1所述的氟胺酮半抗原或如权利要求4所述的氟胺酮抗原在对样本中的氟胺酮进行免疫检测中的应用；
优选地，所述样本包括体液样本或组织样本。
9.一种检测样本中氟胺酮的免疫层析试剂条，其特征在于，所述免疫层析试剂条包括样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水板和底板；所述硝酸纤维素膜包括被如权利要求4所述的氟胺酮抗原包被的检测线和被羊抗鼠抗体包被的质控线。
10.一种液体试剂杯，所述液体试剂杯包括杯体、试纸卡板和覆盖膜，所述试纸卡板置于杯体内，其上设有试纸插槽，其特征在于，所述试纸插槽内放置包括有权利要求9所述的检测样本中氟胺酮的试剂条和其他毒品检测试剂条。
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