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CN112159796A - 一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用 - Google Patents

一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用 Download PDF

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CN112159796A
CN112159796A CN202011091320.4A CN202011091320A CN112159796A CN 112159796 A CN112159796 A CN 112159796A CN 202011091320 A CN202011091320 A CN 202011091320A CN 112159796 A CN112159796 A CN 112159796A
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CN
China
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umbilical cord
cells
mesenchymal stem
stem cells
tissue
Prior art date
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Pending
Application number
CN202011091320.4A
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Inventor
刘中民
贾文文
林鑫
汤红明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Original Assignee
Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
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Publication date
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Abstract

本发明涉及一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用，属于细胞培养技术领域。本发明所述方法包括：用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；将干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；将华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple‑Express消化酶混合，消化，得到消化后的组织块；用完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，进行贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。本发明提供的方法能够增加原代脐带间充质干细胞获得的数量，还能够减少对原代细胞的损伤，为间充质干细胞的规模化培养提供了技术支持。

Description

一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种临床用人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用。
背景技术
脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有较高的分化潜能，在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。不表达或低表达免疫排斥相关标记，且取材方便，无伦理争议，是目前较为理想的再生医学干细胞治疗的种子细胞之一。目前获得脐带间充质干细胞的方法主要有酶消化法和组织块贴壁法两种传统方法，但这两种方法所获得的原代脐带间充质干细胞数量与理论上人脐带所含的间充质干细胞的数量相差很多，同时酶消化法还会对原代脐带间充质干细胞造成损伤。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用。本发明提供的方法能够增加原代脐带间充质干细胞获得的数量，还能够减少对原代细胞的损伤，为间充质干细胞的规模化培养提供了技术支持。
本发明提供了一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法，包括以下步骤：
1)用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；
2)将步骤1)得到的干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；
3)将步骤2)得到的华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple-Express消化酶混合，37℃消化15～25min，得到消化后的组织块；
4)用第一完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，将弃上清的组织块进行10～15d的贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。
优选的是，步骤1)所述脐带在喷淋乙醇水溶液前，还包括：用生理盐水浸没后震荡清洗。
优选的是，步骤1)所述乙醇水溶液中，乙醇的体积百分含量为70～80％。
优选的是，步骤3)所述组织块的体积为1～2mm3。
优选的是，步骤4)所述离心的条件为2500rpm离心5～10min。
优选的是，步骤4)所述第一完全培养基为体积百分含量为8～10％的完全培养基：α-MEM无血清培养基加入体积百分含量为8～10％的HeliosμLtraGROAdvanced。
优选的是，步骤4)所述贴壁培养和消化培养的方法包括以下步骤：
将弃上清的组织块培养4～6h后，加入第一完全培养基进行培养，每4～6d更换新的完全培养基，待细胞融合度达75～85％，去除组织块，加入生理盐水洗去残余完全培养基，弃去生理盐水，加入Tryple-Express消化酶，25～37℃消化1～3min，至细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起，得到消化好的细胞；将消化好的细胞与生理盐水混合，离心，弃上清，将沉淀用第二完全培养基重悬；所述第二完全培养基为体积百分含量为4～5％的完全培养基。
优选的是，所述离心的条件为1500rpm离心5～6min。
本发明还提供了Tryple-Express消化酶在原代分离人脐带来源的间充质干细胞中的应用。
本发明提供了一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法。利用Tryple-Express消化酶消化脐带组织块，使致密的组织变得松散，增加原代脐带间充质干细胞获得的数量。相对于现有的酶消化法和组织块贴壁法，既减少了对细胞的损伤，又增加了原代脐带间充质干细胞获得的数量。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞；
图2为本发明实施例1提供的未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞；
图3为本发明实施例2提供的Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞；
图4为本发明实施例2提供的未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞；
图5为本发明实施例3提供的Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞；
图6为本发明实施例3提供的未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。
具体实施方式
本发明提供了一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法，包括以下步骤：
1)用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；
2)将步骤1)得到的干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；
3)将步骤2)得到的华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple-Express消化酶混合，37℃消化15～25min，得到消化后的组织块；
4)用第一完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，将弃上清的组织块进行10～15d的贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。
本发明对所述脐带的来源没有特殊限定，使用本领域技术人员熟知的常规新生儿脐带即可。本发明所述脐带优选在保存液中进行保存。在本发明中，所述保存液中优选含有双抗，预防脐带在采集和运输过程中污染。在本发明中，所述双抗优选为青霉素和链霉素的混合液。在本发明中，所述双抗的来源优选为美国GIBCO公司，货号为15140-122，规格为100ml。更优选的，脐带保存液中含有200U的青霉素和200μg的链霉素。在本发明中，所述脐带在喷淋乙醇水溶液前，优选还包括：用生理盐水浸没后震荡清洗，所述清洗的目的为去除粘附在脐带表面的血液及其它污染物。
本发明用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带。在本发明中，所述乙醇水溶液中，乙醇的体积百分含量优选为70～80％，更优选为75％。本发明优选用乙醇水溶液对脐带表面进行喷淋，目的是对脐带表面进行消毒。在本发明中，所述清洗的次数优选为2～3次，所述清洗能够防止有酒精残留，有酒精残留会影响细胞的爬出。本发明洗去血液的方法优选包括以下步骤：加入生理盐水，取无菌剪刀将脐带分为3～4cm长的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液。本发明洗去血液的操作为了是去除脐带静脉和动脉内存留的血液，血液也会对细胞后续的生长产生影响，同时血液不除净后续培养中培养基会有红细胞的存在。
得到干净脐带后，本发明将干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶。在本发明中，找到脐静脉后，优选从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。本发明在剔除静脉后，优选先分离脐带华氏胶，分离出的脐带华氏胶及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉(2条)。
得到华氏胶后，本发明将华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple-Express消化酶混合，37℃消化15～25min，得到消化后的组织块。在本发明中，所述组织块的体积优选为1～2mm3，更优选为1mm3。在本发明中，所述Tryple-Express消化酶优选购自美国GIBCO公司货号：12604021无动物源性的胰酶替代物规格：500ml装。所述Tryple-Express消化酶的常规用途为消化贴壁生长的细胞，本发明将Tryple-Express消化酶用于消化华氏胶胶组织块可以使致密的组织块变得疏松，有利于细胞的爬出。
得到组织块后，本发明用第一完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，将弃上清的组织块进行10～15d的贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。本发明使用完全培养基清洗消化后的组织块能够去除残留的消化酶，防止残留的消化酶对细胞的生长产生影响。在本发明中，所述离心的条件优选为2500rpm，5～10min，更优选为7min。在本发明中，所述第一完全培养基优选为体积百分含量为8～10％的完全培养基：α-MEM无血清培养基加入体积百分含量为8～10％的HeliosμLtraGROAdvanced。本发明第一完全培养基用于华氏胶组织块清洗及组织块贴壁培养和消化培养到细胞爬出这一阶段。在本发明中，所述α-MEM无血清培养基的市售来源优选为：美国GIBCO公司，货号：C12571500BT规格：500ml；所述HeliosμLtraGROAdvanced(血清替代物)的市售来源优选为：美国GIBCO公司，货号：PCFDCGL50规格：500ml。相对于生理盐水来说，使用第一完全培养基清洗可以组织块中残留的消化液的后续作用，同时还可以使组织块保持湿润状态，防止组织块过于干燥而不能爬出细胞。得到原代分离的人脐带来源的间充质干细胞后，本发明优选将其均匀铺在T-75细胞培养瓶中进行培养。
在本发明中，所述贴壁培养和消化培养的方法包括以下步骤：
将弃上清的组织块培养4～6h后，加入第一完全培养基进行培养，每4～6d更换新的完全培养基，待细胞融合度达75～85％，去除组织块，加入生理盐水洗去残余完全培养基，弃去生理盐水，加入Tryple-Express消化酶，25～37℃消化1～3min，至细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起，得到消化好的细胞；将消化好的细胞与生理盐水混合，离心，弃上清，将沉淀用第二完全培养基重悬，重悬后得到的含有人脐带来源的间充质干细胞的细胞悬液；所述第二完全培养基为体积百分含量为4～5％的完全培养基，本发明第二完全培养基用于细胞的后续传代培养。本发明所述贴壁培养能够使细胞数量扩增，同时去除华氏胶组织块(后续传代培养时华氏胶组织块不能再和细胞同时存在)。本发明所述消化的目的是将贴壁生长的间充质干细胞脱离贴壁生长的状态，漂浮在消化液中，后续加入生理盐水混合离心，然后将混合液转移至离心管中离心，弃上清，能得到间充质干细胞。本发明优选将弃上清的组织块培养4～6h后，优选加入7mL完全培养基，4～6h后加液有利于华氏胶组织块贴壁，同时组织块也不会过于干燥。
本发明优选使用显微镜观察组织块周围，每4～6d，更优选5d更换培养基，约6～7d组织块周围爬出细胞(每4～6d更换培养基可以促进细胞从华氏胶组织块周围爬出)。
待细胞融合度达75～85％，更优选80％左右，本发明优选轻轻拍打弃去组织块，加入5mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
弃去生理盐水后，本发明优选加入Tryple-Express，25～37℃静置消化1～3min，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起，得到消化好的细胞。在本发明中，所述Tryple-Express消化酶优选根据贴壁细胞的培养面积进行添加，只要能保证消化酶能够覆盖整个培养瓶的底部，确保所有的细胞能够被消化液浸润即可。具体地，T75培养瓶底面积为75cm2，T175培养瓶底面积为175cm2。T75培养瓶优选加1～2ml消化酶，T175培养瓶优选加3～4ml消化酶。
消化好的细胞优选加入6mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5～6min。
本发明弃上清，向沉淀中优选加入20mL完全培养基重悬，制成细胞(间充质干细胞)悬液。取20μL计数后，按照150万/T-175接种于培养瓶。放入培养箱于5％CO2，37℃条件下培养。
本发明还提供了Tryple-Express消化酶在原代分离人脐带来源的间充质干细胞中的应用。Tryple-Express消化酶具体应用情况同上述技术方案所述方法，再次不再赘述。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.在超净工作柜台中打开瓶子，弃去瓶中保存液后，向瓶中加入生理盐水(浸没脐带即可)，震荡清洗。
2.弃去盐水后，将代号为ZDD的脐带倒入无菌100mm培养皿中，用75％乙醇水溶液喷淋脐带表面。
3.用生理盐水清洗75％乙醇水溶液喷淋后的脐带3次后，向培养皿中加入生理盐水，取无菌剪刀将脐带分为3cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液。
4.将洗干净的脐带放入含生理盐水的无菌100mm培养皿中，找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。
5.分离脐带华氏胶，分离出的脐带华氏胶及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉(2条)。
6.取50mL离心管加热后剪去一半，放入分离出的华氏胶，用无菌剪刀剪碎成1mm3大小的组织块。组织剪碎后加入等体积比的Tryple-Express消化酶充分混匀，37℃消化15分钟。另一个50ml离心管内的华氏胶组织块不用消化，直接将剪碎后组织均匀铺在T-75细胞培养瓶中(组织块贴壁法)。
7.将消化后的组块转移的新的50ml离心管中，用生理盐水补足到45ml，2500rpm，7min离心清洗消化后的组织块。
8.弃上清，清洗后的组织均匀铺在T-75细胞培养瓶中。
9.将8所得T-75放入培养箱培养6h后，加入7mL完全培养基，4～6h后加液有利于华氏胶组织块贴壁，同时组织块也不会过于干燥。
10.显微镜观察组织块周围，每5d更换培养基，约7d组织块周围爬出细胞(每5d更换培养基可以促进细胞从华氏胶组织块周围爬出)。
11.于12d后镜下观察分别用两种方法获得的华氏胶组织块周围爬出来的细胞，拍照，可明显观察到用Tryple-Express消化酶消化15min后的华氏胶组织块周围爬出来的细胞多于未用消化酶消化的组织块周围爬出来的细胞。
图1为Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞，图2为未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。图1和图2均为在4×镜下拍摄的图片。图1细胞生长的密度高于图2细胞生长的密度，说明用Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞多于未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。可以得出Tryple-Express消化法相较于组织块贴壁法，可以获得更多的细胞。
12.待细胞融合度达80％左右，轻轻拍打弃去组织块，加入5mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
13.弃去生理盐水后，加入2mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
14.消化好的细胞加入6mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
15.弃上清，向沉淀中加入20mL完全培养基重悬，制成细胞悬液。
两种方法获得脐带间充质干细胞分别吸取20μL细胞悬液计数，计数后计算两种方法各获得的细胞数量的平均数，结果如表1，根据镜下观察和计数结果可以得出利用Tryple-Express消化酶消化脐带华氏胶组织块获得的细胞数量多于未处理过的脐带华氏胶组织块获得的细胞数量。
表1两种方法各获得的细胞数量的平均数
Figure BDA0002722207710000071
Figure BDA0002722207710000081
16.按照150万/T-175将两种方法获得脐带间充质干细胞分别接种于培养瓶中，放入培养箱于5％CO2，37℃条件下进行传代培养。
17.用倒置显微镜观察T-175细胞培养瓶中细胞状态，细胞融合度的达到80％左右时消化获取脐带间充质干细胞。
18.在超净工作柜台中打开需消化细胞的T-175细胞培养瓶，弃去瓶中培养基。加入10mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
19.弃去生理盐水后，加入3mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min左右，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
20.消化好的细胞加入10mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
21.弃上清，向沉淀中加入20mL生理盐水，制成细胞悬液。取20μL计数，根据计数结果各取相应数量的细胞做质量检测。(因Tryple消化获得的脐带间充质干细胞多于未消化获得的脐带间充质干细胞，所以接种了Tryple消化获得的脐带间充质干细胞会更早达到上述融合度，培养瓶会提前处理)。
22.纯度和均一性检测：
(1)细胞计数：2.5×106，体积：1000μL；
(2)将细胞悬液以100μL每管的体积均分到10个EP管中。每份细胞，2.5×105，并做如下标记：Blank、MSC-ISO、Msc、PE-ISO、CD11、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；
(3)2000转/分钟，离心8分钟，小心弃去上清；
(4)加入25μL的DPBS重悬；
(5)先将流式单染抗体PE-ISO、CD11、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR各取5μL加入到对应的EP管中，轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟；
(6)15分钟时，再将流式抗体MSC-ISO、MSC各取2.5μL加入到对应的EP管中；轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育10分钟；
(7)染色终止后，每管加入500μLDPBS洗一遍样品，2000转/分钟，离心6分钟，小心弃去上请；
(8)重复步骤(7)；
(9)加入200μL的DPBS重悬，转移到流式管中。上机做流式检测。使用BD CantoⅡ进行样本数据收集和分析。
(10)tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：100％/100％/100％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：1.91％/0.326％/0.291％/0.770％/0.295％。
未用tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：99.9％/99.9％/99.9％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：1.72％/0.131％/0.190％/0.825％/0.190％。
脐带来源的间充质干细胞主要表达CD73/CD90/CD105等几种细胞因子，低表达或不表达CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR等几种细胞因子。步骤(10)是ZDD这一根脐带用两种方法获取的细胞，表达的细胞因子的检测结果。两种方法获得的细胞的阳性细胞的比例未有明显的区别，用tryple消化酶消化法获得的细胞的阳性细胞比例略高于组织块贴壁法获得的细胞的阳性细胞比例。可以得出tryple消化酶消化法获得的细胞的细胞质量与组织块贴壁法获得的细胞的细胞质量未有明显的差异。
23.异常免疫学反应检测：
1.取待检测样本细胞，7×105个细胞到T75培养瓶(用含5％血替的α-MEM培养)过夜使其贴壁。
2.第2d弃培养基，用DPBS清洗一遍，加入无血清培α-MEM养基培养72h。
3.当样本细胞培养48h时，BV2细胞(用含10％FBS的DMEM培养)铺96孔板(10000个/孔)。
4.当样本细胞培养72h时，收集培养的上清液，离心(4℃，2000rpm，5min)，去除细胞碎片，收集上清液。
5.同时弃去BV2细胞培养上清液，DPBS清洗一遍，加入收集的样本细胞培养上清液，96孔板每孔加入100μL，对照孔加入含10％FBS DMEM，共培养48h。
6.共培养48h后向96孔板加入CCK8试剂(10μL/孔)，用酶标仪在波长450nm测OD值，BV2细胞存活率＝处理组OD值/对照组OD值。样本细胞免疫抑制力＝((1-BV2细胞存活率)*100)％，结果如表2所示。
表2 MSC免疫抑制力实验结果
Figure BDA0002722207710000101
免疫抑制是指对于机体免疫应答机制的抑制作用，免疫抑制力越高说明对免疫应答机制的抑制作用越强。人脐带来源的间充质干细胞具有免疫抑制作用，可以应用于预防和治疗移植物抗宿主病。ZDD的脐带利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的免疫抑制力为67.21％，利用组织块贴壁法获得间充质干细胞的免疫抑制力为59.68％。根据上述结果也可以得出利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的质量与组织块贴壁法获得的细胞的质量没有明显差别，甚至在免疫抑制方面好于组织块贴壁法获得的细胞。
24.根据纯度和均一性检测，及异常免疫学反应检测的结果可以得出，tryple消化酶消化法所获得的细胞的细胞质量与组织块贴壁法所获得的细胞的细胞质量没有明显差异。
实施例2
1.在超净工作柜台中打开瓶子，弃去瓶中保存液后，向瓶中加入生理盐水(浸没脐带即可)，震荡清洗。
2.弃去盐水后，将代号为ZRF的脐带倒入无菌100mm培养皿中，用75％乙醇水溶液喷淋脐带表面。
3.用生理盐水清洗75％乙醇水溶液喷淋后的脐带3次后，向培养皿中加入生理盐水，取无菌剪刀将脐带分为3cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液。
4.将洗干净的脐带放入含生理盐水的无菌100mm培养皿中，找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。
5.分离脐带华氏胶，分离出的脐带华氏胶及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉(2条)。
6.取50mL离心管加热后剪去一半，放入分离出的华氏胶，用无菌剪刀剪碎成1mm3大小的组织块。组织剪碎后加入等体积比的Tryple-Express消化酶充分混匀，37℃消化15分钟。另一个50ml离心管内的华氏胶组织块不用消化，直接将剪碎后组织均匀铺在T-75细胞培养瓶中(组织块贴壁法)。
7.将消化后的组块转移的新的50ml离心管中，用生理盐水补足到45ml，2500rpm，7min离心清洗消化后的组织块。
8.弃上清，清洗后的组织均匀铺在T-75细胞培养瓶中。
9.将8所得T-75放入培养箱培养6h后，加入7mL完全培养基，4～6h后加液有利于华氏胶组织块贴壁，同时组织块也不会过于干燥。
10.显微镜观察组织块周围，每5d更换培养基，约7d组织块周围爬出细胞(每5d更换培养基可以促进细胞从华氏胶组织块周围爬出)。
11.于12d后镜下观察分别用两种方法获得的华氏胶组织块周围爬出来的细胞，拍照，可明显观察到用Tryple-Express消化酶消化15min后的华氏胶组织块周围爬出来的细胞多于未用消化酶消化的组织块周围爬出来的细胞。
图3为Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞，图4为未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。图3和图4均为4×镜下拍摄的图片。图3细胞生长的密度高于图4细胞生长的密度，说明用Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞多于未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。可以得出Tryple-Express消化法相较于组织块贴壁法，可以获得更多的细胞。
12.待细胞融合度达80％左右，轻轻拍打弃去组织块，加入5mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
13.弃去生理盐水后，加入2mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
14.消化好的细胞加入6mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
15.弃上清，向沉淀中加入20mL完全培养基重悬，制成细胞悬液。
两种方法获得脐带间充质干细胞分别吸取20μL细胞悬液计数，计数后计算两种方法各获得的细胞数量的平均数，结果如表3，根据镜下观察和计数结果可以得出利用Tryple-Express消化酶消化脐带华氏胶组织块获得的细胞数量多于未处理过的脐带华氏胶组织块获得的细胞数量。
表3两种方法各获得的细胞数量的平均数
ZRF细胞数量平均数
Tryple消化 2.08ⅹ10<sup>4</sup>
正常未消化 1.03ⅹ10<sup>4</sup>
16.按照150万/T-175将两种方法获得脐带间充质干细胞分别接种于培养瓶中，放入培养箱于5％CO2，37℃条件下进行传代培养。
17.用倒置显微镜观察T-175细胞培养瓶中细胞状态，细胞融合度的达到80％左右时消化获取脐带间充质干细胞。
18.在超净工作柜台中打开需消化细胞的T-175细胞培养瓶，弃去瓶中培养基。加入10mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
19.弃去生理盐水后，加入3mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min左右，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
20.消化好的细胞加入10mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
21.弃上清，向沉淀中加入20mL生理盐水，制成细胞悬液。取20μL计数，根据计数结果各取相应的细胞做质量检测。(因Tryple消化获得的脐带间充质干细胞多于未消化获得的脐带间充质干细胞，所以接种了Tryple消化获得的脐带间充质干细胞会更早达到上述融合度，培养瓶会提前处理)。
22.纯度和均一性检测：
(1)细胞计数：2.5×106，体积：1000μL；
(2)将细胞悬液以100μL每管的体积均分到10个EP管中。每份细胞，2.5×105，并做如下标记：Blank、MSC-ISO、Msc、PE-ISO、CD11、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；
(3)2000转/分钟，离心8分钟，小心弃去上清；
(4)加入25μL的DPBS重悬；
(5)先将流式单染抗体PE-ISO、CD11、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR各取5μL加入到对应的EP管中，轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟；
(6)15分钟时，再将流式抗体MSC-ISO、MSC各取2.5μL加入到对应的EP管中；轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育10分钟；
(7)染色终止后，每管加入500μLDPBS洗一遍样品，2000转/分钟，离心6分钟，小心弃去上请；
(8)重复步骤(7)；
(9)加入200μL的DPBS重悬，转移到流式管中。上机做流式检测。使用BD CantoⅡ进行样本数据收集和分析。
(10)tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：100％/99.9％/99.9％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：0.224％/0.015％/0.057％/0.155％/0.014％。
未用tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：100％/99.9％/99.9％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：1.56％/0.116％/0.152％/1.22％/0.240％。
脐带来源的间充质干细胞主要表达CD73/CD90/CD105等几种细胞因子，低表达或不表达CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR等几种细胞因子。步骤(10)是ZRF这一根脐带用两种方法获取的细胞，表达的细胞因子的检测结果。两种方法获得的细胞的阳性细胞的比例未有明显的区别，用tryple消化酶消化法获得的细胞的阴性细胞比例低于组织块贴壁法获得的细胞的阴性细胞比例。可以得出tryple消化酶消化法获得的细胞的细胞质量与组织块贴壁法获得的细胞的细胞质量未有明显的差异。
23.异常免疫学反应检测：
1.取待检测样本细胞，7×105个细胞到T75培养瓶(用含5％血替的α-MEM培养)过夜使其贴壁。
2.第2d弃培养基，用DPBS清洗一遍，加入无血清培α-MEM养基培养72h。
3.当样本细胞培养48h时，BV2细胞(用含10％FBS的DMEM培养)铺96孔板(10000个/孔)。
4.当样本细胞培养72h时，收集培养的上清液，离心(4℃，2000rpm，5min)，去除细胞碎片，收集上清液。
5.同时弃去BV2细胞培养上清液，DPBS清洗一遍，加入收集的样本细胞培养上清液，96孔板每孔加入100μL，对照孔加入含10％FBS DMEM，共培养48h。
6.共培养48h后向96孔板加入CCK8试剂(10μL/孔)，用酶标仪在波长450nm测OD值，BV2细胞存活率＝处理组OD值/对照组OD值。样本细胞免疫抑制力＝((1-BV2细胞存活率)*100)％，结果如表4所示。
表4 MSC免疫抑制力实验结果
Figure BDA0002722207710000141
Figure BDA0002722207710000151
免疫抑制是指对于机体免疫应答机制的抑制作用，免疫抑制力越高说明对免疫应答机制的抑制作用越强。人脐带来源的间充质干细胞具有免疫抑制作用，可以应用于预防和治疗移植物抗宿主病。ZRF的脐带利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的免疫抑制力为66.06％，利用组织块贴壁法获得间充质干细胞的免疫抑制力为51.98％。根据上述结果可以得出利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的质量与组织块贴壁法获得的细胞的质量没有明显差别，甚至在免疫抑制方面优于组织块贴壁法获得的细胞。
24.根据纯度和均一性检测，及异常免疫学反应检测的结果可以得出，tryple消化酶消化法所获得的细胞的细胞质量与组织块贴壁法所获得的细胞的细胞质量没有明显差异。
实施例3
1.在超净工作柜台中打开瓶子，弃去瓶中保存液后，向瓶中加入生理盐水(浸没脐带即可)，震荡清洗。
2.弃去盐水后，将代号为JJM的脐带倒入无菌100mm培养皿中，用75％乙醇水溶液喷淋脐带表面。
3.用生理盐水清洗酒精喷淋后的脐带3次后，向培养皿中加入生理盐水，取无菌剪刀将脐带分为4cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液。
4.将洗干净的脐带放入含生理盐水的无菌100mm培养皿中，找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。
5.分离脐带华氏胶，分离出的脐带华氏胶及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉(2条)。
6.取50mL离心管加热后剪去一半，放入分离出的组织，用无菌剪刀剪碎成1mm3大小的组织块。组织剪碎后1:1分到两个50ml离心管中，一个50ml离心管内的华氏胶组织块用等比的Tryple-Express消化酶37℃消化15分钟，另一个50ml离心管内的华氏胶组织块不用消化，直接将剪碎后组织均匀铺在T-75细胞培养瓶中(组织块贴壁法)。(组织块贴壁法)。
7.将消化后的组块转移的新的50ml离心管中，完全培养基补足到45ml，2500rpm，7min离心清洗消化后的组织块。
8.将按照上述两种方法所得的脐带组织块分别均匀的铺在T-75细胞培养瓶中，各获得6瓶T-75细胞培养瓶。
9.将8所得的T-75放入培养箱培养6h后，加入7mL完全培养基。
10.显微镜观察组织块周围，每5d更换培养基，约7d组织块周围爬出细胞。
11.于9d后镜下观察分别用两种方法获得的华氏胶组织块周围爬出来的细胞，拍照，可明显观察到用Tryple-Express消化酶消化15min后的华氏胶组织块周围爬出来的细胞多于未用消化酶消化的组织块周围爬出来的细胞。
图5为Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞，图6为未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。图5和图6均为4×镜下拍照所得。图5细胞生长的密度高于图6细胞生长的密度，说明用Tryple-Express消化酶消化后爬出的细胞多于未用Tryple-Express消化酶消化爬出的细胞。可以得出Tryple-Express消化法相较于组织块贴壁法，可以获得更多的细胞。
12.待细胞融合度达80％左右，轻轻拍打弃去组织块，加入5mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
13.弃去生理盐水后，加入2mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
14.消化好的细胞加入6mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
15.弃上清，向沉淀中加入20mL完全培养基重悬，制成细胞悬液。
两种方法获得脐带间充质干细胞分别吸取20μL细胞悬液计数，计数后计算两种方法各获得的细胞数量的平均数，结果如表5，根据镜下观察和计数结果可以得出利用Tryple-Express消化酶消化脐带华氏胶组织块获得的细胞数量多于未处理过的脐带华氏胶组织块获得的细胞数量。
表5两种方法各获得的细胞数量的平均数
Figure BDA0002722207710000161
Figure BDA0002722207710000171
16.按照150万/T-175将两种方法获得脐带间充质干细胞分别接种于培养瓶中，放入培养箱于5％CO2，37℃条件下进行传代培养。
17.用倒置显微镜观察T-175细胞培养瓶中细胞状态，细胞融合度的达到80％左右时消化获取脐带间充质干细胞。
18.在超净工作柜台中打开需消化细胞的T-175细胞培养瓶，弃去瓶中培养基。加入10mL生理盐水洗去瓶中残余培养基。
19.弃去生理盐水后，加入3mLTryple-Express，室温或37℃静置消化2min左右，直至倒置显微镜观察细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起。
20.消化好的细胞加入10mL生理盐水终止消化，冲洗下瓶壁残余细胞后将液体转移至离心管，1500rpm离心5min。
21.弃上清，向沉淀中加入20mL生理盐水，制成细胞悬液。取20μL计数，根据计数结果各取相应的细胞做质量检测。(因Tryple消化获得的脐带间充质干细胞多于未消化获得的脐带间充质干细胞，所以接种了Tryple消化获得的脐带间充质干细胞会更早达到上述融合度，培养瓶会提前处理)。
22.纯度和均一性检测：
(1)细胞计数：2.5×105，体积：1000μL；
(2)将细胞悬液以100μL每管的体积均分到10个EP管中。每份细胞，2.5×105，并做如下标记：Blank、MSC-ISO、Msc、PE-ISO、CD11、CD19、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；
(3)2000转/分钟，离心6分钟，小心弃去上清；
(4)加入25μL的DPBS重悬；
(5)先将流式单染抗体PE-ISO、CD11、CD19、CD34、CD31、CD45、HLA-DR各取5μL加入到对应的EP管中，轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育30分钟；
(6)15分钟时，再将流式抗体MSC-ISO、MSC各取5μL加入到队应的EP管中；轻柔吹打混匀，4℃冰箱避光孵育10分钟；
(7)染色终止后，每管加入500μLDPBS洗一遍样品，2000转/分钟，离心6分钟，小心弃去上请；
(8)重复步骤(7)；
(9)加入200μL的DPBS重悬，转移到流式管中。上机做流式检测。使用BD CantoⅡ进行样本数据收集和分析。
(10)tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：100％/100％/100％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：1.70％/0.777％/0.914％/1.24％0.804％。
未用tryple消化酶消化的脐带华氏胶获得的脐带间充质干细胞检测结果：
CD73/CD90/CD105/CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR(CD73/CD90/CD105阳性细胞比例皆大于95％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例皆小于2％)：CD73/CD90/CD105阳性细胞比例分别为：100％/100％99.9％；CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR阳性细胞比例分别为：1.43％/0.284％/0.241％1.01％/0.487％
脐带来源的间充质干细胞主要表达CD73/CD90/CD105等几种细胞因子，低表达或不表达CD11/CD19/CD34/CD45/HLA-DR等几种细胞因子。步骤(10)是JJM这一根脐带用两种方法获取的细胞，表达的细胞因子的检测结果。两种方法获得的细胞的阳性细胞的比例未有明显的区别。可以得出tryple消化酶消化法获得的细胞的细胞质量与组织块贴壁法获得的细胞的细胞质量未有明显的差异。
23.异常免疫学反应检测：
1.取待检测样本细胞，7×105个细胞到T75培养瓶(用含5％血替的α-MEM培养)过夜使其贴壁。
2.第2d弃培养基，用DPBS清洗一遍，加入无血清培α-MEM养基培养72h。
3.当样本细胞培养48h时，BV2细胞(用含10％FBS的DMEM培养)铺96孔板(10000个/孔)。
4.当样本细胞培养72h时，收集培养的上清液，离心(4℃，2000rpm，5min)，去除细胞碎片，收集上清液。
5.同时弃去BV2细胞培养上清液，DPBS清洗一遍，加入收集的样本细胞培养上清液，96孔板每孔加入100μL，对照孔加入含10％FBS DMEM，共培养48h。
6.共培养48h后向96孔板加入CCK8试剂(10μL/孔)，用酶标仪在波长450nm测OD值，BV2细胞存活率＝处理组OD值/对照组OD值。样本细胞免疫抑制力＝((1-BV2细胞存活率)*100)％，结果如表6所示。
表6 MSC免疫抑制力实验结果
Figure BDA0002722207710000191
免疫抑制是指对于机体免疫应答机制的抑制作用，免疫抑制力越高说明对免疫应答机制的抑制作用越强。人脐带来源的间充质干细胞具有免疫抑制作用，可以应用于预防和治疗移植物抗宿主病。JJM的脐带利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的免疫抑制力为89.93％，利用组织块贴壁法获得间充质干细胞的免疫抑制力为88.20％。根据上述结果可以得出利用tryple消化酶消化法获得的间充质干细胞的质量与组织块贴壁法获得的细胞的质量没有明显差别。
根据实施例1～3的结果可以证明tryple消化酶消化法相较于组织块贴壁法可以获得更多的细胞，且细胞质量不受影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人脐带来源的间充质干细胞原代分离的方法，包括以下步骤：
1)用生理盐水清洗乙醇水溶液喷淋后的脐带，洗去血液，得到干净脐带；
2)将步骤1)得到的干净脐带放入生理盐水中，去除静脉和动脉，分离得到华氏胶；
3)将步骤2)得到的华氏胶剪碎成组织块，等体积比与Tryple-Express消化酶混合，37℃消化15～25min，得到消化后的组织块；
4)用第一完全培养基离心清洗消化后的组织块，弃上清，将弃上清的组织块进行10～15d的贴壁培养和消化培养，得到从组织块中生长爬出的原代分离的人脐带来源的间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述脐带在喷淋乙醇水溶液前，还包括：用生理盐水浸没后震荡清洗。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述乙醇水溶液中，乙醇的体积百分含量为70～80％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述组织块的体积为1～2mm3。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述离心的条件为2500rpm离心5～10min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述第一完全培养基为体积百分含量为8～10％的完全培养基：α-MEM无血清培养基加入体积百分含量为8～10％的HeliosμLtraGROAdvanced。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述贴壁培养和消化培养的方法包括以下步骤：
将弃上清的组织块培养4～6h后，加入第一完全培养基进行培养，每4～6d更换新的完全培养基，待细胞融合度达75～85％，去除组织块，加入生理盐水洗去残余完全培养基，弃去生理盐水，加入Tryple-Express消化酶，25～37℃消化1～3min，至细胞呈透亮圆形，轻轻晃动飘起，得到消化好的细胞；将消化好的细胞与生理盐水混合，离心，弃上清，将沉淀用第二完全培养基重悬；所述第二完全培养基为体积百分含量为4～5％的完全培养基。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为1500rpm离心5～6min。
9.Tryple-Express消化酶在原代分离人脐带来源的间充质干细胞中的应用。
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