CN112111586A - 一种克罗恩病相关微生物标志物集及其应用 - Google Patents
一种克罗恩病相关微生物标志物集及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种克罗恩病相关微生物标志物集及其在制备克罗恩病的检测试剂或检测试剂盒中的应用，克罗恩病相关微生物标志物集中包括特异筛选出的34种人肠道微生物，用于克罗恩病的诊断时准确度高，可实现克罗恩病的早期筛查，为患者节省时间，实现早期治疗，提高治疗效果。本发明还公开了一种克罗恩病相关微生物标志物集在克罗恩病检测中的应用，以人粪便为样本，操作和运输便捷，检测结果的准确度达95.2％、灵敏度达91.4％。本发明还公开了一种克罗恩病检测试剂盒，包括上述克罗恩病相关微生物标志物集，使用方便，可全面、综合地检测、监控疾病状态下的肠道菌群差异状况，用于克罗恩病患者的早期发现。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，尤其涉及一种克罗恩病相关微生物标志物组合及其应用。
背景技术
克罗恩病(crohn’s disease，CD)是一种慢性胃肠道炎症，与溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)一起，是目前最常见的炎症性肠病，影响全球7％至21％人口的健康。UC常表现为结肠和直肠最内层持久的炎症和溃疡，CD却可引起消化道任何部位的炎症。临床上，克罗恩病患者多表现为严重的腹泻、腹痛、疲劳、体重减轻、直肠出血或血便；甚至会出现各种全身并发症，如视物模糊、关节疼痛、皮疹等症状。该病经治疗可好转，但多数患者会出现反复发作、迁延不愈的情况，很多患者还会出现多种并发症而需要进行手术治疗。我国近5年来CD的患病人数已达上世纪90年代同期的8倍，CD发病率的不断升高，已使其成为消化科的常见病，给全球健康带来了挑战。
尽管克罗恩病的确切病因尚不清楚，但可以确定的一点是，克罗恩病是肠道微生物与免疫系统之间相互作用发生改变的结果：肠道微生物群和肠粘膜之间的紧密相互作用，可不断的调节和塑造肠道免疫系统，并且改变正常的微生物组状态，可能通过促炎性信号触发免疫失调。肠道微生物作为克罗恩病的影响因素已受到较多关注，已有研究表明，CD和UC患者的肠道微生物相对于健康人群多样性降低，结构发生改变，并且CD、UC以及健康人群各自具有独特的微生物组特征。例如：Ruminococcusgnavus、Escherichia coli和Clostridium clostridioforme在CD患者肠道中富集，Bifidobacteriumbreve和Clostridium symbiosum在UC患者肠道中富集，而健康人群中Roseburiahominis、Doreaformicigenerans和Ruminococcusobeum明显富集。
随着宏基因组学的发展，利用粪便样本宏基因组测序数据分析肠道微生物的方法已经非常成熟。本发明基于宏基因组学研究克罗恩病中的肠道菌群改变特征，获得克罗恩病相关的粪便菌群标志物，用于辅助早期诊断克罗恩病。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种克罗恩病相关微生物标志物组合，包括34种人肠道微生物，用于克罗恩病的诊断时准确度高，可实现克罗恩病的早期筛查，为患者节省时间，尽早开始治疗，提高临床治疗效果；
本发明的目的之二在于提供一种上述克罗恩病相关微生物标志物集在制备克罗恩病检测试剂或检测试剂盒中的应用；
本发明的目的之三在于提供一种克罗恩病相关微生物标志物集在克罗恩病检测中的应用，操作步骤简单，检测结果准确度高；
本发明的目的之四在于提供一种克罗恩病检测试剂盒，包括上述克罗恩病相关微生物标志物集，使用方便，可全面、综合地检测疾病状态下的肠道菌群差异状况，用于克罗恩病患者的早期发现。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种克罗恩病相关微生物标志物集，包括如下的肠道微生物：Lachnospiraceae_bacterium_oral_taxon_082(毛螺菌科)、Clostridium_ramosum(多枝梭菌)、Stomatobaculum_longum(长口腔杆菌)、Clostridium_clostridioforme(梭状梭菌)、Clostridium_symbiosum(共生梭菌)、Dorea_formicigenerans(长链多尔氏菌)、Anaeroglobus_geminatus(成双厌氧球形菌)、Coprobacillus_unclassified(粪芽孢菌属)、Escherichia_coli(大肠杆菌)、Alistipes_onderdonkii(另枝菌属)、Alistipes_putredinis(腐烂别样杆菌)、Faecalibacterium_prausnitzii(普拉梭菌)、Peptostreptococcusstomatis(胃消化链球菌)、Barnesiella_intestinihominis(肠道巴恩斯氏菌)、Bacteroides_xylanisolvens(木糖降解拟杆菌)、Clostridium_leptum(瘦肉梭菌)、Eubacterium_eligens(挑剔真杆菌)、Eubacterium_ramulus(细枝真杆菌)、Eubacterium_rectale(直肠真杆菌)、Bacteroidales_bacterium_ph8(拟杆菌属)、Eubacterium_ventriosum(凸腹真杆菌)、Ruminococcus_lactaris(酸奶瘤胃球菌)、Ruminococcus_bromii(布氏瘤胃球菌)、Roseburia_hominis(人罗斯拜瑞氏菌)、Ruminococcus_callidus(伶俐瘤胃球菌)、Bilophila_unclassified(嗜胆菌属)、Roseburia_inulinivorans(罗氏伊琳妮佛伦菌)、Coprococcus_sp_ART55_1(粪球菌属)、Bifidobacterium_adolescentis(青春双歧杆菌)、Collinsella_aerofaciens(产气柯林斯菌)、Parabacteroides_goldsteinii(戈氏副拟杆菌)、Coprococcus_catus(灵巧粪球菌)、Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA(毛螺菌)、Adlercreutzia_equolifaciens(产液阿德勒克罗伊茨菌)和Alistipes_senegalensis。
进一步地，所述克罗恩病相关微生物标志物集，由以下步骤获得：
1)收集健康受试者和克罗恩病受试者的粪便样本，分别测序并收集受试者粪便样本中微生物的宏基因组测序序列；
2)将步骤1)的宏基因组测序序列分别比对到人类肠道微生物标志基因集上，根据微生物物种丰度图谱，筛选得到克罗恩病受试者与健康受试者的粪便样本中存在丰度差异的微生物，作为差异微生物集；
3)利用套索回归方法对所述差异微生物集进行分析，获得克罗恩病相关微生物标志物集。
进一步地，所述人类肠道微生物标志基因集是基于人类肠道微生物菌群构建的非冗余基因集。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种克罗恩病相关微生物标志物集在制备克罗恩病的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种克罗恩病相关微生物标志物集在克罗恩病检测中的应用，包括以下步骤：
1)收集受试者的粪便样本，提取粪便样本的DNA，构建DNA文库，然后测序，获取测序序列；
2)将步骤1)的测序序列比对到人类肠道微生物标志基因集上，根据微生物物种丰度图谱，分别获得克罗恩病相关微生物标志物集中每个微生物的相对丰度值；
3)根据所述相对丰度值和套索回归模型计算粪便样本的指数；
4)结果判读：当所述指数大于阈值时，受试者具有克罗恩病或者具有患克罗恩病的风险。
进一步地，所述阈值是通过受试者工作特征曲线获得的；其中，所述阈值是当曲线下面积达到最大值时对应的概率值。
优选地，所述阈值为0.6。
进一步地，所述测序为第二代测序或第三代测序。
所述测序是在Hiseq2000、Hiseq 2500、Hiseq X ten、BGIseq500中的任意一种装置进行的。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种克罗恩病检测试剂盒，包括上述克罗恩病相关微生物标志物集。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明采取了荟萃分析策略研究克罗恩病中的肠道菌群改变特征，获取了大量克罗恩病患者的粪便组织宏基因组测序数据，并且进行了重分析。基于数据统计分析和机器学习方法，获得了可以用于辅助诊断克罗恩病的粪便菌群标志物。本发明的克罗恩病相关微生物标志物可用于制备罗恩病诊断试剂或试剂盒，可以全面、综合地获取疾病状态下的肠道菌群差异状况，用于克罗恩病患者的早期发现。
本发明的克罗恩病相关微生物标志物是基于肠道微生物测序数据进行检测的，结果准确、安全、便宜；而且本发明以人粪便作为检测样本，取样方法是无创的和舒适的，而且样品便于运输。此外，本发明的克罗恩病相关微生物标志物集还可作为克罗恩病患者的潜在治疗工具，即基于肠道微生物的改变而采用针对性的治疗。
附图说明
图1为实施例1数据集中肠道微生物丰度与临床变量的分析图；
图2为实施例1用LEfSe鉴定的48种克罗恩病相关肠道微生物；
图3为实施例1套索回归模型优化过程的lambda参数图；
图4为实施例1套索回归方法鉴定的34种克罗恩病相关的肠道微生物；
图5为实施例1利用套索回归方法进行的34种微生物的ROC分析图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种克罗恩病相关微生物标志物集，包括如下的34种肠道微生物：Lachnospiraceae_bacterium_oral_taxon_082(毛螺菌科)、Clostridium_ramosum(多枝梭菌)、Stomatobaculum_longum(长口腔杆菌)、Clostridium_clostridioforme(梭状梭菌)、Clostridium_symbiosum(共生梭菌)、Dorea_formicigenerans(长链多尔氏菌)、Anaeroglobus_geminatus(成双厌氧球形菌)、Coprobacillus_unclassified(粪芽孢菌属)、Escherichia_coli(大肠杆菌)、Alistipes_onderdonkii(另枝菌属)、Alistipes_putredinis(腐烂别样杆菌)、Faecalibacterium_prausnitzii(普拉梭菌)、Peptostreptococcusstomatis(胃消化链球菌)、Barnesiella_intestinihominis(肠道巴恩斯氏菌)、Bacteroides_xylanisolvens(木糖降解拟杆菌)、Clostridium_leptum(瘦肉梭菌)、Eubacterium_eligens(挑剔真杆菌)、Eubacterium_ramulus(细枝真杆菌)、Eubacterium_rectale(直肠真杆菌)、Bacteroidales_bacterium_ph8(拟杆菌属)、Eubacterium_ventriosum(凸腹真杆菌)、Ruminococcus_lactaris(酸奶瘤胃球菌)、Ruminococcus_bromii(布氏瘤胃球菌)、Roseburia_hominis(人罗斯拜瑞氏菌)、Ruminococcus_callidus(伶俐瘤胃球菌)、Bilophila_unclassified(嗜胆菌属)、Roseburia_inulinivorans(罗氏伊琳妮佛伦菌)、Coprococcus_sp_ART55_1(粪球菌属)、Bifidobacterium_adolescentis(青春双歧杆菌)、Collinsella_aerofaciens(产气柯林斯菌)、Parabacteroides_goldsteinii(戈氏副拟杆菌)、Coprococcus_catus(灵巧粪球菌)、Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA(毛螺菌)、Adlercreutzia_equolifaciens(产液阿德勒克罗伊茨菌)和Alistipes_senegalensis。。
所述克罗恩病相关微生物标志物集，由以下步骤获得：
1)收集健康受试者和克罗恩病受试者的粪便样本，分别测序并收集受试者粪便样本中微生物的宏基因组测序序列。
2)将步骤1)的宏基因组测序序列分别比对到人类肠道微生物标志基因集上，使用MetaPhlan2软件分析、衡量微生物的丰度；然后使用LEfSe软件筛选、鉴定出克罗恩病受试者与健康受试者的粪便样本中存在丰度差异的微生物，作为差异微生物集。通过粪便样本中微生物丰度的分析发现，多种肠道微生物在克罗恩病受试者中发生了显著的富集或者缺失现象，表明这些微生物与克罗恩病存在显著关联性。
3)克罗恩病相关微生物标志物集筛选：为了筛选最具有区分度的微生物标志物集合，使用套索回归方法对差异微生物集进行分析。用R中的“glmnet”包(广义线性模型)计算，设置套索回归模型的不同参数lamda，进行交叉验证筛选；基于交叉验证的错误率，选取错误率最低对应的lamda作为模型优化之后的参数；进而筛选获得最优的肠道微生物作为克罗恩病相关微生物标志物集。
上述人类肠道微生物标志基因集是基于人类肠道微生物菌群构建的非冗余基因集。
一种克罗恩病相关微生物标志物集在制备克罗恩病的检测试剂或检测试剂盒中的应用。
一种克罗恩病相关微生物标志物集在克罗恩病检测中的应用，包括以下步骤：
1)收集受试者的粪便样本，提取粪便样本的DNA，构建DNA文库，然后测序，获取测序序列；
2)将步骤1)的测序序列比对到人类肠道微生物标志基因集上，根据微生物物种丰度图谱，分别获得克罗恩病相关微生物标志物集中每个微生物的相对丰度值；
3)根据所述相对丰度值和套索回归模型计算粪便样本的指数；
基于套索回归方法，使用本发明的标志物集，利用交叉验证方法评估分类错误率，并利用pROC工具包绘制受试者工作特征(ROC)，确定曲线下面积(AUC)达到最大值时对应的概率值，即为上述指数。
4)结果判读：当步骤3)得到的指数大于阈值时，受试者具有克罗恩病或者具有患克罗恩病的风险。其中，阈值是基于本发明的克罗恩病标志物集，利用受试者工作特征曲线(ROC)获得的，该阈值是当曲线下面积(AUC)达到最大值时对应的概率值。
本发明的测序为第二代测序或第三代测序，是在Hiseq2000、Hiseq 2500、Hiseq Xten、BGIseq500中的任意一种装置进行的。
一种克罗恩病检测试剂盒，包括上述克罗恩病相关微生物标志物集。基于上述含有34种肠道微生物的克罗恩病相关微生物标志物集，构建克罗恩病检测试剂盒，检测、计算得出检测样本中34种标志物的相对丰度，根据上述检测步骤，即可判断该样本有没有罹患克罗恩病，或有没有罹患克罗恩病的风险。
实施例1
1)数据收集
基于大量克罗恩病的文献调研，发明人采取了荟萃分析策略，收集了疾病对照设计的3个肠道菌群宏基因组测序数据集(记为C1组、C2组、C3组)，囊括了117例克罗恩病患者和146例健康对照受试者，均未使用抗生素，也未采用侵入性医疗干预。如表1所示。
表1克罗恩病群体数据集特征
2)测序序列比对
在对表1数据集的测序数据进行了数据过滤之后，发明人使用metaphlan2将测序序列比对到人类肠道微生物标志基因集上，并且构建了265个微生物的物种丰度谱。
3)临床关联分析
为了衡量不同临床表型对物种谱的影响，发明人采用了置换多元方差分析(PERMANOVA)方法进行评估。临床特征包括区域、年龄、性别。本实施例利用R中的“vegan”工具包进行分析，经过1000次置换，得到置换P值。在置换多元方差分析(PERMANOVA)过程中发现，健康状态和区域因素对肠道菌群微生物丰度存在最显著的影响，如图1所示，表明克罗恩病患者的肠道菌群结构成发生了显著的变化。
4)用LEfSe鉴定克罗恩病相关微生物
本实施例利用高维度生物标记物发现与解释(LEfSe)来鉴定在克罗恩病患者中发生改变的微生物。为了得到稳定且一致性的结果，本实施例综合了多个数据集中的结果，最终共得到48个物种标志物(线性判别分析效应大于2)，其在克罗恩病组(Disease)中或健康对照(Control)中显著富集，如图2所示。图2中，物种的LDA score值大于2.0表示其在克罗恩病患者中富集，而小于2.0表示在正常样本中富集。
5)套索回归法筛选克罗恩病相关微生物
本实施例优化了套索回归的lamda参数(图3)。然后，在最优lamda的基础上，筛选、鉴定出了克罗恩病相关的34个微生物标记物，如图4和表2所示。
表2使用套索回归方法筛选的34个肠道微生物标记物
6)利用套索回归方法进行ROC分析，基于表2中微生物物种的相对丰度，分析其ROC曲线的线下面积，如图5所示。由图5可以看出，ROC曲线的线下面积AUC为0.97，表明这34个标记物可以用来准确区分克罗恩病患者。此外，从图5还可以看出，当套索模型计算克罗恩病的后验概率阈值设置为0.6时，可以最优的地将克罗恩病患者与健康对照区分开来，准确度为95.2％，灵敏度为91.4％。
上述实施方式仅为本发明专利的优选实施方式，不能以此来限定本发明专利保护的范围，本领域的技术人员在本发明专利的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明专利所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种克罗恩病相关微生物标志物集，其特征在于，包括如下的肠道微生物：Lachnospiraceae_bacterium_oral_taxon_082(毛螺菌科)、Clostridium_ramosum(多枝梭菌)、Stomatobaculum_longum(长口腔杆菌)、Clostridium_clostridioforme(梭状梭菌)、Clostridium_symbiosum(共生梭菌)、Dorea_formicigenerans(长链多尔氏菌)、Anaeroglobus_geminatus(成双厌氧球形菌)、Coprobacillus_unclassified(粪芽孢菌属)、Escherichia_coli(大肠杆菌)、Alistipes_onderdonkii(另枝菌属)、Alistipes_putredinis(腐烂别样杆菌)、Faecalibacterium_prausnitzii(普拉梭菌)、Peptostreptococcusstomatis(胃消化链球菌)、Barnesiella_intestinihominis(肠道巴恩斯氏菌)、Bacteroides_xylanisolvens(木糖降解拟杆菌)、Clostridium_leptum(瘦肉梭菌)、Eubacterium_eligens(挑剔真杆菌)、Eubacterium_ramulus(细枝真杆菌)、Eubacterium_rectale(直肠真杆菌)、Bacteroidales_bacterium_ph8(拟杆菌属)、Eubacterium_ventriosum(凸腹真杆菌)、Ruminococcus_lactaris(酸奶瘤胃球菌)、Ruminococcus_bromii(布氏瘤胃球菌)、Roseburia_hominis(人罗斯拜瑞氏菌)、Ruminococcus_callidus(伶俐瘤胃球菌)、Bilophila_unclassified(嗜胆菌属)、Roseburia_inulinivorans(罗氏伊琳妮佛伦菌)、Coprococcus_sp_ART55_1(粪球菌属)、Bifidobacterium_adolescentis(青春双歧杆菌)、Collinsella_aerofaciens(产气柯林斯菌)、Parabacteroides_goldsteinii(戈氏副拟杆菌)、Coprococcus_catus(灵巧粪球菌)、Lachnospiraceae_bacterium_5_1_63FAA(毛螺菌)、Adlercreutzia_equolifaciens(产液阿德勒克罗伊茨菌)和Alistipes_senegalensis。
2.根据权利要求1所述的克罗恩病相关微生物标志物集，其特征在于，由以下步骤获得：
1)收集健康受试者和克罗恩病受试者的粪便样本，分别测序并收集受试者粪便样本中微生物的宏基因组测序序列；
2)将步骤1)的宏基因组测序序列分别比对到人类肠道微生物标志基因集上，根据微生物物种丰度图谱，筛选得到克罗恩病受试者与健康受试者的粪便样本中存在丰度差异的微生物，作为差异微生物集；
3)利用套索回归方法对所述差异微生物集进行分析，获得克罗恩病相关微生物标志物集。
3.根据权利要求2所述的克罗恩病相关微生物标志物集，其特征在于，所述人类肠道微生物标志基因集是基于人类肠道微生物菌群构建的非冗余基因集。
4.权利要求1-3任一项所述克罗恩病相关微生物标志物集在制备克罗恩病检测试剂或检测试剂盒中的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的克罗恩病相关微生物标志物集在克罗恩病检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)收集受试者的粪便样本，提取粪便样本的DNA，构建DNA文库，然后测序，获取测序序列；
2)将步骤1)的测序序列比对到人类肠道微生物标志基因集上，根据微生物物种丰度图谱，分别获得克罗恩病相关微生物标志物集中每个微生物的相对丰度值；
3)根据所述相对丰度值和套索回归方法计算粪便样本的指数；
4)结果判读：当所述指数大于阈值时，受试者具有克罗恩病或者具有患克罗恩病的风险。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阈值是通过受试者工作特征曲线获得的；其中，所述阈值是当曲线下面积达到最大值时对应的概率值。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阈值为0.6。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述测序为第二代测序或第三代测序。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述测序是在Hiseq2000、Hiseq2500、Hiseq X ten、BGIseq500中的任意一种装置进行的。
10.一种克罗恩病检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的克罗恩病相关微生物标志物集。
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